sản xuất hợp chất thứ cấp ở thực vật

kĩ thuật tế bào

Sản xuất các hợp chất thứ cấp từ nuôi cấy tế bào thực vật

Nguyễn Hoàng Lộc Viện Tài nguyên, Môi trường và Công nghệ sinh học, Đại học Huế

1 Các hợp chất thứ cấp thực vật

Thực vật là nguồn cung cấp các hợp chất dùng làm dược liệu hoặc phụ gia thực phẩm

có giá trị Những sản phẩm này được biết như là các chất trao đổi thứ cấp, thường được hình thành với một lượng rất nhỏ trong cây và chức năng trao đổi chất chưa được biết đầy đủ Chúng dường như là sản phẩm của các phản ứng hóa học của thực vật với môi trường hoặc là

sự bảo vệ hóa học chống lại vi sinh vật và động vật Những nghiên cứu về các hợp chất thứ cấp có nguồn gốc thực vật đã phát triển từ cuối những năm 50 của thế kỷ 20 (Rao và cs 2002) Các chất trao đổi thứ cấp có thể xếp trong ba nhóm chính là alkaloid, tinh dầu và glycoside

Các alkaloid có dạng tinh thể là các hợp chất chứa nitrogen, có hoạt tính sinh lý trên

tất cả động vật và được sử dụng trong công nghiệp dược Họ alkaloid bao gồm: codein, nicotine, caffeine và morphine Một số loài thực vậ

Solanaceae) Người ta thường gặp trong một cây tập hợp các alkaloid có cấu trúc hóa học gần giống nhau Đôi khi toàn câ

-(họ Taxaceae)

dụng lên mạch máu (hydrastin, ephedrin ), một số khác tác dụng

dụng làm thuốc chữa bệnh (Misawa, 1994)

Các tinh dầu chứa hỗn hợp terpenoid, được sử dụng như chất mùi, chất thơm và dung

môi Giống như những

, ví dụ monoterpene chứa 2 đơn vị isoprene, sesquiterpene chứa 3 đơn vị isoprene, diterpene chứa 4 đơn vị isoprene (Lee 2001)

Các glycoside bao gồm các hợp chất phenol và flavonoid, saponin và các cyanogenic

glycoside, một số trong chúng được sử dụng làm thuốc nhuộm, chất mùi thực phẩm và dược phẩm (Lee 2001)

2 Nuôi cấy tế bào thực vật

Kỹ thuật nuôi cấy tế bào thực vật tiêu biểu cho tiềm năng cải thiện các hợp chất có giá trị trong y dược, gia vị, hương liệu và màu nhuộm mà không thể sản xuất chúng từ các tế bào

vi sinh vật hoặc tổng hợp bằng con đường hóa học Những năm gần đây, sự phát triển của các hợp chất thứ cấp quan trọng trong thương mại là kết quả được mong đợi nhất trong lĩnh vực nghiên cứu này Ưu thế về mặt nguyên lý của kỹ thuật nuôi cấy tế bào thực vật là có thể cung

cấp liên tục nguồn nguyên liệu để tách chiết một tỷ lệ lớn lượng hoạt chất từ tế bào thực vật nuôi cấy (Mulbagal and Tsay, 2004)

Một trong những nhân tố quan trọng ảnh hưởng đến việc sản xuất các hợp chất thứ cấp

từ tế bào thực vật là sự phân hóa hình thái Nhiều hợp chất thứ cấp được sản xuất trong suốt quá trình phân hóa tế bào, vì thế chúng được tìm thấy trong các mô có khả năng phân hóa cao như rễ, lá và hoa Do sự phân hóa hình thái và sự trưởng thành không xuất hiện trong nuôi cấy

tế bào nên các chất thứ cấp có khuynh hướng ngưng tạo thành trong quá trình nuôi cấy Tuy nhiên, các tế bào không phân hóa trong nuôi cấy huyền phù thường tạo thành một khối vài trăm tế bào, các tế bào ở giữa khối có sự tiếp xúc với môi trường khác với các tế bào ở bên ngoài nên sự phân hóa sẽ xuất hiện tới một mức độ nào đó trong khối để tạo thành các chất thứ cấp (Lee 2001)

Nuôi cấy tế bào huyền phù thường khởi đầu bằng cách đặt các khối callus dễ vỡ vụn trong môi trường lỏng chuyển động (lắc hoặc khuấy) Trong quá trình nuôi cấy, các tế bào sẽ dần dần tách ra khỏi mẫu do những chuyển động xoáy của môi trường Sau một thời gian ngắn trong dịch huyền phù sẽ có các tế bào đơn, các cụm tế bào với kích thước khác nhau, các mẫu nuôi cấy còn thừa chưa phát triển và các tế bào chết Tuy nhiên, cũng có những dịch huyền phù hoàn hảo, chứa tỷ lệ cao các tế bào đơn và tỷ lệ nhỏ các cụm tế bào Mức độ tách rời của

tế bào trong nuôi cấy phụ thuộc vào đặc tính của các khối tế bào xốp và có thể điều chỉnh bằng cách thay đổi thành phần môi trường (Misawa, 1994)

Bên cạnh nuôi cấy tế bào huyền phù, nuôi cấy callus (trên môi trường rắn) có ưu điểm

là thao tác thí nghiệm đơn giản, dễ vận chuyển mẫu nhưng nhược điểm là thể tích nuôi cấy bé nên khó phát triển ở quy mô công nghiệp, mẫu nuôi cấy chỉ tiếp xúc được một mặt với nguồn dinh dưỡng, những sản phẩm do mẫu nuôi cấy tạo ra trong quá trình trao đổi chất sẽ tích tụ xung quanh dẫn đến làm chậm sự sinh trưởng của tế bào Vì thế, nuôi cấy tế bào huyền phù thích hợp hơn cho việc sản xuất sinh khối tế bào thực vật vì có thể duy trì và thao tác tương tự với các hệ thống lên men vi sinh vật ngập chìm trong môi trường lỏng

3 Sự tích lũy các hợp chất thứ cấp trong tế bào thực vật

Sự tiến bộ vượt bậc của công nghệ sinh học trong nuôi cấy mô và tế bào thực vật giúp nhân giống các cây trồng có giá trị và tách chiết các hóa chất quý hiếm mang lại nhiều ý nghĩa

về mặt thương mại Phương pháp này sẽ mở rộng và tăng khả năng thu hồi các hóa chất giá trị

có nguồn gốc thực vật, một sự thay thế từ quy mô nông nghiệp truyền thống lên quy mô công nghiệp trong sản xuất các hợp chất thứ cấp (Dicosmo và Misawa 1995) Kỹ thuật nuôi cấy tế bào được khởi xướng từ cuối những năm 60 của thế kỷ 20 như là một công cụ hữu ích để nghiên cứu và sản xuất hợp chất thứ cấp thực vật Kỹ thuật này được phát triển với mục tiêu cải thiện hiệu suất các sản phẩm có hoạt tính sinh học Ưu điểm của chúng là có thể cung cấp sản phẩm một cách liên tục và đáng tin cậy dựa trên những lý do sau: (1) tổng hợp các hợp chất thứ cấp có giá trị diễn ra dưới sự điều khiển các yếu tố môi trường nuôi cấy, độc lập với khí hậu và điều kiện đất trồng; (2) phủ định ảnh hưởng sinh học đến các sản phẩm là hợp chất thứ cấp trong tự nhiên (vi sinh vật và côn trùng); (3) có thể chọn lọc các giống cây trồng cho nhiều loại hợp chất thứ cấp khác nhau; (4) với việc tự động hóa điều khiển sự sinh trưởng của

tế bào và điều hòa quá trình chuyển hóa, chi phí có thể giảm và lượng sản phẩm tăng lên Bên cạnh đó, những kết quả nghiên cứu gần đây cho thấy nuôi cấy tế bào huyền phù của thực vật cũng được sử dụng để sản xuất các sản phẩm protein tái tổ hợp (Fisher và cs 1999)

Trong nuôi cấy tế bào, việc chọn lựa cẩn thận các tế bào có khả năng phát triển và điều kiện nuôi cấy tối ưu sẽ giúp tăng khả năng tích lũy một vài sản phẩm ở mức cao hơn Để thu được hiệu suất cao cho khai thác thương mại, người ta đã sử dụng nhiều phương pháp khác nhau trong nỗ lực tập trung vào việc kích thích hoạt động sinh tổng hợp của các tế bào nuôi cấy (Rao 2000, Dixon 1999) Tế bào nuôi cấy tích lũy một lượng lớn hợp chất thứ cấp chỉ khi

ở những điều kiện đặc biệt như (1) chọn lựa thành phần môi trường và điều kiện nuôi cấy thích hợp, (2) chọn lựa các dòng tế bào năng suất cao, (3) bổ sung tiền chất nuôi cấy và (4) các chất kích kháng bảo vệ thực vật (Mulbagal and Tsay 2004)

Tối ưu hóa điều kiện nuôi cấy Các thông số hóa học và vật lý như thành phần và pH

môi trường, chất điều hòa sinh trưởng, nhiệt độ nuôi cấy, sự thông khí, sự lắc hoặc khuấy, và ánh sáng ảnh hưởng đến hàm lượng các hợp chất thứ cấp đã được nghiên cứu nhiều (Goleniowski và Trippi 1999, Lee và Shuler 2000, Wang và cs 1999) Một vài sản phẩm tích lũy trong tế bào ở mức cao hơn so với ở trong cây trồng tự nhiên khi được nuôi cấy ở điều kiện tối ưu Các thông số vật lý và yếu tố dinh dưỡng trong một mẻ có thể gần như là yếu tố

cơ bản cho việc tối ưu hóa hiệu suất nuôi cấy

Chọn lọc các dòng tế bào cho năng suất cao Các tế bào thực vật trong nuôi cấy là

một tập hợp các đặc điểm sinh lý độc lập Chọn lọc tế bào dựa vào khả năng tổng hợp một vài hợp chất có giá trị cao trong nuôi cấy đã được Berlin và Sasse công bố năm 1985, và sau đó phương thức này đã được ứng dụng rộng rãi Chẳng hạn, một dòng tế bào của cây bát tiên

(Euphorbia milli) sau 24 lần chọn lọc đã tích lũy gấp khoảng 7 lần lượng anthocyanin được

sản xuất từ nuôi cấy tế bào bố mẹ (Yamamoto và cs 1982) Yamada và Sato (1981) đã chọn

lọc được một dòng tế bào của Coptis japonica có khả năng sinh trưởng gấp 6 lần trước đây sau

3 tuần nuôi cấy và lượng berberin đạt tới 1,2 g/L

Cung cấp tiền chất (precursor feeding) Bổ sung các tiền chất của quá trình sinh tổng

hợp nội bào vào môi trường nuôi cấy cũng có thể tăng lượng sản phẩm mong muốn do một số hợp chất trung gian nhanh chóng bắt đầu sinh tổng hợp các hợp chất thứ cấp và vì thế làm tăng lượng sản phẩm cuối cùng Phương pháp này hữu ích khi dùng các tiền chất có giá thành rẻ Tăng cường kích thích hoặc bổ sung tiền chất hoặc các hợp chất tương tự mang lại hiệu quả trong nhiều trường hợp (Silvestrini và cs 2002; Moreno và cs 1993) Chẳng hạn, bổ sung

phenylalanine khi nuôi cấy tế bào huyền phù cây Salvia officinalis đã kích thích tạo ra rosmarinic acid, cung cấp ferulic acid trong nuôi cấy tế bào cây Vanilla planifolia đã tăng tích

lũy valnillin, hoặc bổ sung leucine dẫn đến việc tăng các monoterpen dễ bay hơi trong nuôi

cấy Perilla frutiscens (Mulbagal and Tsay 2004)

Sự kích kháng bảo vệ thực vật (elicitation) Thực vật sản xuất các hợp chất thứ cấp

trong tự nhiên như một bộ máy bảo vệ chống lại các yếu tố gây bệnh Chất kích kháng bảo vệ thực vật (elicitor) báo hiệu việc hình thành các hợp chất thứ cấp Sử dụng các elicitor của bộ máy bảo vệ cây, tức sự kích kháng bảo vệ thực vật, là phương thức để thu được các sản phẩm hợp chất thứ cấp có hoạt tính sinh học một cách hiệu quả nhất Sử dụng các elicitor sinh học

và phi sinh học (được phân loại dựa trên nguồn gốc của chúng) để kích thích hình thành các

hợp chất thứ cấp trong quá trình nuôi cấy tế bào, có thể giúp rút ngắn thời gian và đạt hiệu suất cao (DiCosmo và Tallevi, 1985)

4 Ứng dụng nuôi cấy tế bào thực vật trong sản xuất các hoạt chất sinh học

Những năm gần đây, thuốc truyền thống trở thành một đề tài quan trọng mang tính toàn cầu Mặc dù ở các nước phát triển người ta thường sử dụng tân dược trong điều trị nhưng các loại thuốc có nguồn gốc thảo mộc vẫn được dùng phổ biến do yếu tố lịch sử và văn hóa Theo các đánh giá về mặt khoa học, nhiều loài thảo mộc có thể ứng dụng trong y học Vấn đề đặt ra là vùng sinh trưởng của cây thuốc đang biến mất nhanh chóng do sự không ổn định của điều kiện môi trường và các yếu tố khác Như vậy, thật khó có một nguồn nguyên liệu đủ lớn

để tách chiết các hợp chất thứ cấp dùng trong dược phẩm Điều này cảnh báo cho ngành công nghiệp cũng như các nhà khoa học cần tính đến tiềm năng của kỹ thuật nuôi cấy tế bào thực vật như một sự thay thế khác để cung cấp nguyên liệu cho nguồn dược phẩm này Bảng 2 giới thiệu sản phẩm của một số cây dược liệu quan trọng đã được sản xuất từ nuôi cấy callus và tế bào huyền phù (Mulbagal and Tsay 2004)

Ngay từ năm 1971, Wani và các cộng sự đã tìm ra một diterpene amide mới có khả

năng chống ung thư gọi là “taxol” chiết từ cây thông đỏ Pacific (Taxus brevifolia) Đến năm

1983, taxol được Cục quản lý Dược phẩm và Thực phẩm Hoa Kỳ (FDA) đồng ý đưa vào thử nghiệm ở giai đoạn I điều trị cho ung thư buồng trứng Sau đó, FDA đã cho phép sử dụng taxol trong điều trị các trường hợp ung thư buồng trứng và ung thư vú Ngoài ra, taxol cũng có tác dụng đối với các bệnh nhân có khối u ác tính, ung thư phổi và các dạng u bướu khác (Wickremesinhe và Arteca 1993 và 1994), và nó được xem như là chất đầu tiên của một nhóm mới trong hóa trị liệu ung thư (Cragg và cs 1993) Tuy nhiên, sử dụng taxol trong điều trị bị hạn chế do chỉ tách chiết được một lượng rất ít từ vỏ của cây thông đỏ tự nhiên Lớp vỏ mỏng này chứa khoảng 0,001% taxol tính theo khối lượng khô Ở cây 100 năm tuổi trung bình chỉ thu được 3 kg vỏ (khoảng 300 mg taxol), lượng này ứng với một liều trong toàn đợt điều trị ung thư Sở dĩ nguồn taxol khan hiếm như vậy là do các cây tự nhiên sinh trưởng rất chậm (Cragg và cs 1993) Do đó, cần có những nguồn khác để thay thế mới đáp ứng được nhu cầu

sử dụng ngày càng tăng trong y học

Nuôi cấy tế bào các loài Taxus được xem như là một phương pháp ưu thế để cung cấp

ổn định nguồn taxol và dẫn xuất taxane của nó (Slichenmyer và Von Hoff 1991) Hiện nay,

việc sản xuất taxol bằng nuôi cấy tế bào các loài Taxus đã trở thành một trong những ứng

dụng rộng rãi của nuôi cấy tế bào thực vật và đang tạo ra các giá trị thương mại to lớn Fett-Neto và cs (1994) đã nghiên cứu ảnh hưởng của các chất dinh dưỡng và một số yếu tố khác

lên sự tích lũy taxol trong nuôi cấy tế bào T cuspidata Srinivasan và cs (1995) nghiên cứu quá trình sản xuất taxol bằng nuôi cấy tế bào của T baccata Lee và cs (1995) đã nghiên cứu sản xuất taxol bằng nuôi cấy tế bào huyền phù của cây T mairei, một loài được tìm thấy tại

Đài Loan ở độ cao 2000 m so với mực nước biển Các dòng tế bào thu được từ callus có nguồn gốc thân và lá, và một trong những dòng này sau khi được bổ sung các tiền chất vào môi trường nuôi cấy, thì sau 6 tuần cứ một lít dịch huyền phù tế bào sẽ có khoảng 200 mg taxol

Tsay và cs (1994) đã nghiên cứu sản xuất imperatorin từ nuôi cấy tế bào huyền phù của

cây Angelica dahurica var Formosana Đây là một loài cây bản địa lâu năm ở Đài Loan, được

sử dụng để chữa chứng đau đầu và bệnh vảy nến Imperatorin được xem là thành phần hoạt

động chính trong điều trị các bệnh về da Nếu sản xuất cây Angelica dahurica var formosana

bằng phương pháp nhân giống truyền thống sẽ mất một thời gian dài mới có thể đáp ứng được nhu cầu Vì vậy, phương pháp nuôi cấy tế bào huyền phù sản xuất imperatorin đã được chọn lựa sử dụng Nghiên cứu đã cho thấy trong chu kỳ sinh trưởng của tế bào huyền phù, sản phẩm imperatorin đạt giá trị cực đại trong khoảng giữa 10 và 14 ngày Benzylamino purine ở nồng

độ từ 0,5-1,0 mg/L đã kích thích tổng hợp imperatorin, một tỷ lệ thích hợp ammonium nitrate

và nitrate (2:1) cũng như tăng nồng độ phosphate từ 1-2 mM sẽ làm tăng lượng impertatorin Glucose là nguồn carbon tốt hơn saccharose và fructose về hiệu quả sản xuất imperatorin Vai trò của elicitor cũng đã được khảo sát, bổ sung thêm vanadyl sulphate trong môi trường sẽ tăng tích lũy imperatorin, quyết định nồng độ và thời gian sinh trưởng của tế bào Bổ sung vanadyl sulphate ở nồng độ 30 mg/L vào môi trường đã cho hiệu quả tốt nhất sau 10 ngày nuôi cấy Hoặc bổ sung 20 g/L chất hấp phụ amberlite XAD-7 vào môi trường, quá trình tổng hợp imperatorin cũng tăng mạnh ở ngày nuôi cấy thứ 10 Hàm lượng imperatorin sản xuất bởi phương thức này đạt 460 µg khối lượng tươi cao hơn đối chứng 140 lần

Berberine là một isoquinoline alkaloid có trong hệ rễ của cây Coptis japonica và vỏ của cây Phellondendron amurense Berberine chloride được sử dụng để chữa bệnh rối loạn tiêu hóa Để thu được nguyên liệu thô từ rễ cây Coptis phải mất 5-6 năm Yamada và Sato

đó, công ty hóa dầu Mitsui (Nhật Bản) đã cải thiện được năng suất bằng cách thêm 10-8

M gibberellic acid vào môi trường, hiệu suất rất nhiều tới 1,66 g/L (Misawa 1994)

Rễ của cây Panax ginseng, một loại thảo dược lâu năm còn gọi là nhân sâm được sử

dụng rộng rãi như một vị thuốc bổ, một dược phẩm quý giá, có tác dụng chữa bệnh rối loạn tiêu hóa, bệnh đái đường,

sapogenin khác nhau Trong đó, ginsenoside-Rb có hoạt tính an thần, còn Rg có hoạt tính kích

thích Từ 1973, Furuya và cs đã nuôi cấy mô callus P ginseng để phân lập saponins và sapogenins Năm 1994, Choi bắt đầu nghiên cứu nuôi cấy P ginseng trên quy mô công

nghiệp Đến nay, đây là một trong các đối tượng được các nhà khoa học trên thế giới tập trung

nghiên cứu nhiều nhất

Merkli và cs (1997) đã nuôi cấy rễ tơ của cây Trigonella foenum-graecum bằng cách

gây nhiễm chủng A4 của Agrobacterium rhizogenes Các rễ tơ này đã sản xuất diosgenin, một

spirostanol quan trọng cho sự bán tổng hợp (semi-synthesis) của các hormone steroid Hàm lượng diosgenin thu được cao nhất là 0,040 % khối lượng khô gần gấp 2 lần so với các rễ không biến nạp chủng A4 8 tháng tuổi (0,024 %) Các tác giả này đã nghiên cứu ảnh hưởng của cholesterol, pH môi trường và chitosan đến khả năng sản xuất diosgenin Kết quả cho thấy

bổ sung 40 mg/L chitosan vào môi trường nuôi cấy sẽ tăng hàm lượng diosgenin lên gấp 3 lần

so với đối chứng

Yeh và cs (1994) nghiên cứu sản xuất diosgenin bằng nuôi cấy tế bào huyền phù của

cây Dioscorea doryophora Phương pháp này được sử dụng như một cách thay thế quá trình

tổng hợp steroid Nuôi cấy tế bào huyền phù được thiết lập bằng cách đưa callus vào môi trường có 0,2 mg/L 2,4-Dichlorophenoxyacetic acid (2,4-D) Nồng độ saccharose tối thích cho tổng hợp diosgenin là 3% Lượng diosgenin thu được trong trường hợp này đạt tới 3,2% khối

lượng khô Sản xuất diosgenin từ cây D doryophora bằng nuôi cấy tế bào huyền phù hiện nay

đã được ứng dụng trên quy mô công nghiệp

Gentiana davidii var formosana là thảo mộc bản địa sống lâu năm ở Đài Loan Từ xưa

nó đã được sử dụng như một loại thuốc thô sơ trong y học cổ truyền Trung Quốc nhằm ngăn chặn béo phì và lão hóa, bảo vệ phổi khỏi các chất độc (Zheng và cs 1997) Secoiridoid

glycoside là hợp chất chính với đặc tính y học ở trong rễ của chi Gentiana (Skrzypczak và cs 1993) Chueh và cs (2000) nghiên cứu tối ưu hóa điều kiện nuôi cấy tế bào huyền phù của G davidii var formosa để sản xuất gentipicroside và swertiamarin, hai dược chất quan trọng Tế

bào huyền phù sinh trưởng tối ưu khi nuôi cấy callus trong môi trường bổ sung 1,2 mg/L kinetin và 3% saccharose, pH 4,2-5,2, tốc độ lắc 80-100 vòng/phút Sự tích lũy cao nhất 2 hợp chất swertiamarin và gentipicroside trong tế bào được xác định lần lượt sau 12 và 24 ngày nuôi cấy

Miyasaka và cs (1989) đã nghiên cứu sản xuất cryptotanshinone từ nuôi cấy callus cây

Salvia miltiorrhiza Salvia là một chi quan trọng của họ Lamiaceae và một vài loài của Salvia

mọc hoang dại trên khắp thế giới dùng làm thuốc dân gian Hiệu quả của BA đối với việc hình

thành cryptotanshinone trong nuôi cấy callus S.miltiorrhiza đã được khảo sát Callus sơ cấp

được tạo ra từ nuôi cấy mảnh lá ở trong tối trên môi trường bổ sung 1,0 mg/L 2,4-D Callus sau đó phát triển nhanh hơn trên môi trường có 1,0 mg/L 2,4-D và 0,5 mg/L BA Kết quả phân tích HPLC cho thấy callus chứa một lượng nhỏ cryptotanshinone (0,26 mg/g khối lượng khô) Loại bỏ 2,4-D khỏi môi trường nuôi cấy cho kết quả là lượng cryptotanshinone trong callus tăng lên Nồng độ cao nhất của cryptotanshione thu được trong callus nuôi cấy trên môi trường

có 0,2 mg/L BA trong 6 ngày là 4,59 mg/g khối lượng khô (Wu và cs 2003)

chi thuộc họ Solanaceae

như: Duboisia, Scopolia, Atropa, Hyoscyamus và Datura.

những năm 1960 (Misawa, 1994) Tuy nhiên, hàm lượng của scopolamine và hyoscyamine trong tế bào nuôi cấy thường rất thấp Sau này, Tabata và cs (1971) đã bổ sung tropic acid vào dịch

huyền phù nuôi cấy Scopolia japonica

lên 15 lần

Shikonin, một loại sắc tố đỏ có khả năng diệt khuẩn, có trong rễ cây Lithospermum

được dòng tế bào rễ cây Lithospermum có khả năng tích lũy đến 15% shikonin và đã hoàn

chỉnh công nghệ nuôi cấy tế bào sản xuất shikonin Công nghệ này cho phép trong một chu kỳ nuôi cấy thu hoạch tới 5 kg hoạt chất và giúp giảm nhiều giá thành của shikonin

Podophyllotoxin là một aryltetralin lignan chống khối u được tìm thấy ở các cây

Podophyllum peltatum và Podophyllum hexandrum Nó cũng được dùng để tổng hợp các dẫn

xuất etoposide và teniposide, sử dụng rộng rãi trong điều trị chống khối u (Issell và cs 1984) Tuy nhiên, trong tự nhiên những cây này sinh trưởng rất chậm và vì thế đã hạn chế việc cung cấp podophyllotoxin, bắt buộc chúng ta phải hướng tới một phương thức thay thế khác Nuôi cấy tế bào để sản xuất podophyllotoxin đã được Kadkade và cs thực hiện lần đầu tiên vào năm

1981 và 1982 Woerdenberg và cs (1990) đã dùng một phức hợp precursor là coniferyl alcohol

và b-cyclodextrin bổ sung trong môi trường nuôi cấy tế bào huyền phù của P hexandrum Bổ

sung phức hợp 3 mM coniferyl alcohol đã tăng hiệu suất podophyllotoxin lên 0.013% theo khối lương khô, trong khi các nuôi cấy không có precursor chỉ sản xuất được 0.0035%

podophyllotoxin Smollny và cs (1992) đã thông báo callus và tế bào huyền phù của Lilium album đã sản xuất được 0.3% podophyllotoxin

Kết luận

Ứng dụng nuôi cấy tế bào thực vật để sản xuất các hợp chất thứ cấp đã tạo ra một bước tiến xa trong khoa học thực vật Việc phát triển và sử dụng các công cụ di truyền cũng như sự hiểu biết ngày càng sâu sắc hơn về bản chất của tế bào và các phương thức điều hòa quá trình chuyển hóa trao đổi chất thứ cấp là cơ sở cho việc sản xuất chúng ở quy mô thương mại

Do nhu cầu sử dụng các sản phẩm tự nhiên trong y-dược ngày càng tăng nhưng sản lượng của chúng ở cây trồng tự nhiên lại rất thấp đã thúc đẩy sự phát triển không ngừng của công nghệ nuôi cấy tế bào ở quy mô lớn Tuy nhiên, các con đường sinh tổng hợp các hợp chất thứ cấp mong muốn trong thực vật cũng như trong nuôi cấy tế bào ở quy mô lớn là rất phức tạp Vì vậy, các thông tin ở mức độ tế bào và phân tử của các quá trình chuyển hóa là rất cần thiết cho sự phát triển của sản xuất công nghiệp Nhiều nghiên cứu đã được thực hiện ở các điều kiện khác nhau để giải thích các hiện tượng xuất hiện trong quá trình sản xuất các

chất trao đổi thứ cấp từ các tế bào thực vật nuôi cấy in vitro Các kết quả này cũng đã cho thấy

các hệ thống nuôi cấy tế bào thực vật có tiềm năng rất lớn cho việc khai thác thương mại các chất trao đổi thứ cấp

Bảng 2 Các hợp chất thứ cấp đã được sản xuất từ nuôi cấy mô và tế bào thực vật (Mulbagal and

Tsay 2004)

cấy

Tham khảo

glucosides

Huyền phù Yagi và cs 1983

1999

1985

Camellia sinensis Theamine, dẫn xuất của

-glutamyl

Huyền phù Orihara và Furuya 1990

Chrysanthemum

cinerariaefolium

Pyrethrins Callus Rajasekaran và cs 1991

Chrysanthemum

cinerariaefolium

Chrysanthemic acid và pyrethrins

Huyền phù Kuel và cs 1985

1996

D-pseudoephedrin

Huyền phù O’Dowd và cs 1993

Eucalyptus tereticornis Sterol và hợp chất

phenolic

Callus Venkateswara và cs 1986

Fumaria capreolata Isoquinoline alkaloids Huyền phù Tanahashi và Zenk 1985

Glycyrrhiza glabra var

glandulifera

Triterpenes Callus Ayabe và cs 1990

1982

5-Methoxypodophyllo-toxin

Huyền phù Uden và cs 1990

Lithospermum erythrorhizon Dẫn xuất của shikonin Huyền phù Fujita và cs 1981

Lithospermum erythrorhizon Dẫn xuất của shikonin Huyền phù Fujita và cs 1990

alkaloids

Callus Kitajima và cs 1998

Chattopadhyay và cs

2002

quinolinium alkaloids

Callus Petit-Paly và cs 1987

1986

R serpentina × Rhazya

stricta

3-Oxo-rhazinilam Callus Gerasimenko và cs 2001

alkaloids và coumarins

Callus Baumert và cs 1992

huyền phù Karam và cs 2003

rosmarinic acid

Callus Morimoto và cs 1994

huyền phù Neera và Ishimaru, 1992

1999

Tabernaemontana

divaricata

Alkaloids Huyền phù Sierra và cs 1992

glycosides

Callus Pletsch và cs 1993