Y Học Hạt Nhân 2005 Một điểm quan trọng đọc v đánh giá kết xạ hình to n thân với FDG PET l : điều kiện bình thờng, FDG đợc tập trung tổ chức n o, tËp trung Ýt ë c¬, nhiỊu ë c¬ tim (chđ u theo GLUT1 v GLUT4), ë tủ x−¬ng v thải chủ yếu qua đờng thận 4.4 Ghi hình mét sè lo¹i khèi u ung th− b»ng PET, PET - CT VỊ lý thut, ng−êi ta cã thĨ ghi hình cho hầu hết khối u kỹ thuật PET, ung th đại trực tr ng, lymphoma, melanoma (u hắc tố), ung th đầu mặt cổ, ung th phổi, ung th tuyến giáp, ung th di v o xơng, số loại ung th khác nh khối u hệ thần kinh trung ơng, ung th tinh ho n, tiền liệt tuyến, thận Giá trị ghi hình PET (trong hầu hết trờng hợp) giúp chúng ta: - Phát sớm khối u - Phân loại giai đoạn bệnh - Theo dõi sau điều trị v đáp ứng sau điều trị - Phát tái phát v di Dới l số hình ảnh ghi hình khối u kỹ thuật PET, PET - CT: Hình 4.97: Hình ảnh ung th vùng cổ Ghi hình to n thân với máy PET - ảnh bên trái: trớc điều trị - ảnh giữa: sau điều trị hoá chất tháng, tổn thơng đ biến - ảnh bên phải: tái phát sau điều trị hoá chất tháng Hình 4.98: Ung th vú di Ghi hình PET - Bên trái: trớc điều trị hoá chất, nhiều ổ di (các điểm sáng) - Bên phải: sau điều trị, đáp ứng tốt với hoá chất, hầu hết ổ di đ biến Y Học Hạt Nhân 2005 PET CT Hình 4.99: Hình ảnh u tế b o thần kinh đệm gai (oligodendroglioma), ghi hình máy PET - CT Hình ảnh ho trộn PET v CT cho thấy rõ vị trí, mức độ lan rộng tổn thơng Hình 4.100: Ghi hình với 18F - FDG PET bệnh nhân nam, 30 tuổi, chẩn đoán Lymphoma-Hodgkin: nhiều hạch cổ, trung thất, hạch phía ho nh v xung quanh động mạch chủ Trớc điều trị 45 Gy 76 Gy Đáp ứng Không đáp øng H×nh 4.101: Ghi h×nh PET víi 18F – FDG (theo dõi sau điều trị) Y Học Hạt Nhân 2005 CT PET PET CT Hình 4.102: Hình ảnh ung th b ng quang di xơng Ghi hình máy PET - CT Hình ảnh thu đợc l ho trộn hình ảnh PET v CT, định vị đợc xác vị trí tổn thơng (Hình ảnh CT vị trí tổn thơng không rõ r ng) I -131 Hình 4.103: Ung th tuyến giáp - Xạ hình tuyến giáp với I-131 âm tính - 18F -FDG PET: dơng tính (vị trí mũi tên) 18 F FDG PET Hình 4.104: Ghi hình với FDG PET bệnh nhân ung th− vó, 45 ti NhiỊu ỉ tËp trung glucose ë h¹ch cỉ, ë trung thÊt Y Häc H¹t Nhân 2005 Hình 4.105: Ung th phổi ghi PET v CT Câu hỏi ôn tập: 01 Nêu phơng pháp ghi hình khối u theo nguyên tắc tơng phản âm tính ? 02 Nêu phơng pháp ghi hình khối u theo nguyên tắc tơng phản dơng tính (ghi hình không đặc hiệu ? 03 Trình b y ứng dụng lâm s ng phơng pháp ghi hình không đặc hiệu khối u hệ thần kinh trung ơng, đầu mặt cổ, tuyến nội tiết, tuyến thợng thận, tuyến cận giáp ? 04 Trình b y ứng dụng lâm s ng phơng pháp ghi hình không đặc hiệu ung th phổi, ung th gan nguyên phát ? 05 Trình b y ứng dụng lâm s ng phơng pháp ghi hình không đặc hiệu ung th− x−¬ng, bƯnh Hodgkin v Non – Hodgkin lymphoma ? 06 Trình b y nguyên lý ghi hình miễn dịch phóng xạ ? 07 Nêu số đặc điểm kháng nguyên, kháng thể v dợc chất phóng xạ dùng ghi hình RIS ? 08 Trình b y mét sè øng dơng cđa RIS l©m s ng ? 09 Nêu nguyên lý chung ghi hình khèi u b»ng PET ? 10 Nªu mét sè biÕn ®ỉi sinh lý khèi u ? 11 Tr×nh b y số đặc điểm ghi hình khối u PET ? 12 Nêu số giá trị ghi hình PET lâm s ng ? Y Học Hạt Nhân 2005 Chơng Định lợng miễn dịch phóng xạ Mục tiêu: Nắm đợc nguyên lý phơng pháp định lợng miễn dịch phóng xạ (ĐLMDPX) Nêu đợc u, nhợc điểm phơng pháp RIA v IRMA Nắm đợc cách đánh giá kết RIA, IRMA v số phạm vi ứng dụng bệnh tuyến giáp v số bệnh ung th thờng gặp Định lợng miễn dịch phóng xạ (Radioimmunoassay: RIA) l kỹ thuật chẩn đoán y học hạt nhân in vitro (không cần đa đồng vị phóng xạ v o c¬ thĨ ng−êi bƯnh) m chØ lÊy bƯnh phÈm (máu, nớc tiểu, dịch thể) thêm chất đồng vị phóng xạ thích hợp qua xác định bệnh Những ngời xây dựng kỹ thuật n y l Rosalyn S Yalow v A Berson (năm 1956) dùng insulin đánh dấu phóng xạ để xác định thời gian tồn lu chúng máu tuần ho n bệnh nhân đái tháo đờng Kết nghiên cứu cho thấy insulin đánh dấu không bị phân huỷ nhanh nh giả thuyết Misky m tồn lâu so với ngời bình thờng Từ kết trên, tác giả đ sáng tạo kĩ thuật miễn dịch phóng xạ v đ nhận đợc giải thởng Nobel năm 1977 Với độ đặc hiệu v độ xác cao kỹ thuật n y định lợng đợc hầu hết nội tiết tố thể, góp phần quan trọng chẩn đoán bệnh nội tiết nh đái tháo đờng, lùn, rối loạn chức tuyết giáp, rối loạn chuyển hoá, rối loạn sinh dục Ng y phơng pháp n y ng y c ng đợc cải tiến v mở rộng nhiều lĩnh vực nh: nghiên cứu miễn dịch học, đánh giá tình trạng dinh dỡng, ung th học Đặc biệt việc sản xuất đợc kháng thể đơn dòng đ l m tăng độ nhạy kỹ thuật để định lợng chất có nồng độ cực thấp huyết V nh số tác giả đ đánh giá Phơng pháp định lợng miễn dịch phóng xạ đ dẫn đến cách mạng nghiên cứu y häc v sinh häc” Nguyªn lÝ chung 1.1 Nguyên lý Phơng pháp định lợng miễn dịch phóng xạ RIA dựa tính đặc hiệu cao phản ứng miễn dịch, chất cần định lợng đóng vai trò l kháng nguyên (KN) với kháng nguyên đồng miễn dịch nhng đợc đánh dấu đồng vị phóng xạ (KN*) liên kết với kháng thể (KT) đặc hiệu để tạo th nh phức hợp (KN*-KT) v (KN-KT) Nếu phản ứng miễn dịch n y ta cho mét l−ỵng d− thõa KN* v mét lợng hạn chế KT m khả liên kết KN v KN* víi KT l nh− th× sÏ có cạnh tranh KN* v KN việc kết hợp với KT Vì phơng pháp n y đợc gọi l phơng pháp định lợng phóng xạ cạnh tranh (Radiocompentitive assay) Sơ đồ phản ứng xảy nh− sau: KN + KT (F) KN* (KT - KN*) + (KT - KN) + KN* + KN (B) Y Học Hạt Nhân 2005 Trong đó: KN: Kháng nguyên (chất cần định lợng) KN*: Kháng nguyên đánh dấu KT: Kháng thể KT- KN*: Phức hợp kháng thể - kháng nguyên đánh dấu KT- KN: Phức hợp kháng thể - kháng nguyên không đánh dấu B (Bound): Dạng liên kết F (Free): Dạng tự - Nếu nồng độ KN tham gia phản ứng c ng tăng lợng KN* gắn với KT tạo liên kết KT- KN* (B) c ng giảm, lợng KN* dạng tự (F) c ng tăng - Nếu nồng độ KN tham gia phản ứng c ng giảm lợng KN* gắn với KT tạo liên kết KT- KN* (B) c ng tăng, lợng KN* dạng tự (F) c ng giảm Nh hoạt độ phóng xạ phức hợp (B) tỉ lệ nghịch với nồng độ KN cần định lợng Xây dựng đồ thị chuẩn (Standard curve) ta xác định nồng độ chất cần định lợng A B C Hình 5.2: Đồ thị chuẩn RIA A: Dạng đồ thị kinh điển RIA với trục ho nh v trục tung theo thang tuyến tính (Linear) B: Dạng đồ thÞ chn cã trơc tung (Y) theo thang tun tÝnh (Linear) v trôc ho nh (X) theo thang logarit C: Dạng đồ thị chuẩn có trục tung (Y) theo thang logit v trơc ho nh (X) theo thang logarit H×nh 5.1: Một số dạng đồ thị chuẩn A: Đồ thị tổng quát Berson v Yalow (1959) B: Đồ thị Hales v Randles (1963) C: Đồ thị Ekins (1968) D: Đồ thị Jorgensen (1969) Y Học Hạt Nhân 2005 1.2 Đồ thị chuẩn Đồ thị chuẩn l đờng cong biểu diễn mối tơng quan hoạt độ phóng xạ th nh phần (trên trục tung) v nồng độ chất cần định lợng (trên trục ho nh) Để xây dựng đồ thị chuẩn cần tách riêng phần liên kết (B) v phần tự (F), sau đo hoạt độ phóng xạ phần Hoạt độ phóng xạ biểu thị theo tỷ số B/F, F/B, B/B0 B/TC đó: : hoạt độ phần B chất cần định lợng - B0 - TC (Total count) : hoạt độ tổng hai phần B + F Đồ thị có dạng khác tuỳ thuộc v o tỷ số biểu diễn v thớc đo trục tọa độ Hiện để tiện cho việc tính toán v xử lý kết chơng trình computer ngời ta đ biểu diễn đồ thị chuẩn giá trÞ logit Logit ( B / B0 ) = log e [B / B0 ] [1 − B / B0 ] đó: Các th nh phần định lợng miễn dịch phóng xạ Có th nh phần chủ yếu hệ thống định lợng phóng xạ miễn dịch: - Kháng nguyên đánh dấu - Kháng thể (chất gắn đặc hiệu) - Hệ thống tách phần F v phần B 2.1 Kháng nguyên đánh dấu (Tracer) 2.1.1 Kháng nguyên Protein, glucoprotein, peptit có trọng lợng phân tử 3000 Dalton hay lớn l kháng nguyên tự nhiên v có tính gây miễn dịch (tạo kháng thĨ) C¸c steroid, c¸c hormon gi¸p, prostaglandin v mét sè thuốc có trọng lợng phân tử nhỏ có tính kháng nguyên nhng tính gây miễn dịch (kháng nguyên không ho n to n) v đợc gọi l hapten Để tạo đợc kháng thể, kháng nguyên n y cần đợc gắn với prorotein thích hợp nh albumin, globulin, polylysin chất có trọng lợng phân tử cao Trong thực tế protein thờng đợc sử dụng để gắn với hapten l albumin huyết bò Sơ đồ dới mô tả liên kết hapten với protein để tạo th nh phức hợp có tính kháng nguyên ho n to n + Hapten + Albumin huyết bò (Hapte - albumin) = kháng nguyên 2.1.2 Kháng nguyên đánh dấu phóng xạ Các kháng nguyên đợc đánh dấu phóng xạ dùng kỹ thuật RIA gọi l tracer Kháng nguyên đánh dấu phải đặc biệt tinh khiết v có hoạt độ riêng cao tính chất n y định độ đặc hiệu v độ nhạy phép định lợng Các đồng vị phóng xạ (ĐVPX) thích hợp dùng để đánh dấu kháng nguyên cần có đặc tính sau đây: - Có hoạt độ riêng tối thiểu đủ cao để đảm bảo độ nhạy phản ứng - Gắn tơng đối dễ d ng v o chất cần đánh dấu - Thời gian bán huỷ không ngắn không d i Các ĐVPX thờng đợc sử dụng để đánh dÊu l : 125I, 131I, 3H, 57Co, 32P, 35S Trong thực tế 125I có thời gian bán r tơng đối d i (60 ng y) nên thông dụng Các Y Học Hạt Nhân 2005 ĐVPX l nguyên tố cấu trúc nên phân tử kháng nguyên, trình đánh dấu chúng thay nguyên tố đ có phân tử kháng nguyên gắn thêm v o cấu trúc chúng Đối với hormon đa peptit, cách đánh dấu l dùng 125I 131I Để tăng khả gắn iốt v o phân tử protein cần oxy hoá iốt với chất xúc tác l cloramin T để tạo I0 từ I - (v× chØ cã ièt tù ë møc oxy hoá cao có khả gắn chặt với protein) Phơng thức đánh dấu n y cần phải đợc tiến h nh thận trọng để không l m thay ®ỉi thc tÝnh sinh häc cđa hỵp chÊt nhÊt l thuộc tính miễn dịch hay thuộc tính sinh học đặc biệt khác Với chất phi peptit, đánh dấu đồng vị phóng xạ v o cấu trúc phân tử phơng pháp sinh tổng hợp (Ví dụ: 3H - cortisol, 57Co - cyanocobalamin, 125I hc 131 I - triodothyronin v thyroxin) Trong trình bảo quản, hợp chất đánh dấu thờng bị hai ảnh hởng sau: - Thay đổi cấu trúc lợng xạ phân tử kháng nguyên, đặc biệt kháng nguyên có trọng lợng phân tử thấp - Các ĐVPX tách khỏi hợp chất đánh dấu l m giảm hoạt độ phóng xạ chúng v giải phóng ĐVPX dạng tự dẫn đến sai lệch kết chẩn đoán Vì cần kiểm tra độ tinh khiết hoá phóng xạ hợp chất đánh dấu trớc sử dụng Theo lí thuyết để bảo quản hợp chất đánh dấu phóng xạ cần pha lo ng để tránh xạ ion hoá Nhng điều n y áp dụng cho hợp chất đánh dấu RIA Vì ngời ta phải dùng loại dung môi đặc biệt để bảo quản nhằm giảm hiệu ứng xạ ion hoá Nhiệt độ quan trọng độ bền vững hợp chất đánh dấu nhiệt độ cao, iốt phóng xạ dễ tách khỏi hợp chất đánh dấu, nhiệt độ thấp dễ gây biến tính kháng nguyên v phá huỷ liên kết Do nên bảo quản nhiệt độ + C 2.2 Kháng thể (chất gắn đặc hiệu) Hầu hết mô phát triển cao nhận biết vật lạ xâm nhập v o thể cấu trúc hoá học chúng không giống cấu trúc chất thể Một vật lạ nh đợc gọi l kháng nguyên Khi v o thể kháng nguyên kích thích hệ thống miễn dịch tạo kháng thể Kháng thể chất l protein (globulin miễn dịch), kết hợp với kháng nguyên tạo th nh phức hợp kháng nguyên- kháng thể 2.2.1 Tạo kháng thể (kháng huyết thanh) Để tạo kháng thể đặc hiệu, ngời ta thờng dùng kháng nguyên gây miễn dịch cho động vật Súc vật thích hợp để gây miễn dịch l lợn biển, thỏ, chuột lang, khỉ v động vật khác Trên thực tế thỏ v lợn biển thờng đợc dùng nhiều Những súc vật để gây miễn dịch chän ë løa ti trung b×nh Giíi tÝnh cđa sóc vật ý nghĩ việc tạo miễn dịch Có thể gây miễn dịch cho súc vật cách tiêm kháng nguyên v o phúc mạc, cơ, da, dới da tĩnh mạch Nhiều tác giả cho mũi nên tiêm b n chân, mũi sau tiêm vị trí khác thể Các kháng nguyên đa v o phải đảm bảo số lợng v chất lợng l tính gây miễn dịch Lợng kháng nguyên để tạo miễn dịch súc vật phụ thuộc v o loại hormon v cá thể gây miễn dịch Sau tiêm kháng nguyên, kháng thể bắt đầu đợc hình th nh Nồng độ kháng thể máu tăng dần v đạt mức cao nhÊt tõ 10 ®Õn 14 ng y sau mịi tiêm đầu tiên, v sau giảm dần Để trì lợng kháng thể máu cần phải tiêm kháng Y Học Hạt Nhân 2005 nguyên nhắc lại nhiều lần Khoảng cách lần tiêm tuỳ thuộc v o loại kháng nguyên v tính đặc hiệu chúng 2.2.2 C¸c thc tÝnh cđa kh¸ng hut C¸c kh¸ng huyết thu đợc trình gây miễn dịch động vật cần phải đợc kiểm tra độ nhạy, độ đặc hiệu v xác định nồng độ phản ứng thích hợp cho phép định lợng Để có đợc nồng độ thích hợp, kháng huyết cần đợc pha lo ng gắn đợc 50% kháng nguyên đánh dấu (B/F=1) có kháng nguyên không đánh dấu Møc dé pha lo ng cđa kh¸ng hut phơ thuộc v o hoạt độ riêng kháng nguyên v độ đặc hiệu kháng thể Độ nhạy kháng huyết đợc xác định khả phát đợc lợng nhỏ kháng nguyên cần định lợng Tính đặc hiệu kháng huyết đợc xác định không l khả gắn với kháng nguyên cần định lợng, m phản ứng chéo với kháng nguyên khác có cấu trúc tơng tự để tạo th nh liên kết không đặc hiệu l m giảm độ nhạy nghiệm pháp Chính cần phải kiểm tra độ đặc hiệu v độ nhạy kháng huyết trớc sử dụng 2.2.3 Bảo quản kháng huyết Sau thu đợc kháng huyết thích hợp, việc bảo quản cần phải quan tâm đến để chúng không bị thay đổi sử dụng Phơng pháp bảo quản thông thờng l l m đông khô, chia th nh lợng nhỏ v giữ nhiệt độ -23 C Trớc dùng, cần để tan đá tự nhiên v sử dụng Một phơng pháp khác l l m tủa gammaglobulin, sau l m thấm tích v đông khô dạng n y lu giữ kháng thể đợc nhiều năm m không l m thay đổi tính chất chúng 2.3 Hệ thống tách phần tự (F) v phần phức hợp (B) Đây l khâu quan trọng kỹ thuật định lợng miễn dịch phóng xạ Có tách đợc đo hoạt độ phóng xạ phần B, phần F để lập tỷ số v xây dựng đồ thị chuẩn Có số kỹ thuật tách nh sau: - Phơng pháp tách phần F khỏi phần B: kỹ thuật nh sắc ký, điện di gel, điện di giấy, trao đổi ion, thẩm tích, lọc - Phơng pháp hấp phụ pha rắn th nh phần F: chất hấp phụ nh nhựa Amberlit, than ho¹t, Silicat, Dextran, Florisil, bét Sellulose, Sephadex - Phơng pháp hấp phụ pha rắn th nh phần B b»ng c¸c kü tht: + KÕt tđa ho¸ häc (Chemical precipitation): dùng dung môi hữu nh polyethylenglucol (PEG) muối (NH4)2SO4, Na2SO4 + Kết tủa miễn dịch phóng xạ (Immunological precipitation): dùng kháng thể thứ hai (kỹ thuật Sandwich) Kháng thể thứ đợc hấp phụ gắn hoá học lên bề mặt giá đỡ rắn (th nh ống nghiệm hay hạt nhựa), kháng thể thứ hai dạng tự v đợc đánh dấu phóng xạ Kháng nguyên cần định lợng liên kết với hai kháng thể n y Phơng pháp n y thờng đợc sử dụng kỹ thuật định lợng đo phóng xạ miễn dịch (IRMA) Các bớc tiến h nh 3.1 Chuẩn bị bệnh nhân Bệnh nhân đợc lấy máu đói thời điểm khác tuỳ theo yêu cầu xét nghiệm Mẫu máu không chống đông đợc ly tâm để lấy huyết Các Y Học Hạt Nhân 2005 mẫu huyết cần đợc định lợng c ng sớm c ng tèt NÕu ch−a l m cã thĨ l−u gi÷ ®−ỵc v i ng y ë nhiƯt ®é 2-8 0C, để lâu cần bảo quản nhiệt độ -20 0C 3.2 Hãa chÊt, dơng v thiÕt bÞ đo đếm 3.2.1 Hóa chất: RIA kit đợc h ng chế sẵn 3.2.2 Dụng cụ v thiết bị đo đếm: - Bộ micropipets, máy trộn mẫu, máy lắc mẫu tự động, máy ly tâm, tủ lạnh - Thiết bị đo đếm: Máy đo hoạt độ phóng xạ chuyển mẫu tự động bán tự động có gắn phần mềm để xử lý số liệu computer theo chơng trình đ đợc g i đặt sẵn 3.3 Qui trình định lợng Tuỳ theo chất cần định lợng v Kit h ng sản xuất m quy trình thực có chi tiết khác Để minh hoạ, sau l qui trình định lợng FT3 với kit RIA – FT3 cđa h ng CIS Biointernational (Ph¸p) Mét bé RIA – FT3 kit gåm cã: - lä 110 ml tracer 125I- FT3 víi ho¹t tÝnh