Di truyền phân tử ( phần 23 ) Những cấu trúc chứa DNA trong tế bào 1. Những đoạn DNA chứa thông tin di truyền Đại phân tử DNA là do polynucleotide tạo thành, được chia làm nhiều đoạn. Mỗi đoạn là một đơn vị chức năng, gọi là gen. Gen được định nghĩa trong di truyền học: + Mendel là người đầu tiên nêu lên khái niệm “nhân tố di truyền” + J. Morgan cụ thể hóa khái niệm về gen: gen nằm trên nhiễm sắc thể chiếm một locus nhất định. Gen là đơn vị chức năng xác định một tính trạng. + Sau khi học thuyết trung tâm ra đời: gen là đoạn DNA trên nhiễm sắc thể không những mã hóa cho các loại protein mà cả các loại RNA. + Cuối những năm 70, sau khi phát hiện ra gen gián đoạn: gen là một đoạn DNA đảm bảo cho việc tạo ra một polypeptid nó bao gồm cả vùng trước và sau vùng mã hóa cho protein và cả những đoạn không mã hóa xen giữa các đoạn mã hóa. Hiện nay có thể định nghiã tổng quát như sau: gen là đơn vị chức năng cơ sở của bộ máy di truyền chiếm một locus nhất định trên NST và xác định một tính trạng nhất định. Các gen là những đoạn vật chất di truyền mã hóa cho những sản phẩm riêng lẻ như các RNA được sử dụng trực tiếp cho tổng hợp các enzym, các protein cấu trúc hay các mạch polypeptid để gắn lại tạo ra các protein có hoạt tính sinh học. Toàn bộ những gen khác nhau của cơ thể, gọi là Idiotype. Ở Eukaryote nó bao gồm các gen trên nhiễm sắc thể (chromotype) và các gen ngoài nhân (plasmotype). Ở prokaryote, nó bao gồm bộ gen và plasmid. 2. Virus chứa DNA và virus chứa RNA Virus gây bệnh đốm thuốc lá (mosaic tobacco virus - MTV) là virus chứa RNA sợi đơn. Nó là một hạt hình que dài 300 nm, có đường kính 18 nm. Bên ngoài có một vỏ chứa 2130 phân tử và một vòng xoắn RNA ở bên trong. Chiều cao vòng xoắn: 23Ao, khối lượng phân tử = 2.106 đvC. Một số virus chứa DNA sợi đôi như các thực khuẩn thể T2, T4, T6 chứa DNA mạch đôi thẳng, dài. Có chứa 2.105 đôi nucleotide, khối lượng phân tử: 130.10 đvC. Khi lực thẩm thấu của môi trường thay đổi đột ngột, phân tử DNA này thoát ra khỏi vỏ protein, người ta chụp ảnh được ảnh DNA của tjực khuẩn thể T2 với chiều dài 0,05 mm (50mm), phân tử này xếp gọn ở phần đầu của thực khuẩn thể. Tất cả thực khuẩn thể T số chẵn chứa DNA với mạch polynucleotide giống nhau, nên khi trộn lẫn các DNA mạch đơn đã bị biến tính của chúng với nhau thì các mạch đơn này có thể tạo thành phân tử lai. Phân tử DNA của T3, T7 không thể hình thành phân tử DNA lai với DNA của T số chẵn. Còn virus FX174 có chứa DNA sợi đơn gồm 5400 nucleotide với khoảng 9 gen. 3. Nhiễm sắc thể chính và plasmid của vi khuẩn DNA của vi khuẩn làm thành thể nhân, tiếp xúc trực tiếp với tế bào chất, không có màng nhân làm giới hạn. DNA của thể nhân là DNA mạch vòng, xoắn kép Ví dụ: DNA E.coli có đường kính 350 µm, gồm 4.106 đôi nucleotide và chứa khoảng 500 gen xếp nối tiếp nhau thành chuỗi dài chi phối tất cả các hoạt động chức năng của sự sống. Plasmid cũng là phân tử DNA mạch kép, dạng vòng ở bên cạnh thể nhân. Khối lượng phân tử trung bình khoảng 1% DNA của thể nhân. Các plasmid có thể gắn tạm thời hoặc vĩnh viễn ở trên NST chính của vi khuẩn. Có thể tham gia sự tự nhân đôi và tham gia tiếp hợp khác như là một phần của NST chính. 4. Nhiễm sắc thể Eukaryota. 4.1 Các trình tự lặp lại và đơn độc DNA được cắt thành từng đoạn nhỏ, cho biến tính, sau đó hồi tinh thì các đoạn có trình tự bổ sung dễ tái tổ hợp với nhau hơn các đoạn khác. Nhờ vậy có thể nhận biết được các trình tự lặp lại. Dựa vào đó phân DNA thành ba loại: + DNA đơn độc (tái hợp rất chậm) + DNA lặp lại trung bình (tái hợp nhanh vừa) + DNA lặp lại cao (tái hợp rất nhanh) Mặc dù DNA mang thông tin mã hóa cho các protein nhưng trong thực tế chỉ có khoảng 10% trong số 3 tỷ cặp nucleotide trong genome của người thực sự làm chức năng này. Căn cứ vào đặc điểm cấu trúc và phân, chia DNA thành các loại sau: - DNA đơn độc (Single copy DNA) Đây là loại phổ biến nhất, chiếm khoảng 75% genome. Các đoạn DNA này chỉ thấy 1 lần (hoặc vài lần) trong genome. Một phần nhỏ của DNA loại này là các gen mã hóa cho protein. Hẫu hết các DNA đơn độc là các intron hoặc là các đoạn nằm xen giữa các gen. - DNA lặp lại (repetitive DNA) Chiểm 25% còn lại của genome, đây là các đoạn DNA được lặp đi lặp lại hàng ngàn lần trong genome. DNA lặp lại gồm 2 loại: + DNA vệ tinh (satellite DNA): loại DNA tập trung ở 1 số vùng nhất định trên NST, ở đó chúng xếp đuôi nhau, cái này tiếp cái kia. Loại này chiếm 10% bộ gen. + DNA lặp lại rãi rác: loại DNA này chiếm khoảng 15% genome, gồm 2 loại: Các yếu tố rãi rác có kích thước ngắn SINEs (short interspersed repetitive elements): kích thước từ 90-500 bp. Trong nhóm này có loại DNA lặp lại tên Alu với kích thước khoảng 300 bp, mang đoạn DNA có thể bị enzyme hạn chế Alu I cắt (đây là enzyme có nguồn gốc từ vi khuẩn Arthrobacter luteus). Đoạn lặp Alu là 1 họ bao gồm các đoạn DNA có độ giống nhau cao, phân bố rãi rác khắp hệ gen với khoảng 300.000 bản sao, chiếm khoảng 2-3% toàn bộ DNA của người, chúng được xem như là các yếu tố vận động. Ở 2 đầu mỗi đoạn Alu có các đoạn lặp cùng chiều ngắn khoảng 7-10 bp. Bên trong đoạn Alu có các đoạn lặp dài khoảng 40 bp. Điểm đặc biệt của các đoạn lặp DNA này là có thể tạo ra bản sao của mình và có thể cài vào các phần khác của bộ gen. Hiện tượng này đôi khi có thể làm gián đoạn một gen mã hóa cho protein nào đó và gây ra tình trạng bệnh lý di truyền. Vai trò của các trình tự Alu đến nay chưa rõ. Một điều đáng kinh ngạc là có sự tương đồng (homologus) từ 80-100% giữa phần 3' của Alu với đầu mút 5' và 3' của RNA 7SL, là phần tương tác với các tín hiệu peptid trước khi vận chuyển ra tế bào chất. Việc xác định trình tự nucleotide của Alu cho thấy có ít nhất 6 nhóm phụ và tất cả đều bắt nguồn từ DNA mã hóa cho RNA 7SL. Các yếu tố rãi rác có kích thước dài LINEs (long interspersed repetitive elements): bao gồm các họ LINE 1 (hay Kpn 1) và THE 1. Các trình tự LINE có chiều dài khoảng 6000-7000 bp với gần 5.000 bản sao nguyên vẹn và 100.000 bản sao từng phần rãi rác khắp bộ gen người. Chúng là những trình tự lặp lại không mã hóa dài nhất và thường ở vùng giàu AT. Các bản phiên mã trình tự LINE gắn với protein tạo thành phức hợp ribonucleoprotein. Ở một dòng tế bào người bị ung thư (teratocarcinome), người ta quan sát thấy có các ribonucleoprotein này. Sự xen đoạn LINE vào các vị trí khác nhau có thể gây hậu quả nhất định, như trong một trường hợp bệnh máu không đông A (hemophilia). 4.2. Nhiễm sắc thể của Eukaryota Nhiễm sắc thể chứa một phân tử DNA thẳng, mạch kép. NST Eukaryote gồm DNA và protein, trong số đó histon là protein cốt lõi trong việc cuộn lại và điều hòa hoạt tính của DNA. Sự hình thành NST kỳ giữa từ chuỗi xoắn kép DNA qua hệ thống các bậc cấu trúc sau: + Nucleosome là đơn vị cấu trúc của NST được tạo nên do sợi DNA dài quấn quanh các protein histon thành sợi 11nm. Đơn vị này là phức hợp gồm 146 cặp nucleotide của DNA quấn quanh 8 phân tử histon: 2H2A, 2H2B, 2H3 ,2H4. Các nucleosome kề nhau được nối qua một phân tử histon trung gian H1. + Sợi chromatin dày 30nm: các nucleosome xếp sít nhau tạo thành phức hợp nucleoprotein. + Vùng xếp cuộn dày 300 nm do sợi chromatin sau nhiều lần xoắn uốn khúc tạo nên. + Chất dị nhiễm sắc 700 nm + Kỳ giữa 1400nm. 4.3. Trình tự CEN: trình tự lặp lại cao CEN là của các tâm động. 4.4. Trình tự TEL: thuộc các telomer (đầu mút của NST) với nhiều vai trò khác nhau: bảo vệ đầu mút NST khỏi bị cắt bởi nuclease, giữ chiều dài của NST khi sao chép, gắn với màng nhân và kìm hãm sự biểu hiện của các gen ở đầu mút. Các trình tự TEL có tính bảo tồn cao trong tiến hóa. Chúng có số lần lặp lại cao, giàu A và C. Cơ chế phân tử của sao chép DNA 1. Nguyên tắc chung - DNA sao chép theo khuôn. Ưu điểm: + Với phân tử lớn như vậy thì việc tổng hợp theo khuôn sẽ chính xác hơn + Tiết kiệm được ezyme + Đạt hiệu quả nhanh - Sao chép theo nguyên tắc bán bảo tồn (semi-conservative) phân tử DNA mới được tổng hợp gồm một mạch cũ làm khuôn và một mạch mới tổng hợp - Quá trình tổng hợp DNA xảy ra đòi hỏi phải có “ mỗi “ (primer) - Quá trình tổng hợp xảy ra theo chiều 5' - 3'. 2. Thí nghiệm tổng hợp nhân tạo DNA Kornberg (1956) thực hiện phản ứng tổng hợp DNA in vitro. Trong quá trình tổng hợp ông sử dụng DNA polymerase I, 4 loại desoxynucleotid triphosphate (ATP, GTP, CTP, TTP), Mg2+ làm xúc tác. Ngoài ra còn có ít DNA làm khuôn mẫu. 3. Thí nghiệm chứng minh có sự tự nhân đôi theo nguyên tắc bán bảo tồn Meselson, Stahl (1958) đã chứng minh kiểu sao chép bán bảo tồn. Nuôi E.coli nhiều thế hệ trên môi trường có nguồn nitơ đồng vị nặng N15. Như vậy tất cả DNA của vi khuẩn đều mang đồng vị nặng N15 thay cho N14 bình thường. Sau đó tế bào được chuyển sang môi trường chỉ chứa N14 nhẹ, mẫu các tế bào được lấy ra theo những khoảng thời gian đều đặn và chiết tách DNA. Bằng phương pháp ly tâm trên thang nồng độ CsCl, các loại DNA nặng, nhẹ và lai được tách ra. Kết quả cho thấy DNA nặng ban đầu (thế hệ 0) chứa N15, sau một lần phân chia cho thế hệ I với DNA lai có tỷ trọng nằm giữa DNA nặng N15 và DNA nhẹ N14. Nói cách khác sau một lần sao chép phân tử DNA mới chứa một nữa mang N15 và một nữa N14. Ở thế hệ II một nữa số phân tử DNA là lai, nữa còn lại là DNA nhẹ N14. Thí nghiệm này khẳng định giả thuyết của Watson và Crick là đúng tức 2 mạch DNA mẹ tách ra, mỗi cái làm khuôn để tổng hợp nên mạch mới bổ sung. 4. Diễn biến sao chép DNA ở nhiễm sắc thể E.coli Quá trình sao chép DNA ở E.Coli diễn ra qua hai giai đoạn: 4.1. Giai đoạn khởi sự (initiation) + Mở xoắn: Ở E.coliquá trình bắt đầu khi một protein B đặc hiệu nhận biết điểm khởi sự sao chép (replication orgine) ori và gắn vào trình tự base đặc biệt đó. Tiếp theo enzyme gyrase (một loại topoisomerase) cắt DNA làm tháo xoắn ở 2 phía của protein B. Trong khi 2 phân tử enzyme gyrase chuyển động ngược chiều nhau so với điểm ori thì 2 phân tử của enzyme helicase tham gia tách mạch tạo chẻ ba sao chép. Helicase sử dụng năng lượng ATP làm đứt các liên kết hydro giữa 2 base bắt cặp với nhau. + Các protein làm căng mạch SSB (single-strand binding protein) gắn vào các mạch đơn DNA làm chúng tách nhau, thẳng ra và ngăn không cho chập lại hoặc xoắn để việc sao chép được dễ dàng. + Tổng hợp mồi (primer) dặc trưng cho quá trình kéo dài chuỗi là DNA polymerase chỉ hoạt động khi đã có mồi, nên trước khi tổng hợp chuỗi thì phải có qua trình tổng hợp mồi. Mồi là một đoạn khoảng 9 -10 nu, có thể là DNA hoặc ARN. 4.2. Giai đoạn nối dài (elongation) Do tính chất đối song song nên khi tách ra thành 2 mạch đơn khuôn thì một mạch có đầu 3’, mạch kia có đầu 5’ nên để đảm bảo hướng sao chép của DNA theo chiều 5’ -3’ thì sự polymer hóa dựa vào 2 mạch khuôn DNA diễn ra khác nhau. Mạch khuôn có đầu 3’ được DNA polymerase III gắn vào và tổng hợp ngay mạch bổ sung 5’-3’ hướng vào chẻ ba sao chép. Mạch khuôn này được gọi là mạch khuôn trước, còn mạch mới được tổng hợp gọi là mạch trước (leading strand). Ở mạch có đầu 5’ (mạch khuôn sau) việc tổng hợp phức tạp hơn và thực hiện từ chẻ ba sao chép hướng ra ngoài để đảm bảo đúng hướng 5’-3’. Khi mạch kép tách ra ở gần chẻ ba sao chép , enzyme primase gắn mồi (primer) ARN khoảng 10 nucleotid có trình tự bổ sung với mạch khuôn. DNA-polymerase III nối theo mồi ARN, theo hướng ngược với chẻ ba sao chép, tổng hợp các đoạn ngắn 1000-2000 nucleotid, gọi là các đoạn Okazaki (người phát hiện là Reiji Okazaki). DNA polymerase nối dài đoạn Okazaki đến khi gặp ARN mồi phía trước thì dừng lại, rồi lùi ra sau tiếp tục tổng hợp từ ARN mồi mới được tạo nên gần chẻ ba sao chép. Tiếp theo DNA-polymerase I nhờ hoạt tính exonuclease 5’-3’ cắt bỏ mồi ARN, lắp các nucleotid của DNA vào chỗ trống và thực hiện polymer hóa hướng 5’-3’. Đoạn DNA ngắn 10 nucleotid này còn hở 2 đầu, chỗ hở được nối nhờ enzyme ligase của DNA mạch được tổng hợp từ chẻ ba sao chép hướng ra ngoài được tổng hợp chậm hơn nên gọi là mạch sau (lagging strand). Quá trình sao chép DNA ở E.coli diễn ra với tốc độ rất nhanh, có thể đạt đến 50.000 nucleotid/phút. . Di truyền phân tử ( phần 23 ) Những cấu trúc chứa DNA trong tế bào 1. Những đoạn DNA chứa thông tin di truyền Đại phân tử DNA là do polynucleotide tạo thành,. lại. Dựa vào đó phân DNA thành ba loại: + DNA đơn độc (tái hợp rất chậm) + DNA lặp lại trung bình (tái hợp nhanh vừa) + DNA lặp lại cao (tái hợp rất nhanh) Mặc dù DNA mang thông tin. các mạch đơn này có thể tạo thành phân tử lai. Phân tử DNA của T3, T7 không thể hình thành phân tử DNA lai với DNA của T số chẵn. Còn virus FX174 có chứa DNA sợi đơn gồm 5400 nucleotide với