vi tảo (tt) pdf

Hóa chất và cách chuẩn bị: Phương pháp: Giải trình tự ADN sợi kép sử dụng KIT biến tính nhanh với sequenase. Phương pháp này thích ứng với việc giải trình tự các plasmid sợi đôi. Bắt đầu bằng việc gây biến tính trong kiềm (NaOH) hoặc glycerol, sau đó kết tủa ADN và bắt cặp với ADN mồi dùng để giải trình tự. Phương pháp giải trình tự ADN với sợi đôi cần lượng ADN mồi cao gấp 10-20 lần so với sợi đơn. Việc giải trình tự gồm hai phản ứng: phản ứng đánh dấu và phản ứng dừng tại điểm cuối. Trong phản ứng đánh dấu các sợi ADN bổ sung được gắn kết với chất đánh dấu phóng xạ trong việc kéo dài chuỗi. Sau đó phản ứng kéo dài chuỗi ADN bị dừng một cách ngẫu nhiên do nồng độ thấp của nucleotid trong dịch phản ứng (0.08 mM). Bước tiếp theo là kết thúc chỗi với dideoxynucleotid khi có nồng độ cao của deoxyribonucleotid (33,3 mM). Các trình tự tiếp theo của sợi khuôn sẽ được xác định với nồng độ cao của deoxynucleotid trong khi phản ứng đánh dấu xảy ra trước việc bổ sung dideoxynucleotid vào hỗn hợp phản ứng. Quy trình sau đây đã được rút gọn, có nhiều phần tiện ích chi tiết hơn và thay đổi trong các tài liệu hướng dẫn. Điều quan trọng để có kết quả tốt trong việc giải trình tự ADN là chất lượng cao của ADN plasmid. Trong các khâu chuẩn bị việc xuất hiện các phân tử đứt gãy sẽ dẫn đến kết quả không rõ, khó xác định các băng. Các plasmid sợi đơn phải được làm biến tính cho mở xoắn trước khi giải trình tự. Biến tính các plasmid xoắn do liên kết hóa trị không phải lúc nào cũng đạt được bằng xử lý nhiệt tại nhiệt độ bắt cặp mồi hay trong đệm phản ứng, bởi lẽ nhiệt độ mở xoắn thường là 105ng là 105 o C. Có hai phương pháp khá nhanh và tiện lợi: Một phương pháp xuất phát từ thực tế là glycerol hoặc ethylen glycerol có tác dụng làm giảm nhiệt độ mở xoắn, còn phương pháp thứ 2 là mở xoắn bằng môi trường kiềm. Cả hai phương pháp đều thực hiện đơn giản cho hầu hết các loại ADN khuôn. Đối với hai phương pháp biến tính ADN, nên dùng lượng ADN khuôn ở nồng độ 0.5 pmol (05- 0.3 mg) và lượng primer 2-5 pmpol. Nếu sử dụng thể tích ADN nhỏ hơn thì phải pha đến nồng độ thích hợp bằng nước. Kết quả tốt nhất thu được là theo tỷ lệ phân tử mồi : sợi khuôn là 4 : 1. Tỷ lệ này nên được duy trì khi tiến hành với lượng ADN khuôn khác nhau. Trong mọi trường hợp khi mà số lượng thành phần nào quá ít thì đều dẫn đến băng không rõ ở cuối bản gel. Lượng ADN khuôn cần theo phương pháp này ít hơn so với sử dụng sequenase KIT 2.0 do không bị mất ADN trong bước kết tủa với ethanol. Tác nhân gây biến tính ADN khuôn trong KIT này là đệm 40:50 glycerol và ethylen glycerol. Việc bổ sung đệm này vào dung dịch ADN theo tỷ lệ chỉ dẫn; 40% glycerol sẽ làm giảm nhiệt độ biến tính ADN xuống khoảng 20 o C. Chý ý khi dùng đệm glycerol sẽ gây nên việc di chuyển không đều trên gel điện di tại vùng có khoảng cách 300-400 kể từ đoạn ADN mồi. Nên sử dụng đệm chạy gel hạn chế tác dụng của glycerol (thay taurin cho đệm chạy gel TBE) sẽ khắc phục được điều này. ADN plasmid sẽ biến tính tại bất kỳ nhiệt độ nào ở pH kiềm (pH 13). Điều quan trọng đối với phương pháp này là việc trung hòa bước biến tính kiềm bằng HCL phải được thực hiện một cách chính xác. Như vậy nên dùng một loại pipet cho việc bổ sung kiềm và trung hòa bằng acid HCL sau đó. Nói chung dung dịch NaOH và HCL được chuẩn bị có nồng độ 1M, trong trường hợp dùng hóa chất riêng phải đảm bảo nồng độ chỉ dao động trong khoảng 0,95- 1.05M. Bước gây biến tính kiềm và kết tủa với ethanol cũng có thể được thực hiện với các hóa chất trong KIT nhưng đôi khi cũng không đạt được kết quả mong muốn và cần phải cải tiến. Trong trường hợp giải trình tự với ADN sợi đơn, không phải thực hiện bước biến tính ADN, hỗn dịch được chuẩn bị đơn giản gồm: ADN plasmid, 05 pmol primer, 2 ml đệm phản ứng và bổ sung nước cho đủ 15 ml. Phản ứng tốt sẽ đọc được trình tự dài khoảng 400 bps. Vietsciences- Nguyễn Lân Dũng, Nguyễn Hoài Hà . KIT biến tính nhanh với sequenase. Phương pháp này thích ứng với vi c giải trình tự các plasmid sợi đôi. Bắt đầu bằng vi c gây biến tính trong kiềm (NaOH) hoặc glycerol, sau đó kết tủa. đơn. Vi c giải trình tự gồm hai phản ứng: phản ứng đánh dấu và phản ứng dừng tại điểm cuối. Trong phản ứng đánh dấu các sợi ADN bổ sung được gắn kết với chất đánh dấu phóng xạ trong vi c. hướng dẫn. Điều quan trọng để có kết quả tốt trong vi c giải trình tự ADN là chất lượng cao của ADN plasmid. Trong các khâu chuẩn bị vi c xuất hiện các phân tử đứt gãy sẽ dẫn đến kết quả