Chuyển gen thực vật bằng vi khuẩn pps

Chuyển gen thực vật bằng vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens 1. Giới thiệu Chuyển nạp gen (gene transformation) là kỹ thuật chuyển gen ngoại lai vào genome cây trồng. Công nghệ gen thực vật diễn biến nỗi bật qua các móc thời gian tạo ra những bước tiến ngày càng xa và khả năng ứng dụng cũng tăng theo: Năm Những phát triển quan trọng 1980 Lần đầu tiên chuyển DNA vi khuẩn vào thực vật nhờ Agrobacterium tumefaciens 1983 Marker chọn lọc, Ti-plasmid được loại bỏ các gen không cần thiết 1984 Biến nạp vào tế bào trần 1985 Kháng thuốc trừ cỏ 1986 Kháng virus Lần đầu tiên đưa cây biến đổi gen ra đồng ruộng 1987 Kháng côn trùng Biến nạp phi sinh học 1988 Điều khiển sự chín ở cà chua 1989 Kháng thể ở thực vật bậc cao 1990 Biến nạp phi sinh học ở ngô Tính bất dục đực nhân tạo 1991 Thay đổi thành phần carbohydrate Tạo alkaloid tốt hơn 1992 Thay đổi acid béo Biến nạp phi sinh học ở lúa mỳ Lần đầu tiên phân giải plastic nhờ cây biến đổi gen Cà chua biến đổi gen FlavorSaver xuất hiện trên thị trường 1994 Lần đầu tiên hơn 10 gen được chuyển đồng thời vào thực vật 1998 Trên thế giới có 48 trong đó Mỹ có 35 loại thực vật biến đổi gen được thị trường hóa Lúa biến đổi gen với giá trị dinh dưỡng tốt hơn Cây biến đổi gen được trồng trên diện tích hơn 40 triệu ha 1999 Cho đến nay khoảng 9000 thí nghiệm về cây biến đổi gen được đưa ra đồng ruộng (ở EU: 1360) Thành tựu kỹ thuật nuôi cấy mô và kỹ thuật tái tổ hợp AND cho phép người ta thực hiện chuyển gen trên thực vật bậc cao, tạo ra những tính trạng di truyền mới. Cây được chuyển nạp gen mục tiêu được gọi là cây “transgenic”, với hai phương pháp chuyển nạp gen: (1) chuyển nạp gen gián tiếp nhờ sự cải tiến không ngừng hệ thống Ti-plasmid trên vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens, và (2) chuyển gen trực tiếp theo phương pháp PEG (polyethylene glycol), phương pháp vi tiêm (microinjection), phương pháp mỡ lỗ bằng điện (electroporation), phương pháp bắn gen (biolistic), phương pháp chuyển qua ống hạt phấn (pollen tube pathway) và một và kỹ thuật khác. Trong đó ba phương pháp được ứng dụng rộng rãi là chuyển gen bằng Agrobacterium tumefaciens , tế bào trần và phi sinh học. 2. Chuyển gen bằng Agrobacterium tumefaciens Agrobacterium tumefaciens là vi khuẩn gây bệnh ghẻ khối u trên cây, phát sinh ung thư, tạo ra kết quả trực tiếp hình thành khối u để tổng hợp ra một loại dinh dưỡng đặc biệt giúp cho vi khuẩn phát triển. Gen Agrobacterium là nhóm genus có tính chất sinh sản trong đất, gram âm, cùng họ với Rhizobium. Có bốn species đã được ghi nhận. Agrobacterium tumefaciens tạo ra khối u trong tế bào tumor chưa được phân hóa và chưa được tổ chức. một vài dòng của Agrobacterium tumefaciens không tạo khối u nhưng kích thích sự tăng trưởng của teratomas (thẻ dị thường, khác thường). tuy nhiên thực vật thuộc đơn tử diệp tỏ ra kháng đối với Agrobacterium, chỉ trừ một vài loài của Asparagus. Đặc điểm quan trọng của tế bào khối u là tăng trưởng không cần kích tố thực vật trong môi trường nuôi cấy mô. Điều này ngược lại với tế bào cây bình thường, do cần phải bổ sung auxin, cytokinin để duy trì sự tăng trưởng và sự sống trong nuôi cấy. Sự tăng trưởng không phụ thuộc vào hormon của tế bào khối u bị kích thích bởi Agrobacterium gợi cho chúng ta một ý tưởng: sẽ có sự thay đổi hàm lượng hormon nội sinh. Sự thay đổi mức biến dạng dị hình này trong cơ quan bi biến dạng dị hình được ghi nhận. Những khối u này là không gian sống của vi khuẩn, một số chất dinh dưỡng (opine) có lợi cho vi khuẩn được tạo ra, đây cũng chính là đặc tính của tế bào khối u. Trong mô bình thường không có hình thành nhóm hóa học này. Những opine phổ biến là nopalin và octopin.Về mặt hóa học opine là sản phẩm ngưng tụ của aminoacid với cetoacide hoặc aminoacide với đường. Octopin được tạo nên từ amino acid là arginine và pyruvate, còn nopalin được tạo nên từ arginine và -cetoglutaraldehyd. Công thức cấu tạo của opine được trình bày ở hình 1.1. Khả năng chuyển DNA của Agrobacterium tumefaciens được sử dụng trong công nghiệp gen hiện đại. Để được quá trình này điều cần thiết là phải làm rõ sự tương tác giữa Agrobacterium với thực vật. COOH COOH COOH COOH HC NH CH HC CH CH CH 2 CH 3 CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 COOH NH NH C C H2N NH H2N NH Octopin Nopalin Hình 1.1 Công thức cấu tạo của opine. 2.1 Ti – plasmid Chức năng của plasmid đã được ghi trên bản đồ là khả năng của nhiều dòng khác nhau. Agrobacterium tumefaciens kích thích tạo khối u để tổng hợp các opine. Ti-plasmid thể hiện tính chất chuyên biệt đối với một opine nào đó mà thôi. Thí dụ Ti-plasmid của dòng C58 Agrobacterium tumefaciens mã hóa đối với nopaline và dị hóa nopaline nhưng không phân giải được octopine, nó được xếp vào nhóm plasmid có dạng nopaline. Việc sử dụng A. tumefaciens đã bắt đầu từ 1907, khi người ta phát hiện vi khuẩn này có khả năng tạo nên khối u ở cây hai lá mầm bị thương, được gọi là khối u cổ rễ (Hình 1.2). Trong những năm bảy mươi người ta tìm thấy trong các chủng A. tumefaciens tạo khối u có một plasmid rất lớn có kích thước 200 đến 800 kb. Qua những thí nghiệm chuyển đến những chủng không độc (không có plasmid này), đã khẳng định plasmid này cần thiết cho việc tạo khối u. Vì vậy, plasmid này được gọi là Ti-plasmid (tumor inducing-plasmid). Ti-plasmid mang các gen mã hóa cho protein phân giải opine, nhận biết những tế bào thực vật bị thương, cắt và vận chuyển đoạn được gọi là T-DNA. T- DNA là một phần của Ti-plasmid, được chuyển vào thực vật (transfer-DNA). Trên đó định vị những gen tạo khối u và tổng hợp opine. T-DNA được giới hạn bởi hai vùng, bờ trái và bờ phải (LB : left border và RB: right border). Các bờ này gồm một trình tự lặp lại của 25 bp, là trình tự nhận biết cho việc cắt T-DNA. Hình 1.2. Vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens. a: Dưới kính hiển vi điện tử. b: Khối u ở cây và từ khối u này xuất hiện chồi một cách tự nhiên. Một số loài vi khuẩn A.tumefaciens chứa Ti-plasmid của loại octopin và loại khác của nopalin. Một sự khác biệt khác của các loại plasmid ở Agrobacterium là Ti-plasmid của loại nopalin chứa một bản copy của T-DNA, ngược lại pasmid octopin chứa ba. 2.2 Chức năng của T-DNA Phân tích di truyền và ứng dụng kỹ thuật lập bản đồ liên kết gen cho phép chúng ta hiểu được chức năng của vùng mang T-DNA, vùng này được thể hiện theo sự liên hợp nhất. T-DNA được đưa vào DNA thực vật trong nhân tế bào. Vị trí gắn vào thường là ngẫu nhiên, tuy nhiên thường là những vùng có khả năng sao chép. Sự tổng hợp opine được điều khiển bởi T-DNA. Những enzime như: octopine synthase, nopaline synthase được mã hóa trên T-DNA tại những loci: osc và nos theo thứ tự. có những vùng của T-DNA khá quen thuộc với cả hai plasmid: octopine và nopaline. 2.3 Qua trình chuyển nạp Quá trình lây nhiễm được mô tả ở hình 1.3. Khối u được tạo nên là do phytohormone (auxin và cytokinin) được tạo ra ở trong tế bào thực vật bị nhiễm, chúng kích thích sự phân chia tế bào và tạo nên mô không phân hóa. Điều kiện cho việc chuyển T-DNA vào thực vật trước hết là tế bào bị thương. Khi tế bào bị thương chúng tiết ra các hợp chất phenol (acetosyringon), chất có vai trò quan trọng trong việc nhận biết và sự gắn kết giữa vi khuẩn và tế bào thực vật. Bị thương Nhiễm sắc thể của vi khuẩn Ti-plasmid với T-DNA Agrobacterium Nhiễm sắc thể trong nhân tế bào thực vật Agrobacterium Tế bào thực vật Agrobacterium trong khối u Agrobacterium trong khối u T-DNA của vi khuẩn trong DNA nhân của tế bào thực vật Cơ chế nhận biết được giải thích là nhờ tính đặc hiệu của A.tumefaciens với cây hai lá mầm, ở cây một lá mầm thì phản ứng này chỉ ở một ít loài. Vì vậy, Agrobacterium được sử dụng giới hạn cho biến nạp cây một lá mầm. Khi bổ sung syringon người ta có thể biến nạp nấm bằng A. tumefaciens. Thực vật một lá mầm quan trọng như ngô có thể được biến nạp bằng A. tumefaciens. Tms tmr nos RB noc tra ori vir T-DNA LB Hình 1.3. Sơ đồ lây nhiễm của vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens. Hình 1.4.Ti-Plasmid của Agrobacterium dạng nopalin. T-DNA: Transfer-DNA, LB: Bờ trái. RB: Bờ phải, ori: khởi đầu sao chép của A. tumefaciens. noc: Phân giải nopalin, nos: Tổng hợp nopalin. tmr: Tổng hợp cytokinin, tms: Tổng hợp auxin, tra: Vận chuyển tiếp hợp, vir: Vùng virulence (vùng độc tính). Sự phát triển khối u sau khi nhiễm A. tumefaciens dựa trên tác dụng của hai phytohormone. Các enzyme cần thiết cho tổng hợp phytohormone được mã hóa chủ yếu từ những gen trên T-DNA. Sự tổng hợp auxin được thực hiện bởi hai gen là tms1 và tms2. Gen tms1 mã hóa tryptophan-2- monooxygenase xúc tác cho sự biến đổi tryptophan thành indol-3-aceamid. Sản phẩm của gen tms2 là indol-3- acetamid-hydrogenase, xúc tác để tạo ra auxin: indolylacetic acid. Ngoài ra T-DNA còn mang gen tmr mã hóa cho enzyme isopentenyltransferase. Enzyme này gắn 5’-AMP vào chuỗi bên isoprenoid để tổng hợp nên tiền cytokinin là isopentenyladenin và isopentenyladenosin. Hydroxyl hóa tiền cytokinin bằng những enzyme thực vật để tạo nên cytokinin. Auxin được tạo nên cùng với cytokinin làm cho khối u lớn lên, trong đó sự phân chia tế bào không phân hóa được kích thích. A. tumefaciens nhận biết acetosyringon nhờ một chất nhận, được mã hóa bằng một gen ở vùng vir. Sự nhận biết bằng chất nhận dẫn đến sự hoạt hóa của tất cả gen vir. Vùng vir bao gồm nhiều gen. Một sản phẩm gen vir khác là một endonuclease nhận biết bờ phải và trái của T-DNA và cắt T- DNA ở những vị trí này. Sau đó, một protein gắn vào sợi đơn của T-DNA và phức hệ này được chuyển vào thực vật dưới tác dụng của các sản phẩm gen vir (Hình 1.6). LB RB T-DNA RB RB LB virD2 [...]... một protein virD2 gắn vào đầu 5’ của T-DNA sợi đơn đã được cắt ra bằng liên kết đồng hóa trị Bằng cách này xuất hiện một phức hệ DNA-protein và được chuyển vào tế bào thực vật Quá trình này xảy ra như thế nào vẫn chưa biết hết mọi chi tiết, nhưng có thể là 11 protein được mã hóa từ gen virB tạo nên phức lỗ, qua lỗ này phức hệ DNA-protein được vận chuyển vào thực vật Khi đến tế bào thực vật phức hệ... này không cao Ý nghĩa của những gen vir ở sự chuyển A tumefaciens -T-DNA được giải thích như sau: Gen virA mã hóa cho một protein màng, là chất nhận hợp chất phenol ở tế bào cây bị thương Sự nhận biết chất này dẫn đến sự hoạt hóa sản phẩm gen virG, đến lượt nó lại kích thích sự sao chép và sự biểu hiện của tất cả gen vir Ti-plasmid Không có T- DNA vir A.t ori LB T2 Gen P2 T1 SMG P1 RB Mod T-DNA RB... ori Sự hoạt hóa của protein thuộc gen virG có thể do sự vận chuyển những nhóm phosphate (photphoryl hóa) Hai protein được mã hóa từ gen virD2 và virE2 quan trọng đối với vi c chuyển T-DNA Protein virD2 là một endonuclease, cắt sợi đơn đặc hiệu ở bờ phải và trái của T-DNA, Protein virE2 gắn lập tức vào sợi đơn và ngăn cản sự gắn lại với Ti-plasmid (Hình 1.7) Sau đó, bằng cơ chế tổng hợp sửa chữa DNA,... tác chỉ đượcvào tế hiệnthực plasmid nhỏ Tất cả hệ DNA-protein những công vi c tạo dòng, cả vi c đưa DNA lạ, có thể thực hiện trong những tế bào E.coli, còn plasmid lớn đã hoàn thiện và được chuyển vào A tumefaciens Quá trình biến nạp được thực hiện ở những mô thực vật phù hợp, ví dụ mô lá Chúng được ủ với vi khuẩn, sau đó vi khuẩn phải được loại bỏ và mô được tái sinh thành cây hoàn chỉnh Cây Arabidopsis... Sơ đồlớn hơn mang vùng virchuyển T-DNA của Ti-lasmid 1: trái và phải Plasmid biểu diễn quá trình di và plasmid nhỏ hơn mang bờ T- DNA với bờ phải và là trái được chèn T-DNA duy nhất Sợi đơn cho vi c ra chuyển của T-DNA Đâybờ những vùng củavào Ti-plasmid 2:cần thiết được cắtvậnnhờ protein được mã hóa bởi gen là đủ 3: vận chuyển chính được giải phóng gen vào thực vật, plasmid nhỏ virD2 choSợi đơn của T-DNA... nhân tế bào Protein virD2 và virE2 chứa trình tự định vị nhân đặc hiệu cho phép phức hệ đi qua màng nhân và gắn vào DNA thực vật một cách ngẫu nhiên ở những chỗ gãy trên sợi của DNA của tế bào thực vật Tuy nhiên, vị trí tái tổ hợp được quan sát là đặc hiệu, là những trình tự rất ngắn 5-10 bp Quá trình kết hợp được thực hiện nhờ các enzyme thực vật, có thể có sự tham gia của protein virD2 3 Ý nghĩa Dòng... trái một gen chọn lọc và những ở sợi được chèn mộtkết hợp với protein do virD2 và virE2 mã hóa, chỗ đứt gen lạ đơn thứ haivào được tổng hợp bổ sung 4: Lấp đầy chỗ trống trong Ti-plasmid (đường gạch Sơ đồ cấu tạo của một vector hai nguồn được giới thiệu ở hình 1.7 Ưu điểm của nối đậm) là T-DNAtự do được vận chuyển thực bào với vật ở dạng phức vector nàySợi ở chỗ, các thao tác chỉ đượcvào tế hiệnthực plasmid... các vi khuẩn nhờ tính chất di truyền plasmid, nhờ những opine chuyên tính với Ti-plasmid Hình 1.7 Sơ đồ biểunhững hệ thống được hai nguồn để hai nguồnbằng phép Với vi c sử dụng diễn hệ thống vector gọi là vector biến nạp cho A tumefaciens các thao tác chỉ được thực hiện với plasmid nhỏ Tất cả những công vi c tạo dòng, cả vi c đưa tạo khốicó thểtổng hợp nopalinnhững loại ra, E.coli, còn plasmid Các gen. .. phục bằng cách phát triển Ti-plasmid thành một vector trong công nghệ di truyền thực vật, nhờ tách khỏi T-DNA các gen kích thích khối u (Grierson và Covey 1988) Gen được chuyển nạp vào cây hai lá mầm thông qua Agrobacterium tỏ ra rất ổn định và thường di truyền các tính trạng theo định luật Mendel (De Block và ctv 1984, Muller và ctv.1987, Hiei và Komari 1996) Thông qua phương pháp chuyển nạp gen trục... nopalinnhững loại ra, E.coli, còn plasmid Các gen DNA lạ, u và thực hiện trong được tế bào T-DNA mang lớn đã gen đánh dấu để chọn lọc trong A tumefaciens Các gen khác được một hoàn thiện và được chuyển vào thực vật (SMG) chèn vào A t ori: Khởi đầu sao chép để nhân lên trong A tumefaciens, E c ori: Khởi đầu sao chép để nhân lên trong E coli kanR: gen kháng kanamycin để kiện thí nghiệmE.coli vàcủa tumefaciens . Chuyển gen thực vật bằng vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens 1. Giới thiệu Chuyển nạp gen (gene transformation) là kỹ thuật chuyển gen ngoại lai vào genome cây trồng. Công nghệ gen thực vật. ta thực hiện chuyển gen trên thực vật bậc cao, tạo ra những tính trạng di truyền mới. Cây được chuyển nạp gen mục tiêu được gọi là cây “transgenic”, với hai phương pháp chuyển nạp gen: (1) chuyển. gắn kết giữa vi khuẩn và tế bào thực vật. Bị thương Nhiễm sắc thể của vi khuẩn Ti-plasmid với T-DNA Agrobacterium Nhiễm sắc thể trong nhân tế bào thực vật Agrobacterium Tế bào thực vật Agrobacterium