xi 4.3.2. Kết quả kiểm tra PMWaV-2 44 PHẦN 5. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 47 5.1.Kết luận 47 5.2.Đề nghị 48 TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC xii DANH SÁCH CÁC BẢNG Bảng Trang Bảng 3.1 Bố trí thí nghiệm khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến khả năng tái sinh của ĐST chồi dứa Cayenne 30 Bảng 3.2 Bố trí thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng của giống và quá trình xử lí nhiệt lên sự sinh trưởng của chồi tái sinh từ ĐST 31 Bảng 3.3 Thành phần mix phản ứng RT – PCR 33 Bảng 3.4 Các mẫu lá của chồi dứa tái sinh từ ĐST được kiểm tra PMWaV bằng kĩ thuật RT-PCR 34 Bảng 4.1 Ảnh hưởng các yếu tố giống, xử lí nhiệt và kích thuớc mẫu đến TGTS của ĐST chồi dứa Cayenne 35 Bảng 4.2 Ảnh hưởng của các yếu tố giống, xử lí nhiệt và kích thước mẫu đến tỉ lệ tái sinh (TLTS) của ĐST chồi dứa Cayenne 36 Bảng 4.3 Ảnh hưởng của các yếu tố giống, xử lí nhiệt đến hệ số nhân chồi (HSNC) của ĐST chồi dứa Cayenne 37 Bảng 4.4 Ảnh hưởng của các yếu tố giống và xử lí nhiệt đến chiều cao chồi dứa tái sinh từ ĐST 38 Bảng 4.5 Ảnh hưởng của các yếu tố giống và xử lí nhiệt đến số lá của chồi dứa tái sinh từ ĐST 40 Bảng 4.6 Ảnh hưởng của các yếu tố giống và xử lí nhiệt đến số rễ của chồi dứa tái sinh từ ĐST 41 Bảng 4.7 Ảnh hưởng của các yếu tố giống và xử lí nhiệt đến số rễ của chồi dứa tái sinh từ ĐST 42 Bảng 4.8 Kết quả kiểm tra PMWaV ở chồi dứa Cayenne tái sinh từ ĐST sau 70 ngày nuôi cấy 46 xiii ] DANH SÁCH CÁC HÌNH VÀ SƠ ĐỒ Hình Trang Hình 2.1 Cấu tạo cơ bản của đỉnh sinh trưởng 16 Hình 2.2 Qui trình nuôi cấy ĐST 19 Sơ đồ 2.3 Qui trình tạo cây sạch bệnh bằng phương pháp xử lí nhiệt kết hợp nuôi cấy ĐST 20 Hình 4.1 Chồi dứa trước khi tách ĐST và ĐST được tách quan sát dưới kính hiển vi soi nổi SZ40 36 Hình 4.2 Chồi dứa tái sinh từ ĐST sau 30 ngày nuôi cấy 39 Hình 4.3 Chồi dứa tái sinh từ ĐST sau 70 ngày nuôi cấy 39 Hình 4.4 Kết quả điện di sản phẩm RT - PCR của chồi dứa Cayenne tái sinh từ ĐST không qua xử lí nhiệt sử dụng primer đặc trưng cho PMWaV-1 43 Hình 4.5 Kết quả điện di sản phẩm RT - PCR của chồi dứa Cayenne tái sinh từ ĐST đã qua xử lí nhiệt sử dụng primer đặc trưng cho PMWaV-1 44 Hình 4.6 Kết quả điện di sản phẩm RT-PCR của chồi dứa Cayenne tái sinh từ ĐST sử dụng primer đặc trưng cho PMWaV-2 45 xiv DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT Tp. HCM: Thành phố Hồ Chí Minh c.s.: cộng sự PMWaV: Pineapple mealbug- wilt associated virus TT PTTN: Trung tâm phân tích thí nghiệm ĐST: đỉnh sinh trưởng RT-PCR: Reverse transcription-polymerase chain reaction MWP: mealybug wilt of pineapple GLRaV-3: Grape leafroll associated virus TMV: Tobacco mosaic virus ELISA: Enzyme-linked immunosorbent assay TBIA: Tissue blot immunoassay QCM: Quartz crystal microbalance PCR: polymerase chain reaction cDNA: complementary deoxynucleic acid DNA: deoxy nucleic acid RT: Reverse transcription RFLP: Restriction fragment length polymorphism RNA: ribose nucleic acid HSPA: Heat- shocked protein A PCV: pineapple closterovirus 1 PHẦN 1. MỞ ĐẦU 1.1. Cơ sở tiến hành và ý nghĩa của nghiên cứu Dứa là một trong những loại cây ăn quả được ưa chuộng trên thị trường thế giới bởi hương vị đặc trưng và giàu chất dinh dưỡng (vitamin C, tiền vitamin A, acid hữu cơ…). Enzyme bromelin chiết xuất từ dứa có nhiều ứng dụng trong công nghệ thực phẩm, thuộc da và nhiều ngành khác. Với những đặc điểm về dinh dưỡng và mùi vị, dứa được gọi là “Nữ hoàng” của các loại trái cây. Trên thế giới, cây dứa đứng hàng thứ 9 về tầm quan trọng sau nho, chuối, táo [7]… Riêng ở Việt Nam, cây dứa có ưu thế về tính chống chịu với ngoại cảnh như: không kén đất, có thể trồng trên những vùng đất phèn hay vùng đất không thể canh tác cây rau quả nào khác. Từ những điều kiện thuận lợi trên, trong 5 năm qua dứa Cayenne với đặc điểm đạt tiêu chuẩn về năng suất, chất lượng cũng như các yêu cầu cần thiết khác cho chế biến đồ hộp đã được ưu tiên phát triển. Năm 2004 được Bộ Nông nghiệp và phát triển Nông thôn xác định là năm tập trung cho phát triển vùng nguyên liệu dứa [25]. Từ đó, các Sở Nông nghiệp và Phát triển nông thôn các tỉnh thực hiện qui hoạch phát triển dứa và rà soát lại vùng nguyên liệu phục vụ các nhà máy chế biến. Sở Nông Nghiệp và Phát Triển Nông Thôn Thành phố Hồ Chí Minh (Tp. HCM) đã thực hiện chương trình giống cây - con chất lượng cao (gồm bò sữa, tôm, rau an toàn và cây dứa Cayenne) từ năm 2003- 2005 [30]. Ngoài Tp. HCM, các tỉnh thuộc vùng Đông Nam bộ (Đồng Nai, Bình Dương), Tây Nguyên (Gia Lai) và miền Trung cũng dự kiến qui hoạch vùng nguyên liệu quả các loại gắn với xây dựng nhà máy chế biến các sản phẩm quả đạt tiêu chuẩn xuất khẩu, sản phẩm chủ lực là các sản phẩm từ cây dứa [29,31,32]. Tuy nhiên, một khi tăng diện tích gieo trồng và sản lượng thì bệnh hại trên dứa cũng bắt đầu phát triển. Theo kết quả điều tra của nhóm nghiên cứu bệnh hại trên dứa thuộc trường Đại học Nông Lâm Tp. HCM năm 2003 [3,6,8,9], trên hầu hết các ruộng dứa tại Tp. HCM, Long An, Tiền Giang, Lâm Đồng xuất hiện những bệnh như: bệnh héo đỏ đầu lá (bệnh wilt), thối trái, thối nõn làm ảnh hưởng nghiêm trọng đến năng suất và chất lượng dứa, gây thiệt hại về mặt kinh tế. Một trong những nguyên nhân lây 2 lan bệnh hại là nguồn chồi giống ban đầu không sạch các mầm bệnh, đặc biệt là virus gây bệnh đỏ đầu lá PMWaV (Pineapple mealybug wilt – associated virus). Giống dứa 3 Cayenne nhập nội mẫn cảm với bệnh đỏ đầu lá hơn dứa Queen; giống nhập từ Thái Lan, Trung Quốc có mức độ nhiễm cao và lây lan nhanh hơn giống của Lâm Đồng [1]. Chồi dứa nhiễm PMWaV không thể nhận biết bằng mắt thường ở giai đoạn đầu và hiện nay không có loại hóa chất nào để diệt trừ virus hiệu quả. Để cây dứa Cayenne ngày càng mở rộng và chuyên canh hơn nhằm đáp ứng nhu cầu quả tươi và nguyên liệu phục vụ cho việc chế biến đồ hộp xuất khẩu, cần phải có cây giống sạch bệnh đảm bảo chất lượng để cung cấp cho các khu vực trồng dứa. Với đề tài “Nghiên cứu tạo cây dứa Cayenne in vitro sạch virus gây bệnh héo đỏ đầu lá” chúng tôi hi vọng sẽ góp phần tạo được nguồn dứa Cayenne sạch bệnh. 1.2. Mục tiêu nghiên cứu Mục tiêu của đề tài nhằm tạo ra các chồi dứa Cayenne sạch virus thông qua xử lí nhiệt kết hợp nuôi cấy đỉnh sinh trưởng (ĐST) và kiểm tra virus PMWaV – 1 và PMWaV – 2 ở chồi dứa in vitro bằng kĩ thuật RT-PCR. 1.3. Giới hạn của đề tài Do giới hạn về thời gian và điều kiện trang thiết bị phục vụ thí nghiệm, đề tài chỉ giải quyết được các vấn đề cơ bản về mặt kĩ thuật nuôi cấy ĐST chồi dứa in vitro mà chưa thực hiện nuôi cấy ĐST của chồi dứa ngoài đồng đã qua xử lí nhiệt; chưa thực hiện được thí nghiệm xử lí nhiệt chồi dứa nhiễm virus ở các mức nhiệt độ và thời gian khác nhau. Do giới hạn về kinh phí nên thí nghiệm chỉ thực hiện với qui mô nhỏ; không kiểm tra PMWaV cho toàn bộ số chồi tái sinh từ ĐST. Mặt khác do hạn chế về kinh nghiệm nên đề tài chưa khai thác hết các mối tương quan giữa các yếu tố thí nghiệm. Đề tài chỉ khái quát một trong những qui trình tạo chồi dứa sạch virus từ mẫu chồi ngoài đồng bị nhiễm virus PMWaV và bước đầu chứng minh hiệu quả loại trừ virus của phương pháp xử lí nhiệt kết hợp nuôi cấy ĐST. 4 PHẦN 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1. Nguồn gốc của cây dứa[4] Cây dứa có nguồn gốc từ Nam Mỹ, được người Châu Âu phát hiện vào năm 1493. Cây dứa thuộc loài A. comosus var ananassoides được thuần hóa bởi những người thổ dân Tupi-Guarani và được phát tán đến Antilles, bắc Andes và trung Mỹ (Bertoni, 1919; trích dẫn bởi [4]). Theo khảo sát của Baker và Colin (1939; trích dẫn bởi [4]) nguồn gốc cây dứa có thể là vùng tứ giác nằm giữa vĩ tuyến nam 15 0 - 30 0 và kinh tuyến tây 40 0 - 60 0 bao gồm miền trung và nam Brazil, miền bắc Argentina và Paraguay. Trong khu vực này dạng hoang dại các loài dứa được tìm thấy theo những hoàn cảnh thích hợp riêng cho từng loài: o A. ananasoides trong rừng khô của Brazil, cây mọc rải rác và thấp lùn. o A. bracteatus dưới bóng cây thưa thớt thường ưa mọc ven rừng. o Pseudananas sagenarius trong những vùng ẩm ướt hơn, dọc theo bờ sông hay trong những khu rừng ẩm ướt. o A. erectifolius ở lưu vực sông Amazon trong những vùng nóng ẩm. 2.2. Đặc điểm thực vật học và sinh thái cây dứa 2.2.1. Đặc điểm thực vật học[4,22] Dứa là cây thân thảo lâu năm, thuộc lớp đơn tử diệp. Sau khi thu hoạch quả các mầm nách ở thân tiếp tục phát triển và hình thành một cây mới giống như cây trước; quả thứ hai thường bé hơn quả trước. Cây dứa trưởng thành cao đến 1 m và rộng 0,5 m trong khi cây dứa Smooth Cayenne trưởng thành cao 1,5 m và có đường kính từ 1,3 – 1,5 m. Đây là giống dứa được trồng nhiều nhất trên thế giới. Hoa Hoa gồm có 3 lá đài, 3 cánh hoa, 6 nhị đực xếp thành 2 vòng tròn, 1 nhị cái có 3 tâm bì và bầu hạ. Cánh hoa màu xanh, đỏ tía, gốc có màu trắng nhạt và trên mặt cánh hoa có những vảy. Tràng hoa dạng ống dài hơi loe ở phía đầu, ở giữa lồi lên 3 núm nhụy tím mờ của vòi nhụy. Hoa tự bất thụ (self-sterile) và phát triển quả không hạt; thụ phấn nhờ gió không xảy ra và sinh sản hữu tính hiếm thấy trong tự nhiên. Nhân 5 giống vô tính là hình thức sinh sản tiêu biểu sử dụng chồi bao gồm chồi đỉnh, chồi bên và chồi rễ. Quả Quả dứa thuộc loại quả tụ do 100 – 200 quả nhỏ hợp lại. Các giống khác nhau thì hình dạng quả và mắt quả cũng khác nhau. Bộ phận ăn được của dứa là do trục của chùm hoa và lá bắc phát triển nên. Sau khi hoa tàn thì quả bắt đầu phát triển. Hạt Hạt dứa nhỏ, màu tím đen, có vỏ và nội nhủ rất cứng, tỉ lệ nảy mầm thấp và bất thường nếu không qua tiền xử lí. Mỗi quả con chỉ có vài hạt. Dứa thường không hạt nếu để thụ phấn tự do. Hạt dứa thường do thụ phấn nhân tạo và được sử dụng trong các chương trình lai tạo giống mới. Thân Thân cây dứa chia làm 2 phần: một phần trên mặt đất và một phần dưới mặt đất. Phần ở trên thường bị các lá che kín nên khó nhìn thấy. Khi cây đã phát triển đến mức độ nhất định, có thể dùng các mầm ngủ trên các đốt để nhân giống. Lá Lá dứa mọc trên thân cây theo hình xoắn ốc. Lá thường dày, không có cuống, hẹp ngang và dài. Bề mặt và lưng lá thường có một lớp phấn trắng hoặc một lớp sáp có tác dụng làm giảm độ bốc hơi nước ở lá. Các giống dứa thường có gai nhọn và cứng ở mép lá, nhưng cũng có giống lá không gai như Cayenne. Tùy theo giống, một cây dứa trưởng thành có khoảng 60 – 70 lá. Rễ Rễ dứa gồm rễ cái và rễ nhánh (mọc ra từ phôi hạt); rễ bất định (mọc ra từ mầm rễ trên các đốt của các loại chồi dứa trước khi đem trồng). Rễ dứa thuộc loại ăn nông, phần lớn do nhân giống bằng chồi nên mọc từ thân ra, rễ nhỏ và phân nhiều nhánh. Bộ rễ dứa thường tập trung ở tầng đất 10 – 26 cm và phát triển rộng đến 1 m. 2.2.2. Sinh thái cây dứa [4,7] Dứa là cây ăn quả nhiệt đới thích nhiệt độ cao, nhiệt độ thích hợp cho sinh trưởng 28 – 32 0 C, nhiệt độ giới hạn 15 – 40 0 C. Nhiệt độ có ảnh hưởng đặc biệt quan trọng đến quá trình hình thành quả chín của quả do đó là yếu tố đầu tiên ảnh hưởng đến phẩm chất của quả. 6 Yếu tố quan trọng không kém là chế độ nước bao gồm lượng mưa hàng năm và phân bố mưa. Dựa vào 2 chỉ tiêu trên, các vùng sinh thái thích hợp được thiết lập đảm bảo việc trồng dứa trên diện rộng đạt năng suất cao. Theo kinh nghiệm, lượng mưa thích hợp nhất cho dứa là 1000 – 1.500 mm. Tuy nhiên dứa vẫn phát triển tốt ở những vùng có lượng mưa thấp nhưng thuộc khí hậu đại dương, quanh năm ấm mát. Cây dứa ưa ánh sáng tán xạ hơn ánh sáng trực xạ. Lượng chiếu sáng thích hợp làm tăng năng suất và cải thiện phẩm chất hương vị quả. Độ chiếu sáng còn ảnh hưởng đến màu sắc quả. Dứa có bộ rễ tập trung ở lớp đất mặt do đó yêu cầu đất phải tơi xốp, thoáng, có kết cấu hạt, không có nước đọng vào mùa mưa. Về pH, các giống khác nhau có yêu cầu khác nhau. pH 5,6 – 6,0 có thể lên đến 7,5 đối với giống Cayenne; nhóm dứa Queen có thể sinh trưởng tốt trên đất phèn pH 4,0 trong khi giống Spanish (các giống dứa ta) thích nghi với pH từ 4,5 – 5,0. 2.3. Phân loại [7,35] Dứa có tên khoa học là Ananas comosus (L.) Merr thuộc: o Phân lớp: Magnoliophyta o Lớp: Liliopsida o Bộ: Poales o Họ: Bromeliaceae o Giống: Ananas o Loài: A. comosus Giống này cùng với giống lân cận Pseudananas khác biệt với các giống khác trong họ ở chỗ quả dứa là một quả kép trong khi đó các giống khác có quả nhỏ đứng rời nhau. Smith (1939; trích dẫn bởi [7]) đề nghị cách phân loại rõ hơn giữa các chi Ananas và Pseudananas: i. Quả kép khi chín mang một chùm nhỏ lá bắc giống như vảy ở cuống quả không có chồi cuống, trên thân có các chồi ngầm, cánh hoa có nhiều u nổi như những nếp thịt là chi Pseudananas (P. sagenarius). i. Quả kép khi chín mang một chùm lá bắc rất dễ nhận, ở gốc cuống quả có các chồi, trên thân không có chồi ngầm, hoa có 2 vảy hình phễu là chi Ananas. . khẩu, cần phải có cây giống sạch bệnh đảm bảo chất lượng để cung cấp cho các khu vực trồng dứa. Với đề tài Nghiên cứu tạo cây dứa Cayenne in vitro sạch virus gây bệnh héo đỏ đầu lá chúng tôi. lượng dứa, gây thiệt hại về mặt kinh tế. Một trong những nguyên nhân lây 2 lan bệnh hại là nguồn chồi giống ban đầu không sạch các mầm bệnh, đặc biệt là virus gây bệnh đỏ đầu lá PMWaV (Pineapple. ĐST: đỉnh sinh trưởng RT-PCR: Reverse transcription-polymerase chain reaction MWP: mealybug wilt of pineapple GLRaV- 3: Grape leafroll associated virus TMV: Tobacco mosaic virus ELISA: Enzyme-linked