CHƯƠNG III. CÔNG NGHỆ PHÔI VÔ TÍNH – HẠT NHÂN TẠO pps

Công nghệ sinh học thực vật Chương 3. Công nghệ phôi vô tính – Hạt nhân tạo 22  CHƯƠNG III. CƠNG NGHỆ PHƠI VƠ TÍNH – HẠT NHÂN TẠO Một vấn đề trong việc sử dụng phương pháp ni cấy mơ để tạo nên cây con mới nhằm thay thế phương pháp nhân giống bằng hạt là phải tính đến việc giảm nhân cơng lao động để từ đó giảm giá thành cây ni cấy mơ. Một trong những giai đoạn tốn nhiều sức lao động nhất là giai đoạn chuyển cây ni cấy mơ sang điều kiện ex vitro. Phơi vơ tính có một ưu thế rất đặc biệt so với các thể nhân giống in vitro khác là nó sở hữu một hệ thống vận chuyển tương tự như hạt ngồi tự nhiên. Nhờ đó mà phơi vơ tính được nghiên cứu rất nhiều và được sử dụng để làm vật liệu để sản xuất hạt nhân tạo, đây là một phương pháp thu được nhiều lợi nhuận dựa trên khả năng nhân giống cây trồng thơng qua sự phát triển phơi sinh dưỡng. 1. Phơi vơ tính Hạt là cơ quan bảo quản chất mầm và nhân giống ở tất cả thực vật có hoa. Hạt có chứa phơi phát triển từ hợp tử sau khi sự thụ tinh giữa một tế bào trứng với một giao tử đực diễn ra. Sự tái tổ hợp gene trong suốt q trình hình thành cũng như sự kết hợp giữa hai giao tử đóng vai trò quan trọng trong sự tiến hố của thực vật hạt kín. Trong suốt q trình tiến hóa, nhiều lồi thực vật đã phát triển nên những cách nhân giống mới để vượt qua các trở ngại gây ra bởi yếu tố mơi trường, gene, yếu tố vật lý làm ngăn cản q trình ra hoa, tạo hạt. Các cách nhân giống mới này bao gồm sự tạo thành những cấu trúc như thân củ, thân rễ, củ, thân bò, Một hình thức tiến bộ khác xuất hiện ở những lồi có khả năng sinh sản vơ tính đó là tạo phơi từ giao tử khơng được thụ tinh hoặc từ các tế bào sinh dưỡng. Cũng giống như phơi hợp tử, các phơi vơ tính này phát triển trong hạt, được bảo vệ và phân tán đi như các hạt tự nhiên. Sinh sản vơ tính được coi như là khơng chịu kiểm sốt bởi gene, nhưng các điều kiện mơi trường về nhiệt độ, quang kỳ cũng thúc đẩy sự phát triển từ hữu tính sang vơ tính. Sự tạo phơi vơ tính bất định xuất hiện ở một số lồi thực vật hạt kín trong tự nhiên hay trong các thí nghiệm được tiến hành bằng phương pháp ni cấy mơ và tế bào thực vật in vitro. Q trình hình thành phơi vơ tính này được mơ tả bằng thuật ngữ “somatic embryogenesis”. Những mơ tả đầu tiên về sự hình thành phơi vơ tính trong ni cấy tế bào được đưa ra khi ni cấy tế bào cà rốt. Kể từ đó thì hiện tượng này được nghiên cứu thành cơng trên nhiều đối tượng một lá mầm thuộc các họ: Alliaceae, Araceae, Asparagaceae, Dioscoreaceae, Gramineae, Henerocallidaeae, Iridaceae, Liliaceae, Musaceae, Orchidaeae, Zingiberaceae. Công nghệ sinh học thực vật Chương 3. Công nghệ phôi vô tính – Hạt nhân tạo 23  1.1. Khái niệm về phơi vơ tính Phơi vơ tính, phơi soma, phơi sinh dưỡng hay phơi thể hệ đều là khái niệm để mơ tả một cấu trúc lưỡng cực bất định bao gồm cực chồi và cực rễ, mà dưới những điều kiện thích hợp thì có thể phát triển thành một cơ thể có chức năng hồn chỉnh. Sự hình thành phơi vơ tính được xem như là một con đường phát triển riêng biệt, khác hẳn với con đường phát sinh cơ quan chồi và rễ. Trong đó, một tế bào sẽ phát triển thành một cấu trúc có mơ phân sinh chồi và rễ đầy đủ và khơng có kết nối với hệ thống mao mạch của mơ mẹ ban đầu. Sự tạo phơi vơ tính là một q trình ngun vẹn và vì vậy sự phát sinh chồi chỉ là một biến đổi của q trình cảm ứng và phát triển của phơi. Với quan niệm như trên thì sự tạo phơi có thể được coi như là kết quả của một chuỗi các sự kiện phát sinh cơ quan cạnh tranh nhau. Khơng như những cơ thể sinh vật khác, ở thực vật, tính tồn thế của tế bào khơng chỉ có ở các tế bào của phơi hợp tử mà các tế bào sinh dưỡng cũng có mang tính tồn thế. Sự linh hoạt của chương trình biệt hóa giúp cho các tế bào đã biệt hóa hồn tồn vẫn có thể trở về giai đoạn sinh phơi dưới những điều kiện nhất định. Sự lặp lại tồn bộ chương trình phát sinh cơ thể thơng qua việc khởi đầu sự tạo phơi đòi hỏi sự tái thiết lập biểu hiện của những gene cần thiết. Sau khi đã hồn tồn thốt khỏi chức năng trước đó của các tế bào đã biệt hóa, các tế bào sinh dưỡng mang tính tồn thế dưới tác động cảm ứng phân chia của tế bào sẽ có trạng thái biến dưỡng tương tự như phơi hợp tử. Phơi vơ tính có thể được hình thành từ một tế bào đơn hay từ cả một cụm tế bào. Thơng qua một q trình phân chia có thứ tự, ở phơi sẽ diễn ra sự biệt hố, trưởng thành và phát triển thành cây con. Cây có thể phát triển từ một hay từ một cụm tế bào phơi. Sự sinh phơi từ một tế bào sinh dưỡng được định nghĩa là một q trình mà trong đó một hay vài tế bào sinh dưỡng, trong các điều kiện thực nghiệm (bao gồm việc sử dụng các chất điều hòa sinh trưởng thực vật), có thể tham gia vào một q trình phân chia theo một trật tự nhất định để tạo thành một phơi, theo kiểu giống hay gần giống như kiểu sinh phơi từ hợp tử. Giống như các tế bào của mơ phân sinh, các tế bào có khả năng sinh phơi có các đặc tính cơ bản như sau: tế bào có kích thước nhỏ, đẳng kính, có hoạt động biến dưỡng rất mạnh mẽ, cường độ tổng hợp acid ribonucleic cao, thể tích khơng bào giảm, tăng thể tích tế bào chất, nhân và hạch nhân rất to và đậm màu, đặc biệt là các tế bào này có một số lượng lớn các ribosome, ty thể, hạt tinh bột và có mạng Công nghệ sinh học thực vật Chương 3. Công nghệ phôi vô tính – Hạt nhân tạo 24  lưới nội chất nhỏ. Các tế bào có khả năng sinh phơi được phân biệt rõ ràng với các tế bào khơng có khả năng sinh phơi dựa trên những đặc tính trên. Phơi vơ tính được hình thành sau khi được cảm ứng sẽ trải qua những giai đoạn phát triển tương tự như phơi hợp tử. Đối với phơi của thực vật hai lá mầm thì sau giai đoạn tiền phơi sẽ là giai đoạn phơi hình cầu, hình tim, hình thủy lơi và giai đoạn 2 lá mầm tương tự như ở phơi hữu tính (Hình 3.1). Phơi của thực vật một lá mầm sẽ trải qua giai đoạn hình cầu (hình trứng hay hình chùy), bao lá mầm và lá mầm (một lá mầm hay thuẫn). Q trình hình thành cơ quan tính từ khi phơi hình cầu phát triển sang giai đoạn lá mầm được gọi là sự biệt hóa mơ. Sự tạo cơ quan phơi một lá mầm về căn bản giống ở cây hai lá mầm trừ vài khác biệt về số tử diệp hay tính đối xứng của phơi. Hình 3.1. Các biến đổi hình thái hợp tử cây Capsella bursa-pasturis Phơi vơ tính rất giống phơi hữu tính ở hình thái và sinh lý nhưng khơng có q trình tái tổ hợp di truyền do phơi vơ tính khơng phải là sản phẩm của sự thụ tinh giữa giao tử đực và giao tử cái. Về ngun tắc, tất cả những cây con được tái sinh bằng con đường này đều có vật chất di truyền giống hệt các tế bào sinh dưỡng cha mẹ, nếu tế bào này được chuyển gene thì các cây tái sinh là cây chuyển gene. Nhân giống vơ tính thực vật qua con đường phát sinh phơi vơ tính cho hệ số nhân rất cao. Tuy nhiên, sự phát triển bình thường của tất cả các phơi này là cả một vấn đề. Các cơng ty hạt giống đang nghiên cứu q trình này để sản xuất hạt nhân tạo. Công nghệ sinh học thực vật Chương 3. Công nghệ phôi vô tính – Hạt nhân tạo 25  1.2. Một số khía cạnh giả định trong sự hình thành phơi vơ tính Tất cả các tế bào sinh dưỡng của thực vật đều có chứa tồn bộ thơng tin di truyền cần thiết cho việc hình thành nên một cơ thể thực vật hồn thiện với đầy đủ các chức năng cần thiết. Trong suốt q trình phát triển, sự biểu hiện gene ở thực vật được kiểm sốt chặt chẽ theo khơng gian và thời gian để cho phép sự biệt hóa của rất nhiều cơ quan trong cơ thể. Sự cảm ứng hình thành phơi vơ tính phải làm kết thúc sự biểu hiện của một gene trong mơ thực vật tại thời điểm đó, và thay thế nó bằng chương trình biểu hiện của gene sinh phơi. Thuật ngữ IEDC (induced embryogenic determined cell) nhằm mơ tả những tế bào có khả năng sinh phơi xuất phát ban đầu là những tế bào khơng sinh phơi. Những tế bào của phơi hợp tử đã có sẵn chương trình biểu hiện của các gene sinh phơi thì được gọi bằng thuật ngữ PEDC (pre-embryogenic determined cell). Cả IEDC và PEDC đều có chức năng tương tự nhau là nhằm mục đích tái sinh, và cả hai có thể được gọi chung bằng thuật ngữ EDC – embryogenic determined cell, hay gọi đơn giản là EC – embryogenic cell. Thuật ngữ EC được sử dụng nhiều hơn bởi vì sự hình thành phơi vơ tính khơng phải là một hiện tượng chắc chắn sẽ xảy ra của các EC, do đó thuật ngữ EC cho thấy là các tế bào sinh phơi này có tính mềm dẻo trong một số trường hợp. Các thí nghiệm nhằm hình thành phơi vơ tính đều phụ thuộc vào việc mơ cấy chứa các PEDC hoặc là EC. Nếu mơ cấy có các PEDC thì chỉ cần một sự kích thích phân chia tế bào là đủ để hình thành phơi, và q trình này được gọi là sự hình thành phơi vơ tính trực tiếp bởi vì phơi xuất hiện trực tiếp từ mơ cấy. Ngược lại, nếu các mơ cấy là những tế bào đã phân hóa khơng còn khả năng sinh phơi thì chúng cần phải trải qua nhiều lần phân chia tế bào liên tiếp dưới sự cảm ứng của auxin trong suốt q trình để được tái lập trình đi vào con đường sinh phơi. Các tế bào được sinh ra do nhiều lần phân chia ngun nhiễm được gọi là mơ sẹo, và q trình này được gọi là sự hình thành phơi vơ tính gián tiếp vì phải thơng qua giai đoạn tạo mơ sẹo. Sự chuyển vị từ các tế bào mơ sẹo sang trạng thái sinh phơi đi kèm với những thay đổi trong sự sắp xếp của các vi ống từ định hướng ngẫu nhiên để sắp xếp thành những hàng thẳng song song với nhau. Trong thực tế, một mơ cấy có thể rơi vào nhiều trạng thái giữa trạng thái có đặc tính sinh phơi và khơng sinh phơi, tùy thuộc vào độ tuổi sinh lý của mơ cấy đó. Điều này có thể ảnh hưởng đến việc cảm ứng tạo phơi vơ tính. Từ đó có thể giải thích được tại sao có sự khác biệt về khả năng tạo phơi của các loại mơ cấy khác nhau. Ví dụ, mơ cấy cây đậu nành, cà chua, cây lanh chứa các tế bào già thì tạo những phơi bất bình thường hơn những tế bào còn non. Khi các phơi hợp tử Công nghệ sinh học thực vật Chương 3. Công nghệ phôi vô tính – Hạt nhân tạo 26  đậu nành đạt đến giai đoạn khi mà mọi sự phân chia tế bào đều kết thúc thì khơng thể nào cảm ứng sự hình thành phơi vơ tính nữa. Hình 3.2. Vai trò tuổi sinh lý của mẫu cấy trong việc khởi phát sự sinh phơi vơ tính Mẫu cấy bao gồm các tế bào có thể rơi vào các trạng thái giữa trạng thái có khả năng sinh phơi (PEDC) và khơng có khả năng sinh phơi (non-EC). (A) Phơi hợp tử còn non có nhiều khả năng sinh phơi nhất và sẽ đáp ứng các xử lý cytokinin để hình thành phơi vơ tính. (B) Phơi hợp tử trưởng thành hơn sẽ khơng còn khả năng đáp ứng cytokinin riêng lẽ nữa mà đòi hỏi một nhân tố auxin để tạo phơi vơ tính. (C) Ở những lồi thực vật và mơ cấy mà có thể đảo ngược từ trạng thái khơng sinh phơi sang có khả năng sinh phơi sẽ hình thành phơi vơ tính thơng qua giai đoạn mơ sẹo khi được xử lý kết hợp auxin và cytokinin. Những mơ cấy này bao gồm các tế bào cần được cảm ứng để có khả năng sinh phơi (IEDC). 1.3. Nguồn gốc của phơi vơ tính Một chủ đề có liên quan khác đó là phơi vơ tính có nguồn gốc từ một tế bào hay nhiều tế bào. Một giả thuyết cho rằng mơ PEDC thì sẽ tạo thành phơi có nguồn gốc từ nhiều tế bào, trong khi phơi vơ tính thứ cấp (phơi vơ tính có nguồn gốc từ phơi vơ tính khác) có khuynh hướng là từ tế bào đơn. Công nghệ sinh học thực vật Chương 3. Công nghệ phôi vô tính – Hạt nhân tạo 27  Quan điểm khác thì cho rằng các hệ thống tạo phơi vơ tính khơng thơng qua giai đoạn mơ sẹo thì phơi vơ tính sinh ra có nguồn gốc từ một tế bào. Những hệ thống khác, đặc biệt là hệ thống đòi hỏi phải thơng qua giai đoạn tạo mơ sẹo trong ni cấy lỏng, huyền phù tế bào thì nguồn gốc một tế bào của phơi vơ tính khơng chắc chắn lắm và vẫn còn gây nhiều tranh cãi. Tuy nhiên, khơng thể biết chính xác rằng các tế bào nằm trong khối sinh phơi này là những tế bào đã được quyết định sinh phơi hay khơng. Hơn nữa, trong hệ thống ni cấy lỏng, chính điều kiện vật lý đã làm thay đổi hình dạng của các phơi vơ tính, ngăn chặn sự hình thành một khối tiền phơi có thể nhìn thấy được từ một tế bào đơn. Một tế bào đã cơ lập thì gần giống với phơi hợp tử, có nghĩa là nó được giải phóng khỏi tế bào bên cạnh cũng như các chất tiết của tế bào bên cạnh và do vậy phát triển thành phơi giống như một hợp tử. Giả thuyết này nghe có vẻ hợp lý và thuyết phục nhưng vẫn chưa được ủng hộ bởi những nghiên cứu mà trong đó phơi vơ tính xuất hiện trên bề mặt hoặc sâu bên trong các mơ ni cấy và mơ sẹo có tổ chức bằng sự biến đổi của các tế bào có liên kết hữu cơ với những tế bào trung gian bên cạnh. Khi một tế bào đã được quyết định để trở nên sinh phơi thì khơng phải tất cả các tế bào có khả năng sinh phơi đó đều phát triển thành phơi vơ tính. Trong hệ thống biểu mơ của cây lúa, bằng cách xem xét những tương đồng trong cấu trúc của các tế bào người ta thấy rằng nhiều tế bào có khả năng tạo phơi. Tuy nhiên, chỉ một vài phơi vơ tính xuất hiện. Tương tự như vậy, ở cà rốt chỉ có một hoặc vài phơi vơ tính được tạo thành từ một khối tiền phơi. Người ta cho rằng có một sự cạnh tranh giữa các tế bào này vì vậy chỉ có những tế bào nào chiếm ưu thế hơn thì mới tạo nên phơi vơ tính. Ở các hệ thống ni cấy khác nhau thì một tế bào tạo nên một phơi vơ tính có thể bằng cách trực tiếp hoặc gián tiếp thơng qua vài chu kỳ phân chia, tuy nhiên điều kiện ni cấy, sự tương tác với các tế bào bên cạnh có thể làm ảnh hưởng đến sự phát triển của chúng sau này. 1.4. Đặc điểm của thực vật tái sinh từ con đường hình thành phơi vơ tính Mặc dù rõ ràng là hệ thống tạo phơi có khả năng sản xuất ra một số lượng đáng kể các thể nhân giống ở vài lồi thực vật có giá trị thương mại quan trọng, nhưng cơng việc kiểm tra sự biểu hiện của cây từ phơi vơ tính ex vitro vẫn còn cần được tìm hiểu kỹ. Về ngun tắc thì phơi vơ tính khơng giống như phơi hữu tính là nó khơng trải qua q trình trao đổi chéo và tái tổ hợp của DNA, do đó phơi vơ tính tiêu biểu cho một hệ thống nhân giống vơ tính mà trong đó cây con được tạo thành vẫn duy trì các đặc tính của cây mẹ. Nếu có sinh ra đột biến thì đó là đột Công nghệ sinh học thực vật Chương 3. Công nghệ phôi vô tính – Hạt nhân tạo 28  biến sinh ra trong q trình ni cấy in vitro. Tuy nhiên, tần số đột biến ở sự tạo phơi vơ tính thấp hơn là từ hệ thống tái sinh cây từ mơ sẹo, vì phơi vơ tính phát triển nhanh để tạo thành cá thể hồn chỉnh nên đặc tính chống chịu với đột biến và những biến đổi cá thể thấp hơn ở sự ni cấy cơ quan. Điều này rất quan trọng trong nhân giống cây trồng vì phải duy trì tính đồng nhất của các cây nhân giống. Trong phân tích các cây con tái sinh từ phơi vơ tính người ta nhận thấy các cây này có sức sống cao, dễ sống khi chuyển ra mơi trường đất và sinh trưởng, phát triển tốt nhờ nó có các trục rễ và chồi mạnh. Có lẽ một trong những đặc điểm quan trọng của cây từ phơi là nó khơng xuất hiện những bất thường về hình thái trong tự nhiên và khơng có những thay đổi nào về di truyền và tế bào. Điều này có thể là do nguồn gốc một tế bào của phơi và do sự chọn lọc tế bào nghiêm ngặt trong suốt q trình phát triển thành phơi. 1.5. Ứng dụng của q trình tạo phơi vơ tính Q trình hình thành phơi vơ tính đã mang lại nhiều ứng dụng thực tiễn và có tính thương mại to lớn, đặc biệt trong vi nhân giống in vitro. Trên lý thuyết, từ một mẫu mơ được ni cấy có thể sản xuất ra vơ số tế bào phơi. Tốc độ nhân giống từ phơi cao hơn nhiều so với việc nhân giống từ mơ phân sinh. Đây chính là một ưu thế của nhân giống từ phơi so với các phương pháp nhân giống in vitro khác. Ngồi ra, số lượng lớn của phơi chính là một nguồn ngun liệu đáng kể phục vụ cho những ứng dụng thực tiễn quan trọng khác như sản xuất hạt nhân tạo, cải thiện chất lượng cây trồng (là ngun liệu cho chọn lọc tế bào, biến nạp gene, lai soma, tạo những cây đa bội), bảo quản chất mầm, loại trừ virus, sản xuất các chất biến dưỡng in vitro và sự thành lập khuẩn căn in vitro. 1.5.1. Sự chọn lọc tế bào Sự chọn lọc tế bào là việc tái sinh thực vật từ các quần thể tế bào kết hợp với việc chọn lọc những đặc tính mong muốn của gene. Việc cần thiết nhất là phải sử dụng những hệ thống tái sinh thực vật có khả năng tái tạo nên một cây mới từ tế bào đơn nhằm tránh sự xuất hiện các biến dị trên gene. Q trình hình thành phơi vơ tính cho phép tái tạo nên những cây hồn chỉnh từ các tế bào đơn, từ đó ứng dụng trong các chương trình chọn lọc tế bào. Các quần thể tế bào dùng trong chọn lọc tế bào có thể được gây đột biến một cách nhân tạo, tuy nhiên khơng cần phải tốn thời gian và tiền bạc để gây đột biến các tế bào trong ni cấy in vitro bởi vì bản thân chúng trong q trình ni cấy cũng đã xuất hiện những biến đổi phân dòng soma. Thực vật có nguồn gốc từ Công nghệ sinh học thực vật Chương 3. Công nghệ phôi vô tính – Hạt nhân tạo 29  ni cấy in vitro có thể mang những biến đổi về kiểu hình và thường là di truyền được. Những biến đổi này gọi là biến dị soma và các cây có nguồn gốc từ phơi vơ tính cũng xuất hiện những biến dị trên. Biến đổi soma là một vấn đề nghiêm trọng trong nhân giống vơ tính, tuy nhiên nó lại có giá trị trong các chương trình chọn lọc tế bào. Các biến đổi soma có thể tạo ra những đặc tính quan trọng trong nơng nghiệp chẳng hạn như làm tăng khả năng chịu mặn, hay trở nên kháng được thuốc diệt cỏ, kháng bệnh, chịu phèn hay chịu hạn, hoặc có thể xuất hiện những đột biến sinh hóa thú vị khác. Ví dụ như sự chọn lọc tế bào và tái sinh cây thơng qua phơi vơ tính đã được ứng dụng để tăng tính chịu mặn và kháng bệnh ở cây Citrus, kháng virus ở cây mía, kháng phytotoxin ở cây cà phê. 5.1.2. Sự tái sinh các thực vật chuyển gene Có nhiều cách để tái sinh cây sau khi đã được chuyển gene bằng con đường phơi vơ tính:  Biến nạp vào mẫu cấy và sau đó cho tái sinh thơng qua tạo phơi vơ tính trực tiếp.  Biến nạp vào mẫu cấy và sau đó cho tái sinh thơng qua tạo phơi vơ tính gián tiếp.  Biến nạp vào tế bào có khả năng sinh phơi và sau đó tái sinh bằng con đường sinh phơi gián tiếp.  Biến nạp vào phơi vơ tính và tái sinh thơng qua con đường sinh phơi thứ cấp hoặc sinh phơi gián tiếp.  Biến nạp vào trong phơi vơ tính, tăng sinh thơng qua con đường hình thành phơi thứ cấp và sau đó tái sinh thơng qua con đường hình thành cơ quan. 5.1.3. Sự tạo các dòng đồng hợp tử và đa bội Q trình hình thành phơi vơ tính cũng có thể làm xuất hiện những cây tái sinh đa bội. Xử lý colchicine hoặc amiprophos-methyl làm ngăn chặn sự hình thành vi ống trong mơi trường ni cấy phơi vơ tính sẽ thúc đẩy sự hình thành các phơi đa bội. Những thực vật tam bội cũng có thể được tái sinh nếu phơi vơ tính được hình thành có nguồn gốc từ nội nhũ. Hoặc cũng có thể tạo được những cây đơn bội khi ni cấy các mẫu cấy đơn bội như hạt phấn, bào tử thơng qua con đường hình thành phơi vơ tính. Sự kết hợp của sự tạo cây đơn bội và các kỹ thuật nhân đơi bộ nhiễm sắc thể cũng giúp tạo nên các cây đồng hợp tử ở thế hệ đầu tiên. Công nghệ sinh học thực vật Chương 3. Công nghệ phôi vô tính – Hạt nhân tạo 30  1.5.4. Sự loại trừ virus Phơi vơ tính có một hệ mao mạch rất phát triển, tuy nhiên hệ thống này khơng nối liền với hệ mạch dẫn của mơ cấy. Điều này có nghĩa là việc tạo phơi vơ tính cũng có thể giúp để tạo được các dòng cây sạch bệnh virus, có thể kết hợp với biện pháp sốc nhiệt để đạt được kết quả tốt hơn. Các loại virus GFLV (Grapevine Fan Leaf Virus) và A-2 và 3-GLR (Grapevine Leafroll associated virus) đã được loại trừ bằng cách sử dụng phương pháp tạo phơi vơ tính kết hợp với các liệu pháp nhiệt. Mơ sẹo hình thành từ bao phấn và bầu nỗn của những cây bị nhiễm GFLV và các loại virus GLR khác. Các mơ sẹo này được sốc nhiệt (35 o C) và phơi vơ tính được tạo ra sau đó đã nảy mầm và phát triển thành cây. Các cây tái sinh này được kiểm tra bằng phương pháp miễn dịch học và các kiểm nghiệm huyết thanh học. Kết quả sau đó cho thấy sự hình thành phơi vơ tính kết hợp với sốc nhiệt là một q trình hiệu quả nhằm loại trừ các bệnh virus. Phương pháp này cũng được áp dụng thành cơng ở cây Citrus. Vòi nhụy của cây chanh thuộc các giống khác nhau đã bị nhiễm các bệnh virus có khả năng sinh phơi vơ tính. Cây tái sinh từ phơi vơ tính này cho kết quả âm tính khi thử nghiệm sự hiện diện của virus và viroid. 1.5.5. Sự thành lập khuẩn căn Việc kết hợp giữa sự hình thành phơi vơ tính và sự hình thành khuẩn căn in vitro được đưa ra đầu tiên do Redenbaugh và cộng sự vào năm 1987. Các ứng dụng của nó rất hấp dẫn nhưng đến nay vẫn có rất ít các cơng trình nghiên cứu về điều này. Các nghiên cứu cho thấy việc ủ các nấm khuẩn căn ngồi vào mơi trường đã thúc đẩy sự phát triển của cây con có nguồn gốc từ phơi vơ tính. 2. Cơng nghệ hạt nhân tạo Giống như phơi từ hạt, phơi vơ tính có mang sẵn các mơ rễ và chồi, nghĩa là đã được thiết lập sẵn một chương trình để phát triển thành cây hồn thiện. Bên cạnh đó, phơi vơ tính khơng như chồi bất định là vì nó khơng có hệ thống mao mạch nối liền với nguồn mơ ban đầu. Vì tất cả lý do trên mà phơi vơ tính khơng như bất kỳ thể nhân giống thực vật nào khác là nó khơng cần giai đoạn kéo giãn chồi, cắt chồi và giai đoạn ra rễ trước khi chuyển sang mơi trường đất trồng tự nhiên. Tuy vậy, phơi vơ tính cũng có những khác biệt so với phơi hữu tính: (1) khơng được phát triển bên trong một vỏ bọc hạt, (2) khơng phải trải qua q trình làm khơ nhờ nguồn mơ mẫu ban đầu, và (3) khơng được trang bị một hệ thống Công nghệ sinh học thực vật Chương 3. Công nghệ phôi vô tính – Hạt nhân tạo 31  chất dự trữ, nghĩa là khơng được cung cấp năng lượng cần thiết và các nhân tố cần thiết khác cho đến khi nó có thể bắt đầu thực hiện quang hợp. Do vậy, các nghiên cứu về vấn đề tạo hạt nhân tạo nhờ phơi vơ tính đã tập trung chủ yếu vào việc thiết kế ra các phương pháp tạo vỏ bao, thực hiện các xử lý làm khơ và cải thiện chất lượng phơi. Mặc dù quan niệm về việc tạo các hạt tổng hợp bằng cách bao bọc phơi vơ tính được Murashige giới thiệu đầu tiên vào năm 1977, nhưng mãi cho đến vài năm sau đó mới có thí nghiệm đầu tiên được thực hiện, và cho đến năm 1986 thì Redenbaugh và cộng sự mới tóm lại về tất cả các nhân tố cần thiết để tạo nên một vỏ bọc hiệu quả nhất. Ngun liệu để tạo vỏ bao cần phải có độ bền đủ cao để vừa bảo vệ phơi trong suốt q trình vận chuyển và gieo vào đất và vừa cho phép phơi nảy mầm tốt được. Ngồi ra, khả năng tái sinh một số lồi thực vật từ phơi vơ tính và sự thích hợp khí hậu sau đó của cây là một trong những yếu tố khó khăn nhất nhằm đạt đến thành cơng trong việc tạo hạt này. 2.1. Khái niệm về hạt nhân tạo Hạt tổng hợp hay hạt nhân tạo là một thuật ngữ được dùng để chỉ phơi vơ tính hay những thể nhân giống khác được bọc bởi một lớp gel, giúp cho việc bảo quản trong thời gian dài và vận chuyển trở nên dễ dàng hơn. Cơng nghệ hạt nhân tạo sử dụng phơi vơ tính cho thấy có tầm quan trọng đối với những thực vật: 1) khơng tạo được hạt, 2) hạt được tạo thành với một số lượng thấp, 3) khả năng hạt sống sót rất thấp, 4) việc nhân giống thực vật khó khăn, và chất mầm khơng thể bảo quản được. Tuy nhiên, để có thể thương mại hóa hạt nhân tạo thì trước tiên đòi hỏi q trình tạo phơi vơ tính trên các đối tượng thực vật đó phải cho ra những phơi phát triển bình thường, có kiểu hình đồng nhất. 2.2. Các nhân tố cần thiết trong tổng hợp hạt nhân tạo 2.2.1. Các nguồn mẫu sử dụng làm hạt nhân tạo Phơi vơ tính: Q trình tổng hợp hạt nhân tạo từ phơi vơ tính là một cơng việc được thực hiện qua nhiều bước. Để việc tổng hợp hạt thành cơng thì đòi hỏi một u cầu cơ bản đó là phải có một số lượng lớn các phơi vơ tính có chất lượng cao, có sức sống tốt, và các phơi này phải phát triển đồng bộ. u cầu về một chất lượng tốt tồn diện của các phơi vơ tính là yếu tố quan trọng hơn cả để đạt được tần suất biến đổi từ phơi đến cây con cao. Sử dụng phơi vơ tính ở giai đoạn hình tim muộn và hình [...].. .Công nghệ sinh học thực vật Chương 3 Công nghệ phôi vô tính – Hạt nhân tạo thủy lơi làm hạt nhân tạo cho tỷ lệ nảy mầm cao đến 100% Một số hạn chế đáng kể khi sử dụng phơi vơ tính làm vật liệu để tạo hạt nhân tạo là:  Sự phát sinh phơi trong ni cấy tế bào có tính lặp lại cao và phơi vơ tính có thể tạo ra những phơi phụ nhỏ hơn nằm dọc theo trục phơi... trì tiềm 32  Công nghệ sinh học thực vật Chương 3 Công nghệ phôi vô tính – Hạt nhân tạo năng của các tế bào phơi, từ đây chúng dễ dàng phát khởi tạo nhiều điểm sinh trưởng bất định Như vậy, PLB là một cấu trúc sinh cơ quan Trong một vài trường hợp, người ta cũng có thể thu phơi từ PLB Tuy nhiên, việc phát sinh phơi từ PLB là ngẫu nhiên 2.2.2 Vật liệu làm vỏ bọc Có rất nhiều tác nhân tạo gel được sử... Na+ trao đổi với ion Ca2+ Do đó, nồng độ của hai tác nhân tạo gel là sodium 33  Công nghệ sinh học thực vật Chương 3 Công nghệ phôi vô tính – Hạt nhân tạo alginate và CaCl2 cũng như thời gian cho việc tạo liên kết ion phải thật tối ưu để có thể tạo thành vỏ bọc có một độ cứng thích hợp nhất Khơng như phơi hợp tử, phơi vơ tính thiếu lớp nội nhũ chứa chất dinh dưỡng bên ngồi ni phơi, do đó bằng việc thêm... carbohydrate vào chất nền gel sẽ tạo một nội nhũ nhân tạo thích hợp tối đa cho tăng trưởng và sống sót của phơi Ngồi ra nhằm tránh cho phơi bị mất nước, hay các tổn thương cơ học, tăng sức đề kháng cho phơi người ta có thể thêm chất kháng sinh, thuốc trừ nấm, trừ sâu, vi sinh vật (chẳng hạn như rhizobia) vào chất nền gel Mặc dù việc tạo hạt nhân tạo từ cách bọc phơi vơ tính bằng sodium alginate cho thấy... các chồi được tạo ra từ phơi hữu tính khi hạt nảy mầm  Khi phơi vơ tính trưởng thành, nó có thể biến đổi trực tiếp thành cây con mà vẫn khơng ngừng tăng trưởng và cũng khơng cần sự trưởng thành của hạt Trong nhiều trường hợp, điều này xảy ra rất sớm (được gọi là sự nảy mầm sớm) với các kết quả tương tự được tìm thấy khi các phơi hợp tử còn non được sử dụng để ni cấy, và kết quả thường là tạo ra các cây... cấu tạo của alginate Ngun tắc chính trong q trình tạo vỏ bọc alginate đó là sodium alginate chứa phơi sẽ tạo thành từng hạt nhỏ, tròn và cứng khi được nhỏ vào trong dung dịch CaCl2 nhờ vào sự trao đổi ion giữa ion Na+ có trong hỗn hợp sodium alginate với Ca2+ có trong dung dịch CaCl2 Vỏ bọc cứng nhiều hay ít là phụ thuộc vào số lượng ion Na+ trao đổi với ion Ca2+ Do đó, nồng độ của hai tác nhân tạo. .. rãi nhất để tạo vỏ bọc cho phơi đó là sử dụng chất nền sodium alginate Hợp chất này sẽ đơng lại thành gel khi được cho vào mơi trường có muối kim loại hóa trị hai hay ba như đồng sulphate (CuSO4) hay calcium chloride (CaCl2) nhờ vào những liên kết ion Alginate được sử dụng nhiều hơn cả do nó có những đặc tính rất thuận lợi như tính dính vừa phải, khơng gây độc cho phơi vơ tính, có các đặc tính tương... vỏ bao alginate này chẳng hạn như chất dinh dưỡng có thể bị mất đi khỏi vỏ bao, sự trao đổi khí kém Đã có một số đề nghị cho rằng việc thêm vào than hoạt tính sẽ giúp nâng cao khả năng sống sót và phát triển của phơi vơ tính Ngun nhân là do than hoạt tính tăng cường khả năng hơ hấp của phơi, và nó giữ lại những chất dinh dưỡng trong vỏ bọc nhiều hơn, giải phóng dinh dưỡng rất chậm để cung cấp dần cho... rễ và trụ dưới lá mầm hay tại phần gốc của rễ Trong những trường hợp khác, các phơi phụ và phơi thứ cấp có thể xuất hiện trên suốt trục phơi Đây là một trong những ngun nhân chính dẫn đến sự thiếu tính đồng bộ trong quần thể phơi vơ tính  Bên cạnh những đơn phơi thì các dạng song phơi, tam phơi hay các cụm đa phơi cũng được tìm thấy Các cụm phơi này sản sinh ra nhiều chồi khi cây con hình thành  Sự... như tính dính vừa phải, khơng gây độc cho phơi vơ tính, có các đặc tính tương hợp sinh học, khả năng tạo thành gel nhanh, rẻ tiền, để lâu được, độ cứng của gel vừa phải để có thể vừa tạo thuận lợi cho sự hơ hấp của phơi và vừa bảo vệ được phơi khỏi những tổn thương bên ngồi 2.3 Ngun tắc và điều kiện khi tạo vỏ bọc bằng chất nền sodium alginate Alginate, chất hữu cơ mạch thẳng, kỵ nước, muối của acid alginic, . Công nghệ sinh học thực vật Chương 3. Công nghệ phôi vô tính – Hạt nhân tạo 22  CHƯƠNG III. CƠNG NGHỆ PHƠI VƠ TÍNH – HẠT NHÂN TẠO Một vấn đề trong việc. này để sản xuất hạt nhân tạo. Công nghệ sinh học thực vật Chương 3. Công nghệ phôi vô tính – Hạt nhân tạo 25  1.2. Một số khía cạnh giả định trong sự hình thành phơi vơ tính Tất cả các. khi phơi vơ tính thứ cấp (phơi vơ tính có nguồn gốc từ phơi vơ tính khác) có khuynh hướng là từ tế bào đơn. Công nghệ sinh học thực vật Chương 3. Công nghệ phôi vô tính – Hạt nhân tạo 27