Luận văn : SỬ DỤNG KỸ THUẬT DAS-ELISA VÀ RT-PCR ĐỂ PHÁT HIỆN VIRUS GÂY BỆNH ĐỐM VÕNG TRÊN CÂY ĐU ĐỦ (Papaya ringspot virus) TẠI HAI TỈNH ĐỒNG NAI VÀ ĐỒNG THÁP part 2 pps

xi DANH SÁCH CÁC BẢNG BẢNG TRANG Bảng 2.1 Giá trị dinh dƣỡng có trong 100 g bộ phận có thể ăn đƣợc của cây đu đủ 6 Bảng 2.2 Sản lƣợng trung bình đu đủ trên thế giới (Trần Thế Tục, 1998) 9 Bảng 3.1 Bảng thống kê số lƣợng mẫu lấy tại các địa điểm 28 Bảng 4.1 Tỉ lệ nhiễm bệnh đốm vòng theo địa bàn điều tra 40 Bảng 4.2 Tỉ lệ nhiễm bệnh Đốm vòng theo giống cây 42 Bảng 4.3 Tỉ lệ nhiễm bệnh theo tuổi cây 43 xii DANH SÁCH CÁC ĐỒ THỊ ĐỒ THỊ TRANG Đồ thị 4.1 Tỉ lệ nhiễm bệnh trên các địa bàn điều tra 41 Đồ thị 4.2 Tỉ lệ nhiễm bệnh theo giống cây 42 Đồ thị 4.3 Tỉ lệ nhiễm bệnh theo tuổi cây 43 1 PHẦN I GIỚI THIỆU 1.1. Đặt vấn đề Tính cấp thiết của đề tài Đu đủ (Carica papaya L.) là một loại trái cây giàu dinh dƣỡng và đang có giá trị kinh tế hiện nay. Trái chín có hàm lƣợng dinh dƣỡng cao, theo phân tích thành phần hoá học, trong 100g thịt trái chín có chứa 86,6 % nƣớc, 12,1 % tinh bột, 0,6 % protein, 0,3 % lipit, năng lƣợng là 50 calo, 0,7 % xơ, 0,5 % tro và khá nhiều khoáng nhƣ: Kali (204 mg), Ca (34 mg), P (11 mg). Đặc biệt, đu đủ cung cấp lƣợng vitamin rất phong phú: vitamin A (450 mg), C (74 mg), B1 (0,03 mg), P (0,5 mg), B2 (0,04mg) (Trần Thế Tục, 1998). Hơn nữa, lá đu đủ có thể sử dụng làm mềm thịt hay làm giảm độ đục trong quy trình sản xuất bia. Ngoài ra, đu đủ còn đƣợc sử dụng cho nhiều mục đích khác nhƣ: ly trích papain, sử dụng làm rau (đối với trái chƣa chín), hoặc để diệt khuẩn. Trên thế giới, vùng trồng và xuất khẩu đu đủ nổi tiếng là Hawaii, đồng thời nó cũng là nơi sản xuất đu đủ lớn nhất ở Mỹ, cung cấp 60 % số quả tƣơi cho Mỹ và Nhật Bản. Tuy nhiên việc sản xuất đang bị hạn chế bởi bệnh do papaya ringspot virus (PRSV) (Gonsalves, 1998). Đây là virus gây thiệt hại hàng đầu đối với canh tác đu đủ. Không chỉ ở Hawaii, Philippine - một quốc gia nổi tiếng về sản xuất đu đủ - cũng bị thiệt hại rất lớn bởi loài virus này. Chẳng hạn, năm 1984, 200 ha đu đủ ở Silang, Cavite đã bị tàn phá, làm thiệt hại 300.000 USD (Opina, 1986). Do tính chất gây bệnh đặc trƣng của virus là lây lan rất nhanh và không thể kiểm soát bằng hóa chất hay bất kì phƣơng thức nào mà chỉ có thể khắc phục bằng cách phòng trừ và sử dụng giống kháng bệnh nên thiệt hại của bệnh rất nghiêm trọng. Thêm vào đó, bệnh lại rất khó nhận biết ở giai đoạn sớm, đến khi ta quan sát đƣợc triệu chứng một cách rõ ràng thì đã quá muộn và thƣờng không chính xác. Thiệt hại đáng kể do PRSV đối với việc canh tác đu đủ đã làm nảy sinh nhu cầu làm sao để sớm phát hiện và loại bỏ cây bị nhiễm. Đây không chỉ là vấn đề quan trọng đối với các nƣớc có nền sản xuất đu đủ lớn nhƣ Mỹ, Brazil, Philippine, Cuba… mà còn 2 đối với các nƣớc nhiệt đới khác, trong đó có Việt Nam - tiềm năng khí hậu, đất đai rất phù hợp cho việc phát triển sản xuất đu đủ. Cùng với sự phát triển vƣợt bậc của công nghệ sinh học, các kỹ thuật phân tử trong chẩn đoán bệnh ngày nay đã giúp ta có thể chẩn đoán nhanh, sớm một cách chính xác nhiều bệnh virus. Xuất phát từ các vấn đề trên, trong phạm vi khoá luận tốt nghiệp, tôi xin thực hiện với nội dung “Sử dụng kỹ thuật DAS-ELISA và RT-PCR để phát hiện virus gây bệnh đốm vòng trên cây đu đủ (Papaya ringspot virus) tại hai tỉnh Đồng Nai và Đồng Tháp”. 1.2. Mục đích - Khảo sát và thu thập mẫu đu đủ ở một số vùng chuyên trồng đu đủ ở Đồng Nai và Đồng Tháp. - Chẩn đoán nhanh và đánh giá tình hình nhiễm bệnh bằng kit ELISA. - Xây dựng quy trình RT-PCR để nhận biết virus gây bệnh đốm vòng trên đu đủ. - Phân tích trình tự gene của một số mẫu bệnh nhằm tìm hiểu mối quan hệ giữa các chủng gây bệnh tại Việt Nam với các chủng khác trên thế giới. 1.3. Yêu cầu - Đánh giá tình hình nhiễm bệnh bằng kỹ thuật ELISA trên các mẫu thu thập đƣợc. - Xây dựng quy trình RT-PCR có tính đặc hiệu, độ tin cậy cao và kết quả rõ ràng. 1.4. Đối tƣợng và phạm vi nghiên cứu - Đối tƣợng nghiên cứu Các mẫu lá đu đủ (Carica papaya L.) đƣợc lấy từ hai tỉnh Đồng Nai, Đồng Tháp. - Phạm vi nghiên cứu Chẩn đoán và đánh giá tình hình nhiễm bệnh bằng phƣơng pháp DAS-ELISA. Nhận biết sự hiện diện của virus PRSV trên mẫu đu đủ thu thập đƣợc thông qua sử dụng kĩ thuật RT-PCR 3 Hình 2.1 Cây đu đủ (Semillas del Caribe, 2003) PHẦN II TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1. Sơ lƣợc về cây đu đủ (Carica papaya L .) 2.1.1. Phân loại học - Tên khoa học: Carica papaya L. - Họ: Caricaceae (hay Papayaceae- họ đu đủ) Đu đủ do có nhiều đặc tính ƣu việt nhƣ cây thân thảo nên tiết kiệm đƣợc diện tích trồng trọt, tận dụng đƣợc những khoảng không gian trống trên đồng ruộng, vƣờn nhà… lại mau cho trái (khoảng từ 6 - 7 tháng) nên cây đƣợc trồng rất phổ biến ở khắp nơi trên thế giới dù đây là một loại cây khá nhạy cảm với các tác nhân gây hại trong tự nhiên. Sản phẩm thu hoạch đƣợc sử dụng để ăn hoặc làm nguyên liệu cho các ngành công nghiệp nhƣ thực phẩm, dƣợc, thuộc da. Ở một số nơi trên thế giới, đặc biệt là ở Australia và một vài đảo ở phía đông Ấn Độ, cây đu đủ đƣợc biết đến với tên gọi là papaw hay pawpaw. Bên cạnh tên papaya rất phổ biến thì ở Nam Á và Đông Ấn Độ nó còn có các tên gọi bị sai lệch đi nhƣ kapaya, kepaya, lapaya hay tapaya. Ở Pháp, trái đu đủ đƣợc gọi là papaye, còn cây đu đủ là papayer, đôi khi đƣợc gọi theo tên nội địa là figuier des Iles. Theo tiếng Tây Ban Nha, trái đu đủ đƣợc gọi là mélon zapote, lechosa, papaya; còn cây đu đủ có tên là papayo hay papayero, fruta bomba, mamón hay mamona tùy thuộc vào từng nƣớc. Ở Brazil, tên thông dụng của nó là mamao. Ở Châu Âu, khi đƣợc phát hiện lần đầu tiên nó đƣợc đặt cho tên địa phƣơng là “tree melon” (James A. Duke, 1983). 4 2.1.2. Nguồn gốc, phân bố Mặc dù hiện nay vẫn chƣa xác định chính xác nguồn gốc, xuất xứ nhƣng cây đu đủ đƣợc đa số các nhà nghiên cứu khẳng định là bắt nguồn từ Châu Mỹ nhiệt đới, có thể là từ miền Nam Mexico và một số vùng lân cận của Trung Mỹ (Gonsalves, 1998). Hiện nay, ngƣời ta vẫn chƣa tìm thấy một dạng cây nào gần gũi với những giống hiện có mà ở trạng thái hoang dại do cây đu đủ là cây có khả năng giao phấn rất lớn và thƣờng nhân giống bằng hạt nên khả năng bị biến đổi di truyền là rất dễ dàng. Các tài liệu nghiên cứu đã ghi lại rằng, trƣớc năm 1525, hạt đu đủ lần đầu tiên thu thập đƣợc là từ Panama, sau đó là ở Dominican Republic. Từ đó việc trồng trọt đã lan rộng sang khắp các vùng có khí hậu ấm hơn ở miền Nam và Trung Mỹ, miền Nam Mexico, Đông Ấn Độ và Bahamas rồi lan dến Bermuda vào năm 1616. Vào khoảng 1550, ngƣời Tây Ban Nha đem các hạt đu đủ từ Philippine về trồng và từ đây đu đủ bắt đầu lan rộng đến Malacca và Ấn Độ. Sau đó hạt đu đủ lại đƣợc lan truyền từ Ấn Độ sang Naples vào năm 1626. Ở Mỹ, hạt đu đủ đƣợc đem đến Florida từ Bahamas. Đến 1959, đu đủ đƣợc trồng phổ biến ở khắp miền Nam và Trung Florida nhƣng chủ yếu là trong các vƣờn nhà và các trang trại với quy mô nhỏ. Ngày nay, đu đủ phổ biến ở khắp các khu vực nhiệt đới trên thế giới cũng nhƣ quần đảo thuộc Thái Bình Dƣơng và ngày càng trở nên thích hợp đƣợc với nhiều khu vực và nhiều vùng đất khác nhau. 2.1.3. Đặc điểm thực vật học Theo những nghiên cứu, khảo sát của James A. Duke trong Handbook of Enery Crop (1983) Thân, rễ Đu đủ là loại thực vật thân thảo, kích thƣớc lớn, sau khoảng một năm cây có thể cao từ 1,8 - 3 m, sau đó có thể đạt đến độ cao 6 m thậm chí là 9 m. Thân già có màu xám xanh, nâu xám hay nâu đỏ. Thân cây xù xì, lồi lõm do những vết sẹo của lá rụng, sẹo phát hoa để lại. Hầu hết rễ đu đủ là rễ chùm, đâm nhánh ngang mạnh khi gặp điều kiện thuận lợi, phân bố rất nông trên tầng đất 10 - 30 cm và rất rộng. Rễ nhỏ, giòn dễ bị tổn thƣơng do cơ giới cũng nhƣ do ngập úng hay khô hạn. Trong đất, rễ hoạt động rất mạnh do vậy 5 rất cần oxy, vì vậy chúng rất mẫn cảm khi đất chặt, bí hay ngập nƣớc, đất có độ ẩm cao cũng gây bất lợi cho sự phát triển của rễ. Lá Lá đơn, mọc thành chùm ở ngọn thân và xoắn theo hình trôn ốc với khoảng cách giữa các cuống lá là 30 - 105 cm. Lá lớn, cuống lá dài, phiến lá rộng, mỏng, mềm, xẻ thùy (khoảng 5 - 9 thùy). Gân lá màu hơi vàng, nổi rõ ở mặt dƣới phiến lá. Lá đu đủ rất dễ bị gãy, rách. Cần chú ý bảo vệ bộ lá vì số lá tỉ lệ thuận với số phát hoa mọc ra ở nách lá, khả năng đậu trái, độ lớn trái và năng suất thu hoạch. Hoa Hoa mọc ở nách lá, có năm cánh, cánh hoa dày, thƣờng nở vào ban đêm, có mùi hƣơng nhẹ. Thời gian từ khi nở đến khi tàn của một hoa kéo dài từ 3 - 5 ngày. Trái, hạt Đa số trái có hình dạng tƣơng tự trái dƣa (melon-like), ngoài ra còn có hình bầu dục hơi tròn, đôi khi có hình quả lê hoặc kéo dài ra thành hình dùi cui. Trọng lƣợng trái có thể lên đến 9 kg. Đối với những cây hoang dại trái có thể nhỏ hơn. Nằm sát thành phía trong của thịt quả là bó sợi màu trắng, mang các hạt hình trứng, màu đen nhƣ hạt tiêu. Chiều dài hạt khoảng 5 mm, đƣợc phủ bởi bao hạt bằng chất gelatin trong suốt. Trái đu đủ mang trung bình khoảng 300 - 500 hạt. Khi trái có đủ độ già thƣờng có khoảng 60 - 70 % hạt có thể mọc thành cây. 2.1.4. Nhu cầu sinh thái Khí hậu Đu đủ rất nhạy cảm với sự lạnh giá, giới hạn phân bố trong khoảng 32 o Nam đến 32 o Bắc với nhiệt độ ấm áp khoảng 25 o C và lƣợng mƣa 1200 mm/năm. Do đó cần lƣợng mƣa phải nhiều hoặc phải đƣợc tƣới nƣớc đầy đủ nhƣng cũng cần phải có sự thoát nƣớc tốt. Nếu ngập úng, cây sẽ chết trong vòng 48 giờ. Trong điều kiện nhiệt độ thấp khoảng 32 o F (-0,56 o C) sẽ gây hại cho cây, nếu cái lạnh cứ kéo dài cây sẽ chết. Đu đủ là một cây ƣa sáng, thiếu ánh sáng dẫn đến các đốt của thân vƣơn dài, cuống lá nhỏ, phiến lá mỏng và dễ bị sâu bệnh phá hoại nhƣ rệp, virus. 6 Đất đai Mặc dù ánh sáng là yếu tố cần nhất nhƣng bên cạnh đó đất trồng cũng cần giàu hữu cơ và tơi xốp. Tuy nhiên nhìn chung đu đủ có thể trồng trên nhiều loại đất khác nhau song đất đó phải giữ nƣớc cũng nhƣ thoát nƣớc tốt và có độ thoáng nhất định, có tầng canh tác dày 70 cm, hàm lƣợng khí trong đất là 4 %. pH tối ƣu cho cây phát triển là 5,5 - 6,5. 2.1.5. Ý nghĩa kinh tế và giá trị dinh dƣỡng của đu đủ 2.1.5.1. Giá trị dinh dƣỡng Hàm lƣợng dinh dƣỡng có trong các thành phần của cây đu đủ đƣợc công bố từ Trung Mỹ và Cuba (James A. Duke, 1983) Bảng 2.1 Giá trị dinh dƣỡng có trong 100 g bộ phận có thể ăn đƣợc của cây đu đủ Bộ phận Thành phần Trái Lá ( * ) Calories 23,11 - 25,8 Lƣợng nƣớc 85,9 - 92,6 g 83,3 % Protein 0,081 - 0,34 g 5,6 % Chất béo 0,05 - 0,96 g 0,4 % Carbohydrates 6,17 - 6,75 g 8,3 % Chất xơ 0,5 - 1,3 g 1,0 % Chất tro (Ash) 0,31 - 0,66 g 1,4 % Calcium 12,9 - 40,8 mg 0,406 % (CO) Phosphorus 5,3 - 22,0 mg Sắt 0,25 - 0,78 mg 0,00636 % Carotene ( ** ) 0,0045 - 0,676 mg 28,900 I.U. Thiamine 0,021 - 0,036 mg Riboflavin 0,024 - 0,058 mg Niacin 0,227 - 0,555 mg Ascorbic Acid 35,5 - 71,3 mg 38.6 % Tryptophan 4 - 5 mg Methionine 1 mg Lysine 15 - 16 mg Magnesium 0,035 % Phosphoric Acid 0,225 % ( * ) : Phân tích đƣợc thực hiện tại Malaya ( ** ) : Lƣợng carotenoid trong đu đủ chủ yếu ở dạng cryptoxanthin. 7 2.1.5.2. Ứng dụng thực tiễn Giá trị thực phẩm Đu đủ phổ biến nhất là đƣợc sử dụng dƣới dạng tƣơi sống. Ngoài ra còn có thể sử dụng làm món trái cây trộn, nƣớc sốt trái cây, coctail, thêm vào kem, bánh… Đu đủ chƣa chín không bao giờ đƣợc ăn do nó chứa rất nhiều nhựa. Thậm chí khi đƣợc sử dụng làm salad nó cũng cần đƣợc bỏ vỏ, hạt, đun sôi đến khi mềm. Trái chín có thể loại bỏ vỏ, hạt, phần thịt cho vào các chai hoặc can chứa để lên men làm rƣợu trái cây. Ở miền Đông Ấn Độ, lá đu đủ non có thể sử dụng nấu và ăn tƣơng tự nhƣ rau bina (rau Spinach). Các chùm hoa đực đƣợc bán sang các nƣớc Indonesia, New Guinea để nấu (có thay nƣớc nấu để loại bỏ vị đắng) và ăn nhƣ rau sống. Ở Indonesia, hoa đôi khi đƣợc sử dụng để làm kẹo. Ở Châu Phi, thân cây còn non có thể đƣợc sử dụng để nấu ăn. Sự hợp tác nghiên cứu giữa các nhà khoa học Italy và Somalia đã tìm thấy trong hạt đu đủ có chứa đến 18 acid amine gồm: glutamic acid, arginine, proline, aspatic acid, proline, tyrosine, lysine, aspatic acid, glutamic acid. Ngoài ra còn ly trích đƣợc tinh dầu có mùi hƣơng nhẹ từ hạt và tinh dầu này có thể đƣợc sử dụng trong công nghiệp thực phẩm hay trong kĩ nghệ công nghiệp. Giá trị thƣơng mại Nhựa thu đƣợc từ thân và trái đu đủ còn xanh chứa 2 loại enzyme phân giải protein là papain và chymopapain. Trong đó, chymopapain có số lƣợng nhiều nhất song papain lại có hoạt lực mạnh gấp đôi. Một công dụng đƣợc biết đến nhiều nhất của sản phẩm papain thƣơng mại là xử lý làm mềm thịt, đặc biệt là ở các hộ gia đình. Tại các lò mổ, ngƣời ta nhận thấy rằng nếu tiêm papain vào gia súc khoảng nửa giờ trƣớc khi mổ sẽ có tác dụng làm thịt mềm hơn bình thƣờng. Ngoài ra, papain còn đƣợc sử dụng để làm tinh khiết bia, xử lý len và sợi vải trƣớc khi nhuộm, xử lý da thú trong công nghiệp thuộc da, sử dụng nhƣ một chất bổ trợ trong sản xuất cao su, sử dụng xử lý gan cá ngừ trƣớc khi ly trích dầu để thu đƣợc lƣợng vitamin A và D nhiều hơn. Mặt khác, nó còn đƣợc bổ sung vào kem đánh răng, chất tẩy rửa, mỹ phẩm cũng nhƣ là các dƣợc phẩm trị về tiêu hóa. Papain 8 còn có khả năng điều trị những vết loét, hạn chế sự sƣng tấy, khả năng phát sốt và hàn dính vết thƣơng sau phẫu thuật. Gần đây, FDA (Cơ quan quản lý lƣơng thực và dƣợc phẩm Hoa Kỳ) đã khẳng định tác dụng của việc tiêm chemopapain vào đĩa sụn xƣơng sống của bệnh nhân để điều trị hoạt động thoái hoá các đĩa sống lƣng. (FDA Drug Bull. 12(3):17-18) Sử dụng trong dân gian Trong các bài thuốc dân gian ở miền nhiệt đới, nhựa tƣơi đƣợc bôi lên những vết sƣng tấy, trị mụn cóc, đốm tàn nhang và đƣợc sử dụng nhƣ một bài thuốc trị giun sán. Trái còn xanh, hạt khi tiêu hoá rất có hại, có khả năng gây sẩy thai. Tuy nhiên một vài nơi sử dụng chúng nhƣ một bài thuốc điều kinh và tẩy giun. Lá, rễ cũng có thể sử dụng làm thuốc tẩy giun. Lá khô đƣợc sử dụng dƣới dạng thuốc hút với công dụng làm dịu đi cơn hen suyễn hoặc sử dụng thay thế cho thuốc lá. Nhựa cây có thể sử dụng trị bệnh vảy nến, trị chứng khó tiêu, sát trùng tại chỗ, sử dụng đắp lên các vết bỏng, vết cháy… Hoa đƣợc dùng trị bệnh vàng da. Công dụng nhƣ một liều thuốc kháng sinh: những nghiên cứu tại trƣờng Đại học Nigeria đã phát hiện thấy dịch trích từ quả đu đủ chín, chƣa chín và từ hạt đều có hoạt tính chống lại vi khuẩn G + ; sử dụng với liều mạnh có thể chống lại cả vi khuẩn G - . Dịch thu từ hạt đƣợc ly trích, sản xuất ra aglycone của glucotropaeolin benzyl isothiocyanate (BITC) có tác dụng kìm hãm và tiêu diệt vi khuẩn, nấm. Ở một bệnh viện tại London vào năm 1977, trong một ca bị nhiễm khuẩn sau phẫu thuật trên một bệnh nhân đƣợc thay thận, bệnh nhân này đã đƣợc cứu chữa chỉ bằng một mảnh đu đủ đắp lên vết thƣơng và để trong 48 giờ, trong khi đó tất cả các phƣơng thuốc hiện đại lúc bấy giờ đều không hiệu quả. 2.1.6. Tình hình sản xuất Trên thế giới Đối với một vƣờn cây đu đủ bình thƣờng, một cây có thể cho 2 - 4 trái chín/ tuần trong suốt mùa thu hoạch. . Xuất phát từ các vấn đề trên, trong phạm vi khoá luận tốt nghiệp, tôi xin thực hiện với nội dung Sử dụng kỹ thuật DAS-ELISA và RT-PCR để phát hiện virus gây bệnh đốm vòng trên cây đu đủ (Papaya. (Papaya ringspot virus) tại hai tỉnh Đồng Nai và Đồng Tháp . 1 .2. Mục đích - Khảo sát và thu thập mẫu đu đủ ở một số vùng chuyên trồng đu đủ ở Đồng Nai và Đồng Tháp. - Chẩn đoán nhanh và đánh. đoán và đánh giá tình hình nhiễm bệnh bằng phƣơng pháp DAS-ELISA. Nhận biết sự hiện diện của virus PRSV trên mẫu đu đủ thu thập đƣợc thông qua sử dụng kĩ thuật RT-PCR 3 Hình 2. 1 Cây đu