Công nghệ sinh học ( phần 3 ) MicroRNA làm giảm tác động của cocaine Người sử dụng cocaine sẽ bị nghiện càng ngày càng nặng. Tuy nhiên, về lâu dài, cocaine bị hấp thu vào cơ thể sẽ cảm ứng sự biểu hiện của một loại vi RNA (microRNA) trong não. MicroRNA này dường như có khả năng làm giảm lượng cocaine mà con nghiện phải dung nạp. Bộ não có một khả năng đáp ứng lại với những tín hiệu từ môi trường rất to lớn và do đó những điều kiện khác thường cũng dần dần trở nên bình thường. Việc sử dụng lâu dài những chất gây nghiện như cocaine, heroin, và nicotine sẽ dẫn đến sự thích nghi về mặt thần kinh, làm cho người sử dụng bị “lờn thuốc”, kém nhạy cảm với những chất này. Một người nghiện lâu năm chỉ có phản ứng vừa phải với một lượng heroin tương đối lớn, trong khi đó lượng heroin này có thể gây các phản ứng sốc quá liều đối với những người mới “tập tành”. Do đó những con nghiện lâu năm chỉ cảm thấy bình thường nếu có heroin trong người, và liều chất gây nghiện phải ngày càng cao thì mới gây những cảm giác hưng phấn cho họ. Nhóm nghiên cứu của Tiến sĩ Paul J. Kenny tại Viện nghiên cứu Scripps ở bang Florida (Hoa Kỳ) vừa công bố trên Tạp chí Nature số 466 (năm 2010) về việc phát hiện một cơ chế phân tử giới hạn lượng chất gây nghiện cần cho chuột đã bị nghiện cocaine trong thời gian dài. Những thay đổi trong mạng lưới tế bào thần kinh (neuron) làm cho phản ứng của cơ thể đối với một loại chất gây nghiện giảm dần, thường được gọi là “quen thuốc”. Sự linh hoạt của hệ thống nội cân bằng này khởi đầu từ những phản ứng ở mức phân tử và tế bào của mạng tế bào thần kinh đối với những thay đổi môi trường. Chúng có liên quan đến sự kích hoạt các phản ứng thích nghi thứ cấp ở mức phân tử buộc các chức năng tế bào và mạng thần kinh quay trở lại mức bình thường. Tuy nhiên, nếu sử dụng chất gây nghiện trong thời gian dài thì khả năng thích nghi này sẽ bị phá vỡ, dẫn đến nhiều thay đổi trong hành vi như lên cơn nghiện và cảm giác thôi thúc phải dung nạp thêm thuốc. Nhóm nghiên cứu trên đã tìm ra một microRNA, gọi là miR-212, có tác động làm giảm biểu hiện của một nhóm gene có liên quan đến hành vi tìm kiếm thuốc ở chuột. Thí nghiệm của nhóm cho thấy nếu làm tăng sự biểu hiện của miR-212 thì lượng cocaine cần thiết giảm đi ở chuột cho nghiện đã lâu, trong khi nếu ức chế sự biểu hiện của microRNA này thì chuột phải cần có nhiều cocaine hơn. Các microRNA được nhóm nghiên cứu của Tiến sĩ Victor Ambros (Đại học Harvard, bang Massachussetts, Hoa Kỳ) phát hiện lần đầu tiên vào năm 1993 ở tuyến trùng Caenorhabditis elegans và sau đó được chứng minh là có khả năng bất hoạt các gene liên quan đến phát triển. Bộ gene người mang hơn 1000 loại trình tự có khả năng là microRNA. Điều này khiến cho các nhà khoa học đặt ra giải thiết rằng các trình tự không mã hóa cho protein này có thể có vai trò quan trọng trong việc điều phối các thay đổi ở mức phân tử dẫn tới sự thay đổi hành vi cơ thể như trong trường hợp ở chuột. Công trình của nhóm Paul J. Kenny về khả năng microRNA giới hạn các thay đổi hành vi ở chuột nghiện cocaine mở ra một phương thức mới nhằm tìm hiểu các cơ chế tiến hóa chống lại sự nghiện hút ở người. Một phát hiện nữa rất thú vị từ nghiên cứu của nhóm Paul J. Kenny là miR-212 điều hòa hoạt động của CREB, đây là một nhân tố điều hòa phiên mã có liên quan đến cảm giác “phê” cocaine. Hai nhóm nghiên cứu của Tiến sĩ Eric J. Nestler (Đại học Yale, bang Conneticut) và Tiến sĩ Robert C. Malenka (Đại học Standford, bang California) ở Mỹ đã chứng minh rằng làm giảm hoạt động của CREB ở vùng vân bụng, tức là vùng kiểm soát cảm giác “phê” cocaine trên não, thì cảm giác “phê” thuốc sẽ tăng lên và ngược lại. Nhóm của Paul J. Kenny cho rằng cho chuột sử dụng cocaine trong thời gian dài sẽ làm tăng hoạt động của cả CREB lẫn cofactor của nó là TORC và cả hai sẽ điều hòa sự phiên mã của miR-212. Cơ chế này tạo ra một vòng điều hòa phản hồi, CREB-TORC làm tăng sự biểu hiện của miR-212, rồi đến lượt miR-212 làm tăng hoạt động của CREB-TORC và do đó làm giảm lượng cocaine cần phải sử dụng. Tuy nhiên, cơ chế này chỉ có tác dụng ở cơ thể của những con nghiện lâu năm. Nhóm Paul J. Kenny còn xác định con đường phân tử giới hạn lượng cocaine sử dụng của miR-212 (xem hình). Hầu hết các microRNA ngăn cản sự phiên mã của gene mục tiêu. MicroRNA trong công trình mới này cũng không phải là ngoại lệ, khi miR-212 được tăng biểu hiện thì các protein giới hạn hoạt tính của Raf1 (một GTPase nhỏ, có vai trò then chốt trong việc phát sinh chất truyền tín hiệu thứ cấp AMP-vòng nhờ enzyme adenylyl cyclase) bị giảm biểu hiện. Các tác giả xác định một vị trí bám chuyên biệt cho miR-212 trên vùng promoter của gene mã hóa cho SPRED1, một trong những protein giới hạn sự truyền tín hiệu do Raf1 điều hòa. Khi biểu hiện một dạng “kháng” miR-212 của SPRED1 thì miR-212 không còn khả năng giới hạn lượng cocaine sử dụng nữa. Khi miR-212 ức chế sự biểu hiện của SPRED1 và các protein ức chế Raf1 khác thì hoạt tính của Raf1 tăng lên, tạo ra nhiều AMP-vòng hơn, dẫn đến tăng hoạt tính phosphoryl hóa và hoạt tính của CREB. Ở mỗi bước trong con đường truyền tín hiệu này, các tác giả đều chứng minh rằng bắt chước theo hoạt động của miR-212 thì lượng cocaine sử dụng sẽ bị giới hạn, còn ngược lại thì làm tăng lượng cocaine sử dụng ở chuột nghiện. Hình: Con đường hoạt động của miR-212 Nghiên cứu này có ý nghĩa rất to lớn. Vì các nhân tố môi trường có thể cảm ứng sự biểu hiện của các microRNA chuyên biệt dẫn đến thay đổi sự nội cân bằng nên khoa học có thể phát triển các phương pháp chữa trị nghiện thuốc hay ma túy ở người bằng cách lặp lại hoạt động của các microRNA. Khả năng thay đổi nội cân bằng dẫn tới sự “quen” thuốc. Để tiếp tục nghiên cứu này, các nhà khoa học nên tìm hiểu xem miR-212 có liên quan đến việc cơ thể “quen” với cocaine không; và một khi con nghiện ngưng sử dụng cocaine, sự “quen” thuốc có làm tăng các triệu chứng rối loạn khi cai nghiện hay không. Insulin và công nghệ sản xuất insulin trên thế giới Người ta đã nhận thấy rằng bệnh tiểu đường là một trong những căn bệnh đe dọa nghiêm trọng tới sức khoẻ của con người.Trên thế giới, con số những người mắc bệnh tiểu đường ước tính khoảng từ 151 triệu đến 171 triệu (năm 2000), và dự kiến con số này sẽ là 221 triệu (năm 2010), năm 2030 sẽ lên đến 366 triệu người. Và đương nhiên, việc gia tăng con số những người mắc bệnh tiểu đường sẽ kéo theo sự gia tăng các biến chứng của căn bệnh này như thần kinh, xơ vữa động mạch… Theo ước tính, số người tử vong trên thế giới do bệnh tiểu đường trong năm 2000 là 2,9 triệu và con số này sẽ còn tiếp tục gia tăng. Trong đó, tiểu đường type 2 chiếm khoảng hơn 90% tổng số ca bệnh. Điều đó đòi hỏi phải tìm ra những hướng tiệp cận mới cho việc ngăn ngừa và điều trị căn bệnh này. Bệnh tiểu đường là một căn bệnh chịu ảnh hưởng của nhiều yếu tố. Tiểu đường gây ra do tác động phức tạp giữa gene và các yếu tố môi trường, từ đó dẫn tới sự bất bình thường trong quá trình điều hoà lượng glucose trong cơ thể liên quan tới những vấn đề về hormone insulin. Insulin là một hormone được tiết ra bởi tế bào beta trong đảo Langerhans của tuyến tụy khi động vật tiêu ăn thức ăn, đây là hormone quan trọng nhất cho quá trình lưu trữ, sử dụng đường, acid amin và acid béo và duy trì lượng đường trong máu. Hàm lượng đường trong máu (hay còn gọi là hàm lượng glucose trong máu) là nguồn năng lượng thiết yếu cho cơ thể. Nếu lượng đường trong máu không duy trì ở mức bình thường có thể gây ra những căn bệnh nguy hiểm. Hàm lượng đường trong máu tăng có thể gây ra sự bài tiết đường qua nước tiểu, kết quả là bị mất glucose, hiện tượng này còn gọi là bệnh tiểu đường. Nếu tình trạng này tiếp diễn trong thời gian dài, sẽ gây ra những biến chứng nguy hiểm trong mô, các cơ quan của cơ thể. Mặt khác, hàm lượng đường trong máu giảm dẫn đến năng lượng cung cấp cho cơ thể bị thiếu hụt gây nguy hiểm cho sự duy trì cơ thể sống. Hàm lượng đường trong máu được duy trì ở mức bình thường là do sự cân bằng giữa các yếu tố làm tăng lượng đường trong máu (như glucagon, hormone, cortisol, catecholamine) với các yếu tố làm giảm lượng đường trong máu. Insulin là hormone duy nhất có thể làm giảm lượng đường trong máu. Do đó, khi khả năng tiết hormone này giảm đi (do một số nguyên nhân) thì insulin không cung cấp đủ cho cơ thể gây ra bệnh tiểu đường phụ thuộc insulin (Insulin-Dependent Diabetes Mellitus - IDDM), còn gọi là tiểu đường type I. Với những bệnh nhân mắc tiểu đường type I thì insulin là phương thuốc điều trị duy nhất. Insulin người là một polypeptide bao gồm một chuỗi A với 21 acid amin và một chuỗi B với 30 acid amin, có một cầu nối disulfur trong chuỗi A và 2 cầu nối disufur nối giữa hai chuỗi A và B. Insulin ban đầu được tổng hợp ở dạng “preproinsulin” (tiền insulin) trên ribosome trong tế bào beta trong đảo Langerhans của tuyến tụy. Preproinsulin là một phân tử dạng thẳng bao gồm: một peptide tín hiệu chứa 24 acid amin (SP), chuỗi B, peptide C với 31 acid amin (C) và chuỗi A nối với nhau theo thứ tự SP-B- C-A. Khi vận chuyển qua lưới nội chất, peptide tín hiệu bị phân cắt tạo ra proinsulin (B-C-A). Proinsulin hình thành cầu nối disulfur trong lưới nội chất, hình thành cấu trúc bậc ba. Proinsulin bị phân cắt bởi enzyme PC1/3 tại liên kết giữa chuỗi B và peptide C và sau đó bị phân cắt bởi enzyme PC2 ngay vị trí liên kết giữa chuỗi A và peptide C. Hai acid amin đầu N của peptide nối với đầu C của chuỗi B khi bị phân cắt bởi PC1/3 sẽ được phân cắt ra khỏi chuỗi B bởi enzyme carboxypeptidase H. Kết quả cuối cùng của quá trình phân cắt tạo thành insulin. Hình 1. Cấu trúc của phân tử insulin Trong năm 2005, nhu cầu insulin dùng trong trị bệnh tiểu đường ước tính khoảng 4.000 đến 5.000 kg và dự kiến năm 2010 là 16.000 kg. Nhu cầu về insulin của thế giới vượt qua con số vài tấn/năm và vì thế nguồn cung cấp insulin cho trị bệnh tiểu đường đang thiếu hụt. Từ những thập niên 1920 cho đến những năm đầu của thập niên 1980, insulin được tạo ra bằng cách cô lập từ tuyến tụy của động vật như heo và bò. Tuy nhiên, insulin người có sự khác biệt trong thành phần acid amin so với insulin bò (hai vị trí trong chuỗi A và một vị trí trong chuỗi B) và insulin heo (một vị trí trong chuỗi B). Do đó gây ra những tác dụng không mong muốn (như dị ứng) khi sử dụng insulin có nguồn gốc từ heo hay bò. Ngoài ra, quá trình sản xuất và tinh sạch insulin từ động vật còn gặp nhiều khó khăn. Sau đó, các phương pháp bán tổng hợp insulin người từ insulin heo và bò đã được phát triển bằng các sử dụng phản ứng chuyển peptide (transpeptidation) sử dụng trypsin. Tuy nhiên, insulin tái tổ hợp được sản xuất bằng công nghệ tái tổ hợp di truyền hiện đang được sử dụng chủ yếu do chi phí sản xuất thấp và hiệu quả sản xuất cao. Insulin người được sản xuất bằng kỹ thuật di truyền đầu tiên tạiCông ty Genetech (Hoa Kỳ) và sản phẩm này được đưa ra thị trường vào năm 1982. Trong lịch sử, đây cũng là lần đầu tiên các nhà nghiên cứu ứng dụng công nghệ sinh học vào dược phẩm thành công. Về sau, nhiều phương pháp sản xuất insulin tái tổ hợp đã được phát triển. Ví dụ: phương pháp sản xuất của Tập đoàn Eli Lilly: phương pháp sản xuất này biểu hiện chuỗi A và chuỗi B riêng biệt bằng cách sử dụng Escherichia coli, sau đó thu chuỗi A và chuỗi B, trộn với nhau in vitro tạo cầu nối disulfur. Phương pháp này có hiệu quả sản xuất thấp. Do đó, Eli Lilly phát triển một phương pháp cải tiến hơn, phương pháp này biểu hiện proinsulin thay vì biểu hiện chuỗi A và B riêng biệt như phương pháp cũ, tạo cầu nối disulfur in vitro, sau đó phân cắt peptide C khỏi hai chuỗi A và B bằng trypsin và carboxypeptidase, tạo thành insulin. Hình 2. Sản xuất insulin tái tổ hợp với chuỗi A và chuỗi B riêng biệt Một phương pháp khác được phát triển bởi tập đoàn Novo Nordisk, phương pháp này biểu hiện miniproinsulin bao gồm chuỗi B và chuỗi A nối với nhau bằng 2 acid amin, được biểu hiện trong nấm men, sau đó xử lý miniproinsulin in vitro bằng trypsin tạo thành insulin. Phương pháp này có nhiều thuận lợi như cầu nối disulfur được hình thành trong quá trình biểu hiện và quá trình tiết miniproinsulin, và miniproinsulin này được tách chiết và tinh sạch dễ dàng do được tiết thẳng ra môi trường nuôi cấy. Hiện tại, người ta vẫn tiếp tục phát triển những phương pháp sản xuất insulin tái tổ hợp. Công ty Hoechst đã đưa ra một phuơng pháp sản xuất insulin bao gồm: biểu hiện một dạng dẫn xuất mới của insulin hoặc biểu hiện preproinsulin trong E. coli; tạo các cầu nối disulfur invitro; sau đó, xử lý bằng lysylendopeptidase hoặc clostripain/carboxypeptidase B; cuối cùng tạo ra insulin. Mới đây nhất, Công ty Bio-Technology General đã đưa ra một phương pháp mới. Trong phương pháp này, một dạng protein dung hợp (fusion protein) bao gồm superoxide dismutase (SOD) gắn với proinsulin được biểu hiện trong tế bào E. coli. Bằng cách này, hiệu suất của quá trình biểu hiện protein và hiệu quả của quá trình hình thành các cầu nốii. Sau đó, proinsulin được chuyển thành insulin nhờ xử lý với trypsin và carboxypeptidase B. Bằng những cách tương tự như thế, người ta đã đưa ra ngày càng nhiều các phuơng pháp sản xuất insulin tái tổ hợp và cải tiến nhièu hơn để nâng cao hiệu quả của các quá trình biểu hiện protein, hình thành cầu nối disulfur, chuyển proinsulin thành insulin. Hình 3. Sản xuất insulin tái tổ hợp trên vi khuẩn Hiện nay, hầu hết những phương pháp sản xuất insulin thương mại đều dựa trên các chủng nấm men (Saccharomyces cerevisiae) hoặc vi khuẩn (E. coli) kết hợp với các kỹ thuật gene để sản xuất insulin người tổng hợp. Người ta nuôi cấy các chủng này trên quy mô lớn, trong những bồn lên men bằng thép đặt tiền, sau đó, insulin được ly trích ra, tinh sạch để được sản phẩm cuối cùng. Nói về các hệ thống tế bào dùng để biểu hiện insulin tái tổ hợp, người ta sử dụng rất đa dạng từ vi sinh vật tới tế bào động vật và cả thực vật. Trong số đó, tế bào vi sinh vật được sử dụng nhiều nhất do chúng dễ thao tác, dễ đưa vào áp dụng ở quy mô sản xuất công nghiệp, nhiều nhất là E. coli và nấm men. Gần đây, người ta đưa ra một hệ thống biểu hiện khác cho các loại protein tái tổ hợp – đó là Bacillus brevis. Mục đích của những nghiên cứu, phát minh hiện tại là muốn phát triển một hệ thống biểu hiện và 1 phương pháp sản xuất insulin có năng suất cao và hiệu quả sản xuất phải ngang bằng hay vuợt trội hơn so với những hệ thống sản xuất insulin đã từ trước tới nay. Hay nói cách khác, các nghiên cứu trong giai đoạn này nhằm cải tiến phương pháp cổ điển chuyển các tiền chất của insulin thành insulin; nghiên cứu tìm ra môi trường tối ưu cho việc hình thành các cầu nối cần thiết cho việc biểu hiện hoạt tính của insulin; tìm ra một hệ thống biểu hiện insulin cho năng suất, sản luợng cao. . Công nghệ sinh học ( phần 3 ) MicroRNA làm giảm tác động của cocaine Người sử dụng cocaine sẽ bị nghiện càng. tạiCông ty Genetech (Hoa K ) và sản phẩm này được đưa ra thị trường vào năm 1982. Trong lịch sử, đây cũng là lần đầu tiên các nhà nghiên cứu ứng dụng công nghệ sinh học vào dược phẩm thành công. . thành phần acid amin so với insulin bò (hai vị trí trong chuỗi A và một vị trí trong chuỗi B) và insulin heo (một vị trí trong chuỗi B). Do đó gây ra những tác dụng không mong muốn (như dị ứng)