TẠP CHÍ KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ, ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG - SỐ 5(28).2008 173 NGHIÊN CỨU TÁC DỤNG CỦA DARBEPOETINE ALPHA TRÊN ĐỘNG HỌC CỦA CYTOKINE VIÊM TRONG NHIỄM TRÙNG HUYẾT THỰC NGHIỆM A STUDY ON THE EFFECTS OF DARBEPOETIN ALPHA ON INETICS OF PROINFLAMMATORY CYTOKINES IN EXPERIMENTAL SEPSIS LÊ MINH KHÔI Khoa Y Dược, Đại Học Đà Nẵng TÓM TẮT Đáp ứng viêm toàn thể trong nhiễm trùng huyết (NTH) đóng vai trò quan trọng trong bệnh sinh của hội chứng rối loạn chức năng đa cơ quan (MODS) và tỉ lệ tử vong cao. TNFα và IL -6 là những cytokine viêm quan trọng nhất của đáp ứng viêm toàn thể . Nghiên cứu thực nghiệm của chúng tôi cho thấy darbepoetine alpha (DPO), một chất đồng đẳng của erythropoietin, có khả năng làm giảm đáng kể nồng độ của cả TNFα và IL-6 từ thời điểm rất sớm sau khi được gây NTH bằng D - galactosamin/lipopolysaccharide (Gal-LPS). Hoạt độ của các men gan cũng như các chỉ điểm tổn thương tế bào cũng giảm rõ trong các nhóm chuột NTH được điều trị bằng DPO. Như vậy, DPO có tác động làm giảm phản ứng viêm toàn thể và làm giảm tổn thương cơ quan trong NTH thực nghiệm. ABSTRACT The systemic inflammatory response syndrome (SIRS) which occurs during sepsis plays a critical role in pathogenesis of the Multiple Organ Dysfunction Syndrome (MODS) and high mortality. TNFα and IL-6 are the most important proinflammatory cytokines causing SIRS. The present study showed for the first time that intravenous DPO, an analogue of erythropoietin, was capable to significantly reduce concentrations of both TNFα and IL-6 at very early time points after induction of sepsis by Gal-LPS. Activities of liver transaminases and other enzymes, which are markers of cellular injury, were also clearly lower in the septic mice treated with DPO. Thus, DPO was effective in attenuating the SIRS and minimizing organ injury during experimental sepsis. 1. Đặt vấn đề Nhiễm trùng huyết nặng là một trong những nguyên nhân gây tử vong hàng đầu ở bệnh nhân điều trị tại các đơn vị chăm sóc tích cực. Ở Hoa Kỳ, hằng năm có đến 750 000 bệnh nhân nhập viện vì NTH nặng có tỷ lệ tử vong lên đến 28,6% với chi phí điều trị khoảng 16,7 tỷ đô la Mỹ [1]. Nhiều nước châu Âu khác cũng công bố những con số rất đáng quan ngại về tỉ lệ mắc bệnh, tỉ lệ tử vong cao và gánh nặng chi phí do NTH [3], [4], [15]. Nguyên nhân trực tiếp gây tử vong của NTH là MODS. Bản chất sinh lý bệnh của NTH là một phản ứng viêm quá mức không thể kiểm soát được [5]. Trong mạng lưới tương tác cực kỳ phức tạp của một loạt các cytokine thì TẠP CHÍ KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ, ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG - SỐ 5(28).2008 174 yếu tố gây hoại tử khối u alpha (TNFα) đóng vai trò nhạc trưởng [ 2]. Bên cạnh đó, interleukine-6 (IL-6) cũng là một cytokine đóng vai trò quan trọng trong bệnh sinh của NTH [14]. Vì vậy, hạn chế sự phóng thích của TNFα và IL-6 được xem là có khả năng làm giảm mức độ nặng của NTH, ngăn ngừa diễn tiến đến MODS và nhờ đó hạ thấp tỉ lệ tử vong. Gần đây, người ta phát hiện rằng darbepoetin alpha (DPO), một chất đồng đẳng của erythropoietin, bên cạnh chức năng tạo máu còn có những tác động sinh lý khác như ức chế chết tế bào lập trình, ức chế hoại tử và làm dịu phản ứng viêm. Xuất phát từ những cơ sở trên, chúng tôi tiến hành nghiên cứu tác động của DPO lên động học của TNFα và IL-6 trong NTH thực nghiệm. 2. Phương pháp nghiên cứu Phương pháp nghiên cứu thực nghiệm, thực hiện tại Vi ện Phẫu Thuật Thực Nghiệm, Đại học Rostock, CHLB Đức. Chuột C57BL/6 từ 8-12 tuần tuổi có trọng lượng cơ thể xấp xỉ 20g được chia đều thành 4 nhóm, mỗi nhóm 7 con. Nhóm thứ nhất gọi là nhóm chứng chỉ nhận một mũi tiêm 0,4ml dung dịch NaCl 9‰ 6 giờ trước khi mổ (control). Ba nhóm còn lại đều được tiêm 720 mg/kg D -galactosamin (Gal) và 10 μg/kg lipopolysaccharide (LPS) E coli type huyết thanh 0128:B12 (Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Đức) 6 giờ trước khi mổ để gây NTH thực nghiệm. Trong đó, nhóm thứ hai là nhóm tổn thương gan không được điều trị gì (Gal-LPS). Nhóm thứ ba được tiêm DPO 10 μg/kg (Aranesp ; Amgen Europe, Breda, Hà Lan) qua tĩnh mạch sau hốc mắt 24 giờ trước khi gây NTH (DPO pre /Gal-LPS). Nhóm còn lại cũng được tiêm DPO liều tương tự nhưng vào thời điểm 30 phút sau khi chuột được gây NTH (DPO post Sau 6 giờ được tiêm NaCl 9‰ (đối với nhóm thứ nhất) và Gal -LPS (đối với 3 nhóm còn lại) chuột được gây mê bằng ketamine/xylazine để nghiên cứu vi tuần hoàn gan bằng phương pháp Intravital Microscopy (kết quả không thuộc phạm vi bài báo này) và cuối cùng máu được lấy bằng chọc tĩnh mạch chủ dưới để làm các xét nghiệm. Định lượng TNFα và IL6 bằng phương pháp ELISA theo hướng dẫn chuẩn hóa của nhà sản xuất (Pierce Biotechnology, Rockford, Mỹ). Các enzyme SGOT, SGPT, LDH, GLDH được định lượng theo phương pháp trắc quang trên máy HITACHI 704 Automatic Analyzer (Boehringer, Mannheim, Đức). /Gal-LPS). Ngoài ra để nghiên cứu động học của cytokine viêm, chúng tôi cũng tiến hành nghiên cứu ở các thời điểm khác nhau là 2 giờ, 4 giờ và 6 giờ sau khi gây NTH. Tại mỗi thời điểm chúng tôi có hai nhóm chuột (mỗi nhóm 5 con) đều được gây NTH nhưng một nhóm chỉ nhận NaCl 9‰ còn nhóm kia nhận 10 μg/kg DPO đường tĩnh mạch sau nhãn cầu. Cả NaCl 9‰ lẫn DPO đều được tiêm 30 phút sau khi gây NTH. Các xét nghiệm cũng được tiến hành tương tự như đã trình bày ở trên. Xử lý số liệu bằng phần mềm SigmaStat phiên bản 3.0. Để so sánh sự khác biệt giữa các nhóm, chúng tôi sử dụng one way ANOVA, test post hoc có hiệu chỉnh Bonferroni cho sai s ố α. Kết quả được trình bày bằng mean ± SEM. p < 0,05 đư ợc xem là có ý nghĩa. TẠP CHÍ KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ, ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG - SỐ 5(28).2008 175 3. Kết quả Tất cả chuột được tiêm Gal-LPS đều xuất hiện các triệu chứng của NTH nặng như xù lông, run rẩy, kém hoạt động, bỏ ăn, hạ thân nhiệt và bắt đầu chết sau 6 giờ. Ngoài ra, chúng đều có biểu hiện rối loạn vi tuần hoàn gan với mức độ khác nhau tùy theo nhóm. Nồng độ TNFα trong máu tĩnh mạch chủ dưới sau 6 giờ tiêm Gal-LPS hầu như không khác nhau mặc dù nhóm NTH không được điều trị có cao hơn chút ít. Không có sự khác biệt đáng kể giữa nhóm chứng và hai nhóm Gal-LPS được điều trị với DPO (Hình 1A). TNF-alpha (pg/ml) 0 20 40 60 control Gal-LPS DPO pre DPO post Gal-LPS IL-6 (pg/ml) 0 1000 2000 3000 4000 5000 6000 * * control Gal-LPS DPO pre DPO post Gal-LPS B A Hình 1. Nồng độ TNF α và IL-6 ở bốn nhóm chuột nghiên cứu. Control: nhóm chứng không được tiêm Gal-LPS. Gal-LPS: nhóm nhiễm trùng huyết không được điều trị DPO. DPO pre /Gal-LPS và DPO post Khác với TNFα, nồng độ IL-6 ở ba nhóm được tiêm Gal-LPS có cao hơn. Trong đó, cao nhất là nhóm Gal-LPS không được điều trị. Điều trị DPO ở chuột gây NTH làm giảm rõ rệt nồng độ của IL-6. (Hình 1B) /Gal-LPS lần lượt là các nhóm NTH được điều trị bằng DPO 24 giờ trước và 30 phút sau khi tiêm Gal-LPS. Test ANOVA và post hoc; * p < 0.05 so với control. 2h 4h 6h TNF-alpha (pg/ml) 0 50 100 150 200 # † 2h 4h 6h IL-6 (pg/ml) 0 2000 4000 6000 8000 10000 # † † A B ● Gal-LPS ● DPO post / Gal-LPS ● Gal-LPS ● DPO post / Gal-LPS ● Gal-LPS ● DPO post / Gal-LPS ● Gal-LPS ● DPO post / Gal-LPS Hình 2. Nồng độ của TNFα và IL-6 ở nhóm chuột NTH không được điều trị DPO (Gal-LPS) và nhóm chuột NTH được điều trị DPO (DPO post Những thay đổi của TNFα và IL-6 trong quá trình tiến triển của NTH có và không có điều trị bằng DPO được lần lượt trình bày trong hình 2A và 2B. Khảo sát /Gal-LPS ở các thời điểm khác nhau. Test ANOVA và post hoc; # p < 0.05 so với Gal-LPS ở cùng thời điểm; † p < 0.05 so với thời điểm 2 giờ. TẠP CHÍ KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ, ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG - SỐ 5(28).2008 176 TNFα vào các thời điểm khác nhau cho thấy cytokine viêm này được phóng thích từ rất sớm sau khi tiêm Gal-LPS. Nồng độ TNFα cao nhất lúc 2 giờ và nhanh chóng hạ thấp về gần mức bình thường 4 giờ sau tiêm Gal-LPS (Hình 2A). Tương tự, nồng độ IL-6 huyết tương cũng cao nhất vào thời điểm 2 giờ và dần dần hạ thấp, tuy nhiên không trở về bình thường (Hình 2B). Hai hình này cũng cho thấy DPO có khả năng làm giảm đáng kể cả TNFα và IL-6 ở tất cả thời điểm nghiên cứu. Bảng 1 trình bày các thông số đánh giá chức năng gan cũng như chỉ điểm tổn thương tế bào ở bốn nhóm chuột được nghiên cứu. Tiêm Gal-LPS gây nên tổn thương gan mạnh mẽ ở thời điểm 6 giờ. Trong khi đó, DPO 24 giờ trước và 30 phút sau khi tiêm Gal-LPS làm giảm rõ mức độ tổn thương gan cũng như các chỉ điểm tổn thương tế bào chung. Thông số Control Gal-LPS DPO pre DPO /Gal-LPS post /Gal- LPS SGPT (U/L) 33 ± 4 267 ± 51* 92 ± 24 145 ± 76 SGOT (U/L) 140 ± 13 453 ± 13* 249 ± 51 267 ± 91 LDH (U/L) 1249 ± 266 3468 ± 295* 1627 ± 329 1439 ± 667 GLDH (U/L) 15 ± 2 59 ± 11* 33 ± 6 33 ± 12 Bảng 1. Hoạt độ của các men SGOT, SGPT, LDH và GLDH vào thời điểm 6 giờ sau tiêm Gal-LPS phản ảnh mức độ tổn thương gan ở chuột gây NTH và tác dụng bảo vệ gan của DPO. Test ANOVA và post hoc; * p < 0.05 so với control . 4. Bàn luận Mô hình thực nghiệm gây nhiễm trùng huyết và tổn thương gan sử dụng trong nghiên cứu này là mô hình đã được chuẩn hóa và sử dụng trong nhiều nghiên cứu trước đây [9], [11]. Viêm là kết quả của sự hoạt hóa của một hệ thống bao gồm bạch cầu, tế bào nội mô và hệ thống các chất trung gian trong đó cytokine đóng vai trò quan trọng đặc biệt [13]. Trong số các cytokine này, TNFα được xem như nhạc trưởng. Trong NTH do Gal- LPS, TNFα gây nên quá trình sao mã các cytokine viêm khác, thúc đẩy quá trình thoát quản bạch cầu đa nhân vào trong tổ chức như gan gây nên tổn thương cơ quan [2]. Trong nghiên cứu này , DPO làm giảm một cách đáng kể TNFα vào thời điểm rất sớm sau khởi phát NTH do vậy có khả năng làm giảm đáp ứng viêm về sau. Nhờ đó, tổn thương gan và cơ quan khác cũng giảm xuống. Sử dụng mô hình nghiên cứu thực nghiệm tương tự, Lamping và cộng sự chứng minh rằng nồng độ IL-6 tăng cao trong nhóm Gal-LPS và hạ thấp trong nhóm chuột được tiêm protein gắn LPS trước khi tiêm Gal-LPS và nhờ đó bảo vệ được chuột khỏi sốc NTH [8]. Hơn nữa, TNFα là chất cảm ứng chính gây phóng thích IL-6 trong các bệnh lý do viêm [5]. Nồng độ IL-6 thấp ở các nhóm chuột NTH được điều trị DPO có thể được giải thích một phần do TNFα thấp ở các nhóm này. Trong các nghiên cứu TẠP CHÍ KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ, ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG - SỐ 5(28).2008 177 trước đây, erythropoietin làm giảm IL-6 ở bệnh nhân ung thư [7], giảm viêm trong thiếu máu cục bộ/tái tưới máu não [16] và làm giảm TNFα cũng như IL-6 trong bệnh tim mạn tính [10]. Trong nghiên cứu này, chúng tôi lần đầu tiên chứng minh rằng DPO làm giảm viêm trong NTH do Gal-LPS. TNFα đóng vai trò quan trọng trong việc cảm ứng gây tương tác giữa tế bào nội mô và bạch cầu [12]. IL-6 tham gia vào phản ứng viêm thông qua khuyếch đại hiện tượng tụ tập bạch cầu tại các cơ quan [14]. Bạch cầu đóng vai trò quan trọng trong cơ chế bệnh sinh của tổn thương cơ quan do NTH, ví dụ như trong tổn thương gan [6]. Thông qua việc làm giảm nồng độ TNFα và IL-6, DPO làm giảm tập trung bạch cầu tại gan, giảm phản ứng viêm tại đây và nhờ vậy làm giảm tổn thương gan và tổ chức khác. 5. Kết luận DPO liều 10 μg/kg tĩnh mạch 24 giờ trước hoặc 30 phút sau khi gây NTH bằng D-galactosamin/lipopolysaccharide E coli làm giảm đáng kể nồng độ TNF α và IL-6 ngay từ những thời điểm rất sớm. Nhờ đó, DPO làm giảm tổn thương cơ quan, đặc biệt là tổn thương gan do NTH. Như vậy DPO có tác dụng chống viêm và bảo vệ cơ quan trong NTH thực nghiệm. Cần thêm nhiều nghiên cứu thực nghiệm cũng như lâm sàng khác để có thể kết luận DPO có tác dụng tương tự ở người hay không. TÀI LIỆU THAM KHẢO [1] Angus DC, Linde-Zwirble WT, Lidicker J, Clermont J, Carcillo G, Pinsky MR. Epidemiology of severe sepsis in the United States: analysis of incidence, outcome, and associated costs of care. Crit Care Med. 2001; 29:1303-10. [2] Bradham CA, Plumpe J, Manns MP, Brenner DA, Trautwein C. Mechanisms of hepatic toxicity. I. TNF-induced liver injury. Am J Physiol. 1998; 275:G387-92. (a) [3] Brun-Buisson C. The epidemiology of the systemic inflammatory response. Intensive Care Med. 2000; 26:64-74. [4] Brunkhorst FM, Rheinhart K; Kompetenznetzwerk Sepsis (SEPNET). Häufigkeit der Sepsis in deutschen Intensivstationen und Leitlinien der DSG. Notfall- und Intensivmedizin. 2006; 1:34-35. [5] Cohen J. The immunopathogenesis of sepsis. Nature. 2002;420:885-91. [6] Jaeschke H, Hasegawa T. Role of neutrophils in acute inflammatory liver injury. Liver Int. 2006; 26:912-9. [7] Kanzaki M, Soda K, Gin PT, Kai T, Konishi F, Kawakami M. Erythropoietin attenuates cachectic events and decreases production of interleukin-6, a cachexia- inducing cytokine. Cytokine. 2005; 32:234-9. [8] Lamping N, Dettmer R, Schroder NW, Pfeil D, Hallatschek W, Burger R, Schumann RR. LPS-binding protein protects mice from septic shock caused by TẠP CHÍ KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ, ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG - SỐ 5(28).2008 178 LPS or gram-negative bacteria. J Clin Invest. 1998; 101:2065-71. [9] Leist M, Gantner F, Bohlinger L, Tiegs G, Germann PG, Wendel A. Tumor necrosis factor-induced hepatocyte apoptosis precedes liver failure in experimental murine shock models. Am J Pathol. 1995; 146:1220-34. (a) [10] Li Y, Takemura G, Okada H, Miyata S, Maruyama R, Li L, Higuchi M, Minatoguchi S, Fujiwara T, Fujiwara H. Reduction of inflammatory cytokine expression and oxidative damage by erythropoietin in chronic heart failure. Cardiovasc Res. 2006; 71:684-94. [11] Morikawa A, Sugiyama T, Kato Y, Koide N, Jiang GZ, Takahashi K, Tamada Y, Yokochi T. Apoptotic cell death in the response of D-galactosamine-sensitized mice to lipopolysaccharide as an experimental endotoxic shock model. Infect Immun. 1996; 64:734-8. [12] Norman MU, Lister KJ, Yang YH, Issekutz A, Hickey MJ. TNF regulates leukocyte-endothelial cell interactions and microvascular dysfunction during immune complex-mediated inflammation. Br J Pharmacol. 2005; 144:265-74. [13] Rolando N, Wade J, Davalos M, Wendon J, Philpott-Howard J, Williams R. The systemic inflammatory response syndrome in acute liver failure. Hepatology. 2000; 32:734-9. [14] Romano M, Sironi M, Toniatti C, Polentarutti N, Fruscella P, Ghezzi P, Faggioni R, Luini W, van Hinsbergh V, Sozzani S, Bussolino F, Poli V, Ciliberto G, Mantovani A. Role of IL-6 and its soluble receptor in induction of chemokines and leukocyte recruitment. Immunity. 1997; 6:315-25. [15] Van Gestel A, bekker J, Veraart C PWM, van Hout BE. Prevalence and incidence of severe sepsis in Dutch intensive care units. Crit Care. 2004; 8:153-62. [16] Villa P, Bigini P, Mennini T, Agnello D, Laragione T, Cagnotto A, Viviani B, Marinovich M, Cerami A, Coleman TR, Brines M, Ghezzi P. Erythropoietin selectively attenuates cytokine production and inflammation in cerebral ischemia by targeting neuronal apoptosis. J Exp Med. 2003; 198:971-5. . TẠP CHÍ KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ, ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG - SỐ 5(28).2008 173 NGHIÊN CỨU TÁC DỤNG CỦA DARBEPOETINE ALPHA TRÊN ĐỘNG HỌC CỦA CYTOKINE VIÊM TRONG NHIỄM TRÙNG HUYẾT THỰC NGHIỆM A. những cơ sở trên, chúng tôi tiến hành nghiên cứu tác động của DPO lên động học của TNFα và IL-6 trong NTH thực nghiệm. 2. Phương pháp nghiên cứu Phương pháp nghiên cứu thực nghiệm, thực hiện. hình thực nghiệm gây nhiễm trùng huyết và tổn thương gan sử dụng trong nghiên cứu này là mô hình đã được chuẩn hóa và sử dụng trong nhiều nghiên cứu trước đây [9], [11]. Viêm là kết quả của