Công Nghệ Vi Sinh Trong Nông Nghiệp Và Môi Trường - PGS TS.Nguyễn Xuân Thành phần 2 pot

+ Gen điều khiển (Operator): Là đoạn DNA nằm kề bên nhóm gen cấu trúc, ký hiệu O Nhờ tác dụng gắn với chất ức chế, operator làm việc nh công tắc phụ trách việc đóng mở hoạt ®éng cđa nhãm gen cÊu tróc + Gen khëi ®éng (Promoter): Là DNA nằm kề phía trớc operator nơi gắn enzyme RNA polymerase, enzyme xúc tác cho trình tổng hợp RNA thông tin nhóm gen cấu trúc Khi chất ức chế gắn vào operator phân tử RNA polymerase bị cản trở, không di chuyển dọc theo mạch khuôn DNA, dẫn đến gen cấu trúc bị kìm chế không tạo đợc protein nh enzyme tơng ứng Do vị trí chức nh nên đợc gọi gen Promoter (gen khởi động) + Gen điều hòa (Regulator): Gen chịu trách nhiệm mà hóa việc tổng hợp nên protein đặc biệt đóng vai trò chất ức chế Thờng đợc tổng hợp với lợng không đáng kể tế bào (khoảng 10 - 20 phân tử/tế bào) Đặc điểm cđa chÊt øc chÕ lµ mét protein biÕn cÊu oligomer có hai tâm đặc thù Hai tâm làm cho chất ức chế có khả gắn với chất cảm ứng gắn với operator Nếu chất ức chế có lực lớn với operator, thờng gắn vào operator * Có thể khái quát hóa điều kiện cảm ứng nh sau: - Trên nhiễm sắc thể tế bào phải có gen tơng ứng với enzyme đợc hình thành - Các nguyên liệu xây dựng phân tử enzyme: amino acid hợp phần nhóm ngoại - Năng lợng cần thiết cho việc hình thành liên kết - Chất cảm ứng Theo F Jocob Monod, dù có ba điều kiện mà chất cảm ứng enzyme cảm ứng không đợc tạo thành Nh để hình thành enzyme cảm ứng phải hội tụ đủ bốn điều kiện: gen, nguyên liệu xây dựng, lợng chất cảm ứng Điều hòa tổng hợp enzyme nhờ kiềm chế sản phẩm cuối phân giải kiềm chế Nếu ký hiệu X sản phẩm cuối chuỗi sinh tổng hợp, thấy X có tác dụng đặc hiệu với chất ức chế (chất gen điều hòa tổng hợp nên) Khi môi trờng có tợng d thừa X so với nhu cầu tế bào, X gắn với chất ức chế, làm thay đổi cấu hình không gian chất ức chế, làm cho chất ức chế có khả gắn với operator (còn gọi ho¹t hãa chÊt øc chÕ) Do vËy gäi chÊt X chất đồng kìm hÃm Khi chất ức chế gắn với operator làm ngừng trệ trình phiên mÃ, ức chế operon, dẫn đến enzyme không tổng hợp đợc, việc sản xuất X bị gián đoạn Trong tế bào tiếp tục sử dụng chất X, khiến cho chất bị giảm tới mức không đủ để đáp ứng nhu cầu tế bào Lúc xảy trình giải phóng kiềm chế operon nói trên, thiếu chất X, chất ức chế lúc thiếu yếu tố hoạt động hóa học, khả gắn với operator, điều dẫn đến giải phóng operon, dẫn tới enzyme đợc tổng hợp việc sản xuất X đợc tiến hành trở lại Đó tợng giải kiềm chế Điều hòa tổng hợp enzyme nhờ kiềm chế dị hóa Trong nuôi cấy vi sinh vật có nhiều nguồn chất, trớc hết xảy việc tổng hợp enzyme xúc tác cho phân giải chất dễ sử dụng Sự tổng hợp enzyme xúc tác phân huỷ chất khác bị ức chế kiềm chế dị hóa VÝ dơ: Trong m«i tr−êng nu«i cÊy cã hai ngn carbohydrate là: glucose lactose Trớc tiên vi sinh vật hình thành enzyme phân giải glucose Sự cảm ứng để tổng hợp enzyme phân giải lactose - galactosidase bị ức chế kiềm chế dị hóa Cơ chế kiềm chế dị hóa đà đợc nghiên cứu chi tiÕt ë vi khn E coli víi viƯc ®iỊu hòa tổng hợp enzyme - galactosidase Nếu trờng hợp carbohydrate, glucose nguồn chất đợc sử dụng thích hợp nhất, có mặt glucose nhiều enzyme khác trình dị hóa nh trao đổi chất trung gian không đợc tổng hợp Ngời ta gọi tợng hiệu ứng glucose + Khi m«i tr−êng kh«ng cã glucose, cã lactose: M«i tr−êng kh«ng có glucose, dẫn đến tích luỹ lợng lớn AMPv (adenosine monophosphate vòng) Lúc AMPv phản ứng víi mét protein nhËn ký hiƯu lµ CAP - (catabolite activato rprotein) Ngời ta gọi tợng vùng Promoter bị chất đầy Chính chất đầy tiền đề cho hoạt động enzyme RNA polymerase, có nghĩa thúc đẩy đợc hoạt hóa nhờ chất đầy Đồng thời môi trờng có mặt lactose, lactose đóng vai trò chất cảm ứng, phản ứng với chất ức chế, làm thay đổi cấu hình không gian chất ức chế để tạo phức hệ ức chế - chất cảm ứng Điều khiến cho chất ức chế không gắn đợc với operator Nh Lac-operon đợc giải phóng + Khi môi trờng có glucose, có lactose: Trong môi trờng lactose đợc bổ sung glucose, lúc hàm lợng AMPv bị giảm đi, hậu CAP không tạo đợc phức hệ với AMPv, chất đầy Promoter Liên đới RNA polymerase không đợc mở đầu hoạt động đợc mở yếu Vì có mặt chất cảm ứng (lactose) tổng hợp RNA thông tin- có nghĩa tạo thành enzyme + Khi môi trờng glucose lactose: Nếu môi trờng hai glucose lactose, chất ức chế gắn vào operator nên operon bị phong tỏa Do RNA thông tin không đợc tổng hợp Không có tổng hợp protein- enzyme IV Những sai hỏng di truyền điều hòa trao đổi chất tợng siêu tổng hợp Những chế điều hòa nói đà giúp cho thể vi sinh vật đảm bảo đợc hoạt động sống tiến hành cách nhịp nhàng sở tiết kiệm nguyên liệu, lợng cách hợp lý Tuy nhiên, vi sinh vật có hoạt động sống bình thờng lý để quan tâm đặc biệt đến chúng Trong hoạt động sống vi sinh vật chúng tiết sản phẩm đó, mà sản phẩm lại cần thiết cho ngời So với nhu cầu cho hoạt động sống vi sinh vật, sản phẩm chúng tổng hợp đợc chắn d thừa lợng lớn Ngời ta nói: Những thể vi sinh vật có khả siêu tổng hợp chất Với phát triển khoa học, ngời đà tạo đợc nhiều chủng giống vi sinh vật có khả siêu tổng hợp chất Đây kết trình chọn lọc nhân tạo với phơng pháp gây đột biến Những chủng đột biến có sai hỏng di truyền đáng đợc quan tâm 1 Các chủng đột biến chế điều hòa hoạt tính enzyme sản phẩm cuối Lợi dụng chế điều hòa hoạt tính enzyme sản phẩm cuối cùng, ngời ta dùng đột biến làm hỏng trung tâm dị lập thể enzyme (a), làm cho khả gắn với chất X nhng thân enzyme (a) hoạt tính xúc tác chất A (xem sơ đồ chuỗi phản ứng sinh hoá trang 14) Do có mặt chất X sản phÈm ci cïng víi sè l−ỵng d− thõa so víi nhu cÇu cđa vi sinh vËt, enzyme (a) vÉn xóc tác chuyển A thành B, dẫn đến chất X - đợc tiếp tục tổng hợp Các chủng đột biến có sai hỏng chế điều hòa tổng hợp enzyme Ngời ta dùng chất gây đột biến để làm sai hỏng chế điều hòa tổng hợp enzyme Cụ thể đụng chạm đến gen điều hòa (Regulator) - gen chi phối tạo nên chất ức chế, dẫn đến sai hỏng chất ức chế chí phá huỷ trình tổng hợp chất ức chế Hay có đột biến đụng chạm ®Õn gen ®iỊu khiĨn (Operator) lµm cho gen nµy mÊt khả gắn với chất ức chế Kết tác động chất ®ã cã nång ®é d− thõa so víi nhu cÇu vi sinh vật, enzyme cần thiết cho tổng hợp chúng đợc hình thành chất đợc tiếp tục tổng hợp tế bào V ý nghĩa kỹ thuật di truyền Để tìm đợc chủng vi sinh vật theo mong muốn, ngời đà tìm cách tác động vào quy luật điều khiển trình trao đổi chất vi sinh vật Việc tạo nên chủng đột biến dựa sở hiểu biết quy luật di truyền biến dị vi sinh vật, dựa kinh nhiệm công tác lai tạo giống Những thành công công nghệ vi sinh cho phép chủ động tạo đợc DNA tái tổ hợp điều kiện in vitro Càng hiểu thêm sinh học phân tử, di truyền học công nghƯ gen Cã thĨ nãi r»ng ngµy ng−êi đà chuyển đoạn gen từ sinh vật sang sinh vật khác có khác biệt lớn di truyền, hay nói cách khác cất bỏ hàng rào loài tạo hóa gây dựng nên để cản trở giao phối khác loài, nhằm bảo tồn tính đặc trng loài Tuy nhiên bớc đầu công nghệ gen VI Những hiểu biết chuyển tải gen Đây vấn đề phức tạp, tìm hiểu khái quát hai vấn đề sau: + Những cấu trúc tham gia chuyển tải gen + Quá trình hóa chuyển tải gen nhờ vi sinh vật Những cấu trúc tham gia chuyển tải gen gọi thể mang (vector) Các vector chuyển hóa gen phải thoả mÃn yêu cầu tối thiểu sau: - Là đoạn phân tử DNA có khả tự chép tích cực tế bào chủ, tồn độc lập tế bào không phụ thuộc chÐp cđa bé gen tÕ bµo chđ - Cã kÝch thớc nhỏ Càng nhỏ tốt, vector có kích thớc nhỏ dễ xâm nhập vào tế bào vi khuẩn khác đợc chép nhanh, có hiệu - Có trình tự nhận biết enzyme giới hạn (RE) - Có khả chứa mẫu DNA ngoại lai - Có gen đánh dấu, tức có khả biểu bên để dễ nhận biết Gen đánh dấu đợc gọi Marker, ngời nghiên cứu nhận biết dễ dàng tách tế bào có chứa gen cần chuyển tải khái qn thĨ vi khn VÝ dơ: Ng−êi ta th−êng dùng gen chi phối tính trạng đề kháng với chất kháng sinh làm gen đánh dấu Trong môi trờng có chứa kháng sinh, vi khuẩn có mang gen kh¸ng kh¸ng sinh míi sèng sãt Trong sè c¸c cấu trúc đợc sử dụng tham gia chuyển tải gen kể đến plasmid, phage, cosmid, YAC , mà phỉ biÕn nhÊt lµ plasmid vµ phage + Plasmid: ë tÕ bµo Prokaryote, thĨ lµ vi khn, qua kÝnh hiển vi điện tử quan sát đợc chất nhân phân tử DNA nguyên vẹn có dạng vòng tròn hình nhẫn Đó nhiễm sắc thể - nơi chứa nguyên liệu di truyền tế bào Cùng với nhiễm sắc thể có cấu trúc hình nhẫn nhỏ ngời ta gọi plasmid Đem tách plasmid dới dạng tinh khiết để tìm hiểu cấu trúc tính chất nó, thấy plasmid có cấu tạo từ DNA có khả tự nhân đôi cách độc lập tồn cách độc lập với bé gen cđa vi khn V× vËy ng−êi ta coi plasmid phần tử di truyền nằm máy di trun cđa vi khn ë nhãm Eukaryote, ng−êi ta phát đợc plasmid nấm men Ngời ta thấy plasmid có hàng loạt đặc điểm riêng là: - Plasmid tham gia vào chế tái tổ hợp gen nội bào - Plasmid có khả di chuyển từ vi khuẩn sang vi khuẩn khác - Plasmid có khả vận chuyển gen - Plasmid có khả sinh sản cực nhanh có hoạt tính m¹nh + Bacteriophage (Phage hay thùc khn thĨ): - Phage có kích thớc nhỏ qua đợc màng lọc vi khn - Phage thĨ hiƯn tÝnh ®éc ®èi víi vi khuẩn qua chu trình sinh sản gây độc phage, có khả xâm nhập vào tế bào vi khuẩn, đình trình trao đổi chất vi khuẩn lấy nguyên liệu từ vi khuẩn để xây dựng nên thành phần kể nguyên liệu di truyền Do hình thành đoạn DNA tái tổ hợp, bao gồm đoạn gen phage vµ cđa vi khn Qua thùc nghiƯm cho thÊy, viƯc sử dụng phage làm thể mang có nhiều u điểm so với plasmid, phage có đặc điểm giúp xâm nhập vào tế bào vi khuẩn hiệu nhiều so với chuyển plasmid vào vi khuẩn Hơn phage, kích thớc đoạn DNA nã cã thĨ tiÕp nhËn lín h¬n nhiỊu so víi tiếp nhận plasmid Quá trình hóa chuyển tải gen nhờ vi sinh vật Thuần hóa gen trình bắt gen phải làm việc theo ý muốn ngời Quá trình phức tạp, đòi hỏi có hiểu biết sâu sắc đặc tính gen kỹ thuật phân tử Trong kỹ thuật phân tử, vai trò enzyme quan trọng Enzyme gồm nhiều loại: nuclease, ligase, polymerase (DNA polymerase RNA polymerase) 2.1 Các enzyme phân cắt DNA (RNA) đợc gọi nuclease Các nuclease gồm hai nhóm: endonuclease exonuclease - Endonuclease enzyme cắt DNA phân tử, exonuclease cắt từ hai đầu mút phân tử DNA Trong nhóm endonuclease có enzyme giới hạn (RE - restriction enzyme), enzyme đợc nhà khoa học đặc biệt quan tâm có đặc tính quý, có tính đặc hiệu cao, cắt DNA mạch kép chỗ định không linh động Những điểm nhận biết enzyme thờng có trình tự - cặp nucleotide đối xứng đảo ngợc đợc gọi palindrome Mỗi RE có trình tự nhận biết đặc trng - Hiện ngời ta đà phát đợc 500 loại RE, số có 100 loại RE đà đợc bán thị trờng Míi chØ ph¸t hiƯn RE ë c¸c nhãm sinh vËt nhân sơ Prokaryote, nhóm nhân thật cha phát thấy Do đặc tính RE có khả nhận biết cắt trình tự xác định phân tử DNA, mà ngời ta chia RE thành loại sau: Loại I: Khi enzyme nhận biết đợc trình tự, di chuyển phân tử DNA đến cách khoảng 1000 - 5000 nucleotide cắt Loại II: Enzyme nhận biết đợc trình tự cắt vị trí Loại III: Enzyme nhận biết trình tự cắt DNA vị trí cách khoảng 20 nucleotide Trong số loại RE trên, loại II đợc quan tâm sử dụng nhiều lĩnh vực phân tử 2.2 Các enzyme gắn Trong nhóm ngời ta sử dụng phổ biến enzyme xúc tác hình thành liên kết nối đoạn DNA (DNA ligase) hay RNA (RNA ligase) + Trong ligase thờng sử dụng phải kể đến: - E coli DNA ligase: Enzyme đợc trích ly từ trực khuẩn E coli xúc tác phản ứng nối hai trình tự DNA có đầu so le - T4 DNA ligase: Cã nguån gèc tõ phage T4 xâm nhiễm E coli, enzyme có chức với ligase trích từ E coli nói trên, nhng đặc biệt có khả nối hai trình tự DNA đầu bằng, nên ligase đợc chuộng kỹ thuật tạo chủng - T4 RNA ligase: Enzyme đợc trích ly từ phage T4 xâm nhiễm E coli, xúc tác trình nối hai trình tự RNA liên kết phosphodiester + Quá trình hóa chuyển gen chia thành bớc sau: - Thu nhận gen cần chuyÓn: Cã thÓ thu nhËn gen trùc tiÕp tõ bé gen cách lắc học hay cắt RE, tổng hợp hóa học theo trình tự nucleotide đà biết gen sinh tổng hợp gen từ RNAm nhờ enzyme phiên mà ngợc reverse - Tạo vector tái tổ hợp: Sau đà có dạng khiết ngời ta gắn vào vector tái tổ hợp Trớc tiên ngời ta cắt vector gen loại RE trình tự nhận biết Nh hai đầu đoạn gen cần chuyển hai đầu vector bị cắt có đầu dính (trình tự DNA mạch đơn bổ sung nhau), trộn lẫn DNA cần chuyển vector đầu dính bắt cặp với Dùng ligase để hàn dính lại, ngời ta có vector tái tổ hợp - Chuyển vector vào tế bào nhận, làm clone hóa gen (tức nhân gen) vừa tạo nên tế bào nhận, chọn dòng tế bào chứa gen mong muốn Bớc trình chuyển tải gen chuyển vector tái tổ hợp đà tạo thành điều kiện in vitro vào tế bào nhận thích hợp Đối với vector plasmid, trình biến nạp, đợc hỗ trợ nhiều cách khác Đối với vector phage, có khả tự động thực tải nạp với hiệu suất cao nhiều Tuỳ đối tợng nhận gen yêu cầu cụ thể mà ngời ta lựa chọn áp dụng phơng pháp hiệu nhất: vi khuẩn E coli, xử lý tế bào CaCl2 nhiệt độ thấp để làm cho màng tế bào trở nên dễ tiếp nhận plasmid số vi khuẩn khác nấm men phải xử lý để tạo dạng tế bào trần (protoplast) biến nạp thực đợc Chơng ba Những nguyên tắc nuôi cấy vi sinh vật công nghiệp I quy trình lên men Quy trình lên men cổ điển đợc tiến hành theo giai đoạn sau: Chế tạo môi trờng Khử trùng môi trờng Giống vi sinh vật Nhân giống cấp 1, 2, Lên men Kiểm tra tạo thành phẩm Thu hồi sản phẩm Hình 2: Các bớc quy trình sản xuất c«ng nghƯ vi sinh c«ng nghiƯp Gièng vi sinh vật Muốn có sản phẩm tốt, quy trình công nghệ khâu giống quan trọng nhất, định chất lợng sản phẩm giá trị kinh tế quy trình công nghệ sản xuất Trong công nghệ lên men, ngời ta sử dụng rộng rÃi nhiều loại vi sinh vËt thuéc nhãm Prokaryote (vi khuÈn, x¹ khuÈn, vi khuÈn lam) vµ nhãm Eukaryote (nÊm men, nÊm mèc, tảo) + Tiêu chuẩn giống Chủng vi sinh vật đợc coi chủng tốt sản xuất phải có tính u việt là: Có khả sinh tổng hợp tạo sinh khối với hiệu suất cao, đồng thời phải có thêm đặc điểm sau: - Có khả sử dụng nguyên liệu rẻ tiền, dễ kiếm nh phụ phẩm, nguyên liệu thô, phế thải - Trong trình lên men không tạo phẩm phụ không mong muốn ngời sản xuất - mẫn cảm tạp nhiễm vi sinh vật khác phage - Sản phẩm sinh khối tách dễ dàng khỏi môi trờng dinh dỡng Tuy nhiên trình sản xuất tiêu chuẩn gắn liền với tồn số đối tợng vi sinh vật Các vi sinh vật thuộc nhóm Eukaryote có kích thớc tế bào lớn thể hình sợi, dễ tách chúng khỏi môi trờng dinh dỡng phơng pháp lọc ly tâm thờng Nhng chúng thờng tồn quy tắc chung kích thớc tế bào tỷ lệ nghịch với hoạt tính trao đổi chất Việc chọn chủng cho quy trình công nghệ quan trọng, để chọn đợc chủng có hoạt tính cao ngời ta phải tìm cách hoàn thiện genotype chúng với phơng pháp sau: chọn lọc, lai tạo, gây đột biến chất liệu di truyền tế bào hệ thống điều hòa trao đổi chất Gần ngời ta đà sử dụng phơng pháp di truyền tạo chủng giống có tính chất mong muốn cách chủ động, chủng dùng sản xuất ngày hoàn hảo hơn, đáp ứng ngày tốt yêu cầu ngời + Các công việc chủ yếu công tác giống sản xuất Trong sản xuất, việc hoạt hóa giống thờng xuyên kiểm tra chất lợng giống điều cần thiết thiếu Muốn làm tốt khâu cần phải tiến hành việc sau: - Kiểm tra độ khiết giống lên men - Kiểm tra khả hồi biến giống Hầu hết chủng vi sinh vật dùng sản xuất đột biến , phải kiểm tra xem chúng có hồi trở lại giống gốc hay không, tợng hay xảy - Hoạt hóa giống sau thời gian sử dụng Để hoạt hóa giống ngời ta thờng sử dụng môi trờng nuôi cấy giàu chÊt kÝch thÝch sinh tr−ëng nh− cao nÊm men, n−íc chiết cà chua, hỗn hợp vitamin, acid béo - Giữ giống phơng pháp thích hợp để trì hoạt tính u việt chúng, chống thoái hóa giống, hoạt tính + Các phơng pháp giữ giống Hiện thờng sử dụng phơng pháp để giữ giống vi sinh vật: - Bảo quản môi trờng thạch bằng, định kỳ kiểm tra cấy truyền Giống vi sinh vật đợc giữ môi trờng thạch nghiêng (đối với giống vi sinh vật hiếu khí) trích sâu vào môi trờng thạch (đối với vi sinh vật kỵ khí) Các ống giống đợc bảo quản tủ lạnh nhiệt độ 3- 5oC Định kỳ ®Ĩ cÊy trun gièng, t tõng nhãm vi sinh vËt khác mà định kỳ cấy truyền khác nhau, song giới hạn tối đa tháng Để công tác giữ giống đợc tốt, lâu đỡ bị tạp hơn, ngời ta thờng phủ lên môi trờng đà đợc cấy giống vi sinh vật lớp dầu khoáng nh paraffin lỏng Lớp paraffin hạn chế đợc tiếp xúc vi sinh vật oxygen không khí (O2) hạn chế thoát nớc môi trờng thạch, giống bảo quản đợc lâu không bị nhiễm tạp, thoái hóa - Giữ giống cát đất sét vô trùng Do cấu trúc hóa lý cát sét chất tốt mang tế bào vi sinh vËt, chđ u lµ nhãm vi sinh vËt cã bµo tử Cách làm nh sau: Cát đất đợc xử lý sạch, sàng lọc qua rây, xử lý pH đạt trung tính, sấy khô khử trùng Sau thao tác vô trùng trộn bào tử vào chất cát đất ống nghiệm Dùng paraffin nóng chảy phết lên nút ống nghiệm để giúp cho ống giống không bị ẩm trở lại Ngoài cát đất, ngời ta giữ giống hạt ngũ cốc hay silicagen Phơng pháp bảo quản giống chủ yếu cho nấm mốc xạ khuẩn - Giữ giống phơng pháp lạnh đông: Bằng phơng pháp dựa nguyên tắc ức chế phát triển vi sinh vật, đa chúng vào điều kiện lạnh sâu - 25oC đến - 70oC Ngời ta trộn vi sinh vật với dung dịch bảo vệ hay gọi dung dịch nhũ hóa nh glycerin 15%, huyết ngựa (loại không cho chất bảo quản), dung dịch glycose lactose 10% Việc làm lạnh đợc tiến hành cách từ từ Khi độ lạnh đạt - 20oC, tiếp tục làm lạnh tốc độ làm lạnh phải đạt - 2oC/phút Phơng pháp bảo quản có u điểm bảo quản đợc lâu: Nếu giữ ToC = - 15oC đến - 20oC tháng cấy truyền lại lần Nếu giữ ToC = - 30oC tháng cấy truyền lại lần Nếu giữ ToC = - 40oC 12 tháng cấy truyền lại lần Nếu giữ ToC = - 50oC năm cấy truyền lại lần Nếu giữ ToC = - 70oC 10 năm cấy truyền lại lần - Giữ giống phơng pháp đông khô: Về nguyên tắc giống nh phơng pháp lạnh đông, nhng khác chỗ đa chất bảo vệ vào nh Glutamate 3% hay Lactose 1,2% + pepton 1,2% hay Saccharose 8% + s÷a 5% + gelatin 1,5% Điều khác biệt với phơng pháp lạnh đông là: Để đảm bảo an toàn cho sống tế bào giống, ngời ta làm thăng hoa phần nớc tế bào môi trờng có chất bảo vệ - thiết bị đông khô áp suất 1.10 4mmHg Hỗn hợp tế bào giống dung dịch bảo vệ đợc chứa ampul thuỷ tinh có 10 - 15mm đợc hàn kín để đảm bảo độ khô chân không cần thiết, ampul đợc bảo quản nhiệt độ - 5oC hay nhiệt độ phòng Đây phơng pháp bảo quản tối u nay, tới vài chục năm phải làm lại Những năm gần ngời ta đa phơng pháp giữ giống ngân hàng gen để giữ giống vi sinh vật quý hiÕm, song chi phÝ rÊt tèn kÐm Nh©n giống vi sinh vật Mục đích việc nhân giống để tăng số lợng tế bào vi sinh vật Trong quy trình lên men, tuỳ chủng giống vi sinh vật khác mà cần nhân theo chất môi trờng nhân khác Thờng có hai dạng giống: tế bào sinh dỡng bào tử + Trờng hợp giống tế bào sinh dỡng Để thu đợc lợng tế bào sinh dỡng, ngời ta thờng chọn môi trờng nhân sinh khối môi trờng đảm bảo cho vi sinh vật tồn thích hợp nhất, để víi thêi gian ng¾n nhÊt cho sinh khèi vi sinh vật lớn Trong trờng hợp thờng dùng môi trờng dịch thể (nuôi cấy chìm) + Trờng hợp giống bào tử hay conidi: Thông thờng chọn môi trờng đặc (nuôi cấy bán rắn: cám gạo, bột bắp, thóc, trấu, mùn ca ) Nuôi cấy nấm mốc xạ khuẩn thờng cần thời gian dài để tạo bào tử Bào tử đợc thu hồi nhiều cách: Dùng máy hút (nh hút bụi) hay dùng chổi lông mềm quét lên bề mặt môi trờng bán rắn để thu hồi giống Bào tử đợc thu hồi cho vào bình khô có gắn miệng bình paraffin, bảo quản nơi thoáng mát sử dụng hàng năm Trong công nghiệp, ngời ta thờng nhân với lợng lớn sinh khối vi sinh vËt b»ng c¸c b−íc nh− sau: - Giai đoạn phòng thí nghiệm (gọi nhân giống cấp I) Đây giai đoạn cấy giống vi sinh vật khiết từ ống giống, đem nhân môi trờng dinh dỡng chuyên tính vô trùng, nuôi cấy phòng thí nghiệm, nhằm đáp ứng đủ lợng giống cần thiết cho bớc - Giai đoạn xởng (nhân giống sản xuất) Đây giai đoạn cần nhân lợng giống lớn để đáp ứng cho khâu giống sản xuất Từ giống cấp 1; 2; nhân nồi lên men hay chất đặc (chất mang) Khi kết thúc khâu nhân giống cần kiểm tra độ giống mật độ tế bào vi sinh vật cần nhân 3 Lên men Là giai đoạn nuôi cấy vi sinh vật để chúng tạo sản phẩm sinh khối vi sinh vật, sản phẩm trao đổi chất Đây khâu định kết quy trình lên men Để thực lên men, ngời ta thờng sử dụng hai phơng pháp lên men bề mặt lên men chìm 3.1 Khái niệm lên men bề mặt Lên men bề mặt thực nuôi cấy vi sinh vật bề mặt môi trờng dịch thể bán rắn + Nuôi cấy bề mặt dịch thể (dùng cho nhóm vi sinh vËt hiÕu khÝ): Tuú tõng lo¹i vi sinh vật khác mà chọn môi trờng thích hợp khác Môi trờng đợc pha loÃng với nồng độ thích hợp, sau bổ sung nguồn nitrogen (N), nguồn khoáng Khi môi trờng cho vào thiết bị lên men phải đảm bảo cho cột môi trờng có bề mặt thoáng, rộng Nuôi cấy theo phơng pháp đơn giản, nhng đòi hỏi diện tích sử dụng lớn, khó tự động hóa quy trình sản xuất Hiện phơng pháp đợc sử dụng + Nuôi cấy bề mặt sử dụng môi trờng bán rắn: Có thể dùng vi sinh vật hiếu khí bán hiếu khí kỵ khí phơng pháp lên men nguyên liệu thờng dùng là: - Các loại hạt: thóc, gạo, nếp, đậu tơng - Các loại mảnh: mảnh sắn, mảnh bắp - Các loại phế liệu hữu cơ: bà mía, trấu, cọng rơm rạ, rác thải sinh hoạt Các loại nguyên liệu chứa tinh bột trớc sử dụng phải xử lý cách nấu chín, nguyên liệu nói ngời ta phải bổ sung chất dinh dỡng vào môi trờng để đảm bảo cho dinh dỡng vi sinh vật trình nhân sinh khối (lên men) Đối với vi sinh vật hiếu khí cần phải có quạt thổi khí vô trùng Trong lên men bán rắn, yêu cầu nguyên liệu độ ẩm cần thiết cho trình lên men Phải luôn đảm bảo độ ẩm 60 - 75% (độ ẩm không khí 90 - 100%) Phơng pháp lên men bán rắn đợc sử dụng rộng rÃi giới lĩnh vực nh: - Sản xuất kháng sinh dùng chăn nuôi - Sản xuất enzyme từ nấm mốc - Làm tơng - Đờng hóa tinh bột để sản xuất rợu ethanol từ nấm men 3.2 Khái niệm lên men chìm áp dụng cho vi sinh vật hiếu khí kỵ khí Khi lên men chìm, vi sinh vật đợc nuôi cấy môi trờng dịch thể, chúng phát triển theo chiều đứng cột môi trờng Để thực trình lên men chìm, cần qua bớc sau: + Thực trình khuấy đảo sục khí Quá trình lên men chìm, vi sinh vật phát triển nồi lên men cần đợc trộn để tăng cờng diện tiếp xúc tế bào môi trờng dinh dỡng đồng thời ngăn cản kết lắng tế bào Để thực việc thiết bị lên men ngời ta lắp hệ thống cánh khuấy, hệ thống cần cho vi sinh vật hảo khí yếm khí Đối với vi sinh vật hiếu khí, có tác dụng đảm bảo cung cấp oxy đầy đủ theo yêu cầu loại vi sinh vật Hệ thống cánh khuấy phần quan trọng thiết bị lên men Để tăng tác dụng khuấy trộn ngời ta lắp thêm hệ thống sục khí Không khí trớc đợc bơm vào nồi lên men phải xử lý để đảm bảo học (sạch bụi) vô trùng (không có vi sinh vật) cách cho ®i qua mét hƯ thèng läc b»ng b«ng thủ tinh khử trùng nóng Tuỳ chủng loại vi sinh vật khác tuỳ vào giai đoạn lên men khác nhau, mà cần cờng độ thông khí khác + Theo dõi tạo bọt lên men biện pháp phá bọt Khi khuấy đảo sục khí mạnh liên tục nồi lên men tạo bọt, có khuynh hớng trào khỏi nồi lên men gây nhiễm tạp môi trờng lên men, bọt khí cản trở tiếp xúc vi sinh vật môi trờng dinh dỡng Do vậy, trình lên men ngời ta cần kiểm soát lợng bọt tạo thành tìm cách phá huỷ chúng Để phá bọt ngời ta thờng dùng chất tự nhiên nh: dầu thực vật (dầu lạc), mỡ cá heo chất đợc tổng hợp theo đờng hóa học + Điều chỉnh pH môi trờng lên men Mỗi loại vi sinh vật thích hợp với pH định môi trờng nuôi cấy Trong trình lên men vi sinh vật tạo sản phẩm mang tính acid kiềm làm cho pH môi trờng thay đổi Khi pH môi trờng thay đổi không thích hợp cho hoạt động sống vi sinh vật Vì việc chủ động điều chỉnh pH môi trờng cần thiết suốt trình sản xuất Ngời ta điều chỉnh pH môi trờng trình lên men dung dịch NaOH, HCl, NH4OH, urea, hay bổ sung dịch đệm photphate , nhng phải đảm bảo điều kiện vô trùng + Theo dõi điều chỉnh nhiệt độ môi trờng lên men Nhiệt độ yếu tố quan trọng ảnh hởng lớn đến phát triển vi sinh vật hiệu lên men Mỗi loại vi sinh vật thích ứng nhiệt độ thích hợp để sinh trởng tạo sản phẩm Quá trình lên men có toả nhiệt mạnh, nhiệt độ thiết bị lên men thờng tăng vợt ngỡng nhiệt độ thích hợp cho vi sinh vật Vì phải thờng xuyên giám sát điều chỉnh nhiệt độ theo yêu cầu trình lên men Để làm đợc việc ngời ta thờng trang bị hệ thống làm ngội, cách cho nớc chảy qua nồi lên men hay cho vào nồi hệ thống ống ruột gà làm nguội + Tiếp thêm nguyên liệu bổ sung chất tiền thể Việc bổ sung nguyên liệu trình sản xuất việc làm cần thiết, có số chất không cho phép đa vào quy trình lên men từ đầu với nồng độ hàm lợng cao (nh đờng phải bổ sung nhiều đợt với nồng độ thấp) Đối với số quy trình sinh tổng hợp số chất nh vitamin B12, cần phải bổ sung chất tiền thể cđa vitamin B12 lµ 5,6 dimethylbenzimidazol sau mét thêi gian lên men định Ngoài việc theo dõi nghiêm ngặt bớc trên, trình lên men phải lấy mẫu để kiểm tra tiêu sau: - Trạng thái tế bào chủng giống dùng trình lên men độ tạp khuẩn - Kiểm tra tiêu hao lợng, tạo thành sản phẩm trình lên men - Điều cuối quan trọng xác định thời gian trình lên men Tuỳ quy trình lên men khác mà thời gian lên men khác Ngời sản xuất phải nắm thời gian lên men để thu hồi sản phẩm với hiệu suất cao Lên men chìm phơng pháp đợc phổ biến rộng quy trình lên men công nghiệp, kiểm soát đợc toàn khâu trình cách dễ dàng So với phơng pháp lên men bề mặt, lên men chìm có nhiều u điểm là: choán bề mặt (không nhiều diện tích), dễ giới hóa tự động hóa trình theo dõi Tuy nhiên phơng pháp lên men chìm đòi hỏi đầu t nhiều kinh phí cho trang thiết bị Ngoài ra, mẻ lên men, lý bị xử lý xử lý cục đợc, đa phần phải hủy bỏ trình lên men, gây tốn lớn Phế liệu trình lên men thải phải kèm theo công nghệ xử lý chống ô nhiễm môi trờng Thu hồi sản phẩm Việc thu håi s¶n phÈm víi hiƯu st cao cã ý nghÜa định tính kinh tế quy trình công nghệ Vì việc tách, thu hồi sản phẩm phải đợc tính toán từ chọn giống chủng vi sinh vật để lên men, chọn nguyên liệu nh môi trờng dinh dỡng Khi trình lên men kết thúc, ngời ta tiến hành thu hồi sản phẩm Các sản phẩm trình tổng hợp vi sinh vật thờng đợc tích luỹ tế bào dung dịch nuôi cấy * Việc tách tế bào vi sinh vật khỏi pha lỏng dịch lên men - Nếu vi sinh vật có cấu tạo hệ sợi nh nấm, tảo dùng phơng pháp lọc vớt - Nếu vi sinh vật đơn bào, có kích thớc tế bào nhỏ nh nấm men, vi khuẩn dùng phơng pháp ly tâm, thờng ly tâm tốc độ cao * ViƯc xư lý tiÕp theo sau thu håi s¶n phÈm phụ thuộc vào mục tiêu công nghệ Thông thờng ngời ta hay dùng phơng pháp sau: chiết rút, hấp phụ, kết tủa, kết tinh, sắc khí, điện ly, phân tích quang phổ hấp phụ Để tính hiệu kinh tế quy trình công nghệ nh tính khả thi xí nghiệp (nhà máy) lên men, ngời ta thờng xây dựng thành khu liên hợp xí nghiệp có mối quan hệ sản xuất gần nhau, khép kín công nghệ từ A đến Z + Về vấn đề lợng: Sẽ sử dụng đợc triệt để nguồn lợng trình lên men VÝ dơ: Mét nåi lªn men phơc vơ cho xí nghiệp sản xuất, xí nghiệp khác giai đoạn chuẩn bị để lên men, sử dụng lợng d thừa để sấy sản phẩm, sởi ấm phòng phân xởng sản xuất (vào mùa lạnh) + Về vấn đề nguyên liệu: Do đặc điểm công nghệ mục tiêu xí nghiệp (nhà máy), mà xÝ nghiƯp nµy cã thĨ sư dơng phÕ liƯu cđa xí nghiệp làm nguyên liệu đầu vào Ví dụ: Nhà máy sản xuất acid glutamic cần cao ngô Ngời ta xây dựng xí nghiệp sản xuất cao ngô cạnh nhà máy Hạt ngô sau ngâm lấy nớc chiết làm cao ngô, đợc sử dụng làm nguyên liệu cho xí nghiệp sản xuất tinh bột + Vấn đề xử lý nớc thải chất thải: Xử lý ô nhiễm hoạt động nhà máy, xí nghiệp thực phẩm chế biến rau quả, đông lạnh thờng đợc liên kết chặt với xí nghiệp xử lý môi trờng, tái chế phế thải vào mục đích khác Ví dụ: Xí nhiệp xử lý bùn mía thành phân hữu bón cho trồng đợc xây dựng cạnh nhà máy đờng II dinh dỡng vi sinh vật nguyên liệu nuôi cÊy vi sinh vËt c«ng nghiƯp Nu«i cÊy vi sinh vật quy mô (phòng thí nghiệm, nhân giống cấp 1, 2, hay nồi lên men) phải đảm bảo đầy đủ nguyên tố dinh dỡng cho vi sinh vật hoạt động nhân sinh khối tạo sản phẩm Nguyên tố dinh dỡng vi sinh vật là: nguyên tố đa lợng, vi lợng vitamin (xem Giáo trình vi sinh vật đại cơng) Tuy lên men công nghiệp có chỗ khác biệt đáng lu ý Ngời ta không bổ sung nguyên tố vi lợng dạng dung dÞch tinh khiÕt ... trao đổi chất vi sinh vật Vi? ??c tạo nên chủng đột biến dựa sở hiểu biết quy luật di truyền biến dị vi sinh vật, dựa kinh nhiệm công tác lai tạo giống Những thành công công nghệ vi sinh cho phép... giữ giống vi sinh vật: - Bảo quản môi trờng thạch bằng, định kỳ kiểm tra cấy truyền Giống vi sinh vật đợc giữ môi trờng thạch nghiêng (đối với giống vi sinh vật hiếu khí) trích sâu vào môi trờng... rÊt tèn Nhân giống vi sinh vật Mục đích vi? ??c nhân giống để tăng số lợng tế bào vi sinh vật Trong quy trình lên men, tuỳ chủng giống vi sinh vật khác mà cần nhân theo chất môi trờng nhân khác