Câu 7: phương pháp bảo quản và sử dụng vacxin. A, phương pháp bảo quản. Vacxin đc sx từ vk giứ ở 2-5 o c Vd: vacxin tụ dầu bảo quản 5-15 o c /9 tháng Vacxin phó thương hàn lợn 2-10oc/ 18 tháng Vacxin đc sx từ virus: Vd: vacxin ở dạng nước trứng giứ ở âm đến -86oc Vacxin ở dạng đông khô:2-10oc (phương pháp đông khô : làm lạnh huyền dịch vsv nhanh đến -70oc. Nâng nhiệt độ trong điều kiện chân ko làm các tinh thể băng thăng hoa tế bào tách khỏi nước mà ko tiếp xúc với không khí sẽ tồn tại mà ko bị chết. b. sự dụng vacxin: +. Nguyên lý sd vacxin: khi đưa vacxin vào cơ thể động vật , kN có trong vacxin kích thích hệ thống MD của cơ thể hoạt động đến một đáp ứng MD tế bào sản sinh KT dịch thể đặc hiệu hoặc kT tế bào. Khi mầm bệnh từ ngoài sâm nhập sẽ bị các KT đặc hiệu tiêu diệt . Thực tết cho thấy dùng vacxin phòng bệnh cho người , đv là biện pháp cơ bản , chủ động nhất để khống chế tiến tới thanh toán bệnh truyền nhiễm. +. Quy luật hình thành kháng thể dịch thể đặc hiệu. Khi kN xâm nhập vào cơ thể , KT chưa sinh ra ngay lập tức mà phải sau một thời gian tiềm tàng . thời gian này dài hay ngắn phụ thuộc nhiều vào KN vào lần KNxâm nhập vòa cơ thể lần đầu tiên hay lần 2,3… sau đó KT mới đc sinh ra lượng KT tăng dần đạt mức cao nhất sau 2 -3 tuần sau đó gảm dần và biết mất sau vài tháng ,vài năm. +. Nguyên tắc sd vacxin: -, tiêm phòng vacxin trên phạm vi hợp lý , đạt tỉ lệ cao, tỷ lệ tiêm phòng càng cao càng tốt , nói trung phải đạt 80% vùng uy hiếp phải đạt 90-95% -, tiêm phòng đúng đối tượng . - phòng cho đv khẻo chưa mắc bệnh , trường hợp ngoại lệ có thể dung cho đv nhiễm bệnh - bình thường ko dùng vacxin cho đv quá non: trường hợp có dịch đe dọa thì nên dung vacxin sớm cho đv non , sau dó cần dung vacxin bổ sung , trường hợp ko có dịch đe dọa thì nên dung vacxin cho đv non lúc 2-7 tuần tuổi . + thần trọng với đv mang thai: • Tiêm phòng vacxin đúng thời gian ; thường tiêm phòng vacxin trước mùa phát bệnh 1 thời gian , tiêm đúng liều lượng đúng đường + kỹ thuật sd vacxin: • Điều kiện bảo quản vacxin phải đảm bảo • Kiểm tra vacxin trước khi sd • Nơi tiêm phải sát trùng , dụng cụ tiêm phải đc khử trùng + các phản ứng ko mong muốn khi tiêm vacxin và cách khắc phục : • Phản ứng cụ bộ nơi tiêm : sưng đỏ ,phù nề , ngứa chỗ tiêm. Nhẹ ko can thiệp sâu sau 24h phản ứng mất. nặng xoa bóp , cho vật nghỉ ngơi ăn uồng tốt • Phản ứng toàn thân : dạng nhẹ sốt nhẹ tăng 0,5 đến 1 o c .nặng co thắt phết quản ngất, hạ huyết áp . + tai biến khi sd vacxin có thể do • Do nhiễm bệnh : vacxin sống , giảm động lực có thể gây bệnh . do cơ thể bị suy giảm MD khi tiêm quá liều khi vacxin nhiễm vsv gây bệnh khác • Bệnh tự nhiễm :thử nghiệm vacxin phòng dại cho cưu cho thấy có xác xuất gây bệnh tự nhiễm khoảng 1/3000-1/10000 • Sốc quá mẫn : sau khi tiêm vacxin do vacxin chứa một lượng độc tốt cao chưa vô hoạt triệt để Biểu hiện thường vật khó thở niêm mạc mắt , mũi đỏ ửng cơ vân dung mạnh cò triệu chứng thần kinh kèm theo dẫy dựa kêu la. Nặng hơn đại tiện tiết ko kiểm soát , sùi bọt mép , niêm mạc tím tái Can thiệp: đưa vào nơi yên tĩnh thỉnh thoảng xoa bóp vùng ngực , dung thuốc kháng histamine ,truyền dịch. + sd vacxin ở một số trường hợp đăc biệt : • Vacxin với trẻ đẻ non: Viện hàn lâm y khoa Mỹ khuyến cáo có thể dung vacxin khi trẻ 2 tháng tuổi Có nước quy định dung vacxin khi trẻ đạt trọng lượng từ 3kg trở lên + vacxin với bệnh rối loạn thần kinh :ko dung vacxin với trường hộp rối loạn thần kinh trẻ nhỏ có tiền sử co giật cẩn trọng khi dùng vaxin đặc biệt vối vacxin ho gà Mande khuyên nên bất đầu dung ¼ liều và dùng them thuốc chống co gật nếu dung nạp tốt tăng dần liều và tiêm đủ liều ở liều thứ 3 + vacxin với bệnh AID: ko dung vacxin BCG, vacxin nhược độc . trẻ có huyết thanh dương tính với HIV ko dung vacxin BCG chỉ dung vacxin vô hoạt. Cau8: kháng thể lòng đỏ : • Kháng thể lòng đỏ là trong long đỏ trứng gia cầm co KT dịch thể đặc hiệu (IgG) • Kháng thể tạo ra = phương pháp này MD cao cho đv • Động vật hay sd để chế Kt lòng đỏ là gà • Vd:KT lòng đỏ kháng virus gumbono KT …………………… viêm gan vịt KT ……………….mycoplasmagalisiptium Quý trình sản xuất KT lòng đỏ Gây MD cao cho gà đẻ thu trứng mổ trứng thu lòng đỏ pha loãng lòng đỏ với dung môi kiểm tra vô trùng , kiêm tra hiệu lực kiểm tra an toàn đóng chai bảo quản ở -20 o C Câu 9: quy trình cơ bản sx vacxin trên môi trường tb sơ phôi gà : A, tách tb fibroblast phôi gà = tripsin háo : • Sát trùng vỏ trứng = cồn 5% • Mổ trứng lấy phôi cho vào bình cầu có khía trong đó có viên nam châm và cho tripsin loãng nếu 5-10 phôi cho 20 ml .11-20 phôi cho 30ml • Đặt bình cầu lên máy khuấy từ , quy tốc độ trung bình trong 1h • Đổ lớp nước tripsin chứa tb vào một cốc 3 lần vải gạc • Cho tiếp tripsin mới vào tiếp tục quay như vậy đều đều khi tb đc tách rời hoàn toàn • Ly tâm 200vong/phut/3 phút bỏ lớp tripsin lấy cặn tb rửa sạch tn = dung dịch hanks (2 lần) • Hòa tb với môi trường nuôi dướng(LH) • Đếm số lượng tb b. nuôi cấy tb pha loáng để có 60000- 70000 tb/ml nuôi vào chai dẹt ống nghiệm bình Roux với dung tích khác nhau • ống nghiệm rót 1-2ml hỗn dịch tb • chai dẹt dung tích 100ml rót 20ml, chai 250ml rót 25ml • bình Roux dung tích 12000ml rót 170ml nuôi ở 37oc kiểm tra sự phát triển của tế bào hang ngày • sau 3-5 ngày tb mọc kín một lớp dùng nuôi cấy virus c. nuôi cấy virus tb một lớp - pha loãng giống virus cầm cấy - đổ hết môi trường cũ trong chai tb. - cho dung dịch hanks vào láng nhẹ để rửa đổ hết dung dịch hanks Đặt chia tb vào tủ ấm 37oc /45-60 phut Để hết hỗn dịch virus vừa cấy ra khỏi chai Rót môi trường nuôi cấy vào chai Đặt chai tb vao tủ ấm 37oc thời gian hủy hoại tb tùy loại virus và loại tb nuôi d. thu hoạch vacxin: - kiêm tra tb đối chứng : Tb ko bị thóa hóa bán đều khắp bề mặt chai • kiểm tra các chai gây nhiễm virus soi trên kính hiển vi thấy tb huy hoại có tròm bong khỏi thành chai • thu vacxin thời gian thu tùy loại virus dung tay lắc mạnh chai tb bong hết khỏi thành chai bảo quản trong nhiệt độ -20oc kiểm tra các chỉ tiêu vacxin . câu 10: quá trình sản xuất kháng huyết thanh dại: KHT dại đc sx từ HT của ngựa đã đc gây MD – virus dại cố định ở dạng dung dịch hoặc dạng đông khô. Sản xuất kháng huyết thanh dại gồm những bước sau Bước 1:gây MD cao cho ngựa : • gây MD cơ sở dùng KN là virus dai vô hoạt • gây MD cao dùng vacxin dại nhắc lại bước 2: lấy máu để thu huyết tương : • khi huyết thanh ngựa có nồng độ KT dại đạt 100UI/ml lấy máu cho chất chống đông vào KS rồi loại bỏ hồng cầu thu huyết tương bước 3: tiêu hóa huyết tương pha loãng huyết tương 2-3 lần để nhiệt độ 30oc điều chỉnh PH them tripsin bươc 4: quá trình tinh chế : • làm biến tính bằng nhiệt để loại bỏ fibrin , albumin , mảnh Fc • đun nóng 57-59 o c them ammonium sulphats :15%[(NH 4 ) 2 SO 4 ] lọc loại bỏ chất tủa giữa phần nước nổi • tạo tủa : them ammonium sulfat 20% gây tủa , gữ lại tủa bỏ phần nước nổi bước 5: cô đặc gạn lọc vô trùng F(ab , ) 2 • tảy màu = cách them ammonium sulfat 5% để hấp thu chất gây sốt và Pr tạp • cô đặc F(ab , )2 = phương pháp siêu lọc • cho thêm chất dinh dưỡng vào rồi lọc vô trùng bước 6: kiểm định sản phẩm • hóa lý ,vô khuẩn , an toàn ,chỉ nhiêt tố , công hiệu , hàm lương F(ab , )2 • tiêu chuẩn kỹ thuật của KHT dại • thưc nghiệm tiêu chuẩn kỹ thuật nhân dạng trong, màu trắng hàm lượng Pr đạt PH nhỏ hơn 170g/l Muối 7,5-9,5g/l (NH4)2SO4 nho hơn 0,1g/l Chloroform nhỏ hơn 0,5% (ml/ml) Abbumin ko có F(ab,)2 lớn hơn 60% Vô khuẩn đạt An toàn đạt Chỉ nhiệt tố nhiệt độ tăng nhỏ hơn 1,3oc Nguyên lieu tương tự nhóm máu A nhỏ hơn 4ng/ml Công hiệu lớn hơn 200ml/ml Kết luận đạt Câu 11:quy trình sản xuất vacxin bại liệt cổ: Sản xuất trên môi trường lớp tb thận khỉ tiên phát , tb thận khỉ đc lấy = phương pháp tripsin hóa. Cụ thể: • a, tách tb thận khỉ = phương phap truyền dịch khỉ dùng cho sản xuất là giống Maccaca muldatta, trong lượng 2-3kg , tuổi 2-2,5 ko có virus ngoại lai SV40. SIV.STLV, ko có kháng thể polio cách ly kiểm dịch 6 tuần b, mổ lấy thận (vô trùng) gây mê sâu = ketamin liều 10-20ml/kg ,cắt đọng mạch cổ , tắm = xà phòng và cloramin , lột da bụng , mổ bộc lộ thận , bóc tách thận , đảm bảo ko gây tổn thương nhu mô thận bảo quản thận trong bình có 100ml môi trường LHE hoặc hanks ủ ấm 37oc c, tripsin hóa : đặt thận vào đĩa petri • luồn kim vào đọng mạch thận , truyền dịch vến ,150ml • 200ml vào với tốc độ 15-20ml/phut .đẩy máu động mạch trong nhu mô • Truyền 150-200ml dung dịch tripsin cho tới khi thấy dịch chảy ra ngoài nhơt , nhu mô thận xuất hiện vết nứt, cho thận vào bình chứa 80-100ml LHE , lắc nhẹ đến khi môi trường hóa đục • Hỗn dịch tb đc giữ lại trong bình 100-150ml huyết thanh bê và giữ trong lạnh • Tiếp tục tripsin hóa cho đến khi nhu mô thận tan hết • Hỗn dịch tb đc cho them LHE vừa đủ 1000- 1500ml sao cho nông đọ huyết thanh bê đạt 10% , bảo quản lạnh 4-8 o c đến khi nuôi cấy • Kiểm tra vô trùng • Đệm tb: pha tb = xanh trypan với tỷ lệ 1,5 lần , đếm bằng buồng đếm hồng cầu đọc trên kính hiển vi phản pha • Tiêu chuẩn chấp nhận :hỗn dịch tb đồng nhất tỷ lệ sống trên 80% lượng tb đủ nuôi cấy trên 100 bình Roux. • Nuôi cấy tb : Pha tb = môi trường LHE .70000tb/1ml Môi trường LHE gôm: 50%LH 0.5% , 50% eargle, NaHCO 0,025%, huyêt thanh bê 7-10% kháng sinh Nuôi vào bình Roux : diện tích 1200ml diện tích nuôi cấy 250cm 2 khối lượng 170ml hỗn dịch tế bào đã pha loãng . Nuôi ở 37oc/4-5 ngày , thay môi trường = môi trường duy trì có 2-55 huyết thanh bê , môi 2-4 ngày để tb mọc kín một lớp Kiểm tra sự phát triển của tb hàng ngày • Tiêu chuẩn chấp nhận : tb mọc kín 1 lớp ko nhiễm khuẩn số tb trong 1 chai khoảng 30-40 triệu • Gây nhiễm virus : Gây nhiễm virus là giai đoạn chính , quan trọng nhất trong quá trình sản xuất vacxin Mỗi chủng virus có một nồng độ gây nhiễm riêng đảm bảo thu được vacxin an toàn đạt hiệu quả cao nhất • Pha loãng giống virus tính số lượng virus gây nhiễm trong lô sản xuất Dùng chủng gốc virus bại liệt typ I WHO –IS 90C do viện nghiên cứu bại liệt NHẬT BẨN cung cấp . chúng có nguồn gốc từ chủng sabin(SO) đc cấy truyền 2 lần (SO +2 ) hiệu giá 10 8,3 tăng C/D 50ml Pha loãng với LH 3 E với khối lượng cần thiết . • Rửa tb : • Loại bỏ hết môi trường trong chai tb nuôi • Cho vào mỗi chai 100ml hanks láng qua , lắc nhẹ hut hết dịch rửa hanks • 25% số chai tế bào chọn ngẫu nhiên làm đối chứng • Gây nhiễm : cho vào mỗi chia 3ml hỗn dịch giống virus = bơm kim tự động láng đều hỗn dịch virus lên bề mặt tế bào . • Hấp thụ virus : toàn bộ số chai tb gây nhiễm và chai đối chứng được để ở 33,5 o c /1h Cứ 15 phút láng nhẹ 1 lần hỗn dịch virus trên toàn bộ bề mặt chai tb . • Bổ sung môi trường : cho vào mỗi chai 110-120ml LHE nuôi ở 33,3 o c theo dõi sự hủy họa tb . những chai đã thu hoạch trên 80% tbao bị hủy họa vào mức CPE 3 + đến 4+ . • Thu hoạch vacxin : Thu vacxin đúng quy định sẽ mang lại hiệu quả cao nhất trong sản xuất . • Kiểm tra tbao đối chứng : môi trường vàng cam , trong suốt tbao ko bị thoái háo , bán đều khắp bề mặt trên. • Kiểm tra các chai gây nhiễm virus : môi trường có màu vàng sẫm trong suốt soi trên kính hiển vi thấy tbao hủy hoại ,có tròm bong khỏi thành chai : 3+ : hầu hết tb thoái hóa . 4+: tbao bong hết khỏi thành chai. • Thu hoạch . • Thời gian thu hoạch 65-90h sau gây nhiễm • Dùng tay lắc mạnh chai cho tbao bong hết khỏi thành chai • Bảo quả trong tủ -20 o c • Ta thu được vacxin bán thành phẩm • Thử vô chùng bán thành phẩm . • Tập trung vacxin : lấy chai tbao ra khỏi tủ đá đẻ ở t o phòng khi gần tan hết đá , dùng tay lắc mạnh đễ vỡ tbao , gải phóng virus chuyển vacxin từ bình Roux sang chai 2,5 lit chuyển chai 2,5 l sang chai 20l . xác định số lượng vacxin thu được . chia vacxin từ bình 20 lit ra chai 1,5 lit bảo quản -20oc . lấy 100ml mẫu kiểm định , thử vô chùng . • Lọc vacxin:nhằm lạo bỏ tbao và các tạp chất trong quá trình nuôi cấy đảm bảo vô chùng . • Trộn vacxin thành vacxin thành phẩm .: các vacxin bại liệt đơn giá typ I,II,III sau khi chế đơn giá được trộn lại với nhau thành vacxin bại liệt . vacxin thành phẩm ra chai dán nhãn, bảo quản • KIỂM ĐỊNH VACXIN : nếu khẳng định đạt yêu cầu quy trình chế tạo vacxin hoàn tất. . , lắc nhẹ hut hết dịch rửa hanks • 25% số chai tế bào chọn ngẫu nhiên làm đối chứng • Gây nhiễm : cho vào mỗi chia 3ml hỗn dịch giống virus = bơm kim tự động láng đều hỗn dịch virus lên bề. tripsin mới vào tiếp tục quay như vậy đều đều khi tb đc tách rời hoàn toàn • Ly tâm 200vong/phut/3 phút bỏ lớp tripsin lấy cặn tb rửa sạch tn = dung dịch hanks (2 lần) • Hòa tb với môi trường. hết môi trường cũ trong chai tb. - cho dung dịch hanks vào láng nhẹ để rửa đổ hết dung dịch hanks Đặt chia tb vào tủ ấm 37oc /45-60 phut Để hết hỗn dịch virus vừa cấy ra khỏi chai Rót môi trường