Chương VII ĐẠI CƯƠNG VỀ SẮC KÝ docx

Chương VII ĐẠI CƯƠNG VỀ SẮC KÝ Phần I: CƠ SỞ LÝ THUYẾT I. VÀI NÉT LỊCH SỬ: Phương pháp sắc ký được phát triển vào năm 1903 do nhà thực vật hoc người Nga Michael C.Txvet.Ông thực sự là người đầu tiên có công tìm ra phương pháp, giải quyết vấn đề tách các chất có tính chất giống nhau theo một cơ chế độc đáo, hoàn toàn khác với phương pháp tách đã từng có trước đây, tuy nhiên phát hiện này đã bị lãng quên nhiều năm. Năm 1941, Martin và Synge đã phát triển sắc ký phân bố trên giấy và đưa ra lý thuyết đĩa để giải thích các quá trình sắc ký, các tác giả đã ứng dụng để tách các ancaloit từ các cây thuốc phục vụ cho chế tạo dược phẩm. Do có công trong việc phát triển lý thuyết của phương pháp cho nên năm 1952 hai ông được nhận giải thưởng Nobel về hoá học. Cũng từ năm 1952 những máy sắc ký mới ra đời tỏ ra có ưu thế do có hiệu quả tách rất cao. Cột mao quản và các detectơ sau này được cải tiến tăng độ phân giải và độ nhạy của phương pháp người ta có thể phân tích được các chất có hàm lượng nhỏ cở ppm và ppb. Từ đây phương pháp được phát triển nhanh, ứng dụng được nhiều trong thực tế. Về sắc ký lỏng một kỹ thuật mới được phát hiện từ năm 1970 làm tăng hiệu quả tách đó là sắc ký lỏng hiệu năng cao (high performance lipuid chromatography- HPLC): Chất nhồi cột được cải tiến, máy tính và thiết bị vào bổ trợ được đưa vào, tăng cường khả năng của phương pháp. Ngày nay kỹ thuật ghép nối giữa sắc ký và các phương pháp khác được áp dụng. Đó là kỹ thuật ghép nối giữa sắc ký và khối phổ ( GC-MS, GC-MS) sắc ký và cộng hưởng hạt nhân, sắc ký đa chiều, sắc ký điện mao quản(CEC) Phương pháp có độ chính xác và độ nhạy rất cao, phân tích được nhiều đối tượng phức tạp hơn. II. PHÂN LOẠI – NGUYÊN TẮC: 1) Định nghĩa: Sắc ký là quá trình tách dựa trên sự phân bố liên tục các cấu tử chất phân tích trên hai pha: một pha thường đứng yên có khả năng hấp thụ chất phân tích gọi là pha tĩnh, một pha di chuyển qua pha tĩnh gọi lạ pha động; do các cấu tử chất phân tích có ái lực khác nhau với pha tĩnh, chúng di chuyển với tốc độ khác nhau và tách ra khỏi nhau. 2) Phân loại các phương pháp tách sắc ký 2.1) Phân loại theo hệ pha Phương pháp đầu tiên được nhiều người quan tâm, đây là phương pháp phân loại đơn giản theo hệ pha tức là chất phân tích phân bố giữa hai pha là gì? Sơ đồ phân loại các phương pháp sắc ký 158 2.2) P hân loại theo cơ chế tách: a) sắc ký hấp thụ: Sắc khí hấp thụ là phương pháp dựa trên cơ sở phân bố chất phân tích giữa pha tĩnh và pha động nhờ tương tác phân tử thông qua các trung tâm hấp thụ. Pha tĩnh là các chất rắn hoặc lỏng có diện tích bề mặt lớn, bền vững về mặt hoá học. Chúng hấp thụ chất phân tích trên bề mặt của chúng ở các mức độ khác nhau khi cho pha động chứa chất phân tích tiếp xúa với chúng. Tuỳ thuộc lực liên kết giữa pha tĩnh và từng cấu tử chất phân tích có trong pha động, khi cho pha động đi qua pha tĩnh chúng sẽ di chuyển với tốc độ khác nhau. b) Sắc ký phân bố lỏng - lỏng Sự phân biệt giữa sắc ký phân bố lỏng-lỏng và sự phân bố thông thường là ở chỗ sắc ký phân bố lỏng - lỏng còn được gọi là sắc ký chiết, pha tĩnh là chất lỏng pha động cũng là chất lỏng, sự phân bố chất phân tích giữa hai pha lỏng giống như quá trình chiết, còn sự phân bố nói chung là sự phân chia chất phân tích vào hai pha không cần xét tới lỏng hay rắn. Điểm khác nhau cơ bản giữa sắc ký phân bố lỏng - lỏng và sắc ký hấp phụ là ở chỗ: sắc ký phân bố lỏng- lỏng có đường đẳng nhiệt tuyến tính ở khoảng nhiệt độ lớn, phương pháp có độ nhạy cao nhưng có nhược điểm là pha tĩnh không được bền vững, hiện tương trôi mất pha tĩnh làm cho độ lặp lại bị giảm. c) Sắc ký ion ( trao đổi ion) Pha tĩnh thường là pha rắn có khả năng trao đổi ion của nó với các chất phân tích trong pha động.Chất có khả năng trao đổi cation gọi là cationit, còn chất có khả năng trao đổi anion gọi lá anionit. Lực liên kết chủ yếu giữa chất 159 hệ pha Cơ chế phân tích và pha tĩnh chủ yếu là liên kết tĩnh điện , phụ thuộc nhiều vào điện tích của ion chất phân tích, pH của dung dịch và bán kýnh hidrat hoá của các ion chất phân tích. Ví dụ: phản ứng trao đổi ion giữa cationit acid mạnh và Ca 2+ có thể viết như sau: 2R-SO 3 H + Ca 2+ = (R-SO 3 )Ca + 2H + phản ứng của anionit bazơ mạnh với Cl - : R-N(CH 3 ) 3 OH + Cl - = R-N(CH 3 ) 3 Cl + OH - d) Sắc ký rây phân tử (sắc ký loại cở) Pha tĩnh là các chất rắn có diện tích bề mặt lớn, xốp, có những đường đi trong lòng chất rắn, còn gọi là mao quản có kých thước cở phân tử. Các phân tử chất phân tích có thể thấm vào chất đó ở mức độ khác nhau tuỳ theo kých thước của chúng. Các chất phân tích có kých thước lớn không thể đi vào sâu vào pha tĩnh được, sẽ bị rửa giải nhanh còn các phân tử chất phân tích có kých thước nhỏ phân bố sâu vào pha tĩnh sẽ bị rửa giải chậm. Thứ tự rửa giải là các chất có kich thước nhỏ đi ra sau và ngược lại. Thời gian lưu của các chất tỷ lệ nghịch với kých thước phân tử của chúng. Tuy nhiên chất phân tích có thể có tương tác khác với pha tĩnh. Như vậy một phép sắc ký có thể tách theo một hay nhiều cơ chế khác nhau mà chúng ta không xét ở đây. 2.3) P hân loại theo cách hình thành sắc đồ a) P hân tích tiền lưu Các cấu tử A, B, C có ái lực với pha tĩnh là A < B< C. Cho hỗn hợp chất phân tích liên tục đi qua cột, chất phân tích có ái lực với pha tĩnh thấp nhất đi trước, tiếp theo là chất có ái lực yếu hơn. Tuy nhiên do chúng ta cho liên tục chất phân tích vào nên đi sau A là A + B và A+B+C. Chỉ có một phần chất tinh khiết A đi trước A Sắc đồ phân tích tiền lưu b) P hân tích thế đẩy Trong sắc ký này, chúng ta cũng nạp lượng nhỏ hỗn hợp chất phân tích A, B, C vào cột sau đó cho chất D là chất đẩy liên tục đi qua cột. Ái lực hấp thụ là A<B<C<D. Do D đẩy C, C lại đẩy B,B lại đẩy A nên sắc đồ có dạng như sau: 160 C A B B A nồng độ t. V nồng độ D t,V Sắc đồ phân tích thế đẩy c) Phân tích rửa giải: Đưa một lượng nhỏ mẫu bao gồm các chất A, B, C vào cột sau đó dùng chất E có ái lực hấp thụ với pha tĩnh yếu nhất để rửa giải liên tục. Cả A, B, C, E đều tan tốt trong pha động . Thứ tự ái lực hấp thụ là E<A<B<C. Một câu hỏi đặt ra làm sao E có ái lực hấp thụ yếu nhất với pha tĩnh lại có thể rửa giải A, B, C ? Để trả lời câu hỏi này chúng ta hình dung là sự tranh chấp những trung tâm hoạt đông ở pha tĩnh không phải chỉ có một cấu tử chất phân tích tương tác với cấu tử chất rửa giải mà ở đây có thể có nhiều cấu tử rửa giải tham gia (câu tử có thể là ion hoặc phân tử). Giả sử có chất tan C(phân tử hoặc ion) đã hấp thụ vào pha tĩnh, để phân bố C trở lại pha động phải cần tới nhiều cấu tử rửa giải E. Quy luật ưu thế số đông xem ra có tác dụng. Vì vậy khi rửa giải người ta thường chất rửa giải có nồng độ lớn hơn chất phân tích rất nhiều. chiều cao(h) diện tích(S) thời gian(t) Sắc đồ phân tích rửa giải Tóm lại một phép sắc ký nhìn theo cách phân loại nào cũng có thể liên quan đến một hay nhiều cách phân loại khác, thí dụ ở sắc ký lỏng- rắn chỉ đơn giản là pha tĩnh là chất rắn, pha động là chất lỏng theo cách phân loại theo liên kết pha nhưng theo cách phân loại theo cơ chế thì lỏng rắn ở đây có thể là hấp phụ,trao đổi ion. Tuỳ theo pha tĩnh sử dụng, sắc ký lớp mỏng có thể là sắc ký trao đổi ion, hấp phụ, phân bố, rây phân tử. Ngược lại sắc ký hấp phụ xét về mặt tương tác pha có thể thuộc loại sắc ký - rắn hay lỏng- rắn. Sắc ký rửa giải có ứng dụng nhiều trong lĩnh vực phân tích do hiệu quả tách cao 3) Các lực liên kết trong hệ sắc ký Trong hệ sắc ký có ba thành phân chủ yếu tác quyết định sự tồn tại của hệ, chất phân tích, pha tĩnh, pha động tạo nên sự phân bố cần thiết, giúp cho sự di chuyển các chất phân tích dọc theo chiều dài cột với tốc độ khác nhau. Chúng ta thường nói chất phân tích phân bố giữa hai pha, tuy nhiên đây la cân bằng động chất phân tích luôn thay đổi pha liên kết (trừ một số trường hợp đặc 161 A B C biệt nó chỉ ở một pha trong suôt quá trình phân tích) vấn đề là tại sao chất phân tích được giữ trong pha tĩnh? Hơn nữa ba thành phần này tương tác như thế nào với nhau, bằng các lực liên kết nào mà kết quả các chất phân tích lại phân bố vào pha tĩnh ở mức độ khác nhau? Câu trả là do bản chất các của các thành phân trong hệ sắc ký. Chất phân tích có thể là ion, phân tử trung hoá hay chất phân cực, đối tượng liên kết của nó cũng có thể là ion, phân tử, chất phân cực. Như vậy tuy thuộc vào độ lớn của điện tích kich thước phân tử, độ phân cực mà chúng tương tác với nhau theo các lực liên kết khác nhau.Người ta chia các lực liên kết thành bốn loại: 3.1) Lực liên kết ion Trên bề mặt pha tĩnh có các trung tâm hoạt động là ion. Đó là các phần tử có khả năng phân ly tạo thành các ion, tạo nên trung tâm hoạt động ion chung tham gia liên kết với các ion chất phân tích trong dung dịch theo lực tương tác tĩnh điện gọi là liên kết ion. Để giữ các anion chất phân tích trong dung dịch pha tĩnh cần có các trung tâm cation trên bề mặt, và ngược lại để giữ các cation chất phân tích trong dung dịch pha tĩnh cần có các ctrung tâm anion cũng tương tự, pha động cũng có các trung tâm hoạt động là các ion, chúng tham gia tương tác với chất phân tích và pha tỉnh. Chúng có khả năng phân li trong dung dịch tạo thành các cation và anion. Thí dụ khi rửa giải các ion kim loại trên cột cationit, ta có thể dùng pha động là dung dịch HCl loãng. Các phương pháp sắc ký thường gặp có sự tham gia của các liên kết ion gọi là sắc ký ion, sắc ký cặp ion. 3.2) Lực phân cực Trong phân tử chất phân tích, chất rửa giải trong pha động cũng như các phân tử trên bề mặt pha tĩnh có các trung tâm phân cực, chúng có thể là các lưỡng cực điện cố định, cũng có thể là các lưỡng cực điện do cảm ứng. Các trung tâm phân cực của chất này liên kết với trung tâm phân cực của chất khác bằng lực liên kết phân cực. Sự phân cực trong các phân tử đôi khi rất nhỏ và sự chênh lệch về độ phân cực cũng rất nhỏ. Tuy nhiên, sự chênh lệch này là yếu tố quan trọng để có độ bền liên kết khác nhau, đó là điều cần thiết để phân chia chúng trong các phép tách sắc ký. Thí dụ: các Cresol (o-, m-,p- cresol) chỉ khác nhau về vị trí nhóm CH 3 - trong phân tử. Chính sự khác nhau về vị trí này làm cho mật độ electron trong phân tử cresol khác nhau tạo nên một sự khác biệt nhỏ về độ phân cực, từ đó lực liên kết với pha tĩnh khác nhau. Là nguyên nhân chênh lệch thời gian lưu trong quá trình sắc ký 3.3) Lực Van- de- Van (lực phân tán) Lực này có bản chất điện, tuy nhiên không hề có cực điện trong mạng lưới phân tử, cũng không liên quan tới phân tử lưỡng cực hay cố định. Tương tác phân tán điển hình là mạch hidrocacbon nó là tương tác phân tử . Thí dụ n-heptan là chất lỏng chứ không phải là chất khí sự tương tác giữa các phân tử n-heptan là lực phân tán đủ lớn để giữ chất này ở trạng thái lỏng. Để tách các hidrocacbon người ta dùng hidrocacbon khác làm pha tĩnh. 3.4) Lực tương tác đặc biệt 162 Lực tương tác đặc biệt là lực tương tác tạo thành do các liên kết hydro, liên kết cho nhận mà có.Sự hình thành liên kết giữ nguyên tử hidro và các nguyên tử có độ âm điện cao như O, N, F gọi là liên kết hidro. Khi tham gia liên kết, các electron còn gọi là đám mây electron chuyển dịch sang nguyên tử có độ âm điện lớn hơn. Như vậy các nguyên tử có độ âm điện cao hơn, liên kết hidro càng bền chặt. 4)Sự tương tác giữa ba thành phần trong hệ sắc ký, tối ưu hoá hệ sắc ký Khi nạp chất phân tích vào hệ sắc ký, nó được phân bố giữa hai pha, pha tĩnh và pha động, tuỳ theo lực liên kết giữ từng pha với chất phân tích mà chúng có thời gian ở pha nào nhiều hơn. Như vậy thực chất là ba thành phần trong hệ sắc ký tương tác với nhau, pha tĩnh, pha động, và chất phân tích. Ta xét từng thành phần và quan hệ của chúng. Pha tĩnh phài lưu giữ được chất phân tích, tuy nhiên để tách được các chất, nó không được giữ quá chặt chất phân tích để có điều kiện phân bố vào pha động và sau đó, ở một thời điểm khác, nó lại bị hấp thụ vào pha tĩnh. Các chất phân tích có tính chất càng giồng nhau sự phân bố càng phải lặp đi lặp lại nhiều lần, ở đây ta muốn nói đến số lần phân bố đạt cân bằng hay số đĩa lí thuyết phải đủ lớn để tách có hiệu quả, do đó các vấn đề vật liệu làm pha tĩnh, chiều dài cột tách và cách nạp cột cũng cần được quan tâm. Ngày nay ta có thể sử dụng những cột có sẵn trên thị trường nhưng đôi khi, cùng một loại pha tĩnh, các hãng khác nhau có thể tạo được các sản phẩm với tính chất khác nhau. Vấn đề tiếp theo là pha động và cách vận hành tức là tóc độ pha động, nhiệt độ, lượng mẫu đưa vào cột, tái sinh cột Pha động phải hoà tan dược chất phân tích, tuy nhiên thành phần pha động phải phù hợp sao cho chất phân tích không bị giữ quá lâu ở pha động để nó có thể liên kết trở lại với pha tĩnh. Sự tương tác giữa pha động và pha tĩnh cũng là vấn đề cần bàn. Pha động không được làm ảnh hưởng tới pha tĩnh, không làm thay đổi tính chất hoá lý của pha tĩnh. Pha động không được liên kết với pha tĩnh một cách quá bền vững để tạo điều kiện cho các chất phân tích có thể phân bố vào pha tĩnh được. Ngoài ra tốc độ pha động, nhiệt độ hệ trong đó có nhiệt độ của từng bộ phận riêng, đặc biệt là trong sắc ký khí phải được quan tâm khống chế một cách chặt chẽ. Để làm sáng tỏ vấn đề trên ta lấy một ví dụ tách các ion kim loại M + bằng phương pháp sắc ký trao đổi ion. Pha tĩnh là cationit axit mạnh, nhóm trao đổi là R-SO 3 H: Pha động là dung dịch đệm có chất rửa giải là H + . Sự tương tác của ba đại lượng trên được miêu tả bằng hình sau: 163 Sự tương tác của 3 đại lượng chủ yếu trong hệ sắc ký Pha tĩnh (RSO 3 ) có khả năng hấp thụ chất phân tích theo phản ứng sau: R-SO - 3 +M + R-SO 3 M * Mặt khác chất rửa giải trong pha động cũng tương tác với pha tĩnh theo phản ứng R-SO 3 - + H + R-SO 3 H ** Ion kim loại M + cần liên kết với pha tĩnh ở một mức độ không quá bền vững, phản ứng hấp thụ ở đây là phản ứng thuận nghịch. Cân bằng phân bố là cân bằng động và hợp chất R-SO 3 M có liên kết bền vững sao cho M + dễ dàng đi vào pha động. Đến lượt H + , không được liên kết bền vững với R-SO 3 - , nói một cách khác là nồng độ H + không quá cao sao cho phản ứng ** xảy ra thuận nghịch. Mặt khác tương tác giữa M + và H + là tương tác phủ định nhau, cạnh ranh nhau. Chính H + là yếu tố cạnh tranh để cho phản ứng ** xảy ra. Như vậy vai trò của nồng độ chất rửa giải,(H + ) ở đây rất quan trọng nó có giá trị phù hợp sao cho hiệu quả tách tốt nhất. Phương pháp đưa thêm chất tạo phức vào pha động cũng thường được áp dụng trong sắc ký trao đổi ion. III. MỘT SỐ ĐẠI LƯỢNG DÙNG TRONG SẮC KÝ 1) Hệ số phân bố K D và cách xác định Cấu tử A phân bố giửa pha động và tĩnh khi cân bằng được thiết lập A s A m (1) hệ số phân bố được định nghĩa là tỉ số của nồng chất phân tích giữa hai pha [ ] [ ] m K s A D A = (2) Trong đó : [A m ] là nồng độ chất phân tích trong pha động [A s ] là nồng độ chất phân tích trong pha tĩnh Cân bằng phân bố trong pha khí gọi là cân bằng động đó là cân bằng giữa lỏng - lỏng, khí-lỏng, rắn-lỏng. Giả sử chất phân tích được phân bố ở phần nào đó của cột, đĩa thứ n. Nhưng do pha động di chuyển, chất phân tích lại đi xuống đĩa thứ (n+1) và ở đây lại thiết lập cân bằng mới của cả đĩa thứ n và n+1. Để cân bằng thiết lập nhanh một yêu cầu rất cần thiết là lớp pha tĩnh phải mỏng, hệ số khuếch tán của chất phân tích trong pha tĩnh lớn hơn hệ số khuếch tán trong pha động. Hệ số phân bố K D có thể được xác định theo phương pháp tính bằng cách đo nồng độ chất phân tích trong pha động và chất phân tích M + Pha động H + Pha tĩnh R-SO 3 - 164 nồng độ chất phân tích trong pha tĩnh sau khi đã đạt cân bằng. Một cách gần đúng K D được xác định theo công thức sau: ( ) 1 1 . . D M M V K M m − = (3) Trong đó: M là lượng chất ban đầu tính bằng mg M 1 là lượng chất phân tích còn lại sau khi tiếp xúc mg V là thể tích pha động ml M là lượng chât hấp thụ, gam 2) Sự liên hệ giữa tốc độ di chuyển của chất phân tích và K D Chất phân tích A muốn di chuyển được phải ở pha động. Gọi f A là phần thời gian A ở pha động: [ ] [ ] [ ] [ ] . . . m m A m m s s A V f A V A V = + (4) chia cả tử và mẩu cho [A] m . V m ta có: 1 1 A S D m f V K V = + (5) Hay (6) Trong đó k A là hệ số dung tích.Tốc độ tuyến tính của cấu tử A trong pha động là: u A = u.f A = u / (1+f A ) (7) U là tốc độ tuyến tính của pha động (cm/s). Từ biểu thức (6) và (7) ta có nhận xét: Khi D K hoặc f A càng lớn ; thời gian chất phân tích trong pha động càng ít, nói cách khác là chất phân tích di chuyển càng chậm, ngược lại khi f A càng nhỏ, chất phân tích di chuyển càng nhanh. 3) Thời gian lưu t R , thời gian lưu hiệu chỉnh t R ’ Thời gian lưu t R là thời gian lúc bắt đầu bơm mẫu vào đầu cột tới khi pic đạt giá trị cực đại. (8) L/u là thời gian mà cấu tử không lưu giữ trên cột còn gọi là thời gian chết (9) thời gian lưu hiệu chỉnh t R ’ là thời gian lưu không tính thời gian chết (10) 4) Thể tích lưu V m , thể tích lưu hiệu chỉnh Thể tích lưu V R là thể tích của dung dịch rửa giải từ khi bắt đầu bơm mẫu vào cột cho đến khi pic đạt cực đại. Gọi F là tốc độ chảy của pha động ml/phút,thể tích lưu V R được tính theo công thức:V RA = t RA F; V m = t m F V RA = V m (1 + k’) (11) Thể tích lưu hiệu chỉnh V R ’ là thể tích lưu đã loại đi thể tích trống của cột V R ’ = V R – V m = V m k A ’ = K DA V S Thể tích lưu riêng V g là thể tích riêng cho cấu tử, là thể tích dung dịch rửa giải để rửa chất phân tích trong một đơn vị trọng lượng hay thể tích của pha tĩnh 165 A A f f + = 1 1 u kL u L t A A R )1( + == )1(.1 Am m s DmR kt V V Ktt A +=         += m R m R mmR V V t t kktttt A '" '' R A ===>=−= gDA S RA VK V V == (12) 5) Hệ số tách α (còn gọi là hệ số lưu giữ tương đối) Hệ số tách α là đại lượng đánh giá khả năng tách hai chất bằng phương pháp sắc ký. Nó phụ thuộc vào hệ số phân bố của chúng và tỷ số của hệ số phân bố của hai chất: một chất phân tích A và một chất khác B hoặc một chất chuẩn. Điều kiện để hai chất tách khỏi nhau là α ≠ 1 ' DB§ B A DA k k K K == α ≠ 1 (13) Nói một cách khác hệ số phân bố của hai chất A và B giữa pha tĩnh và pha động phải khác nhau. Mặt khác tỷ số thể tích lưu của hai chất, t’ RA / t’ RB cũng chính là tỷ số của hệ số phân bố. Vậy có thể tóm tắt là: ' ' ' ' ' DB§ RB RA RB RA B A DA V V t t k k K K ==== α (14) 6) sắc đồ. Sắc đồ là sự biểu diễn sự phụ thuộc diện tích (S) hoặc chiều cao (h) tín hiệu đo được có thể là độ hấp thụ quang,cũng có thể là độ dẫn điện hoặc là tần số xung điện liên quan chặt chẽ tới nồng độ chất phân tích có trong mẫu và thời gian. Các tín hiệu này được gọi là “ pic” sắc ký.Để tính toán hàm lượng chất phân tích, tính diện tích pic sắc ký là chính xác nhất.Ngày nay hầu hết các máy hiện đại đều được trang bị các thiết bị tÍnh diện tích của pic sắc ký một cách tự động Sắc đồ hai cấu tử A&B 7) Đĩa lý thuyết a) Khái niệm đĩa lý thuyết: Đĩa lý thuyết là phần nào đó của cột mà ở đó cân bằng được thiết lập. Theo quan niệm của Martin và Synge, cân bằng được thiết lập nhanh chóng, tức thời. Tuy nhiên điều này gặp khó khăn khi giải thích hiện tượng giãn rộng vùng mẫu, hiện tương pic sắc ký không cân đối. Amundson và Lapidus và sau đó là Van Deemter cho rằng đĩa được cân bằng khi đạt cân bằng chuyển khối lượng chất tan từ pha động vào pha tĩnh và ngược lại và tác giả đã đưa ra thuyết tốc độ. 166 RBRB Vt . '' , RBRB Vt RARA Vt , '' RA¶ , RA Vt hS, A W¦ B W Vt, m t 0 t Xác định số đĩa lý thuyết thực nghiệm Như vậy có thể nói rằng phần nhỏ của cột gọi là đĩa lý thuyết khi đạt được cân bằng phân bố chất phân tích. Gọi n là số đĩa lý thuyết, σ là độ lệch chuẩn; σ ~ n . Đối với cột sắc ký n càng lớn pic càng hẹp, thời gian lưu tỷ lệ với số đĩa lý thuyết n, t R ~ n, nên ta có thể vết: n nt R = σ hay 2       = σ R t n mặt khác w = 4 σ hay 4 W = σ số đĩa lý thuyết có thể viết lại là: (14) b) Đĩa lý thuyết có tính thời gian không lưu giữ, n ef (15) Vì từ (8) ta có t m = t R /(1+k ’ ). Chiều cao đĩa lý thuyết hiệu lực được tính: (16) từ (15) và (16) ta có: (17) 8) Độ phân giải và cách làm tăng độ phân giải: a) Độ phân giải Độ phân giải nói lên mức độ tách cấu tủ khỏi nhau trong một phép tách sắc ký. Hai cấu tử A và B được tách khỏi nhau càng triệt để, độ phân giải càng cao. Độ phân giải được đánh giá qua các đại lượng đặc trưng là: thời gian lưu, t RA , t RB và rộng pic W A , W B . Độ phân giải R được tính theo công thức: (18) 167 ( ) ( ) 2 2 2 ' 2 ' ef 2 2 2 16 16 16 R m R m t t n t t k w W W − = = = ( ) ( ) 2 2 2 ef 2 2 2 16 . 1 1 R t k k n n w k k = = + + f f n L H = ( ) ( ) 2 2 ' 2 ef 2 ' 1 16 R m k L w H H k t t + = = − ( ) B W 2 + − = A RARB W tt R [...]... 5065, 7 ; H ef = 5965, 7 = 0, 053 Bài 2: Trên sắc ký đồ người ta thu được 3 pic ở 0,84 phút và 10,60 phút và 11,08 phút tương ứng với các hợp chất A,B và C Hợp chất A không lưu giữ bởi pha tĩnh lỏng Các pic của các hợp chất B và C có dạng đường Gauss có chiều rộng tương ứng 0,56 và 0,59 phút Độ cao sắc ký bằng 28,3cm 1 Tính số đĩa lý thuyết (n) của cột sắc ký và chiều cao đĩa lý thuyết (H) của pic B,C... H1+H2+H3 (19) H1 là đại lượng khuếch tán xoáy, đặc trưng cho sự đồng đều của cột nhồi, đường kýnh của hạt nhồi, khả năng nạp cột H1 = 2λdp (20) Trong đó λ là hệ số nạp cột, nếu nạp cột tốt thì λ= 1,5; dp là kýnh hạt nhồi H2 là đại lượng khuếch tán theo chiều dọc Nó được hình thành do sự khuếch tán của chất phân tích về hai đầu của cột, phụ thuộc vào tốc độ của pha động, hệ số khuếch tán của chất phất phân... yếu tố: đường kýnh hạt nhồi, kỷ thuật nạp cột và các yếu tố tốc độ của pha động, hệ số khuếch tán của chất phân tích trong pha động và pha tĩnh ảnh hưởng rất nhiều tới sự giản rộng vùng chất phân tích hay độ rộng của pic trong sắc đồ Đại lượng đặc trưng cho độ giản rộng của vùng chất phân tích là chiều cao đĩa lý thuyết H, được hình thành do ba thành phần H1,H2, H3 H = H1+H2+H3 (19) H1 là đại lượng khuếch... − ) = 0,4 4 1,011 với α là yếu tố phân chia Bài 4: Một hệ thống sắc ký lỏng hoạt động với các thông số sau đây: - Chiều dài của phần cột được nhồi pha tĩnh: 25,2 cm - Tốc độ dòng: 0,312 ml/phút - Thể tích pha động (Vm): 1,40 ml - Thể tích pha tĩnh (Vs): 0,168 ml Sau khi cho qua cột một hỗn hợp chứa 4 cấu tử A,B,C và D thu được một sắc ký đồ cung cấp các dữ kiện sau: Cấu tử Thời gian lưu giữ,phút Chiều... Hmin = 2(B.C)1/2 = 0,02 cm Số đĩa lý thuyết ở vận tốc tối ưu là: n= 3000 = 150000 0, 02 Bài 8 Một cột dài 360 cm dùng để tách propan và butan bằng phương pháp sắc ký khí Dùng thước người ta đo được khoảng cách từ lúc bơm mẫu đến đỉnh của pic sắc ký lần lượt là 152,5 mm và 415,5 mm,bề rộng chân các pic lần lượt là 13,5 mm và 33,8 mm Tính số đĩa lý thuyết và chiều cao đĩa lý thuyết ứng với mỗi chất Giải... Chiều cao đĩa lý thuyết H = L ta được n H(propan) = 0,176 cm H(butan) = 0,149 cm 174 Bài 9 Một hỗn hợp chứa metyl xiclohexan,metyl xiclohexen và toluen được tách bằng phương pháp sắc ký lỏng – khí trên cột nhồi dài 42 cm Sắc ký đồ cung cấp thời gian lưu của chúng lần lượt là 10,1 ; 11,0 ; 13,5 và chiều rộng pic lần lượt là 0,75 ; 0,80 ; 1,05 phút Hãy tính: 1 Số đĩa lý thuyết đối với mỗi pic, giá trị... B,C: Vm (1 − RB ) 17, 6(1 − 0, 079) = = 16, 68 RB VS 0, 079.12,3 Vm V (1 − RC ) 17, 6(1 − 0, 076) RC = ⇒ kC = m = = 17, 40 Vm + kC VS RC VS 0, 076.12,3 V m Ta có: RB = V + k V ⇒ k B = m B S Bài 3 Pic sắc ký của hợp chất X được phát hiện sau 15 phút sau khi đưa mẫu vào (lúc đó của hợp chất Y không được giữ bởi vật liệu của cột xuất hiện qua 1,32 phút) Pic của chất X có dạng đường phân bố Gauss với bề... diển bằng phương trình: H2 = B/u trong đó B= 2γDm Là đại lượng đặc trưng cho hệ số khuếch tán của chất phân tích trong pha động và hệ số đường đi của nó Trong điều kiện nạp cột tốt, đường đi của chất phân tích không quá khúc khuỷu, γ = 1; Dm là hệ số khuếch tán của chất phân tích trong pha động, như vậy H2 có thể viết lại là: H2 = 2γDm/u (21) H3 là đại lượng đặc trưng cho quá trình chuyển khối lượng... n1,n2 là số đĩa lý thuyết của cột cũ và cột mới,ta có: Rs ,1 Rs ,2 = n1 n2 ⇔ 0,94 1500 = ⇒ n2 = 3800 1,50 n2 Chiều dài cột để độ phân giải tăng lên 1,5: L2 = H.n2 = 0,017 3800 = 65 cm Bài 5: Cho hệ sắc ký có tính chất sau: t R = 280s; t R = 300s; WA = 14s; WB = 15s Cột có chiều dài là 3,2m Thay đổi chiều dài từ 320 cm lên 400 cm Tính độ phân giải? Giải: A t RA = 280 400 = 350( s ) 320 2 B t RB = 300...  R ÷ = 6400 = 8000 320 W 2 Ta có: 16.t 2 t  R n = 16. R  ⇒ W = n W 16.(350) 2 WA = = 15, 65( s) 8000 2 ( 375 − 350 ) R= = 1,54 15, 65 + 16, 77 16.(375) 2 WB = = 16, 77( s) 8000 Bài 6 Trong sắc ký khí tốc độ di chuyển của pha động có thể đo được trực tiếp, nếu đưa vào một lượng nào đó của chất tan tương tự như metan,nó không được giữ bởi pha tĩnh Trong cột mao quản có chiều dài 50m; thời gian . dụng, sắc ký lớp mỏng có thể là sắc ký trao đổi ion, hấp phụ, phân bố, rây phân tử. Ngược lại sắc ký hấp phụ xét về mặt tương tác pha có thể thuộc loại sắc ký - rắn hay lỏng- rắn. Sắc ký rửa. thuật ghép nối giữa sắc ký và các phương pháp khác được áp dụng. Đó là kỹ thuật ghép nối giữa sắc ký và khối phổ ( GC-MS, GC-MS) sắc ký và cộng hưởng hạt nhân, sắc ký đa chiều, sắc ký điện mao quản(CEC). Chương VII ĐẠI CƯƠNG VỀ SẮC KÝ Phần I: CƠ SỞ LÝ THUYẾT I. VÀI NÉT LỊCH SỬ: Phương pháp sắc ký được phát triển vào năm 1903 do nhà thực vật hoc người