di truyền phân tử 06

Chơng 7 ứng dụng của di truyền học 7.1 ứng dụng trong Chọn lọc và cải tạo giống 7.1.1 ứng dụng trong chọn giống Chọn giống là sự lựa chọn các cá thể đực và cái để giữ lại làm giống, đồng thời loại ra những cá thể không làm giống. Sự tuyển chọ và loại thải này thùy thuộc vào mục đích và phơng pháp chọn giống; do vậy đây là hình t6hức chọn lọc nhân tạo. Ngoài tác động của chọn lọc nhân tạo, đặc tính di truyền của giống còn chịu ảnh hởng của chọn lọc tự nhiên. Tần số gen của quần thể giống bị thay đổi qua 3 giai đoạn: giai đoạn đầu do tác động của chọn lọc nhân tạo (chọn phối và nuôi dỡng), giai đoạn hai do chọn lọc tự nhiên tác động (các yếu tố môi trờng tự nhiên) và giai đoạn ba do tác động của chọn lọc tự nhiên tới sức sống của thế hệ con cái [Nguyễn Hải Quân và cộng sự, 2005, tr. 83]. Tuy chọn lọc tự nhiên có ảnh hởng trong quá trình chọn lọc, nhng không có liên quan sâu sắc tới các gen chi phối tính trạng số lợng nên không cần thiết đề cập trong các nội dung chọn giống. Hệ số di truyền trong chọn giống Hệ số di truyền là thành phần xác định hầu hết những tham số quan trọng trong chọn giống. Hiệu quả chọn lọc (R) R = h 2 .S = h 2 .i. P Cờng độ chọn lọc (i) Tiến bộ di truyền (g) Độ chính xác chọn lọc (r AP ) -Dùng 1 giá trị KH trên bản thân: -Giá trị KH lặp lại m lần trên bản thân: Nh vậy hiệu quả chọn lọc hàng năm R = (r AP .i. A )/L và tiến bộ di truyền hàng năm g = (r AP .i. A )/L Để đánh giá giá trị di truyền của một tính trạng có thể sử dụng giá trị KH về tính trạng đó trên các đối tợng: bản thân con vật, tổ tiên của nó, anh chị em của nó và đời con của nó. Searle (1963) đã xây dựng các công thức tính toán độ chính xác của chọn lọc khi sử dụng một trong các nguồn thong tin này. 161 Bảng tra độ chính xác chọn lọc theo h 2 , R và m m 1 2 3 4 5 h 2 R 0.2 0,4 0,6 0,2 0,4 0,6 0,2 0,4 0,2 0,4 0,6 0,1 0,32 0,41 0,38 0,36 0,47 0,41 0,37 0,51 0,43 0,38 0,53 0.44 0,39 0,2 0,45 0,58 0,54 0,50 0,66 0,58 0,52 0,71 0,61 0,54 0,75 0,63 0,54 0,3 0,55 0,66 0,61 0,71 0,64 0.74 0,66 0,76 0,67 0,4 0,63 0,76 0,70 0,81 0,73 0,83 0,76 0,88 0,76 0,6 0,77 0,85 0,89 0,92 0,93 Trích theo Nguyễn Hải Quân, 2005, tr. 92 a) Trờng hợp giá trị kiểu hình của tính trạng đợc xác định trên bản thân con vật, ví dụ tính trạng tăng khối lợng trung bình của gia súc nuôi thịt và tính trạng độ dày mỡ lng của lợn đực giống. Ví dụ: chọn lọc một bò cái có h 2 = 0,3 và hệ số lặp lại R = 0,4. - Nếu chỉ căn cứ vào sản lợng sữa của một kỳ tiết sữa , độ chính xác của chọn lọc là r AP = 2 h = 3,0 = 0,55. - Nếu căn cứ sản lợng sữa trung bình của 3 kỳ tiết sữa thì độ chính xác của chọn lọc là r AP = R).1m(+1 h.m 2 = 4,0).13(+1 3,0.3 = 0,71 b) Trờng hợp giá trị kiểu hình đợc xác định trên tổ tiên Phơng thức sử dụng giá trị kiểu hình trên tổ tiên Độ chính xác chọn lọc 1 giá trị kiểu hình trên bố hoặc mẹ r AP = 2 h 2 1 Vài giá trị kiểu hình trên bố hoặc mẹ 1 giá trị KH trên bố và 1 giá trị KH trên mẹ r AP = 2 h 2 1 Trên mỗi tổ tiên (bố, mẹ, ông nội, bà nội, ông ngoại, bà ngoại) sử dụng 1 giá trị KH Trên s anh chị em mỗi cá thể cùng 1 giá trị KH Trên s anh chị em nửa ruột thịt mỗi cá thể cùng 1 giá trị KH Trên p con cái mỗi cá thể cùng 1 giá trị KH Độ chính xác của chọn lọc dựa trên nguồn số liệu giá trị KH khác nhau Hệ Số TStiSn Bản Thân Anh chị em Đời con 162 Bố Và Mẹ Bố Mẹ ông bà nội ngoại Ton hQ t6 liSn íiố lợng Anh chị em ruột Số lợng anh chị em Nửa ruột thịt Số lợng đời con 2 4 8 5 10 20 40 5 10 20 40 80 120 0,1 0,22 0,27 0,29 0,32 0,22 0,29 0,38 0,17 0,23 0,29 0,36 0,34 0,45 0,58 0,71 0,82 0,87 0,2 0,32 0,37 0,39 0,45 0,30 0,39 0,48 0,23 0,29 0.36 0,41 0,46 0,59 0,72 0,82 0,90 0,93 0,3 0,39 0,43 0,45 0,55 0,36 0,45 0,54 0,27 0,33 0,39 0,44 0,56 0,70 0,79 0,87 0,93 0,95 0,4 0,45 0,49 0,50 0,63 0,41 0.50 0,58 0,30 0,36 0,41 0,45 0,60 0,73 0,83 0,90 0,95 0,96 0,5 0,50 0,53 0,54 0,71 0,45 0,53 0,60 0,32 0,38 0,43 0,46 0,65 0,77 0,86 0,92 0.96 0,97 0,6 0,55 0,57 0,57 0,77 0,48 0,56 0,62 0,34 0,40 0,44 0,47 0,68 0,80 0,88 0,94 0,97 0,98 0,7 0,59 0,61 0,61 0,84 0,51 0,58 0,63 0,36 0,41 0,45 0,47 0,72 0,82 0,90 0,95 0,97 0,98 0,8 0,63 0,64 0,64 0,89 0,53 0,60 0,65 0,37 0,42 0,46 0,48 0,75 0,84 0,91 0,95 0,98 0,98 0,9 0,67 0,67 0,67 0,95 0,56 0.62 0,66 0,38 0,43 0,46 0.48 0,77 0,8G 0,92 0,96 0,98 0,99 1,0 0,71 0,71 0,71 1,00 0,58 0,63 0,67 0,39 0,44 0,47 0,48 0,79 0,88 0,93 0,96 0,98 0,99 Trích từ Nguyễn Hải Quân, 2005, tr. 95 Ngoài ra, hệ số di truyền còn tham gia xác định chỉ số chọn lọc. Đối tợng chọn lọc Công thức áp dụng Xác định chỉ số chọn lọc 1 tính trạng trên bản thân cá thể I = h 2 .X 1 Xác định chỉ số chọn lọc 1 tính trạng từ giá trị KH lặp lại m lần trên bản thân cá thể (hoặc m lần từ m cá thể chị em nửa ruột thịt cùng quan hệ di truyền cộng gộp với cá thể ) Xác định chỉ số chọn lọc 1 tính trạng trên bản thân cá thể từ giá trị KH mẹ và bà ngoại I = b 1 .X 1 + b 2 .X 2 Giải hệ phơng trình b 1 + 2 1 h 2 b 2 = 2 1 h 2 và 2 1 h 2 b 1 + b 2 = 2 1 h 2 => I = (4-h 2 ).X 1 + 2(1-h 2 ).X 2 Xác định chỉ số chọn lọc vài tính trạng trên bản thân cá thể Với i tính trạng Với 2 tính trạng Trích theo Nguyễn Hải Quân, 2005, tr. 100, 101 Hệ số di truyền còn là tham số xác định giá trị giống (giá trị các gen mà con giống truyền cho thế hệ sau). Giá trị giống ớc tính Phơng thức áp dụng 163 Dùng số liệu 1 giá trị KH 1 lần từ bản thân Dùng số liệu 1 giá trị KH nhắc lại m lần từ bản thân Dùng i số liệu giá trị KH 1 lần từ mỗi bản thân và những cá thể họ hàng ứng dụng tơng tác gen trong lai giống Lai giống là dùng hai dòng cho giao phối với nhau, hoặc cho hai cá thể thuộc hai dòng cận huyết giao phối với nhau. Trờng hợp cho hai cá thể thuộc hai loài giao phối với nhau thì gọi là lai xa. Mục tiêu của lai giống là lợi dụng tơng tác trội hay siêu trội trong biểu hiện của gen ở con lai (F 1 ) nhằm nâng cao khả năng sản xuất của chúng (thịt, trứng, sữa ), tạo điều kiện hình thành giống mới, đồng thời lợi dụng u thế lai của sinh vật (heterosis). Phần này không đề cập nguyên nhân dẫn đến u thế lai trong lai giống mà chỉ phân tích kết quả do u thế lai mang lại. Giá trị của u thế lai ở F 1 là độ lệch giá trị kiểu hình trung bình của F 1 so với giá trị kiểu hình trung bình của cha mẹ hay của hai quần thể cha mẹ. Trớc hết quan sát hiệu quả u thế lai trên 1 locus với 2 allen A 1 và A 2 ở 2 quần thể P 1 và P 2 : - Sự khác nhau về tần số của 2 allen ở hai quần thể là y (y = p - p = q - q). Do đó p = p - y và q = q + y Giá trị kiểu gen A 1 A 1 là +a, kiểu gen A 1 A 2 là d và kiểu gen A 2 A 2 là -a (giả thiết các giá trị này tơng ứng bằng nhau ở hai quần thể và không xét trờng hợp ức chế của gen). Trung bình giá trị kiểu gen cha mẹ ở quần thể P 1 là M P1 = a(p - q) + 2dpq và ở quần thể P 2 là M P2 = a(p - y - q - y) + 2d(p - y)(q + y) = a(p - q - 2y) + 2d[(pq + y(p - q) + y 2 ] Trung bình giá trị kiểu gen bố mẹ ở cả hai quần thể là P M = 2 1 (M P1 + M P2 ) = a(p q y) + d[(2pq + y(p q) y 2 ] Các cá thể quần thể P 1 giao phối ngẫu nhiên với quần thể P 2 tạo ra F 1 . Tính tần số hợp tử ở F 1 : 164 P 1 P 2 pA 1 q (p y)A 1 A 1 A 1 p(p y) A 1 A 2 q(p y) (q + y)A 2 A 1 A 2 p(q + y) A 2 A 2 q(q + y) Kiểu gen, tần số kiểu gen và giá trị kiểu gen ở F 1 Kiểu gen A 1 A 1 A 1 A 2 A 2 A 2 Tần số kiểu gen p(p y) 2pq + y(p q) q(q + y) Giá trị kiểu gen +a d -a M P1 (Trung bình kiểu gen F 1 ) a(p q y) + d[2pq + y(p-q) H F1 = M P1 - P M (u thế lai ở F 1 ) dy 2 = d(p p) Nh vậy u thế lai ở F 1 phụ thuộc d, p và p: - Hiện tợng trội của gen: d = 0 => không có u thế lai; d > a => u thế lai cực đại. Nói khác đi u thế lai cao nhất khi có tơng tác siêu trội. - P = P: không có u thế lai; P càng lớn hơn p u thế lai càng cao Ưu thế lai ở F 2 : trung bình kiểu gen ở F 2 theo M = a(p q) + 2 dpq. ở F 1 , tần số của A 1 là p - 2 1 y và của A 2 là q + 2 1 y M F2 = a(p - 2 1 yq - 2 1 y) + 2d(p - 2 1 y)(q + 2 1 y) = a(p q y) + d[2pq +y(p q) - 2 1 y 2 ] Ưu thế lai ở F 2 là H F2 = M F2 . P M = 2 1 dy 2 = 2 1 H F1 (suy giảm u thế lai cũng coi là suy hóa cận huyết). Trong thực tiễn, ngời ta thờng lợi dụng u thế lai ở F 1 đối với các tính trạng có hệ số di truyền thấp vì khi đó hệ số di truyền càng thấp thì mức độ biểu hiện u thế lai càng cao [Nguyễn Hải Quân, 2005, tr. 135-136]. 7.1.2 Chọn giống động vật, thực vật và vi sinh vật Chọn giống động vật Chọn giống thực vật Chọn giống vi sinh vật 7.2 Vài nét về di truyền học ngời 7.2.1 Các đặc điểm và phơng pháp nghiên cứu 7.2.2 Phân tích bộ gen ngời 7.2.3 Di truyền y học 7.2.4 Vấn đề x hội của di truyền họcã 7.3 Kỹ thuật di truyền 165 7.3.1 Kỹ thuật gen - genomic Tách chiết, thu nhận ADN Nguyên tắc là thu nhận ADN nguyên vẹn không bị phá hủy bởi cơ học, hóa học. Quy trình gồm các bớc cơ bản sau: (1) Nghiền nhanh mẫu thành dạng bột mịn trong nitrogen lỏng. (2) Đa vào dd đệm chứa Tris. SDS (15 ml), ủ mẫu trong bể ổn nhiệt 65 0 C trong 90 phút, lắc nhẹ. (3) Đa vào 10 ml hỗn dịch chloroform/rs camyl (tỷ lệ 24/1), lắc nhẹ 20 phút (4) Ly tâm 10.000 vòng/phút ở 4 0 C trong 10 phút; lặp lại ly tâm; thu dịch phía trên. (5) Tủa bằng 15 ml isopropanol (hoặc etanol) 70%; ly tâm 14.000 vòng/phút; lặp lại ly tâm; thu ADN đặc. (6) Làm khô trong TE ở 4 0 C qua đêm thu đợc dung dịch chứa ADN tách chiết (mẫu khảo sát). Các men giới hạn enzyme restriction (endonuclease) Các nhóm men giới hạn Men giới hạn gồm 3 nhóm I, II và III; các men giới hạn đợc dùng phổ biến thuộc nhóm II. Chúng có cơ chế tác động đơn giản, cắt liên kết phosphatdiester tại vị trí nằm trong chuỗi polynucleotid (gọi là endonuclease)và không phân hủy phân tử ADN; trong khi men giới hạn nhóm I và III cắt và phân hủy phân tử ADN tại vị trí đầu. Đăc điểm Nhóm I Nhóm II Nhóm III Điểm cắt Xa vị trí nhận biết (> 1000 bp) Trong điểm nhận biết Ngoài điểm nhận biết Khả năng metyl hóa gốc Adenin có Không Có Điều kiện để cắt ATP, Mg ++ , S-adomet Mg ++ hoặc Mn ++ Mg ++ , S-adomet Số chuỗi của men Khác nhau Giống nhau Khác nhau Khả năng metyl hóa gốc adenin của nhóm men giới hạn I và III 166 Gọi tên men giới hạn theo quy định quốc tế: Đặc điểm hoạt động - Có tính đặc hiệu: mỗi men nhận biết một đoạn ADN riêng (gồm từ 4 đến 8 bp). Mỗi đoạn ADN đợc lặp lại khác nhau trong phân tử ADN. Đoạn 4 bp thì cứ 4 4 = 256 bp, đoạn 5 bp thì cứ 5 4 bp = 1024 bp, đoạn 6 bp thì cứ 6 4 = 4096 bp lặp lại một lần. Cùng một phân tử ADN, nhng cắt bởi men giới hạn nhận biết 4 bp sẽ đ- ợc nhiều hơn và chiều dài ngắn hơn các đoạn ADN so với cắt bởi men nhận biết đoạn ADN 5 hây 6 bp. - Có hai loại hình dạng đầu bằng blunt end và đầu so le hay đầu dính sole cobesive end của đoạn cắt đợc tạo ra tùy theo men giới hạn cụ thể. Loại đầub dính có 2 kiểu: kiểu đầu 3 nhô ra và kiểu đaauf 5 nhô ra. Men giới hạn cắt đầu bằng - Afu I - Hea II - Hnd II - Sma I Men giới hạn cắt đầu dính 5 - Banh I - Bg II - Cfa I - Ecofd - Hnd II - Hpa II - Mbo I - Pru I - Aru I - Xma I - Not I Men giới hạn đầu dính 3 - Kpn I - Pat I - Men giới hạn khác nhau cắt cùng một phân tử ADN thành những đoạn có kích thớc khác nhau. Nếu sử dụng phối hợp nhiều men giới hạn khác nhau để cắt cùng một phân tử ADN sẽ thu nhận đợc nhiều đoạn ADN kích thớc (số lợng bp) khác nhau. Chạy điện di hỗn hợp các đoạn ADN của một mẫu ADN; sau đó so sánh kết quả trên băng điện di với băng điện di của ADN chuẩn (đã biết cấu trúc các đoạn nucleotid) sẽ tìm ra trật tự phân tử ADN khảo sát. Sử dụng men giới hạn trớc hết để lập bản đồ cắt giới hạn. Căn cứ vào trình tự nucleotid của đoạn nhận biết theo từng men và vào sự phân tích trình tự các đoạn theo ADN chuẩn sẽ suy ra trình tự nucleotid của phân tử ADN khảo sát. 167 Ngoài ra còn sử dụng men giới hạn RE (restriction enzyme) phối hợp với men nối đoạn ADN để gắn các đoạn ADN vào vector (vật tải gen) tạo ADN tái tổ hợp [Chu Hoàng Mậu, 2005, tr. 61-66]. Các vector chuyển gen Vector chuyển gen là ADN dạng vòng, có khả năng gắn đợc một đoạn ADN có thể xâm nhập tế bào vật chủ (phần lớn là vi khuẩn) để tạo các bản sao (hệ gen tạp - có gắn gen lạ) khác giống hệt vector ban đầu (hệ gen tế bào chủ). ứng dụng của vector - Tạo dòng: Vector gắn với đoạn ADN nhất định (gọi là một dòng) nhằm để nhân bản đoạn ADN (gắn với vector) xác định. - Sản xuất ARN với số lợng lớn từ ADN đã tạo dòng - Sản xuất protein với số lợng lớn từ ADN đã tạo dòng Đặc tính cần có của một vector - Độc lập tự sao chép trong tế bào vật chủ - Có kích thớc càng nhỏ càng tốt - Phải đợc phát hiện rõ ràng trong tế bào vật chủ (có thật) - Phải tồn tại trong tế bào vật chủ qua nhiều thế hệ - Chỉ có mộtk vị trí nhận biết cho men đặc hiệu Các loại vector - Vector tách dòng đợc đa vào tế bào E. coli gồm plasmid, Bacteriophage I, cosmid, Bacteriophage M13, và một số loại vector đặc biệt nh Ti plasmid, YACs, BACs, Retrovirus, Baculovirus, Yeast 2 micron plasmid. - Vector chuyển gen (vector tái tổ hợp) thờng dùng để chuyển gen vào tế bào chủ của động vât và thực vật (Eucaryota bậc cao). Các vector tái tổ hợp có thể đợc đa trực tiếp hoặc gián tiếp qua các sinh vật lây nhiễm của động vật hay thực vật nh các virus, vi khuẩn, nấm đơn bào. Một số vector có thể dùng cho tế bào động vật, thực vật Tế bào chủ Loại vector Loại genom Ví dụ vector tái tổ hợp Thực vật Plasmid ADN Plasmid Ti của Agrobacterium tumefaciens Virus (phage) ADN Virrus khảm cải hoa, Gemini virus ARN Virus khảm thuốc lá Động vật Plasmid ADN Nhiều loại plasmid khác nhau, nhiều loại chứa cả SV40 Virus (phage) ADN Baculovirus, Virus papilloma Virus siliman 40 (SV40), virus vaccinia ARN Retrovirus Gen nhảy Các phần tử p trong ruồi giấm (Drossophila melanogaster) Plasmid: ADN mạch vòng trong vi khuẩn. Phân biệt hai loại là plasmid tiếp hợp (tự chuyển sang vi khuẩn khác trong tiếp hợp nhờ các đoạn đặc thù tra transfer và mob mobilising di 168 chuyển), và plasmid không tiếp hợp (không tự chuyển sang đợc). Các plasmid tiếp hợp có số bản sao thấp, kiểm soát chặt chẽ sao chép ADN tái tổ hợp, sao chép phụ thuộc ADN nhiễm sắc thể. Plasmid không tiếp hợp thờng sao chép ADN tái tổ hợp thoải mái, không phụ thuộc sự sao chép ADN nhiễm sắc thể và tồn tại với số bản sao cao [Chu Hoàng Mậu, 2005, tr.134]. Các plasmid phổ biến là pBR322, pAT153 (với p thay cho plasmid và BR hay AT thay cho tên ngời phân lập hay thiết kế chúng, các con số dùng để phân loại chủng plasmid). Phage: Là những thể ăn khuẩn (chỉ nhân lên bên trong vi khuẩn) do Max Delbruck nghiên cứu từ những năm 1940. Phage hoạt động nh những đoạn ADN ngoài NST vi khuẩn. Có hai loại phage ( và M13) đợc hoàn thiện tích cực cho mục đích tách dòng. Các vector phage hoạt động đặc hiệu hơn các plasmid. Chúng có thể chia làm 3 nhóm: nhóm không đuôi, nhóm có đuôi và nhóm có lông. Khi vào tế bào vi khuẩn, phage có thể sinh sôi và giết chết tế bào chủ (trạng thái phage sinh tan) hoặc nhập vào NST mà không giết chết tế bào (trạng thái tiềm tan). Hệ gen của phage (48,5 kb) mã cho 46 gen. Toàn bộ hệ gen đã đợc giải trình tự. Hai đầu có 2 đoạn ngắn (12 bp) mạch đơn là những đầu dính tạo mạch vòng cho hệ gen sau khi nhiễm vào tế bào vi khuẩn. Khi hệ gen vòng phage nhập vào NST tế bào chủ thì hệ gen phage tiềm tan và gọi là prophage (tiền thực thể). Hệ gen phage Khi chu trình sinh tan bắt đầu, phage làm chủ tế bào và tạo ra nhiều bản sao hệ gen phage và các protein cấu trúc. Chúng chui ra khỏi tế bào khi tế bào chủ vỡ tan (sự sống tế bào tan biến). Để xác định số lợng phage trong dịch tan, pha loãng dịch tan nhiều lần và trộn lẫn với vi khuẩn còn lại rồi cấy lên mặt thạch. Sau khi ủ, vi khuẩn mọc thành thảm. Phage có trong thảm làm cho vi khuẩn sinh tan tạo ra các vết tan (plaque) trên thảm. Đếm số lợng vết tan và xác định số l- ợng phage trong dịch tan. Hệ gen phage vào tế bào chủ chuyển sang dạng mạch kép (dạng sao chép RF replication form). Khi sao chép đ ợc khoảng 1000 bản sao thì rơi vào trạng thái sao chép bất đối xứng (asymetric replication); các bản sao mạch đơn của hệ gen phage đợc sinh ra và thoát khỏi tế bào nh các hạt M13. Vi khuẩn lúc đó không chết (không sinh tan) nhng sinh sản và phân chia chậm hơn so với tế bào không bị xâm nhiễm. Tạo vector tái tổ hợp 169 Hình ảnh phage Tạo plasmid tái tổ hơp Tùy theo ADN tái tổ hợp (ADN, ARN) mà chọn loại vector (plasmid, virus hay gen nhảy) phù hợp với mục tiêu (nghiên cứu sự biểu hiện gen, sản xuất protein hữu ích hay biến đổi cấu trúc di truyền) [Chu Hoàng Mậu, 2005, tr.138]. Quy trình tạo plasmid tái tổ hợp Phỏng theo Nông Văn Hải, 2002) Tạo phage tái tổ hợp Hệ gen phage M13 (6407 bp) không mang các gen không quan trọng (khác phage ) Vùng gen (nằm giữa hệ gen) dùng để thiết kế một loạt các vector M13mp bằng cách xen một đoạn polinker/lac Z -peptid vào đó. Qua đó có thể sử dụng hệ thống sàng lọc X-gal để phát hiện các thể tái tổ hợp ví dụ pUC. Khi M13 mọc trên thảm vi khuẩn, các vết tan xuất hiện, các tế bào không bị sinh tan nên có thể lấy ra tiếp tục phân tích. Mô hình tạo phage M13 tái tổ hợp Phỏng theo Chu Hoàng Mậu, 2005, tr.143 Biến nạp ADN tái tổ hợp vào tế bào chủ Ghép đoạn ADN vào vector Các vector nhận ADN có kích thớc khác nhau. Plasmid thờng có kích thớc nhỏ không mang đợc ADN có kích thớc lớn (<7 kb). Tuy nhiên vector nhân tạo YAC (yeast artifical chromosom) có thể mang đoạn ADN cỡ 1 Mb. Các vector hiện nay hay dùng là plasmid, phage, cosmid, BAC (bacteria artifical chromosom). 170 [...]... sai khác trên băng điện di ở kích th ớc phân tử protein 10-16 kDa giữa các thể đột biến ở 5 giống lúa khác nhau Kỹ thuật điện di hai chiều: có thể đợc ứng dụng để phát hiện đột biến do thay thế nucleotid hay do biến đổi trình tự nucleotid Tiến trình điện di: - Gây biến tính protein ở 100 0C - Điện di ở thế hiệu khác nhau - Nhuộm màu, chụp ảnh băng điện di - Phân tích băng điện di theo mục đích nghiên... lý và đa vào điện di hai chiều Kết quả điện di hai chiều của mỗi mẫu so với của mẫu protein chuẩn giúp phân tích trình tự các acid amin, sự sắp xếp peptid, nhận dạng protein Phân tách từ gel điện di Các pha xử lý - Kết quả phân tích tiểu phần Làm sạch Sấy khô Hòa tan và thêm protease Chiết Cắt phân đoạn Phân tích tiểu phần Theo Phan văn Chi, 2022; từ Chu Hoàng Mậu, 2005, tr 86 Phân tích men Xác... chúng di chuyển khác nhau trong điện trờng Phân tích kết quả điện di protein theo những mục đích nghiên cứu khác nhau 183 Kỹ thuật điện di một chiều: tách các phân tử protein khác nhau có trong mẫu (protein tan tổng số trong dd NaCl 1M, và protein tan trong n ớc) So sánh kết quả điện di giữa các mẫu nghiên cứu để xác định tính đa hình protein và tính đa dạng sinh học của sinh vật Ví dụ kết quả điện di. .. nớc) đợc hòa tan vào dd NaCl 1M (phân đoạn III) (2) Dùng cho phân tích điện di: Mẫu dịch (đã chiết bằng nớc cất phân đoạn I) đợc ly tâm 14.000 vòng/phút Dịch ly tâm chứa phần lớn albumin và một phần globulin (phân đoạn IV) Căn ly tâm đợc chiết tiếp bằng NaCl 1M và ly tâm lấy dịch (phân đoạn VII) Dịch ly tâm (IV) đợc thẩm tích, dịch thẩm tích chứa phần lớn albumin (phân đoạn V) Cặn thẩm tích đợc hòa... dừng lại Vì vậy còn gọi là ph ơng pháp dideoxy (dideoxy method) dA-TP = dideoxy-adenosin-triphosphat dG-TP = dideoxy-guanosin-triphosphat dT-TP = dideoxy-thymidin-triphosphat dC-TP = dideoxy-cytosin-triphosphat Đầu tiên sợi đúp ADN (cần đọc trình tự nuc leotid) biến tính bởi nhiệt thành hai sợi đơn và đợc lai với mồi (ddA-TP, ddT-TP.ddC-TP hay ddG-TP = dideoxy A-, T-, C- hay G-triphosphat) có sự tham... C) tạo ra những đoạn ADN mạch đơn kích thớc khác nhau, điện di và sắc ký sản phẩm, phân tích kết quả Trớc hết đánh dấu phân tử ADN sợi kép tại đầu 5, rồi dùng nhiệt phân tách thành các sợi đơn Sau đó xử lý độc lập 4 loại hóa chất phá hủy lần l ợt các nucleotid (ví dụ nu-A) Kết qua đợc hàng loạt đoạn ADN kích thớc khác nhau Các đoạn này đợc phân ly độc lập trên gen polyacrylamid và chỉ những đoạn có... (mẫu dịch - phân đoạn I) đ ợc bảo quản ở nhiệt độ 200C, dùng nhiều lần cho định lợng và một lần cho phân tích điện di (1) Dùng cho phân tích định lợng protein: Mẫu dịch (phân đoạn I) đợc ly tâm 14.000 vòng/phút trong 20 phút, sau đó loại bỏ cặn ly tâm (chứa tinh bột và tạp chất) bằng cách thẩm tích Dịch thẩm tích chứa protein tổng số đợc ly tâm; dịch ly tâm (lần II chứa hầu hết albumin (phân đoạn II),... đích nghiên cứu Cơ cấu băng (gel) điện di: Thành phần Gel (%) Nớc (ml) 30% degassed acrylamid/Bis (ml) Gel buffer (ml) SDS (ml) Gel cô mẫu 4% 6,1 1,3 2,5 0,1 Gel phân lập protein 12% 3,4 4,0 2,5 0,1 Phân tích ảnh điện di: So sánh hình ảnh các mẫu khảo sát (1-9) với hình ảnh mẫu chuẩn (M) rồi đa ra những nhận xét tùy theo mục đích nghiên cứu 184 Hình ảnh phổ điện di protein chiết bằng nớc cất Từ Chu Hoàng... Mẫu protein tr ớc khi đo đợc xử lý thủy phân ở 1050C trong 24 giờ Tùy theo mục đích có thể xác định hàm lợng acid amin tự do trong tế bào (nghiên cứu mối liên quan hàm lợng một acid amin nào đó với tính trạng - mùi thơm) hoặc xác định hàm lợng acid amin liên kết (nghiên cứu chất lợng sản phẩm) trong protein Phân tích protein bằng kỹ thuật điện di protein Phân tử protein khác nhau mang điện tích và... nuôi cấy tăng số lợng Để phân lập vi khuẩn chứa vector cần dựa vào dấu hiệu nhận biết chúng (vector mang gen chống chịu kháng sinh mọc đ ợc trong môi trờng có kháng sinh), hoặc dựa vào vị trí nằm trong vùng chứa mã di truyền của gen đánh dấu khi ghép ADN lạ làm cho hoạt động của gen này bị thay đổi (nhận biết qua sự thiếu vắng sản phẩm từ gen đó) Nh vậy dể dàng nhận biết và phân lập tế bào mang vector . vật 7.2 Vài nét về di truyền học ngời 7.2.1 Các đặc điểm và phơng pháp nghiên cứu 7.2.2 Phân tích bộ gen ngời 7.2.3 Di truyền y học 7.2.4 Vấn đề x hội của di truyền họcã 7.3 Kỹ thuật di truyền 165 7.3.1. liên kết phosphatdiester tại vị trí nằm trong chuỗi polynucleotid (gọi là endonuclease)và không phân hủy phân tử ADN; trong khi men giới hạn nhóm I và III cắt và phân hủy phân tử ADN tại vị. còn gọi là phơng pháp dideoxy (dideoxy method). dA-TP = dideoxy-adenosin-triphosphat dG-TP = dideoxy-guanosin-triphosphat dT-TP = dideoxy-thymidin-triphosphat dC-TP = dideoxy-cytosin-triphosphat Đầu