1 XÁC ĐỊNH CÔNG HIỆU CỦA GIẢI ĐỘC TỐ UỐN VÁN HOẶC THÀNH PHẦN UỐN VÁN TRONG VẮC XIN DTwP HẤP PHỤ Công hiệu của giải độc tố uốn ván hoặc thành phần uốn ván trong vắc xin DTwP được xác định bằng phương pháp so sánh liều hữu hiệu 50% (ED 50 ) của vắc xin chuẩn và vắc xin thử. Kết quả được tính theo phương pháp Probit analysis (phần mềm WHO program). MIỄN DỊCH Sử dụng ít nhất 4 độ pha loãng bậc 2 nhưng không quá 5 độ pha cho cả vắc xin mẫu chuẩn và vắc xin mẫu thử. Pha vắc xin Vắc xin được pha thành các độ pha loãng khác nhau bằng nước muối sinh lý vô khuẩn sao cho giá trị ED 50 không nằm ra ngoài các độ pha của vắc xin. Pha vắc xin chuẩn 2 Hoàn nguyên và pha loãng trong nước muối sinh lý ống vắc xin mẫu chuẩn quốc gia cho ít nhất 4 độ pha loãng bậc 2; tuỳ theo số đơn vị ghi trên nhãn pha sao cho ED 50 của vắc xin mẫu chuẩn nằm trong khoảng của 4 độ pha loãng (Ví dụ: 4 độ pha loãng bậc 2 tương ứng với 10 I.U/ 0,5 ml; 5 I.U/0,5 ml; 2,5 I.U/0,5 ml; 1,25 I.U/0,5 ml). Ví dụ cách pha như sau: Vắc xin chuẩn quốc gia chứa 360 IU/ ống được hoàn nguyên trong 9 ml nước muối sinh lý để có dung dịch (*) chứa 40 IU/ml. A = 1/2 = 9 ml (*) + 9 ml NMSL B = 1/4 = 9 ml (A) + 9 ml NMSL C = 1/8 = 9 ml (B) + 9 ml NMSL D = 1/16 = 9 ml (C) + 9 ml NMSL Pha vắc xin thử Ví dụ đối với giải độc tố uốn ván : A = 1/15 = 2 ml (*) + 28 ml NMSL B = 1/30 = 10 ml (A) + 10 ml NMSL C = 1/60 = 10 ml (B) + 10 ml NMSL D = 1/120 = 10 ml (C) + 10 ml NMSL Ví dụ đối với thành phần uốn ván trong vắc xin DTwP : 3 A = 1/ 25 = 1 ml (*) + 24 ml NMSL B = 1/ 50 = 10 ml (A) + 10 ml NMSL C = 1/ 100 = 10 ml (B) + 10 ml NMSL D = 1/200 = 10 ml (C) + 10 ml NMSL Tiêm miễn dịch Mỗi độ pha của vắc xin mẫu chuẩn và vắc xin mẫu thử được tiêm dưới da ít nhất cho 16 chuột nhắt trắng khoẻ mạnh, 4-5 tuần tuổi, có trọng lượng 14g –16 g, mỗi con 0,5 ml. Dùng chuột cùng giống; nếu không cùng giống phải chia đều số chuột đực, cái vào các nhóm và nhốt riêng. Sau tiêm miễn dịch, chăm sóc và theo dõi chuột trong 28 ngày và tiến hành tiêm thử thách. TIÊM THỬ THÁCH Xác định liều độc tố thử thách Chỉ sử dụng độc tố có ít nhất 10.000 LD 50 /Lf. Độc tố được pha loãng để có các độ pha ví dụ như: 0,0004 Lf/ ml; 0,0002 Lf/ ml; 0,0001 Lf/ ml và 0,00005 Lf/ ml. Mỗi độ pha tiêm cho một nhóm gồm 5 con chuột nhắt trắng, mỗi con có trọng lượng 16 g ± 0,3g. Theo dõi chuột hàng ngày trong 96 giờ, ghi lại số chuột còn sống trong mỗi độ pha. 4 Độ pha loãng độc tố gây chết 50% số chuột vào ngày thứ 4 (sau 96 giờ) được tính là 1LD 50 . Tiêm thử thách Dựa vào kết quả LD 50 được xác định ở trên để độ pha dung dịch độc tố thử thách tương ứng với 50 LD 50 /ml trong dung dịch Jensen vô khuẩn có 1% pepton . Sau 28 ngày toàn bộ chuột đã miễn dịch bởi vắc xin mẫu chuẩn và mẫu thử được tiêm dưới da 0,5 ml với liều độc tố thử thách chứa 50 LD 50 Nhóm chuột chứng: Từ dung dịch độc tố thử thách pha thành 3 độ pha 2 LD 50 , 1 LD 50, 0,5 LD 50 . Mỗi độ pha tiêm cho 5 chuột nhắt trắng có trọng lượng 16 g ± 0,3g. Theo dõi chuột Theo dõi chuột thử thách hàng ngày trong 5 ngày. Ghi lại số chuột sống, chết, liệt ở mỗi độ pha miễn dịch của cả vắc xin mẫu thử và mẫu chuẩn. Triệu chứng liệt uốn ván: Liệt cứng hoặc co giật kích động( sau thử thách 2 ngày) Chuột đi nhón cao chân và chân sau liệt co cứng tiếp đến 2 chân trước. Khi nắm vào chuột cảm thấy rất cứng do các cơ bị co cứng, cổ cong vẹo về phía lưng. Khi kích thích bằng tiếng động như quẹt bút trên nắp thanh lồng chuột, những chuột này sẽ phản ứng bằng cách co cứng. Chuột chết do co cứng các cơ hô hấp, các triệu chứng liệt này rất đau. 5 TÍNH KẾT QUẢ Dựa vào số chuột sống sót trong mỗi độ pha, công hiệu được xác định bằng phương pháp Probit analysis Phần mềm WHO program). Thử nghiệm có giá trị nếu: -Liều thử thách: Khi tiêm cho các nhóm chuột đối chứng. 2 LD 50 : 4 chuột chết hết trong thời gian 96 giờ theo dõi. 0,5 LD 50 : không có chuột chết trong thời gian 96 giờ theo dõi. 1 LD 50 : Chuột chết ít nhất 1 con và không quá 3 con trong thời gian 96 giờ theo dõi. - ED 50 của mỗi loạt vắc xin phải nằm giữa liều miễn dịch nhỏ nhất và lớn nhất. - Đường dốc đáp ứng miễn dịch của vắc xin thử và vắc xin chuẩn không có sự chênh lệch có ý nghĩa từ đường thẳng và đường song song nghĩa là kết quả thử nghiệm này phải đạt yêu cầu đặt ra trong chương trình Probit Analysis đối với đường thẳng và đường song song của tương quan đáp ứng liều. Tiêu chuẩn chấp thuận Tiêu chuẩn công hiệu của thành phần uốn ván trong vắc xin DTwP khi kiểm tra trên chuột lang phải không ít hơn 40 I.U trong 1liều đơn vắc xin cho người với điều kiện khoảng tin cậy 95% của công hiệu tìm được nằm trong giới hạn 50% - 200%, hoặc khi giới hạn dưới của khoảng tin cậy 95% của công hiệu tính được phải lớn hơn 40 I.U trong liều đơn vắc xin cho người. 6 Tiêu chuẩn công hiệu của thành phần uốn ván trong vắc xin DTwP khi kiểm tra trên chuột nhắt phải đạt 60 IU trong 1 liều đơn cho người. Khoảng tin cậy 95% của công hiệu phải nằm trong khoảng 50% - 200%. Nếu khoảng tin cậy 95% vượt ra ngoài khoảng 50% - 200%, thì giới hạn dưới của khoảng tin cậy của công hiệu phải lớn hơn 60 IU trong liều đơn vắc xin cho người. Nếu thử nghiệm không đạt các tiêu chuẩn trên phải nhắc lại thử nghiệm với số lượng mẫu thử gấp đôi (thử nghiệm lần 1 có giá trị - valid test) hoặc bằng số lượng mẫu bằng lần 1 (thử nghiệm lần 1 không có giá trị - invalid test). Loạt vắc xin DTwP hấp phụ đạt yêu cầu về công hiệu thành phần uốn ván nếu lần thử nghiệm nhắc lại cho kết quả công hiệu đạt yêu cầu như trên. Nếu kết quả thử nghiệm nhắc lại không đạt yêu cầu trên thì loạt vắc xin DTwP hấp phụ đó bị coi là không đạt công hiệu thành phần uốn ván và phải huỷ bỏ. . 1 XÁC ĐỊNH CÔNG HIỆU CỦA GIẢI ĐỘC TỐ UỐN VÁN HOẶC THÀNH PHẦN UỐN VÁN TRONG VẮC XIN DTwP HẤP PHỤ Công hiệu của giải độc tố uốn ván hoặc thành phần uốn ván trong vắc xin DTwP được xác định. được phải lớn hơn 40 I.U trong liều đơn vắc xin cho người. 6 Tiêu chuẩn công hiệu của thành phần uốn ván trong vắc xin DTwP khi kiểm tra trên chuột nhắt phải đạt 60 IU trong 1 liều đơn cho người ra trong chương trình Probit Analysis đối với đường thẳng và đường song song của tương quan đáp ứng liều. Tiêu chuẩn chấp thuận Tiêu chuẩn công hiệu của thành phần uốn ván trong vắc xin DTwP