Luận văn : BƯỚC ĐẦU ĐÁNH GIÁ MỨC ĐỘ ĐA DẠNG DI TRUYỀN CỦA QUẦN THỂ ĐIỀU (Anacardium occidental L.) TẠI TỈNH BÀ RỊA – VŨNG TÀU BẰNG KỸ THUẬT RAPD VÀ AFLP part 5 doc

37 Bảng 4.2 Nhiệt độ giảm từ 90 o C về 10 o C STT Thời gian (s) Nhiệt độ máy ( o C) 0 0 90 1 5 83,1 2 10 76,2 3 15 69,4 4 20 62,9 5 25 56,7 6 30 51,2 7 35 46,3 8 40 41,7 9 45 36,8 10 50 32,7 11 55 28,9 12 60 25,3 13 65 23 14 70 20,8 15 75 18,7 16 80 17,2 17 85 15,8 18 90 14,5 19 95 13,2 20 100 12,1 21 105 11,2 22 110 10,3 38 Nhiệt độ máy 0 20 40 60 80 100 0 15 30 45 60 75 90 105 Thời gian Nhiệt độ Nhiệt độ máy Đồ thị 4.2 Nhiệt độ giảm từ 90 o C về 10 o C Nhận xét: Khi nhiệt độ hạ xuống thấp, tốc độ giảm nhiệt chậm lại do ΔT tăng. Cần hạ thấp ΔT bằng cách bố trí quạt tạo tốc độ gió đủ lớn thổi vào tấm tản nhiệt và nhiệt độ tấm tản nhiệt thích hợp. 39 Bảng 4.3 Nhiệt độ duy trì STT Thời gian (s) Nhiệt độ máy ( o C) 0 0 65 1 5 65 2 10 65,2 3 15 65,1 4 20 64,8 5 25 65 6 30 65,1 7 35 65 8 40 64,5 9 45 65,2 10 50 65 11 55 64,9 12 60 65,1 13 65 65,2 14 70 64,7 15 75 65 16 80 65,1 17 85 65,1 18 90 65 19 96 65,2 20 100 64,9 40 Nhiệt độ máy 64 64,5 65 65,5 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 Thời gian Nhiệt độ Nhiệt độ máy Đồ thị 4.3 Nhiệt độ duy trì ở 65 o C Nhận xét: Nhiệt độ duy trì còn biến thiên lớn, khắc phục điều điều này có 2 cách: Cách 1: Khảo sát tìm điện áp nguồn điện nuôi thích hợp cho nhiệt độ cần duy trì. Cách này không hay, vì mỗi khoảng nhiệt độ khác nhau cần có điện áp nuôi khác nhau. Nếu làm theo cách này, phải dùng thêm một số thiết bị tải và điện áp kích tốn kinh phí chế tạo và làm máy cồng kềnh. Cách 2: Dùng phương pháp băm xung, tức là từ điện xoay chiều được chuyển thành điện một chiều, sau đó được đưa qua thiết bị băm xung được điều khiển bởi vi xử lý. Dòng điện dạng xung được đưa qua bộ phận chỉnh lưu thành dòng một chiều có điện thế phụ thuộc vào băm xung. Dùng điện áp này để kích tải. Chương trình trên vi xử lý được viết dạng băm xung tự động, khi nhiệt độ máy bằng nhiệt độ cần thiết, vi xử lý sẽ tự động xuất dòng điện "nuôi" có công suất tỏa nhiệt đúng bằng nhiệt lượng tiêu hao. Vì vậy nhiệt độ sẽ rất ổn định. 41 Bảng 4.4 So sánh nhiệt độ máy và nhiệt độ nhiệt kế DT150 (Korea) Nhiệt độ máy Nhiệt độ kế 29 19,5 32,6 24,4 34,4 26,1 36,5 28,5 38,5 31,2 40,4 33,5 44,2 37,5 46 40,6 48 44,7 50 47,7 51,8 51,1 56 57,5 57,9 59,9 59,7 62,9 62 65,7 64,1 67,7 66,2 70 68,2 72,2 70,1 74,4 72,2 77 74 78,9 76,1 81 78 83,2 42 Kết quả xử lý số liệu nhiệt độ máy và nhiệt độ nhiệt kế SUMMARY OUTPUT Regression Statistics Multiple R 0,997964 R Square 0,995931 Adjusted R Square 0,995738 Standard Error 0,987181 Observations 23 ANOVA df SS MS F Significance F Regression 1 5009,645 5009,645 5140,592 1,37E-26 Residual 21 20,46506 0,974527 Total 22 5030,11 Coefficients Standard Error t Stat P-value Lower 95% Upper 95% Lower 0.95% Upper 0.95% Intercept 14,98439 0,589689 25,41069 2,98E-17 13,75807 16,21072 13,75807 16,21072 X Variable 1 0,737742 0,01029 71,69792 1,37E-26 0,716344 0,75914 0,716344 0,75914 0 20 40 60 80 100 19,5 28,5 37,5 47,7 59,9 67,7 74,4 81 Nhiệt độ nhiệt kế Nhiệt độ máy Nhiệt độ máy Nhiệt kế Đồ thị 4.4 Nhiệt độ máy và nhiệt độ thực trên nhiệt kế 43 Phương trình đường chuẩn nhiệt độ của nhiệt kế: y = x (4.1) Phương trình đường thẳng nhiệt độ máy y = 0,75x + 14,98 (4.2) Toạ độ điểm cắt A (59,92; 59,92) Tại điểm này nhiệt độ máy bằng nhiệt độ nhiệt kế Qui nhiệt độ máy về nhiệt độ nhiệt kế Khi nhiệt độ lớn hơn 59,92 y = y o + (y' - y o )/0,75 (4.3) Khi nhiệt độ nhỏ hơn 59,92 y = y o - (y o - y')/0,75 (4.4) y : Nhiệt độ thực tế y o : Nhiệt độ tại điểm cắt y' : Nhiệt độ vi xử lý đưa ra Từ kết quả khảo sát thấy, hệ số tuyến tính còn thấp (0.9957), nhiệt độ biến thiên còn lệch so với nhiệt độ chuẩn sau khi chuẩn lại chương trình đường nhiệt độ. Có hai lý do dẫn đến sai số này: - Nhiệt kế sai số và hệ số tuyến tính không cao. Đã đo thử nhiệt độ trên máy PCR của hãng eppendorf thấy nhiệt độ trên máy là 94 o C trong khi nhiệt độ trên nhiệt kế là 86 o C. - Nguyên nhân thứ hai là board mạch khuếch đại cho Pt có hệ số tuyến tính không cao. Khắc phục, thay OP07 bởi MAX4236_37A. 44 Đồ thị 4.5 Hệ số tuyến tính board mạch khuyếch đại dùng MAX4236_37A 4.4. Về kết quả chạy mẫu 4.4.1. Hoạt động của máy 45 Khi khởi động máy, LCD hiện chu "Help??". Nếu nhấn nút Help trên bàn phím, màn hình sẽ hiện cách sử dụng máy. Để kêt thúc ấn phím Cancel muốn tiêp tục ấn phím Help. Sau khi ấn phím Cancel máy sẽ "khởi động", chờ đến khi màn hình hiện chữ "an STAR". Lúc này máy khởi động xong. Sau khi ấn Star màn hình hiển thị nhập số liệu. Đồng ý với số liệu nhập ấn phím OK, không đồng ý ấn Cancel. Khi nhập, nếu nhập sai máy yêu cầu nhập lại số. Nhập xong máy sẽ chạy theo chương trình cài đặc. Sau khi chạy xong phản ứng PCR máy sẽ thông báo lên màn hình. Lúc này muốn chạy tiếp tục thì ấn phím Reset nhập lại số liệu mới. 4.4.2. Chạy phản ứng PCR Mẫu chạy trên hai máy đồng thời. Một trên máy của hãng eppendorf và một trên máy chế tạo. Chạy RAPD trên đối tượng cây điều. Trình tự của primer 11 (OPN 06): 5’GAGACGCACA 3’ và T m = 35,3 0 C Bảng 4.5 Hoá chất chạy PCR Hoá chất Dung dịch gốc Thể tích sử dụng Nồng độ cuối PCR buffer MgCl 2 dNTP Primer (OPN 06) Taq DNA polymerase DNA mẫu H 2 O 25 mM 25 mM 10 mM 10 pmol/ul 5 U 20 ng/ul 2,5 ul 2 ul 3 ul 0,65 ul 0,1 ul 1 ul 19 ul 250 uM 200 uM 120 uM 6,5 pmol (260 uM ) 0,5 U 20 ng . Nhiệt độ duy trì STT Thời gian (s) Nhiệt độ máy ( o C) 0 0 65 1 5 65 2 10 65, 2 3 15 65, 1 4 20 64,8 5 25 65 6 30 65, 1 7 35 65 8 40 64 ,5 9 45 65, 2 10 50 65 11. Nồng độ cuối PCR buffer MgCl 2 dNTP Primer (OPN 0 6) Taq DNA polymerase DNA mẫu H 2 O 25 mM 25 mM 10 mM 10 pmol/ul 5 U 20 ng/ul 2 ,5 ul 2 ul 3 ul 0, 65 ul 0,1 ul 1 ul 19 ul 250 . 65 11 55 64,9 12 60 65, 1 13 65 65, 2 14 70 64,7 15 75 65 16 80 65, 1 17 85 65, 1 18 90 65 19 96 65, 2 20 100 64,9 40 Nhiệt độ máy 64 64 ,5 65 65, 5 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 Thời