i BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP.HCM BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC ***000*** KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG ĐÁP ỨNG MIỄN DỊCH ĐỐI VỚI PROTEIN MBP-VT2eB TRÊN HEO Ngành học: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Niên khóa: 2001-2005 Sinh viên thực hiện: TRƢƠNG THỊ THẢO UYÊN Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 8/2005 ii BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP.HCM BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG ĐÁP ỨNG MIỄN DỊCH ĐỐI VỚI PROTEIN MBP-VT2eB TRÊN HEO Giáo viên hƣớng dẫn : Sinh viên thực hiện: TS. NGUYỄN NGỌC HẢI TRƢƠNG THỊ THẢO UYÊN Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 8/2005 iii LỜI CẢM ƠN Con thành kính ghi ơn ba mẹ cùng những ngƣời thân trong gia đình luôn tạo điều kiện và động viên con trong suốt quá trình học tập. Chúng tôi xin chân thành cảm ơn: - Ban Giám Hiệu trƣờng Đại học Nông Lâm Tp. Hồ Chí Minh đã tạo mọi điều kiện cho chúng tôi trong suốt thời gian học tập. - Các Thầy Cô trong Bộ môn Công nghệ sinh học cùng các Thầy Cô trực tiếp giảng dạy trong suốt bốn năm qua luôn tận tình giảng dạy, giúp đỡ và động viên. - TS. Nguyễn Ngọc Hải đã tận tình hƣớng dẫn và động viên trong thời gian thực hiện đề tài tốt nghiệp. - TS. Bùi Minh Trí và các anh chị phụ trách phòng CNSH thuộc Trung tâm phân tích thí nghiệm Đại học Nông Lâm Tp. HCM. - ThS. Nguyễn Kim Dung cùng các anh chị thuộc phòng kiểm dịnh Vacxin, Viện Pasteur Tp. Hồ Chí Minh đã tận tình hƣớng dẫn và giúp đỡ trong thời gian thực hiện đề tài tại viện. - Anh Lê Quốc Thắng đã tạo điều kiện cho chúng tôi bố trí thí nghiệm tại trại. - Các Thầy Cô bộ môn Vi sinh truyền nhiễm khoa Chăn nuôi thú y đã tận tình giúp đỡ. - Bạn Châu Thanh Duy, anh Vũ Lại Xuân Hiệp cùng tập thể lớp CNSH27 đã hỗ trợ, giúp đỡ và động viên chúng tôi trong suốt thời gian làm đề tài. Chân thành cảm ơn. Tháng 8 năm 2005 Trƣơng Thị Thảo Uyên iv TÓM TẮT TRƢƠNG THỊ THẢO UYÊN, Đại học Nông Lâm Tp. Hồ Chí Minh. Tháng 8/2005. “ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG ĐÁP ỨNG MIỄN DỊCH ĐỐI VỚI PROTEIN MBP- VT2eB TRÊN HEO” Giáo viên hƣớng dẫn: TS. Nguyễn Ngọc Hải Sử dụng kháng nguyên là protein tái tổ hợp MBP-VT2eB pha trong keo phèn với liều 50µg/heo và 75µg/heo có lập lại và không lập lại gây đáp ứng miễn dịch trên heo. Thí nghiệm đƣợc bố trí ngẫu nhiên trên 25 cá thể với 5 lô thí nghiệm. Sau đó thu kháng huyết thanh để định hiệu giá kháng thể theo 2 phƣơng pháp: trung hòa độc tố trên tế bào vero và khuyếch tán kết tủa trên thạch. Kết quả thu đƣợc nhƣ sau: - Protein tái tổ hợp MBP-VT2eB ở liều 50µg và 75µg/heo pha trong keo phèn là loại kháng nguyên an toàn với heo. - Hoàn thiện qui trình định hiệu giá kháng huyết thanh bằng phƣơng pháp kết tủa khuyếch tán trên thạch. - Hoàn thiện qui trình định hiệu giá kháng huyết thanh bằng phƣơng pháp trung hòa độc tố trên tế bào vero: huyết thanh phải bất hoạt trƣớc khi thử nghiệm và không bổ sung sodium azid vào trong huyết thanh. - Liều tiêm 50µg và 75µg/heo có lập lại và không lập lại không tạo đủ lƣợng kháng thể để phát hiện bằng phƣơng pháp kết tủa khuyếch tán trên thạch và trung hòa độc tố trên tế bào vero. v MỤC LỤC Tiêu đề Trang Trang bìa i Trang tựa ii Lời cảm ơn iii Tóm tắt iv Mục lục v Danh sách các bảng viii Danh sách các hình ix 1. MỞ ĐẦU 1 1.1. ĐẶT VẤN ĐỀ 1 1.2 MỤC TIÊU VÀ YÊU CẦU 1 2.TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2 2.1 VACXIN 2 2.1.1 Lịch sử ra đời vacxin 2 2.1.2 Đáp ứng miễn dịch 2 2.1.2.1Kháng nguyên 2 2.1.2.2 Kháng thể 3 2.1.2.3 Cơ chế đáp ứng miễn dịch 4 2.1.2.4 Các yếu tố ảnh hƣởng đến đáp ứng miễn dịch 7 2.1.3 Phân loại 9 2.1.3.1 Vacxin sống 9 2.1.2.2 Vacxin vô hoạt 10 2.1.2.3 Vacxin phân tử 10 2.2 BỆNH PHÙ VÀ ĐỘC TỐ VT2e 12 2.2 PROTEIN TÁI TỔ HỢP MBP-VT2eB 14 2.3 PHƢƠNG PHÁP OUCHTERLONY 14 2.3.1 Nguyên tắc 14 2.3.2 Định tính kháng nguyên- kháng thể bằng phƣơng pháp khuyếch tán trên thạch 16 vi 2.4 PHẢN ỨNG TRUNG HÕA ĐỘC TỐ VEROTOXIN TRÊN TẾ BÀO VERO 16 2.4.1 Sơ lƣợc về tế bào Vero 16 2.4.2 Nguyên tắc phản ứng trung hòa độc tố 17 2.4.3 Đánh giá hiệu quả vacxin bệnh phù bằng phƣơng pháp trung hoà độc tố verotoxin trên môi trƣờng nuôi cấy tế bào vero 17 3. NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP TIẾN HÀNH 18 3.1 THỜI GIAN VÀ ĐỊA ĐIỂM 18 3.2 NỘI DUNG NGHIÊN CỨU 18 3.3 VẬT LIỆU THÍ NGHIỆM 18 3.3.1 Sinh vật thí nghiệm 18 3.3.2 Hóa chất thí nghiệm 18 3.3.3 Dụng cụ thí nghiệm 19 3.4 PHƢƠNG PHÁP 20 3.4.1 Bố trí thí nghiệm 20 3.4.2 Cách pha dịch tiêm 20 3.4.3 Lấy máu 20 3.4.4 Định tính kháng thể bằng phƣơng pháp Ouchterlony 21 3.4.5 Xác định liều TCID 50 22 3.4.5.1Chuẩn bị dịch độc tố 22 3.4.5.2Chuẩn bị tế bào vero 22 3.4.5.3Xác định liều TCID 50 23 3.4.6 Thực hiện phản ứng trung hòa độc tố 25 3.5 Các chỉ tiêu theo dõi 26 4.KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 27 4.1 CÁC TRIỆU CHỨNG CỦA HEO SAU KHI TIÊM VACXIN 27 4.2 HIỆU GIÁ KHÁNG HUYẾT THANH THEO PHƢƠNG PHÁP KẾT TỦA KHUYẾCH TÁN TRÊN THẠCH 27 4.2.1 Với kháng nguyên là độc tố của E. coli H28 27 4.2.2 Với kháng nguyên MBP-VT2eB 28 4.3 LIỀU TCID50 CỦA DỊCH LỌC VI KHUẨN 27 4.4 HIỆU GIÁ KHÁNG HUYẾT THANH TRÊN MÔI TRƢỜNG NUÔI CẤY vii TẾ BÀO 30 4.4.1 Đối với mẫu huyết thanh có sodium azid chƣa bất hoạt 30 4.4.2 Đối với mẫu huyết thanh có sodium azid và có bất hoạt 31 4.4.3 Thí nghiệm chứng minh sodium azid gây chết tế bào vero 33 4.4.3.1 Mẫu huyết thanh có sodium azid 33 4.4.3.1 Đối với mẫu không có sodium azid 33 4.4.4 Đối với mẫu huyết thanh không có sodium azid và có bất hoạt 33 5.KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 36 5.1 KẾT LUẬN 36 5.2 ĐỀ NGHỊ 36 6.TÀI LIỆU THAM KHẢO 38 7.PHỤ LỤC 39 Thành phần hóa chất 39 Bảng phân tích biến lƣợng tăng trọng heo thí nghiệm 41 Bảng 3. Kết quả đo OD620nm đối với mẫu có sodium azid, có bất hoạt 42 Bảng 4. Kết quả đo OD620nm đối với mẫu không có sodium azid, có bất hoạt 43 viii DANH SÁCH CÁC BẢNG BẢNG TRANG Bảng 1. Tăng trọng của heo thí nghiệm trong thời gian thí nghiệm 25 Bảng 2. Kết quả đo OD trên đĩa nuôi cấy tế bào với dịch lọc vi khuẩn 27 Bảng 3. Kết quả đo OD620nm đối với mẫu có sodium azid 42 Bảng 4. Kết quả đo OD620nm đối với mẫu không có sodium azid 43 ix DANH SÁCH CÁC HÌNH VÀ BIỂU ĐỒ HÌNH TRANG Biểu đồ 4.1 Đồ thị chuẩn độ độc tố 28 Hình 2.1. Cấu trúc kháng thể 3 Hình 2.2. Liên kết kháng nguyên- kháng thể 15 Hình 4.1 Kết quả dƣơng tính với huyết thanh thỏ 26 Hình 4.2 Kết quả âm tính trên huyết thanh heo 26 Hình 4.3 Hình tế bào vero chết do sodium azid 33 Hình 4.4 Hình tế bào vero chết do độc tố 33 Hình 4.5 Giếng đối chứng độc tố đã nhuộm 33 Hình 4.6 Giếng đối chứng tế bào đã nhuộm 33 . ix 1. MỞ ĐẦU 1 1. 1. ĐẶT VẤN ĐỀ 1 1. 2 MỤC TIÊU VÀ YÊU CẦU 1 2.TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2 2 .1 VACXIN 2 2 .1. 1 Lịch sử ra đời vacxin 2 2 .1. 2 Đáp ứng miễn dịch 2 2 .1. 2.1Kháng nguyên 2 2 .1. 2.2. Tháng 8/2005. “ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG ĐÁP ỨNG MIỄN DỊCH ĐỐI VỚI PROTEIN MBP- VT2eB TRÊN HEO Giáo viên hƣớng dẫn: TS. Nguyễn Ngọc Hải Sử dụng kháng nguyên là protein tái tổ hợp MBP-VT2eB pha trong. SINH HỌC ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG ĐÁP ỨNG MIỄN DỊCH ĐỐI VỚI PROTEIN MBP-VT2eB TRÊN HEO Giáo viên hƣớng dẫn : Sinh viên thực hiện: TS. NGUYỄN NGỌC HẢI TRƢƠNG THỊ