Luận văn : Áp dụng qui trình nuôi chín noãn in vitro trên heo và chó part 2 ppsx

10 sự kiện này cần thiết cho NST cô đặc lại (Wei và cs, 1999; de la Barre và cs, 2000) [35],[7]. (2) Nhân con biến mất Trong giai đoạn từ MI đến MII nhân không xuất hiện, nhưng xuất hiện vào giai đoạn tiền nhân ngay sau khi tinh trùng xâm nhập. Chất nhân dạng sợi được giải phóng vào dịch nhân lúc nhân con biến mất, sau đó vào dịch tế bào lúc vỡ màng nhân. Quá trình này được điều khiển bởi sự phosphoryl hóa và dephosphoryl hóa một protein trong nhân. Noãn heo lấy nhân vẫn có hiện tượng cô đặc NST, màng nhân biến mất và hình thành trục (Fulka và cs, 2003) [10]. Do đó, có thể nhân trong noãn không quan trọng lắm, ít nhất vào giai đoạn trưởng thành. (3) Vỡ màng nhân GVBD (germinal vesical breakdown) Màng nhân là màng đôi gồm 2 lớp lipid, lớp trong tạo bởi 3 mảnh A,B,C, có ở động vật có xương sống, là vị trí kết hợp của MPF. GVBD xảy ra khi 3 mảnh này biến mất; MPF hoạt hóa sẽ phosphoryl hóa các phân tử của mảnh, phá vỡ trạng thái polymer thành dimer. Màng nhân bị vỡ, mạng lưới nội chất gắn với màng nhân ngoài cũng vỡ. (4) Tạo trục metaphase Trong quá trình trưởng thành, trục được tạo hai lần, MI và MII. Trục MI xuất hiện sau tác dụng của MPF và hoàn thành khi MAP kinase được hoạt hóa. MPF phosphoryl hóa protein liên kết với vi ống, gồm α và β tubulin, do đó tăng biến đổi của chúng. Trong nguyên phân, hai trung thể nhân đôi và đi về hai cực tế bào. Vi sợi tỏa ra từ hai cực và tìm bắt cặp NST chị em. Cyclin B gắn với vi ống, MAP kinase gắn với cực. Giảm phân ở noãn khác với nguyên phân ở tế bào sinh dưỡng: không có trung thể, giống tế bào thực vật. Trên heo, sau GVBD, NST tạo dạng đám bụi, theo Motlik và Fulka mô tả đây là giai đoạn hướng cực muộn. Vi ống bị cắt và tỏa xung quanh đám bụi này. 2.2.5.2. Các chất liên quan (1) MPF Theo Masui và Markert (1971), progesteron gây trưởng thành noãn khi được cung cấp bên ngoài noãn, nhưng thất bại khi tiêm vào noãn [19]. Do đó, 11 chỉ tế bào chất gần bề mặt noãn nhận tín hiệu hormon. Noãn sau khi nhận tín hiệu hormon đã tạo yếu tố thúc đẩy trưởng thành gọi là MPF (maturation promoting factor hoặc M phase promoting factor). MPF gồm một đơn vị thủy phân Cdc2 và đơn vị điều hòa cyclin B. MPF xuất hiện trong giai đoạn cô đặc NST, biến mất nhân con. Trong giai đoạn vỡ màng nhân, Cdc2 kinase kích hoạt, nhưng theo Kubelka và cs (2002), màng nhân vẫn vỡ mà không có Cdc2 kinase dưới một số điều kiện đặc biệt, trong khi đó MAP kinase xuất hiện với hoạt động yếu [13]. Giai đoạn tạo trục chỉ bắt đầu khi Cdc2 kinase hoạt động và hoàn tất khi xuất hiện MAP kinase. (2) MAPK (mitogen activated protein kinase) MAPK là kinase khác liên quan đến trưởng thành noãn. Noãn GV chứa MAPK dạng bất hoạt, được phosphoryl hóa và hoạt hóa ở giai đoạn GVBD. 2.3. IVM (In vitro maturation) 2.3.1 . Lịch sử IVM [23] Năm 1935, Pincus và Enzmann tách noãn thỏ chưa trưởng thành khỏi sự ức chế của nang noãn, cho phép noãn đạt tới trưởng thành khi nuôi cấy in vitro. Năm 1983, Minato và Toyoda (Nhật) và Schroeder và Eppig (Mỹ) cho rằng noãn chuột được trưởng thành in vitro có khả năng tạo phôi nếu được thụ tinh. Năm 1983, Lenz và cs cho rằng 39 o C là nhiệt độ tối ưu để noãn bò trưởng thành in vitro. Năm 1988, Lu và cs cho ra đời con bê từ kỹ thuật chín noãn và thụ tinh in vitro. Năm 1996, Eppig và O’Brien cho ra đời chuột con sau khi dùng kỹ thuật IVM, thụ tinh in vitro và chuyển phôi vào tử cung chuột mẹ. 2.3.2 . Hệ thống IVM Hệ thống nang noãn giữ cấu trúc không gian 3 chiều của nang, bảo đảm hình thái và chức năng của nang để giữ noãn tăng trưởng và trưởng thành. Bolamba và cs (1998) nuôi noãn chó trong đĩa phủ 0,6 % agar để tránh mất tế bào hạt. Kết quả là noãn chó đạt MII khoảng 8,7 % ở nang xoang giai đoạn sớm và 11,5 % ở nang xoang. Điều đó cho thấy rằng, nếu sự trao đổi các yếu tố trong buồng trứng bị gián đoạn, khả năng giảm phân bị giảm [5]. 12 Hệ thống giọt là hệ thống phổ biến nhất, noãn được nuôi trong giọt môi trường phủ dầu khoáng. Cần quan tâm đến tỉ lệ giữa số noãn nuôi và thể tích môi trường nuôi cấy. Nếu noãn quá nhiều, giảm phân bị ức chế do tế bào hạt tụ tiết nhiều yếu tố ảnh hưởng giảm phân và ngăn cản chúng tăng kích thước, từ đó giảm việc gãy các cầu nối. Sự gãy các cầu nối này sẽ gián đoạn sự truyền thông tin giữa noãn và tế bào hạt và do đó sẽ tăng giảm phân [28]. Nếu ít noãn, tỉ lệ giảm phân cũng giảm. Tỉ lệ giữa số noãn nuôi và môi trường nuôi tối ưu là 1:10. Trên chó tỉ lệ giảm phân là 16,2 % nếu nuôi 10 noãn /100 µl, và 4,6 % nếu 5 noãn/100 µl [25]. Hệ thống tế bào đơn lớp tức là noãn được nuôi với tế bào ống dẫn trứng đơn lớp. Bogliolo và cs (2002) nuôi noãn chó đạt 23,2 % sau 72 giờ [4]. Hệ thống nuôi với ống dẫn trứng, rất tốt vì gần giống điều kiện in vivo, có nhiều tế bào hơn so với hệ thống tế bào đơn lớp, có sự tiếp xúc giữa lớp nhầy và noãn, và một số yếu tố dinh dưỡng cũng như yếu tố tăng trưởng cần cho trưởng thành. Luvoni và cs (2003) nuôi noãn chó đạt 31,9 % sau 30 giờ nuôi [15]. 2.3.3 . Yếu tố ảnh hƣởng IVM 2.3.2.1. Thời gian Buồng trứng được thu từ lò mổ là nguồn tế bào trứng cung cấp cho IVM. Thời gian vận chuyển đến phòng thí nghiệm ảnh hưởng rất lớn đến tế bào trứng. Buồng trứng giữ ấm 30 – 37 o C trong nước muối sinh lý vào khoảng 1 – 2 giờ. Thời gian nuôi trứng rất quan trọng, trên heo nuôi 44 – 48 giờ. Trên chó còn nhiều tranh cãi, noãn chó nuôi trong hệ thống giọt sau 72 giờ thoái hóa 74,3 % và sau 96 giờ thoái hóa 94,8 % [16]. 2.3.3.2. Nồng độ oxi và nhiệt độ Oxi ảnh hưởng lớn đến trưởng thành nhân trên chuột và bò, mức oxi 5 % tốt hơn 20 % trong không khí [9]. Nhiệt độ nuôi cấy dao động 37 – 39 o C. 2.3.2.2. Môi trƣờng nuôi Có hai loại môi trường nuôi cấy, môi trường đơn giản và môi trường phức tạp. Môi trường đơn giản là dung dịch muối bổ sung nguồn năng lượng 13 như pyruvate, lactate, glucose, môi trường phức tạp thêm amino acid, vitamin, và một số phân tử khác. Môi trường đơn giản là mKRB (modified Krebs Ringer Bicarbonate), SOF (synthetic oviductal fluid), môi trường phức tạp là TCM 199 (tissue cell medium). Trong số các môi trường, TCM 199 là môi trường tốt nhất [31]. 2.3.3.4. Sự trƣởng thành của động vật giết mổ Các trứng thu từ heo trưởng thành có khả năng phát triển trong điều kiện in vitro hơn so với trứng thu từ thú chưa trưởng thành. Noãn hoàn thành giảm phân 24,6 % khi thu noãn ở pha nang noãn của chu kỳ động dục, 19,6 % ở thời kỳ yên tĩnh, 16,4 % thời kỳ không động dục [27]. 2.2.3.5. Stress Yếu tố môi trường gây stress như nhiệt độ quá cao ảnh hưởng sinh sản cá thể đực và cái. Nhiệt độ cao làm thay đổi tăng trưởng của nang noãn và chất lượng noãn. 2.3.3.6. Dinh dƣỡng cá thể cái Noãn nuôi trong môi trường dịch nang noãn thu nhận từ heo cái cho ăn đầy đủ có tỉ lệ chín nhân cao hơn so với các noãn nuôi trong dịch nang noãn từ heo cho ăn hạn chế. 2.3.3.7. Dầu khoáng hay dầu parafin Noãn nuôi trong môi trường có phủ dầu khoáng sẽ bị lớp dầu hút hormon steroid do tế bào hạt tụ tiết ra, đây là hormon quan trọng cho khả năng phát triển của noãn. Do đó, sẽ kìm hãm sự trưởng thành nhân. Đối với dầu silicon, Zn là chất nhiễm độc trong môi trường tạo giọt. 2.3.3.8. Kích thƣớc nang noãn Kích thước nang ảnh hưởng rất lớn đến tỉ lệ thành công IVM, vì kích thước khác nhau thì nang noãn ở các giai đoạn phát triển khác nhau. Theo Mao và cs (2003), tỉ lệ thành công IVM trên noãn heo là 13,8 %, 26,3 %, 33,4 % trên các noãn có đường kính lần lượt là 2 – 3 mm, 3,1 – 5 mm, 5,1 – 7 mm [17]. 2.3.3.9. Phƣơng pháp lấy noãn Để lấy noãn ra khỏi nang, có nhiều cách, trong đó cắt và hút là hai cách phổ biến nhất. Hút là dùng kim và syringe đâm vào nang và dùng lực hút để 14 hút noãn. Cách này thu noãn nhanh nhưng tỉ lệ noãn loại A và tỉ lệ thành công thấp, vì làm mất lực liên kết giữa noãn và tế bào hạt tụ. Cắt là dùng dao xẻ nang noãn và vuốt nhẹ để noãn tách ra khỏi liên kết với tế bào của nang. Cách này chậm nhưng tỉ lệ noãn loại A và tỉ lệ thành công cao. Nếu thu noãn heo bằng phương pháp hút, tỉ lệ trứng ở GVI thấp hơn (45 %) so với cách cắt (78 %) [33]. 2.3.4. Thành phần môi trƣờng IVM 2.3.4.1. Thành phần chính (1) Nƣớc Nước là thành phần chính cho mọi môi trường. Chất lượng của nước rất quan trọng, nước có chất lượng tốt phải qua hệ thống chưng cất, siêu lọc nhằm loại bỏ các chất khoáng và ion tồn tại trong nước. Hấp khử trùng để tiệt trùng. (2) Nguồn năng lƣợng Thực nghiệm cho thấy glucose, lactate, pyruvate là nguồn cơ chất năng lượng ngoại sinh quan trọng nhất cho trứng và phôi. Tuy nhiên, tùy giai đoạn phát triển mà trứng hay phôi có nhu cầu năng lượng với từng cơ chất khác nhau. Thêm glucose vào môi trường chứa pyruvate (tỉ lệ 5,5 Mm : 1 mM) làm tăng tỉ lệ MII trên noãn chuột [8]. Thêm 11 mM glucose vào môi trường nuôi cấy không tăng tỷ lệ thành công IVM trên chó. Glucose không đủ cung cấp năng lượng cho noãn chó cũng như noãn chuột, hoặc nồng độ glucose cao (20 %) ảnh hưởng xấu lên phát triển nhân của noãn chó. Glucose tăng kích cỡ tế bào hạt và trưởng thành nhân trên noãn bò. Pyruvate cũng có vai trò thúc đẩy giảm phân, noãn chuột đạt MII (71,9 %) khi nuôi với pyruvate cao hơn đối chứng (19,6 %) [18]. (3) Nguồn protein Vai trò protein trong môi trường không chỉ là nguồn đạm có sẵn mà còn là chất hấp thụ ion kim loại độc. Huyết thanh Một số loại huyết thanh thường được sử dụng là huyết thanh thai bò (FCS - fetal calf serum), huyết thanh bò lên giống (ECS - estrus cow serum), huyết thanh bò trưởng thành (BAS - bovine adult serum). FCS tăng khả năng sống của noãn chó in vitro khi thêm > 10 % mà không có tác dụng gây trưởng 15 thành. Noãn trưởng thành với tỉ lệ cao (16,3 %) khi thêm huyết thanh chó lên giống so với thêm huyết thanh chó không lên giống (11,1 %) [24]. Albumin huyết thanh Nếu không bổ sung huyết thanh, ta có thể bổ sung protein dưới dạng albumin. Albumin huyết thanh bò (BSA - bovine serum albumin) là loại thường được sử dụng nhất. Vai trò BSA thể hiện ở số lượng yếu tố tăng trưởng liên kết với protein và khả năng kìm hãm chất độc do oxy tự do gây ra và BSA không kết hợp các yếu tố như steroid, vitamin, acid, cholesterol trong đáp ứng kích thích hay ức chế. Do đó, BSA chỉ giúp noãn phát triển tới MI, không có khả năng làm noãn phát triển hơn nữa. Hai nguồn protein trên được sử dụng tùy vào mục đích. Theo kết quả nghiên cứu của Zhang và Sirard, việc bố sung BSA trong môi trường nuôi noãn không cung cấp khả năng tăng kích thước các tế bào hạt tụ và sự chín của noãn so với khi bổ sung FCS. Những kết quả tương tự cũng được ghi nhận trên noãn bò, chuột và thỏ. Qua đó cho thấy, trong FCS hiện diện một số yếu tố có khả năng tái lập lại quá trình phân bào giảm nhiễm và cung cấp khả năng chín của trứng ở điều kiện in vitro. Theo nghiên cứu trên chuột, nếu bổ sung huyết thanh trong môi trường nuôi noãn sẽ ngăn cản màng trong suốt khỏi sự cứng hóa. Ngược lại, trong môi trường có bổ sung BSA, sự cứng hóa màng xảy ra và sự xâm nhập tinh trùng bị cản trở. Do đó, BSA được sử dụng như biện pháp ngăn chặn sự xâm nhập đa tinh trùng trong các qui trình thụ tinh in vitro. (4) Muối Đây là thành phần rất quan trọng trong môi trường nuôi noãn và phôi nhằm bảo đảm áp suất thẩm thấu. Có nhiều ion chịu trách nhiệm cho sự điều hòa này, nhưng chủ yếu là Na + , K + . Hàm lượng ion trong môi trường dựa trên thành phần các chất khoáng trong huyết tương của máu. (5) Hệ đệm Hệ đệm thông dụng nhất là bicarbonate dưới 5 % CO 2 . Cơ chế đệm của hệ này giống với hệ đệm sinh lý máu. 16 (6) Kháng sinh Kháng sinh được sử dụng với mục tiêu hạn chế sự nhiễm khuẩn. Các loại thường sử dụng là penicillin, streptomycin, gentamycin. 2.3.4.2. Các thành phần khác (1) Hormon Nhìn chung hầu hết các môi trường đều được bổ sung hormon, đặc biệt LH/FSH. Có nhiều báo cáo cho rằng hormon trong môi trường nuôi noãn chín không chỉ tạo thuận lợi cho quá trình phân bào giảm nhiễm mà còn ảnh hưởng đến quá trình chín tế bào chất của noãn heo ở điều kiện in vitro. Ngược lại, một số báo cáo cho rằng noãn heo có thể trải qua giai đoạn GVBD trong môi trường không có hormon. Vì thế hormon cần được bổ sung hay không vào môi trường nuôi trứng chín vẫn còn là vấn đề tranh luận. Môi trường không có FSH giúp noãn vượt qua chướng ngại trong giảm phân, nhưng không giúp trưởng thành hơn được. FSH giúp trưởng thành bằng cách điều hòa cAMP, FSH giúp hạt tụ dãn nở. Ngoài ra còn thêm estradiol và progesterone vào môi trường. Tỉ lệ MII khi thêm estradiol (14,7 %) cao hơn so với đối chứng(1,5 - 8,2 %), khi thêm progesterone cao hơn (10 %) so với đối chứng (4,8 %) [22]. (2) Chất chống oxy hóa Các chất thêm vào môi trường có thể bị oxy hóa và tạo một số chất độc ảnh hưởng noãn. Chất chống oxy hóa thường được thêm vào môi trường là β- mercaptoethanol, chất này làm tăng glutathione trong tế bào. Tỉ lệ MII khi thêm 50 μM là 20 % so với đối chứng 0 % [21]. (3) Yếu tố tăng trƣởng Yếu tố tăng trưởng thường được thêm vào môi trường nuôi, tăng tỉ lệ MII (13,3 %) khi thêm 20 ng/ml EGF (epidermal growth factor), cao hơn so với đối chứng (2,7 %) [21]. 2.3.5. Vấn đề và triển vọng IVM [23] Hiện nay một phương pháp mới kinh tế hơn để lấy noãn là dùng siêu âm, có thể lấy từ bò thụ tinh và chưa thụ tinh. Kỹ thuật này thực hiện hàng tuần, có thể thu hoạch trên một năm, mỗi lần thu 4 – 5 noãn. Vấn đề là dù thu hoạch 17 trứng bằng phương pháp gì đi nữa và mặc dù tỉ lệ phôi sau thụ tinh phân chia cao, nhưng ít phôi phát triển tới phôi dâu. Vấn đề của việc lấy noãn chưa trưởng thành từ buồng trứng không chỉ ở việc tỉ lệ noãn chín, mà còn tuỳ thuộc vào chính noãn đó được qui định thành tế bào chết (apoptosis) hay thành nang noãn tịt. Apoptosis bắt đầu trong nang và sau đó ảnh hưởng đến noãn. Có bằng chứng cho thấy ngay cả noãn tốt lấy từ nang noãn bò với tỉ lệ cao apoptosis, noãn vẫn mất khả năng trưởng thành (Hendriksen và cs, 2000). Ứng dụng kiến thức này ta có thể dễ dàng tìm noãn apoptosis bằng cách nhuộm sống trong trường hợp sớm, nhờ vậy có thể đảo ngược tình thế. Trong một vài tế bào, hoạt hóa protein kinase C có thể ức chế apoptosis sớm và do đó tăng tỉ lệ noãn chín (Zhiang và cs, 1998). Một chất nữa ảnh hưởng đến quá trình trưởng thành là sterol. Chất này ảnh hưởng giảm phân, chúng có thể có vai trò gián tiếp trong tác động của kích dục tố lên việc trưởng thành của noãn (Byskov và cs, 2002 và Trafriri và cs, 2002). Nếu IVM được ứng dụng trên vật nuôi thì có tiềm năng thật sự, nhưng tình hình hiện nay trên chuột tỉ lệ thành công còn thấp, chủ yếu phát triển tới giai đoạn phôi dâu rồi dừng (Smitz và Cortvrindt, 2002). Gần đây (24/04/2005), cùng với việc cho ra đời thành công chú chó Snuppy bằng kỹ thuật sinh sản vô tính, các nhà khoa học của Đại học quốc gia Seoul hy vọng đây là bước khởi đầu của kỹ thuật tạo một số nội tạng thay thế cho người để tránh phản ứng loại thải. Đây là bước đột phá lớn trong khoa học, thao tác trên chó khó hơn các loài khác vì noãn chó chỉ trưởng thành 2 – 3 ngày sau khi được xuất noãn (trích báo tuổi trẻ số ra ngày 05/08/2005). 18 PHẦN 3. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP 3.1. Thời gian và địa điểm thực hiện Thời gian: từ 15/3/2005 đến 15/8/2005. Địa điểm: phòng Sinh lý Sinh hóa và phòng Nuôi cấy tế bào, khoa Chăn nuôi Thú y, trường Đại học Nông Lâm TP.HCM. 3.2. Nội dung khảo sát Nội dung Chi tiết Khảo sát buồng trứng heo - Trung bình số lượng hoàng thể, nang noãn ở các mức đường kính nang (< 4 mm; 4 – 6 mm; > 6 mm) trên một buồng trứng. - Liên quan giữa chất lượng noãn thu được với phương pháp lấy và kích thước nang noãn. Khảo sát buồng trứng chó - Trung bình số lượng hoàng thể, số lượng nang noãn ở các mức đường kính nang (< 2 mm; ≥ 2 mm) trên một buồng trứng. - Liên quan giữa chất lượng noãn thu được với chiều dài buồng trứng (< 2 cm; ≥ 2 cm) và với đường kính nang noãn (< 2 mm; ≥ 2 mm). - Tỉ lệ nang đa noãn trên một buồng trứng. - So sánh chất lượng các loại trứng trong nang đơn noãn và nang đa noãn. Áp dụng IVM Trên chó nuôi trong môi trường giọt, trên heo nuôi trong môi trường đĩa. Nhuộm nhiễm sắc thể và thể cực Sử dụng thuốc nhuộm orcein. . giữa số noãn nuôi và môi trường nuôi tối ưu là 1:1 0. Trên chó tỉ lệ giảm phân là 16 ,2 % nếu nuôi 10 noãn /100 µl, và 4,6 % nếu 5 noãn/ 100 µl [25 ]. Hệ thống tế bào đơn lớp tức là noãn được nuôi. sinh lý vào khoảng 1 – 2 giờ. Thời gian nuôi trứng rất quan trọng, trên heo nuôi 44 – 48 giờ. Trên chó còn nhiều tranh cãi, noãn chó nuôi trong hệ thống giọt sau 72 giờ thoái hóa 74,3 % và. trong nang đơn noãn và nang đa noãn. Áp dụng IVM Trên chó nuôi trong môi trường giọt, trên heo nuôi trong môi trường đĩa. Nhuộm nhiễm sắc thể và thể cực Sử dụng thuốc nhuộm orcein.