CHỈ THỊ NỘI ĐỘC TỐ Mục đích sử dụng: Chỉ thị nội độc tố được thiết kế cho việc thẩm định hoặc theo dõi quá trình loại chất gây sốt (pyrogen) như quá trình tiệt trùng bằng sấy khô và các phương pháp rửa. Sự đánh giá của quá trình loại nội độc tố có thể đo được bằng việc so sánh nồng độ của endotoxin trước và sau chu trình loại nội độc tố, bằng cách sử dụng hóa chất và thiết bị đo nội độc tổ của Charles River. Dược điển Mỹ khuyến cáo rằng một quá trình loại bỏ nội độc tố nên giảm một chỉ thị nội độc tố ít nhất 1000 lần (giảm 3 log) về hoạt tính khi được đo bằng phương pháp LAL. Giải thích thí nghiệm . Phương pháp tiệt trùng bằng sấy khô là phương pháp hay được chọn hơn khi xử lý sản phẩm thủy tinh và các nguyên liệu chịu nhiệt khác để loại bỏ nội độc tố. Dược điển Mỹ, Mục số 7 về kỹ thuật đối với dược phẩm không uống, hiệp hội những người sử dụng LAL và những người khác đã cho thấy các kết quả trong việc sử dụng chỉ thị nội độc tố.(1-6) Chỉ thị nội độc tố của Charles River đã được chuẩn bị cẩn thận và được thí nghiệm kỹ lưỡng về thành phần nội độc tố, do đó hoạt lực nội độc tố trong các ống chỉ thị nội độc tố có thể đạt được với sự pha loãng 2 lần của hoạt lực được dán nhãn của lysate chuẩn tham chiếu. Mức độ cuả quá trình loại chất gây sốt có thể được đánh giá bằng cách so sánh lượng nội độc tố của chỉ thị nội độc tố đã qua chu trình loại nội độc tố với chỉ thị nội độc tố chưa qua chu trình loại nội độc tố. Các hóa chất hay được sử dụng cho việc đánh giá này là Charles River endosafe 50 test 0.125 EU/ mL (code: R110). Phương pháp thuận tiện nhất cho việc định lượng chỉ thị nội độc tố là sử dụng phương pháp Kinetic LAL và sử dụng các sản phẩm KTA(code: R150), hóa chất định lượng theo phương pháp kinetic turbidimetric hoặc Endochrom K (code:R170), hóa chất định lượng theo phương pháp kinetic chromogenic của Charles River. Thành phần: Mỗi lọ chưa 2000 EU (endotoxin Units) lipopolysaccharide từ E.coli 055:B5, được chứng nhận bởi Charles River Endosafe với các nguyên liệu tham chiếu. Ống chỉ thị được làm bằng thủy tinh cứng nhìn trống trơn vì nội độc tố đông khô không được trộn lẫn với các chất phụ gia khác. Bảo quản: ở 25 o C với nắp chưa mở. Chú ý: chỉ thị nội độc tố chứa mộ lượng nhất định chất gây sốt, do đó chúng nên được chỉ định theo quy định thuốc tiêm. Các chỉ thị nội độc tố chỉ sử dụng ngoài cơ thể, không được sử dụng cho người hoặc động vật. Phương pháp: Phương pháp đặt chỉ thị nội độc tố. Đối với thẩm định hầm sấy, lò sấy, đặt chỉ thị nội độc tố ở nơi được chỉ định. Ngay trước khi đưa chỉ thị nội độc tố vào nơi chỉ định, mở nắp ống, loại bỏ nắp cao su và thay thế bằng tấm nhôm lá và đưa chỉ thị nội độc tố vào quá trình sấy. Ghi chú: nhãn của ống chỉ thị nội độc tố là chịu nhiệt nên không cần loại bỏ trước khi đưa vào sấy. Chuẩn bị phân tích: Sau khi chỉ thị nội độc tố đã được sấy, Các ống mẫu đã qua quá trình sấy và một hoặc hai chỉ thị nội độc tố đã qua sấy (chỉ thị dương) nên được chuẩn bị cho việc phân tích. Các chỉ thị nội độc tố nên được đánh giá bởi một phương pháp LAL đã được thẩm định, độ nhạy của hóa chất được đánh giá bởi chỉ thị nội độc tố chuẩn đã được chứng nhận (code: E110 hoăc E120) hoặc RSC (Reference Standard Endotoxin –nội độc tố tham chiếu ). Tất cả các ống nên được chuẩn bị cho kiểm tra LAL bằng cách thêm 1 mL LRW (code: W110) và vortex 2 phút và sau đó là 1 phút sau mỗi 10 phút trong khoảng 1 giờ 30 phút. Phân tích LAL nên bắt đầu nhanh chóng để kết quả được chính xác. Phương pháp phân tích bằng Gel-clot: Tính toán sự giảm nội độc tố bằng cách tìm nồng độ cuối của đối chứng dương (Chỉ thị nội độc tố qua quá trình sấy) bằng cách pha loãng 10 lần và sau đó 2 lần và lấy log[E] (nồng độ nội độc tố) chưa qua sấy trừ đi log[E] của chỉ thị nội độc tố đã qua sấy. Sử dụng log[λ] cho nồng độ endotoxin trong các ống qua sấy khi kết quả kiểm tra LAL âm tính đối với dung dịch không pha loãng. Ví dụ: Giảm log = log 2000 EU/mL – log 0.125 EU/mL = 3.301 – ( - 0.903) =4.2 Do đó kết quả của quá trình loại chất gấy sốt (depyrogenation) được minh chứng ở trên là giảm 4.2 log. Phương pháp phân tích bằng Kinetic LAL: Một phương pháp thuận tiện cho việc phân tích chỉ thị nội độc tố là sử dụng phương pháp kinetic LAL từ Charles River. Phương pháp phân tích được thực hiện bằng việc thiết lập một phân tích kinetic chromogenic hoặc kinetic turbidimetric sử dụng một đường cong chuẩn 2 log 0.05 đến 5.0 EU và kiểm tra sự pha loãng của một đối chứng dương và các mẫu không pha loãng. Kết quả của phân tích thỏa mãn các điều kiện > giảm 3 log nếu log (đối chứng dương) – log (đối chứng dương đã qua quá trình sấy) > 3. Ví dụ tính toán được đưa ra ở đây là đối chứng dương có nồng độ ban đầu là 2000 EU/mL và sau quá trình sấy là nhỏ hơn lamda (0.05 EU/mL), điểm thấp nhất của đường cong chuẩn. Giảm log = log 2000 EU/mL – log 0.05 EU/mL =3.301 –(-1.301) =4.6 Tài liệu tham khảo: 1. U.S Pharmacopeia 23, United States Pharmacopeial convention, inc., 1995,p.1977. 2. Parenteral Drug Association, inc., Depyrogenation, Technical Report No.7,1985. 3. LAL Users Group. Preparation and use of endotoxin indicators for depyrogenation process studies, J.Parenteral Drug Assoc.,43:109,1989. 4. Weary, M and F Pearson. A manufacturer’s guide to depyrogenation. Biopharm. 1,1988. 5. Nakata, T, Destruction of challenged endotoxin in a dry heat oven, PDA J.Pharm. Sci. Technol.,48:59,1994. Hecker, W, D Witthauer and A Staerk. Validation of dry heat inactivation of bacterial endotoxin, PDA J.Pharm.Sci. Technol.,48:197, 1994. . đánh giá bằng cách so sánh lượng nội độc tố của chỉ thị nội độc tố đã qua chu trình loại nội độc tố với chỉ thị nội độc tố chưa qua chu trình loại nội độc tố. Các hóa chất hay được sử dụng. độc tố. (1-6) Chỉ thị nội độc tố của Charles River đã được chuẩn bị cẩn thận và được thí nghiệm kỹ lưỡng về thành phần nội độc tố, do đó hoạt lực nội độc tố trong các ống chỉ thị nội độc tố. đặt chỉ thị nội độc tố ở nơi được chỉ định. Ngay trước khi đưa chỉ thị nội độc tố vào nơi chỉ định, mở nắp ống, loại bỏ nắp cao su và thay thế bằng tấm nhôm lá và đưa chỉ thị nội độc tố vào