Trân trọng cảm ơn sự đóng góp ý kiến chuyên môn có giá trị khoa học và thực tiễn từ Quý thầy cô qua các hội đồng đánh giá để cho luận án ngày càng hoàn thiện và bản thân hàm thụ được nhi
ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Đối tượng và phương pháp nghiên cứu của mục tiêu 1
Xác định thành phần loài, mật độ, tập tính của muỗi Anopheles spp và tỷ lệ
An minimus và An dirus nhiễm Plasmodium spp bằng kỹ thuật sinh học phân tử tại 4 tỉnh Tây Nguyên, 2019-2022
2.1.1 Đối tượng, địa điểm và thời gian nghiên cứu Đối tượng nghiên cứu: Muỗi Anopheles trưởng thành thu thập tại các điểm điều tra và ký sinh trùng Plasmodium spp trong cơ thể muỗi sốt rét
Nghiên cứu được thực hiện từ năm 2019 đến năm 2022 tại các xã, huyện, tỉnh có sốt rét lưu hành phức tạp và kéo dài.
- Chọn điểm nghiên cứu tại tỉnh Kon Tum: xã Ia Dal- huyện Ia H’Drai
- Chọn điểm nghiên cứu tại tỉnh Gia Lai: xã Ia Dom-huyện Đức Cơ, xã Ia O- huyện Ia Grai
- Chọn điểm nghiên cứu tại tỉnh Đắk Lắk: xã Easo-huyện Ea Kar, xã Krông Na- huyện Buôn Đôn
- Chọn điểm nghiên cứu tại tỉnh Đắk Nông: xã Đắk Wil - huyện Cư Jut
Hình 2.1 Địa điểm nghiên cứu các tỉnh Gia Lai,
Kon Tum, Đắk Lắk, Đắk Nông
2.1.2.1 Thiết kế nghiên cứu: Nghiên cứu ngang mô tả Điều tra cắt ngang hai đợt mùa mưa và mùa khô tại các điểm nghiên cứu nhằm xác định thành phần, mật độ loài Anopheles, đặc điểm sinh học và tỷ lệ nhiễm KSTSR tại điểm nghiên cứu
2.1.2.2 Cỡ mẫu, chọn mẫu, bảo quản mẫu
Nghiên cứu định loại hình thái toàn bộ muỗi Anopheles thu thập được, xác định thành phần loài, mật độ và tập tính sinh học tại các điểm khảo sát.
Muỗi được định loại hình thái, bảo quản khô hoặc ngâm cồn 70% trong tube Eppendorf riêng biệt (ghi chú loài, thời gian, địa điểm, phương pháp thu thập), rồi bảo quản ở -85°C tại phòng thí nghiệm để phân tích.
- Xác định thành phần, mật độ và tập tính sinh học muỗi Anopheles tại các điểm nghiên cứu
- Định loại muỗi Anophles bằng phương pháp hình thái và xác định lại chính xác loài các véc tơ chính bằng kỹ thuật sinh học phân tử
- Xác định tỷ lệ muỗi nhiễm KSTSR bằng kỹ thuật ddPCR
2.1.4 Các kỹ thuật sử dụng trong nghiên cứu
2.1.4.1 Kỹ thuật điều tra muỗi Anopheles
Các đợt điều tra muỗi Anopheles được thực hiện tại mỗi điểm nghiên cứu gồm 2 đợt vào mùa mưa (tháng 3-4) và mùa khô (tháng 5-8)
* Số đêm, thời gian thực hiện các phương pháp thu thập mẫu theo quy trình thường quy của TCYTTG (1994) và Viện Sốt rét-KST-CT Trung Ương
Nghiên cứu sử dụng phương pháp bắt muỗi bằng mồi người, tiến hành quan sát trong nhà từ 6 giờ chiều đến 6 giờ sáng, liên tục 4 đêm tại các địa điểm khác nhau.
Nghiên cứu thu hút muỗi sử dụng mồi người được tiến hành trong 4 đêm liên tiếp, từ 6 giờ chiều đến 6 giờ sáng hôm sau, tại các địa điểm khác nhau, với hai điều tra viên ngồi ngoài trời mỗi đêm.
- Bắt muỗi bằng bẫy đèn CDC trong nhà ban đêm: Treo hai bẫy đèn CDC trong nhà từ 18 giờ đến 6 giờ sáng hôm sau trong bốn đêm
- Bắt muỗi bằng bẫy đèn CDC ngoài nhà ban đêm: Treo hai bẫy đèn CDC ngoài nhà từ 18 giờ đến 6 giờ sáng hôm sau trong bốn đêm
- Bắt muỗi bằng bẫy màn gia súc ban đêm: Treo ba bẫy bẫy màn từ 18 giờ đến 6 giờ sáng hôm sau trong bốn đêm
Bắt muỗi Anopheles bằng bẫy đèn trong và ngoài nhà ban đêm
Mục đích: thu thập và cung cấp dẫn liệu về thành phần loài, mật độ và tập tính sinh học của muỗi Anopheles
Thời gian thực hiện từ 18 giờ ngày hôm trước đến 6 giờ sáng hôm sau Cách thực hiện
Bẫy đèn diệt côn trùng hiệu quả nhất khi đặt trong nhà có người ngủ qua đêm Treo hai bẫy đèn ở độ cao 1,5m trong hai nhà như vậy suốt đêm.
Đặt bẫy đèn diệt côn trùng ngoài trời ở nơi kín gió, nhiều cây cối, cách mặt đất 1,5m Treo hai bẫy trên các cành cây thích hợp qua đêm.
Bắt muỗi Anopheles mồi người trong và ngoài nhà ban đêm
Mục đích: thu thập và cung cấp dẫn liệu về thành phần loài, mật độ và tập tính sinh học của muỗi Anopheles
Thu hút muỗi từ 18h hôm trước đến 6h sáng hôm sau bằng cách để chân trần hoặc mặc quần cộc, vén quần trên đầu gối.
Bắt muỗi bằng bẫy màn mồi gia súc
Vị trí đặt bẫy màn: Bẫy màn gia súc làm mồi được đặt ngoài nhà, gần sát với vị trí gia súc thường được giữ ở đó qua đêm
Chọn một con trâu, bò hiền lành trong số trâu, bò của dân địa phương để làm mồi
Trước khi mặt trời lặn, dùng dây thừng cột trâu, bò đã chọn vào chiếc cọc đã đóng cố định xuống đất ở vị trí đặt bẫy
Bẫy muỗi bằng màn lớn trùm lên trâu, bò, cách mặt đất 15-20cm để muỗi bay vào Cố định màn chắc chắn bằng cọc để tránh gió thổi bay.
Nghiên cứu số lượng muỗi đậu màn bằng cách bắt muỗi mỗi giờ, sử dụng đèn pin và ống nghiệm để thu mẫu, phân loại muỗi theo từng thời điểm bắt.
2.1.4.2 Phương pháp định loại muỗi Anopheles bằng hình thái Định loại muỗi trưởng thành dựa vào đặc điểm hình thái bằng cách sử dụng bảng định loại muỗi Anopheles đến loài của Viện Sốt rét-Ký sinh trùng- Côn trùng Trung ương (2008) [114]
2.1.4.3 Kỹ thuật tách chiết DNA tổng số của muỗi Anopheles
Kỹ thuật tách chiết acid nucleic sử dụng bộ kit DNeasy Blood and Tissue của Qiagen, dựa trên nguyên lý hấp phụ qua cột.
Muỗi Anopheles minimus s.l và An dirus s.l trưởng thành được nghiền trong 180ml dung dịch ATL, sau đó bổ sung 20ml Proteinase K để tạo dung dịch đồng nhất.
Đối tượng và phương pháp nghiên cứu của mục tiêu 2
Phân tích các chỉ điểm phân tử kháng thuốc: K 13 , Plasmepsin 2, Plasmepsin
3, Exonulcease, Pfmdr1, Pfcrt trong quần thể Plasmodium falciparum tại điểm nghiên cứu
2.2.1 Đối tượng, địa điểm và thời gian nghiên cứu Đối tượng nghiên cứu:
Nghiên cứu sử dụng mẫu máu khô trên giấy thấm Whatman 3MM từ bệnh nhân sốt rét (P falciparum đơn thuần hoặc phối hợp) tại các vùng dịch tễ bốn tỉnh Tây Nguyên Mẫu được thu thập từ các cơ sở y tế nơi bệnh nhân khám và điều trị.
Thời gian nghiên cứu: Từ năm 2019 đến năm 2022 Địa điểm nghiên cứu:
- Chọn điểm nghiên cứu tại tỉnh Kon Tum: huyện Ia H’Drai
- Chọn điểm nghiên cứu tại tỉnh Gia Lai: huyện Đức Cơ, huyện Ia Grai, huyện Krông Pa, huyện Kông Chro
- Chọn điểm nghiên cứu tại tỉnh Đắk Lắk: huyện Easup, huyện Krông Năng, huyện Ea Kar, huyện Buôn Đôn
- Chọn điểm nghiên cứu tại tỉnh Đắk Nông: huyện Tuy Đức, huyện Cư Jut
2.2.2.1 Thiết kế nghiên cứu: Nghiên cứu mô tả có phân tích
Nghiên cứu sử dụng mẫu máu thuận tiện, bao gồm tất cả các mẫu dương tính với P falciparum thu thập từ các điểm nghiên cứu trong giai đoạn 2019-2022 để đạt mục tiêu 2.
Nghiên cứu thu thập mẫu máu dương tính với P falciparum từ bệnh nhân sốt rét (nhiễm đơn hoặc phối hợp) tại các tỉnh Tây Nguyên Mẫu máu khô trên giấy Whatman 3MM được lấy từ các bệnh nhân tại cộng đồng và cơ sở y tế Việc thu thập mẫu được thực hiện thông qua phát hiện ca bệnh chủ động và thụ động.
Mẫu máu sốt rét nghi ngờ được lấy từ đầu ngón tay (5-7µl/giọt), mỗi bệnh nhân một lam kính soi KSTSR bằng nhuộm Giemsa và một giọt lên giấy Whatman 3MM Mẫu giấy thấm được làm khô, bảo quản riêng biệt trong túi nilon có chất chống ẩm, rồi chuyển về phòng lab xét nghiệm sinh học phân tử.
- Sàng lọc các mẫu nhiễm đơn P falciparum và nhiễm phối hợp có P falciparum qua kết quả soi lam phát hiện KSTSR
- Thẩm định lại mẫu dương tính với P falciparum bằng kỹ thuật Nested
- Xác định đột biến trên gen K13 liên quan kháng artemisinin của P falciparum
- Xác định biến thể đa hình gen Plasmepsin 2 và đột biến ExoE415G liên quan kháng piperaquine của P falciparum
- Xác định đột biến trên gen Pfcrt liên quan kháng cloroquine của P falciparum
- Xác định biến thể đa hình gen Pfmdr1 liên quan kháng mefloquine của P falciparum
2.2.4 Các kỹ thuật sử dụng trong nghiên cứu
2.2.4.1 Kỹ thuật tách chiết DNA tổng số
Nguyên lý kỹ thuật tách chiết acid nucleic
Acid nucleic được tách chiết bằng bộ tách chiết DNeasy blood and tissue của Qiagen được trên nguyên lý hấp phụ qua cột trong tách chiết
DNA của KSTSR được chiết tách bằng bộ kit QIAamp DNA Extraction (QIAGEN) Quy trình gồm: ủ mẫu máu với dung dịch ATL, proteinase-K ở 56°C; thêm dung dịch AL và RNase A, ủ ở 70°C; thêm ethanol 96-100%; ly tâm hỗn dịch qua cột lọc QIAamp spin Column.
Sau khi loại bỏ dung dịch thừa (1 phút), DNA được rửa sạch bằng dung dịch AW1 và AW2, rồi giải phóng bằng 100ml dung dịch AE và bảo quản ở -20°C.
2.2.4.2 Kỹ thuật PCR xác định chủng loại KSTSR
Nghiên cứu sử dụng DNA từ mẫu giấy thấm sau tách chiết làm khuôn cho phản ứng nested PCR nhằm xác định KSTSR Phản ứng outer-PCR khuếch đại đoạn gen ~1,2kb của KSTSR, trong khi nested-PCR khuếch đại đoạn gen đặc trưng từng loài gây bệnh Các cặp mồi P5-P6; FF-FR; VF-VR; MF-MR; OF-OR được sử dụng Xác định loài Plasmodium spp tuân theo quy trình của TCYTTG.
Phản ứng khuếch đại Nested PCR được thực hiện qua 2 giai đoạn:
Hình 2.5 minh họa sơ đồ phản ứng nested-PCR gen 18S xác định 4 loài KSTSR Phản ứng outer PCR sử dụng cặp mồi PLU5 và PLU6 khuyếch đại đoạn DNA Plasmodium (~1200bp) trong ống eppendorf 0,2ml, với chu trình nhiệt: 95°C (5 phút, 1 chu kỳ); 94°C (45 giây), 55°C (1 phút), 72°C (1 phút 30 giây) x 35 chu kỳ Sản phẩm PCR được bảo quản ở 4°C.
Nested PCR: Sản phẩm outer PCR được dùng để khuếch đại bằng các cặp mồi
FF-FR; VF-VR; MF-MR và OF-OR để xác định 4 loại KSTSR tương ứng P
Trình tự Kích thước sản phẩm PCR
PLU5 CCT GTT GTT GCC TTA AAC TTC
≈ 1,2 kb PLU6 TTA AAA TTG TTG CAG TTA AAA CG
FF TTA AAC TGG TTT GGG AAA ACC AAA TAT ATT
FR ACA CAA TGA ACT CAA TCA TGA CTA CCC GTC
VF CGC TTC TAG CTT AAT CCA CAT AAC TGA TAC
VR ACT TCC AAG CCG AAG CAA AGA AAG TCC TTA
MF ATA ACA TAG TTG TAC GTT AAG AAT AAC CGC
MR AAA ATT CCC ATG CAT AAA AAA TTA TAC AAA
OF ATC TCT TTT GCT ATT TTT TAG TAT TGG AGA
OR GGA AAA GGA CAC ATT AAT TGT ATC CTA GTG falciparum, P vivax, P malariae, P ovale Chu trình nhiệt cho phản ứng PCR
95 o C trong 5 phút gồm 1 chu kỳ, 94 o C trong 45 giây, 58 o C trong 1 phút 35 giây,
PCR được thực hiện với 72°C trong 1 phút, lặp lại 35 chu kỳ Sản phẩm PCR sau đó được điện di trên gel agarose 1,8%, nhuộm Eco dye 10 phút và chụp ảnh dưới đèn UV.
Phân tích kết quả trên máy đọc UV:
- Mẫu đối chứng âm không có băng điện di
- Mẫu đối chứng dương có các băng điện di đặc hiệu tương ứng với kích thước: P falciparum: 205bp, P vivax: 120bp, P malariae: 144bp, P ovale:
2.2.4.3 Kỹ thuật PCR - giải trình tự phát hiện đột biến điểm trên gen K 13
Mẫu bệnh phẩm xác định nhiễm đơn thuần hoặc phối hợp Plasmodium falciparum sẽ được xét nghiệm nested-PCR để khuếch đại vùng gen mã hóa K13 propeller Phản ứng sử dụng hai cặp mồi đặc hiệu trên vùng gen này [89].
Sử dụng cặp mồi K13_PCR_F và K13_PCR_R, phản ứng PCR khuếch đại đoạn gen K13 propeller (khoảng 2kb) của P falciparum trong ống eppendorf 0,2ml.
Chu trình nhiệt cho phản ứng outer : 94 o C trong 5 phút gồm 1 chu kỳ, 94 o C trong 30 giây, 55 o C trong 1 phút, 72 o C trong 1phút 30 giây quá trình lặp lại gồm
30 chu kỳ, giai đoạn kéo dài 72 o C trong 4 phút Sản phẩm PCR được bảo quản ở
Nested-PCR:Sản phẩm outer-PCR được dùng để khuếch đại bằng các cặp mồi
K13-N1-F và K13-N1-R để thu nhận vùng gen K 13 propeller P falciparum
Phản ứng nested-PCR sử dụng chu trình nhiệt: 94°C (2 phút, 1 chu kỳ); 94°C (30 giây), 55°C (30 giây), 72°C (1 phút, 35 chu kỳ); 72°C (4 phút) Sản phẩm được bảo quản ở 4°C và điện di trên gel agarose 1,5%, nhuộm Eco dye (10 phút) trước khi chụp ảnh dưới đèn UV.
Phân tích kết quả trên máy đọc UV:
- Mẫu đối chứng âm không có băng điện di
- Mẫu đối chứng dương là chủng chuẩn nuôi cấy trong phòng thí nghiệm
PF3D7 có các băng điện di đặc hiệu với kích thước thang đo tương ứng của đoạn gen K13 là 850bp
Quy trình giải trình tự phát hiện đột biến điểm trên gen K 13
Sản phẩm PCR được tinh sạch bằng bộ QIAquick PCR purification kit, xác định nồng độ DNA rồi pha loãng đến 5-20ng Mồi nested-PCR gen K13 (K13_PCR_F và K13_PCR_R) được sử dụng cho phản ứng giải trình tự.
Phản ứng PCR-giải trình tự : được thực hiện riêng rẽ với mồi xuôi và mồi ngược sử dụng bộ kit Big dye với thành phần như sau:
Primer ( 3,2pmol-5pmol/ àL) 1àL
DNA template ( 30-50ng/ àL) 1àL
Chu trình nhiệt : 96 o C trong 1 phút gồm 1 chu kỳ, 96 o C trong 10 giây, 50 o C trong 5 giây, 60 o C trong 4 phút quá trình lặp lại gồm 25 chu kỳ Sản phẩm PCR được bảo quản ở 4 o C
Bài báo cáo trình tự gen sử dụng bộ kit BigDye XTerminator để tinh sạch sản phẩm, điện di trên hệ thống ABI 3500 và phân tích kết quả thu được.
Trình tự nucleotide được kiểm tra chất lượng bằng phần mềm SeqA 7 trên hệ thống ABI 3500 và xác thực bằng chương trình BLAST trên ngân hàng gen.
- Ứng dụng các phần mềm Sinh tin như Geneious R8, dữ liệu gen trên Genbank để phân tích các trình tự nucleotide thu được của gen K13 propeller của
2.2.4.4 Kỹ thuật thực hiện PCR - giải trình tự phát hiện đột biến điểm trên gen exonuclease liên quan đến kháng piperaquine phosphate
Phân tích và xử lý số liệu
- Số liệu thu thập được ghi vào các biểu mẫu đã thiết kế sẵn trong form;
Bài viết hướng dẫn phân tích dữ liệu bằng Excel 2013, bao gồm tính toán tần số phần trăm, mật độ trung bình sử dụng phương pháp thống kê sinh học, và xác định số bản sao của biến thể đa hình.
Trình tự nucleotide được kiểm tra chất lượng bằng phần mềm trên hệ thống ABI 3500 và xác nhận bằng BLAST trên ngân hàng gen.
- Ứng dụng các phần mềm Sinh tin như Geneious R8, dữ liệu gen trên Genbank để phân tích các trình tự nucleotide các gen kháng thuốc của P.falciparum
- Ứng dụng phần mềm R vẽ bản đồ phân bố các gen kháng thuốc.
Kiểm soát sai lệch chọn lựa các dữ liệu và khắc phục sai số
- Kiểm soát sai lệch từ nguồn thông tin từ cán bộ nghiên cứu phỏng vấn trực tiếp hay từ bệnh nhân được lấy mẫu và phỏng vấn;
Người phỏng vấn được đào tạo bài bản về quy trình, câu hỏi phỏng vấn, kỹ năng giao tiếp, khai thác thông tin và bảo mật dữ liệu cá nhân.
Để giảm thiểu sai số, toàn bộ thành viên tham gia thu thập dữ liệu đã được tập huấn kỹ lưỡng về quy trình chuẩn (SOPs) trước khi triển khai.
- Hạn chế sai số khi phỏng vấn, thống nhất ghi chép chỉ số theo phiếu soạn sẵn;
Nghiên cứu tuân thủ nghiêm ngặt quy trình xét nghiệm chuẩn, đáp ứng đầy đủ các quy định của Bộ Y tế và Tổ chức Y tế Thế giới.
Để đảm bảo độ chính xác, các máy xét nghiệm sinh học phân tử cần được hiệu chuẩn, đồng thời duy trì sử dụng cùng loại hóa chất và vật tư tiêu hao trong suốt quá trình nghiên cứu.
- Đảm bảo tính trung thực trong quá trình nghiên cứu từ các cán bộ tham gia.
Khía cạnh đạo đức trong nghiên cứu
2.5.1 Sự chấp thuận của Hội đồng Khoa học và Đạo đức Y sinh
- Đề cương luận án được thông qua Hội đồng phê duyệt đề cương và Hội đồng Đạo đức Y sinh của Viện Sốt rét-KST-CT Trung ương;
Đề cương nghiên cứu đã được Hội đồng Khoa học và Hội đồng Đạo đức Y sinh Viện Sốt rét-KST-CT Quy Nhơn phê duyệt trước khi thực hiện.
- Tất cả thời điểm, tính an toàn, quyền lợi phải luôn đảm bảo cho bệnh nhân;
- Bất kỳ sự thay đổi nào trong đề cương phải xin ý kiến chấp thuận của các Hội đồng Khoa học và Đạo đức Y sinh trước khi thay đổi;
Các nhà nghiên cứu phải tuân thủ đầy đủ các đánh giá của Hội đồng Đạo đức Y sinh học để đảm bảo quá trình nghiên cứu được thực hiện một cách phù hợp.
- Những người tham gia điều tra muỗi truyền bệnh sốt rét bằng phương pháp mồi muỗi đều được giải thích và tự nguyện tham gia vào nghiên cứu;
Nghiên cứu cung cấp dữ liệu về tình hình véc tơ sốt rét, hỗ trợ xây dựng biện pháp phòng chống hiệu quả, tối ưu nguồn lực tại từng địa phương.
2.5.2 Cam kết tham gia nghiên cứu
- Đối tượng nghiên cứu là bệnh nhân hoặc người nhà, người giám hộ đồng ý, chấp thuận khi nghe rõ quyền lợi và trách nhiệm khi tham gia nghiên cứu;
- Tất cả câu hỏi của bệnh nhân đều phải được nhóm nghiên cứu trả lời cụ thể;
- Giải thích về lợi ích, quyền lợi và cả nguy cơ có thể xảy ra sau khi thăm khám, xét nghiệm với các dụng cụ xét nghiệm tối thiểu
2.5.3 Thực hiện đúng với Thực hành lâm sàng tốt
Các nghiên cứu viên tham gia bắt buộc phải hoàn thành khóa tập huấn thực hành lâm sàng tốt (GCPs) do Bộ Y tế hoặc Đơn vị Nghiên cứu lâm sàng Đại học Oxford cấp.
- Tất cả quy định ở địa phương được tuân thủ, nhất là đối với những quy chế có ảnh hưởng lớn hơn về an toàn của đối tượng tham gia
2.5.4 Cam kết tham gia nghiên cứu thông qua ký bản chấp thuận
- Đối tượng tham gia hoặc người nhà đồng ý ký vào mẫu đơn chấp thuận trước khi tham gia nghiên cứu;
- Tất cả câu hỏi của đối tượng tham gia hoặc thân nhân đã được nhóm nghiên cứu trả lời rõ ràng, cụ thể;
- Nghiên cứu viên chính phải ghi nhận tất cả mọi đồng ý của trẻ và kèm theo chấp thuận của người giám hộ hoặc cha mẹ;
- Giải thích về lợi ích, quyền lợi và cả nguy cơ có thể xảy ra khi tham gia;
- Viết cam kết với đối tượng tham gia hoặc thân nhân;
- Nếu đối tượng nghiên cứu không biết chữ có thể nhờ một người địa phương hoặc CBYT làm chứng
2.5.5 Bảo mật thông tin và số liệu
- Tất cả thông tin liên quan đến đối tượng nghiên cứu sẽ được bảo mật và chỉ chia sẻ với các thành viên trong nhóm nghiên cứu;
- Trưởng nhóm nghiên cứu phải đảm bảo cất giữ tài liệu nguồn, hồ sơ giấy tờ liên quan và sản phẩm nghiên cứu được giữ cẩn trọng;
- Nếu có vấn đề y tế khác không liên quan, nghiên cứu viên chính có trách nhiệm tư vấn, khuyên bệnh nhân trong khả năng tốt nhất.
KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
Kết quả xác định thành phần loài, mật độ, tập tính của muỗi Anopheles spp và tỷ lệ An minimus và An dirus nhiễm Plasmodium spp bằng kỹ thuật sinh học phân tử tại 4 tỉnh Tây Nguyên, 2019-2022
3.1.1 Thành phần loài muỗi Anopheles tại các điểm nghiên cứu
Nghiên cứu xác định 15 loài muỗi Anopheles thuộc hai phân giống, dựa trên phân loại hình thái học của các mẫu muỗi trưởng thành thu thập được từ thực địa.
Anopheles Meigen, 1818 (4 loài) và phân giống Cellia Theobald, 1902 (11 loài) Bảng 3.1 Số lượng Anopheles tại các điểm nghiên cứu bằng định loại hình thái
TT Tên loài Địa điểm nghiên cứu
Gia Lai Đắk Lắk Đắk Nông
1 An (Cell.) dirus Peyton & Harrison,1979 89 0 157 141 387
6 An (Ano.) barbirostris Van der Wulp, 1884 38 95 22 263 418
Ghi chú: Cell.: Cellia; Ano.: Anopheles
Nghiên cứu tại Kon Tum ghi nhận 13 loài muỗi Anopheles, trong đó 4 loài là véc tơ sốt rét chính và phụ ở vùng rừng núi, gồm 2 véc tơ chính An dirus và An minimus, cùng 2 véc tơ phụ An aconitus và…
Tại Gia Lai, trong 14 loài Anopheles thu thập được, có 3 loài là véc tơ sốt rét (An minimus - chính; An aconitus và An maculatus - phụ) Tương tự, tại Đắk Lắk, 3 trong 13 loài Anopheles thu thập được là véc tơ sốt rét (An dirus - chính; An aconitus và An maculatus - phụ).
Nghiên cứu tại Đắk Nông ghi nhận 12 loài muỗi Anopheles, bao gồm 4 loài truyền sốt rét chính và phụ ở vùng rừng núi: An dirus, An minimus (véc tơ chính) và An aconitus, An maculatus (véc tơ phụ).
Tổng số cá thể muỗi thu thập được trong nghiên cứu gồm 6957 cá thể, nhiều nhất là An maculatus với 1153 cá thể (16,57%), tiếp theo là An jamesi
(997 cá thể), An aconitus (922 cá thể) và ít nhất là An.vannularis (16 cá thể)
Số cá thể muỗi và các phương pháp thu thập của từng điểm nghiên cứu được thể hiện qua các kết quả dưới đây
Bảng 3.2 Số lượng các loài muỗi Anopheles thu thập tại Ia H’Drai - Kon Tum
TT Thành phần loài BĐTN BĐNN MNTN MNNN BMGS TỔNG
Ghi chú: BĐTN: Bẫy đèn trong nhà; BĐNN: Bẫy đèn ngoài nhà;MNTN: Mồi người trong nhà; MNNN: Mồi người ngoài nhà; BMGS: Bẫy màn gia súc
Tại Kon Tum, thu thập được 13 loài Anopheles với 1191 cá thể muỗi cái trưởng thành Trong đó, loài An aconitus thu thập được số lượng cá thể nhiều nhất
Nghiên cứu ghi nhận sự đa dạng về loài muỗi, với loài nhiều nhất chiếm 22,33% (266 cá thể) và loài ít nhất chỉ 0,76% (9 cá thể) Điểm nghiên cứu này phát hiện cả hai loài muỗi truyền bệnh sốt rét chính.
An dirus (89 cá thể, chiếm tỷ lệ 7,47%) và An minimus (117 cá thể, chiếm tỷ lệ
Bảng 3.3 Số lượng các loài muỗi Anopheles thu thập tại Ia Dom (Đức Cơ-Gia Lai)
TT Thành phần loài BĐTN BĐNN MNTN MNNN BMGS TỔNG
Ghi chú: BĐTN: Bẫy đèn trong nhà; BĐNN: Bẫy đèn ngoài nhà;MNTN: Mồi người trong nhà; MNNN: Mồi người ngoài nhà; BMGS: Bẫy màn gia súc
Nghiên cứu tại Ia Dom (Gia Lai) thu thập 14 loài muỗi Anopheles (1918 cá thể cái trưởng thành), với An jamesi chiếm số lượng nhiều nhất (523 cá thể, 27,27%), An annularis và An vagus thấp nhất (7 cá thể, 0,36%) Véc tơ sốt rét chính là An minimus (199 cá thể, 10,36%), cùng hai véc tơ phụ An aconitus (231 cá thể, 12,04%) và An maculatus (264 cá thể).
Bảng 3.4 Số lượng các loài muỗi Anopheles thu thập tại Ia O (Ia Grai-Gia Lai)
TT Thành phần loài BĐTN BĐNN MNTN MNNN BMGS TỔNG
Ghi chú: BĐTN: Bẫy đèn trong nhà; BĐNN: Bẫy đèn ngoài nhà;MNTN: Mồi người trong nhà; MNNN: Mồi người ngoài nhà; BMGS: Bẫy màn gia súc
Nghiên cứu tại Ia O (Ia Grai, Gia Lai) thu thập 435 muỗi Anopheles cái trưởng thành thuộc 10 loài An splendidus chiếm đa số (122 cá thể, 28,05%), trong khi An vagus ít nhất (5 cá thể, 1,15%) Không phát hiện véc tơ sốt rét chính, chỉ ghi nhận 2 véc tơ phụ là An aconitus (62 cá thể, 14,25%) và An maculatus (81 cá thể, 18,62%).
Bảng 3.5 Số lượng các loài muỗi Anopheles thu thập tại Ea Sô
TT Thành phần loài BĐTN BĐNN MNTN MNNN BMGS TỔNG
Ghi chú: BĐTN: Bẫy đèn trong nhà; BĐNN: Bẫy đèn ngoài nhà;MNTN: Mồi người trong nhà; MNNN: Mồi người ngoài nhà; BMGS: Bẫy màn gia súc
Nghiên cứu tại Ea Sô, Ea Kar, Đắk Lắk thu thập 449 muỗi Anopheles cái trưởng thành thuộc 8 loài An aconitus chiếm đa số (114 cá thể, 25,39%), trong khi An crawfordi ít nhất (12 cá thể, 2,67%) Véc tơ sốt rét chính, An dirus, được tìm thấy với 64 cá thể (14,25%).
Bảng 3.6 Số lượng loài muỗi Anopheles thu thập tại Krông Na
TT Thành phần loài BĐTN BĐNN MNTN MNNN BMGS TỔNG
Ghi chú: BĐTN: Bẫy đèn trong nhà; BĐNN: Bẫy đèn ngoài nhà;MNTN: Mồi người trong nhà; MNNN: Mồi người ngoài nhà; BMGS: Bẫy màn gia súc
Tại Krông Na (Buôn Đôn-Đắk Lắk), thu thập được 13 loài Anopheles với
Nghiên cứu thu thập được 1020 muỗi cái trưởng thành, trong đó *Anopheles maculatus* chiếm số lượng nhiều nhất (259 cá thể, 25,39%), *Anopheles varuna* ít nhất (10 cá thể, 0,98%) Vecto chính gây sốt rét là *An dirus* (93 cá thể, 9,12%), hai vecto phụ là *An aconitus* (170 cá thể, 16,67%) và *An maculatus* (259 cá thể, 25,39%).
Bảng 3.7 Số loài muỗi Anopheles thu thập tại Đắk Wil (Cư Jut- Đắk Nông)
TT Thành phần loài BĐTN BĐNN MNTN MNNN BMGS TỔNG
Ghi chú: BĐTN: Bẫy đèn trong nhà; BĐNN: Bẫy đèn ngoài nhà;MNTN: Mồi người trong nhà; MNNN: Mồi người ngoài nhà; BMGS: Bẫy màn gia súc
Tại Đắk Wil (Cư Jut- Đắk Nông), thu thập được 12 loài Anopheles với
Năm 1936, người ta thu thập được 1936 muỗi cái trưởng thành Loài Anopheles maculatus chiếm tỷ lệ cao nhất (15,65%, 303 cá thể), trong khi loài muỗi khác có số lượng thấp nhất.
Tại điểm nghiên cứu, ghi nhận 141 cá thể Anopheles dirus (7,23%) và 12 cá thể Anopheles minimus (0,62%), đại diện cho hai véc tơ chính gây sốt rét.
(12 cá thể, chiếm tỷ lệ 0,62%) Ngoài ra ra còn thu thập được hai véc tơ phụ An maculatus và An aconitus
Nghiên cứu tại bốn tỉnh Tây Nguyên (Kon Tum, Gia Lai, Đắk Lắk, Đắk Nông) phát hiện 15 loài muỗi Anopheles, trong đó có các véc tơ sốt rét chính (An dirus, An minimus) và phụ (An maculatus, An aconitus) Tổng cộng thu được 6957 muỗi cái trưởng thành, với An maculatus chiếm đa số (1153 cá thể, 16,57%), cùng 715 véc tơ sốt rét chính.
Nông, trong đó tại Kon Tum và Đắk Nông có mặt cả 2 véc tơ chính là, các tỉnh còn lại chỉ thu thập An dirus hoặc An minimus
3.1.2 Mật độ và tập tính hoạt động đốt người Anopheles tại các điểm nghiên cứu 3.1.2.1 Mật độ của muỗi Anopheles thu thập tại các điểm nghiên cứu
Tại 4 tỉnh nghiên cứu ở Khu vực Tây Nguyên, đã xác định được 15 loài
Anopheles dirus và An minimus là hai véc tơ chính truyền sốt rét ở Tây Nguyên, ngoài ra còn có các véc tơ phụ An maculatus và An aconitus.
Nghiên cứu sử dụng các phương pháp thu thập muỗi trưởng thành gồm bẫy đèn (trong nhà và ngoài trời), mồi người (trong nhà và ngoài trời) và bẫy màn gia súc tại các điểm nghiên cứu Kết quả phân tích chỉ số thu thập được từ các phương pháp này được trình bày tiếp theo.
Bảng 3.8 Mật độ muỗi Anopheles qua các đợt điều tra tại Ia H’Drai-Kon Tum
TT Thành phần loài BĐTN c/đ/đ BĐNN c/đ/đ
Bài viết phân tích hiệu quả của các phương pháp diệt muỗi: bẫy đèn trong nhà (BĐTN), bẫy đèn ngoài nhà (BĐNN), mồi người trong nhà (MNTN), mồi người ngoài nhà (MNNN), và bẫy màn gia súc (BMGS), dựa trên số lượng con muỗi bắt được mỗi đêm (c/đ/đ), số người bị muỗi đốt mỗi đêm (c/ng/đ) và số con muỗi mắc bẫy màn mỗi đêm (c/m/đ).
Qua các phương pháp điều tra thu thập muỗi Anopheles tại Ia H’Drai-
Phân tích các chỉ điểm phân tử kháng thuốc K 13 , plasmepsin 2, exonulcease, Pfmdr1, Pfcrt trong quần thể Plasmodium falciparum tại điểm nghiên cứu
3.2.1 Xác định loài ký sinh trùng Plasmodium spp của các mẫu nghiên cứu
Nghiên cứu thu thập 562 mẫu máu khô trên giấy Whatman 3MM từ bệnh nhân sốt rét, bao gồm cả trường hợp nhiễm đơn loài *P falciparum* và nhiễm phối hợp có *P falciparum*.
Từ năm 2019 đến 2021, 562 mẫu giấy thấm được thu thập tại các vùng sốt rét và cơ sở y tế thuộc bốn tỉnh Tây Nguyên: Kon Tum (23 mẫu), Gia Lai (251 mẫu), Đắk Lắk (162 mẫu) và Đắk Nông (126 mẫu).
Mẫu máu giấy thấm chất lượng cao (không mốc, thể tích 5-7µl/giọt, thấm đều hai mặt hoặc đường kính >6mm) được sử dụng Các mẫu dương tính KSTSR được tách chiết DNA và định loài lại bằng kỹ thuật nested-PCR Kết quả định loài Plasmodium spp được thể hiện ở Hình 3.10 và Bảng 3.22.
Hình 3.10 Kết quả điện di định loài các mẫu P falciparum
Ghi chú: (-); chứng âm; 1: chứng dương P falciparum với kích thước 205 bp; 2-11: mẫu dương tính với P falciparum; M: thang chuẩn là ladder 100bp
Kết quả điện di cho thấy tất cả mẫu dùng trong nghiên cứu có kích thước đúng như mong muốn, cụ thể mẫu P falciparum có kích thước 205bp
Bảng 3.22 Kết quả xác định các mẫu máu nhiễm P falciparum
Thời gian Địa điểm nghiên cứu Tổng cộng
(n = 562) Kon Tum Gia Lai Đắk Lắk Đắk Nông
Kết quả PCR xác định loài ký sinh trùng sốt rét *Plasmodium falciparum* khớp hoàn toàn với kết quả nhuộm Giemsa soi kính hiển vi.
Bài báo trình bày bản đồ phân bố thời gian và địa điểm thu thập mẫu ký sinh trùng sốt rét Plasmodium falciparum (Hình 3.11), kết quả xác định đột biến điểm trên gen mã hóa K13 của P falciparum, bao gồm cả quá trình nhân bản và giải trình tự gen này.
Sau khi xác định mẫu là *P falciparum*, PCR sẽ được tiến hành để khuếch đại gen mã hóa vùng K13 (khoảng 850bp), dựa trên kết quả định loài Plasmodium spp trước đó.
Năm 2019-2021, 562 mẫu được dùng để thu nhận gen mã hóa K13 Phản ứng PCR thành công cho sản phẩm có độ dài 850bp (Hình 3.12).
Hình 3.12 Điện di sản phẩm nested PCR nhân bản gen K 13 của P falciparum
Ghi chú: (-): chứng âm; (+): chứng dương gen K 13 của P falciparum, 850bp; giếng 11-28: sản phẩm điện di gen K 13 P falciparum, 850bp; M: thang chuẩn
Điện di các mẫu *P falciparum* cho kết quả 850bp, khớp với kích thước gen K13 dự đoán, xác nhận thành công việc nhân bản gen mục tiêu.
Gen K13 của P falciparum được khuếch đại bằng PCR, giải trình tự trên hệ thống ABI, và xác thực bằng BLAST Các trình tự nucleotide thu được từ các chủng P falciparum khác nhau sẽ được phân tích so sánh, bao gồm so sánh với các trình tự K13 propeller đã biết.
Nghiên cứu sử dụng trình tự gen K13 hoàn chỉnh của chủng *P falciparum* N32 (gil|921028236|gb|KT328132.1) và trình tự gen K13 propeller hoang dại (Ariey và cộng sự, 2014) làm đối chứng Kết quả phân tích đột biến trên vùng gen K13 được minh họa ở Hình 3.13 Dữ liệu phân tích dựa trên 21-29 chủng *P falciparum* đã được công bố trên ngân hàng gen.
Hình 3.13 Kết quả phân tích trình tự phát hiện các đột biến trên vùng gen K 13 3.2.2.2 Phân tích đột biến điểm trên gen K 13 tại điểm nghiên cứu
Tổng số 562 mẫu P falciparum tại các điểm nghiên cứu, trong đó tại Kon
Phân tích 23 mẫu Tuyên Quang, 251 mẫu Gia Lai, 162 mẫu Đắk Lắk và 126 mẫu Đắk Nông ghi nhận 4 đột biến gen K13: R539T, C580Y, I446F và A578S Số lượng và tỷ lệ các đột biến này được tổng hợp trong Bảng 3.23 và Hình 3.14.
Bảng 3.23 Số lượng và tỷ lệ các đột biến trên gen K 13 tại các điểm nghiên cứu
Thời gian Đột biến gen K 13 Địa điểm thu thập mẫu nghiên cứu
Gia Lai (N = 251) Đắk Lắk (N = 162) Đắk Nông (N = 126)
Năm 2019, tại Kon Tum ghi nhận 23 mẫu *P falciparum*, trong đó phát hiện hai đột biến C580Y (30,43%) và R539T (8,70%) Việc thu mẫu bị gián đoạn từ năm 2020 đến 2021.
Tại Gia Lai, qua phân tích đột biến trên vùng gen K 13 propeller trên 251 mẫu phân lập P falciparum thì thấy đột biến C580Y chiểm đa số với tỷ lệ là
88,45% và có 1 mẫu xuất hiện đột biến A578S chiếm tỷ lệ 0,4% Số mẫu 251 thu được tại Gia Lai trong khoảng thời gian từ giai đoạn 2019-2021, trong đó năm
2019 thu được 86 mẫu, năm 2020 là 89 mẫu và năm 2021 thu được 76 mẫu; theo đó tỷ lệ đột biến C580Y trong năm 2019 là 69,77 , năm 2020 là 98,88 và năm
Nghiên cứu tại Đắk Lắk (2019-2021) cho thấy đột biến C580Y xuất hiện ở 87,4% trong 162 mẫu, đột biến R539T ở 0,62% (2020: 2,1%) Tại Đắk Nông (2019), 126 mẫu cho thấy đột biến C580Y (87,3%), R539T (0,79%) và I446F (16,67%) Tỷ lệ đột biến C580Y ở Đắk Lắk theo từng năm rất cao: 87,95% (2019), 77,08% (2020), và 100% (2021).
2020, trong đó năm 2019 thu được 44 mẫu và 82 mẫu thu được trong năm 2020; theo đó, số mẫu phát hiện đột biến C580Y có tỷ lệ theo năm lần lượt là 79,55% và 100%
Hình 3.14 Bản đồ phân bố các đột biến gen K 13 propeller tại điểm nghiên cứu
Nghiên cứu tại Đắk Nông phát hiện hai đột biến R539T (1,3%) và F446I (25,6% năm 2020, 21/82 mẫu) trong nhóm mẫu Đột biến F446I có tỷ lệ đáng chú ý.
Đột biến C580Y có tỷ lệ cao (88,45%, 87,04%, 87,3%) ở Gia Lai, Đắk Lắk, Đắk Nông, thấp hơn ở Kon Tum (30,43%) Đắk Nông ghi nhận đột biến mới F446I (16,67%) cùng tỷ lệ nhỏ đột biến R539T và A578S.
3.2.3 Kết quả xác định biến thể đa hình gen Plasmepsin 2 của P falciparum 3.2.3.1 Kết quả phát hiện gen Plasmepsin 2 bằng kỹ thuật Realtime-PCR
Các mẫu P falciparum được giám định bằng kỹ thuật nested-PCR, sau đó được dùng để phân tích gen plasmepsin bằng kỹ thuật realtime-PCR sử dụng probe
BÀN LUẬN
Xác định thành phần loài, mật độ, tập tính của muỗi Anopheles spp và tỷ lệ An minimus và An dirus nhiễm Plasmodium spp bằng kỹ thuật sinh học phân tử tại 4 tỉnh Tây Nguyên, 2019-2022
tỷ lệ An minimus và An dirus nhiễm Plasmodium spp bằng kỹ thuật sinh học phân tử tại 4 tỉnh Tây Nguyên, 2019-2022
4.1.1 Thành phần loài muỗi Anopheles tại các điểm nghiên cứu
Trong thời gian (2019-2022), nghiên cứu được thực hiện tại 4 tỉnh Tây Nguyên gồm Kon Tum, Gia Lai, Đắk Lắk và Đắk Nông Trong số loài
Kon Tum ghi nhận 13 loài muỗi Anopheles, trong đó 4 loài là véc tơ sốt rét chính và phụ ở vùng rừng núi: An dirus và An minimus (véc tơ chính), An aconitus và An maculatus (véc tơ phụ).
Nghiên cứu tại Gia Lai ghi nhận 14 loài muỗi Anopheles, trong đó 3 loài là véc tơ truyền sốt rét chính và phụ ở vùng rừng núi: Anopheles minimus (véc tơ chính) và Anopheles aconitus, Anopheles maculatus (véc tơ phụ).
Trong 13 loài muỗi Anopheles thu thập được tại Lắk, 3 loài là véc tơ chính và phụ truyền sốt rét ở vùng rừng núi, bao gồm 1 loài véc tơ chính.
Đắk Nông ghi nhận 12 loài Anopheles, trong đó có 4 loài là véc tơ chính và phụ của sốt rét vùng rừng núi: An dirus, An minimus (véc tơ chính) và An aconitus, An maculatus (véc tơ phụ).
Gia Lai ghi nhận 14 loài muỗi Anopheles, cao nhất trong 4 tỉnh được khảo sát Do đặc điểm địa hình đồi núi và rừng tương đồng giữa 4 tỉnh Tây Nguyên, nên thành phần loài muỗi Anopheles và các véc tơ sốt rét cũng có sự giống nhau.
Nghiên cứu thu thập 6957 cá thể muỗi, xác định 15 loài Anopheles (4 loài thuộc phân giống Anopheles Meigen, 1818 và 11 loài thuộc phân giống Cellia Theobald, 1902) Kết quả này thấp hơn so với số loài ghi nhận trước đây ở Tây Nguyên (38-39 loài) [Nguyễn Đức Mạnh, 1988; Trương Văn Có, 1996], và thiếu các loài muỗi phân bố ở rừng sâu, núi cao Một số loài như An pampanai hiếm gặp ở Tây Nguyên cũng không được tìm thấy.
Thành phần loài muỗi Anopheles ở Trung-Tây Nguyên và cả nước đa dạng, thay đổi đáng kể theo vùng, sinh cảnh, mùa vụ, vật chủ và thời gian nghiên cứu.
Miền Trung-Tây Nguyên (1998) ghi nhận 48 loài muỗi Anopheles, với 2 loài chính gây sốt rét là An dirus và An minimus, cùng 3 loài phụ là An aconitus, An maculatus và An jeyporiensis Nghiên cứu tập trung vào muỗi Anopheles ở khu vực Tây Nguyên.
Các nghiên cứu về loài muỗi Anopheles tại Việt Nam ghi nhận sự đa dạng loài đáng kể: 14 loài ở khu bảo tồn thiên nhiên Đắk Hà - Kon Tum, 17 loài ở vườn quốc gia Yok Đôn, 15 loài ở Đắk Lắk, 17 loài ở Phú Yên, 15 loài ở Gia Lai, và 30 loài ở một số khu vực miền Bắc (Nguyễn Xuân Quang (2011, 2015); Vũ Đức Chính và cộng sự (2006)).
Nghiên cứu của Lê Thành Đồng và cộng sự (2015) về phân bố véc tơ sốt rét tại Nam Bộ - Lâm Đồng (2003-2013) ghi nhận 42 loài Anopheles, với An epiroticus chiếm tỷ lệ cao nhất (47,2%).
Hồ Đình Trung và cộng sự (2005) [119] cho biết, Việt Nam có 59 loài
Việt Nam có 62 loài muỗi Anophelinae, trong đó 15 loài được xác định là vectơ chính, phụ hoặc nghi ngờ truyền bệnh sốt rét (theo Bảng định loại muỗi Anophelinae ở Việt Nam năm 2008, Viện Sốt rét-KST-CT Trung ương).
Việt Nam [114]; Tài liệu “Danh mục các loài muỗi ở Việt Nam” của Nguyễn Văn Dũng (2015) [29] cho biết đến nay cả nước ghi nhận 64 loài Anopheles
Bài viết so sánh kết quả nghiên cứu thành phần loài tại Gia Lai với nghiên cứu của Nguyễn Văn Dũng và cộng sự (2015).
Nghiên cứu năm 2020 tại Gia Lai ghi nhận 21,88% thành phần loài muỗi Anopheles, thấp hơn so với các nghiên cứu trước đó ở miền Trung-Tây Nguyên (29,17%), miền Bắc (60%), Nam bộ-Lâm Đồng (33,33%), và các nghiên cứu khác tại Gia Lai (14/19 loài và 14/15 loài).
Nghiên cứu tại Kon Tum ghi nhận 13 loài muỗi Anopheles, chiếm 20,31% tổng số loài ghi nhận trên toàn quốc (Nguyễn Văn Dũng và cộng sự, 2015), 27,08% so với miền Trung-Tây Nguyên (Lê Khánh Thuận, 2002), 43,33% so với miền Bắc (Vũ Đức Chính và cộng sự, 2006), và 30,95% so với Nam bộ-Lâm Đồng (Lê Thành Đồng và cộng sự, 2015).
[48] So sánh điểm nghiên cứu ở Vườn Quốc gia Chư Mom Ray, Kon Tum của Nguyễn Xuân Quang và cộng sự (2012) thì ít hơn 5 loài (13/18) [67]
Nghiên cứu tại Đắk Lắk ghi nhận 13 loài muỗi Anopheles, chiếm 20,31% tổng số loài trên toàn quốc (Nguyễn Văn Dũng và cộng sự, 2015), 27,08% so với miền Trung-Tây Nguyên (Lê Khánh Thuận và cộng sự, 2002), 43,33% so với miền Bắc (Vũ Đức Chính và cộng sự, 2006), và 30,95% so với Nam bộ-Lâm Đồng (Lê Thành Đồng và cộng sự, 2015).
Xác định chỉ điểm phân tử kháng K 13 , Plasmepsin 2, Exonulcease, Pfmdr1,
4.2.1 Xác định các đột biến điểm trên gen mã hóa K 13 propeller
Nghiên cứu phân tích vùng gen K13 propeller của 562 mẫu *P falciparum* tại 4 tỉnh Tây Nguyên (Kon Tum, Gia Lai, Đắk Lắk, Đắk Nông) cho thấy kích thước gen (850bp) khớp với dự đoán lý thuyết và thành công trong việc nhân bản gen K13 Tỷ lệ thu nhận gen K13 đạt 93,53% (253/271 mẫu), tương tự nghiên cứu của Mohon và cộng sự (2014).
Trong tổng số 23 mẫu phân lập P falciparum tại Kon Tum, thấy xuất hiện
Phân tích 251 mẫu *Plasmodium falciparum* tại Gia Lai cho thấy đột biến gen K13 propeller, với C580Y chiếm 88,45% và R539T chiếm tỷ lệ thấp hơn (8,70%) Ngược lại, nghiên cứu khác ghi nhận C580Y và R539T có tỷ lệ lần lượt là 30,43% và 8,70%.
1 mẫu xuất hiện đột biến A578S chiếm tỷ lệ 0,4% Số mẫu 251 thu được tại Gia Lai trong khoảng thời gian từ giai đoạn 2019-2021, trong đó năm 2019 thu được
Nghiên cứu tại Đắk Lắk (2019-2021) thu được 162 mẫu, 87,4% (141 mẫu) có đột biến C580Y và 0,62% (1 mẫu) có đột biến R539T Tỷ lệ C580Y theo năm lần lượt là 87,95%, 77,08%, và 100% Tại Đắk Nông (2019-2020), 126 mẫu được thu thập, với 87,3% có đột biến C580Y, 0,79% có đột biến R539T và 16,67% có đột biến I446F Tỷ lệ C580Y năm 2019 và 2020 lần lượt là 79,55% và 100%.
Nghiên cứu phát hiện đột biến C580Y trên gen K13 của Plasmodium falciparum ở Tây Nguyên (Kon Tum, Gia Lai, Đắk Lắk, Đắk Nông), với tỷ lệ cao (87-88%), ngoại trừ Kon Tum (30%) Đột biến này cũng là đột biến chủ yếu trong khu vực tiểu vùng sông Mê Kông mở rộng (khoảng 85%), được chứng minh ảnh hưởng mạnh đến quá trình làm sạch ký sinh trùng thể vô tính (in vivo và in vitro), và liên quan đến kháng artemisinin, phổ biến ở Campuchia, Lào và Việt Nam.
Nhiều nghiên cứu tại Việt Nam, bao gồm các công trình của Asley và cộng sự (2014), Shannon Takala-Harrison và cộng sự (2015), Huỳnh Hồng Quang và cộng sự (2016), đã xác định đột biến C580Y trong các mẫu phân lập.
Các đột biến xuất hiện chủ yếu trên vùng gen K13 làm thay đổi các acid amin ở vị trí sau 440 tại khu vực GMS được báo cáo bởi TCYTTG (WHO,
2015) Trong khi đó, tại khu vực Châu Phi, các đột biến thấy được trên vùng gen
Các nghiên cứu tại Uganda (Conrad et al., 2014), Bangladesh (Mohon et al., 2014), và một nghiên cứu khác (Isozumi et al., 2015) cho thấy đột biến K13 ở khu vực ngoài GMS khác biệt đáng kể so với các đột biến trong khu vực GMS Trong khi đa số không tìm thấy các đột biến K13 đã được báo cáo trước đây, đột biến A578S, có liên hệ với đột biến C580Y ở GMS, đã được phát hiện ở Bangladesh và được đề cập trong một nghiên cứu khác.
Đột biến C580Y chiếm tỷ lệ cao tại Tây Nguyên, đạt 75% ở Gia Lai và 88,89% ở Đắk Lắk, tăng mạnh so với các nghiên cứu trước đây (36,5% và 24,6% tại Gia Lai và Đắk Nông năm 2016; 11,59% tại Gia Lai và 6,67% tại Ninh Sơn năm 2016) Đây là đột biến chiếm ưu thế tại khu vực GMS, với tỷ lệ 85% theo nghiên cứu của Ariey và cộng sự.
Nghiên cứu của Shannon Takala-Harrison và cộng sự (2015) ghi nhận đột biến C580Y phổ biến ở 61 mẫu Campuchia, 13 mẫu Myanmar và 6 mẫu Việt Nam [126], tỷ lệ cao hơn nữa so với các nghiên cứu trước đó của Asley và cộng sự (2014) [93] và Kyaw M Tun và cộng sự.
Đột biến C580Y là đột biến kháng thuốc lao chiếm ưu thế ở Đắk Lắk (100% trong nghiên cứu năm 2021) và cũng phổ biến tại Pailin (Campuchia) và Srisaket (Thái Lan), trong khi tỷ lệ xuất hiện ở Trung Quốc thấp hơn Nghiên cứu của Huỳnh Hồng Quang (2019) và Imwong (2020) đã xác nhận điều này.
Nghiên cứu năm 2017 của Anderson và cộng sự [130] xác định 32 đột biến không đồng nghĩa trên gen K13, chủ yếu (29/32) nằm trong vùng cánh quạt Số lượng SNPs trên gen K13 tăng từ vài trường hợp năm 2003 lên 90 vào năm 2014, với E252Q là alen phổ biến nhất trước năm 2008 và C580Y xuất hiện năm 2006, đạt tần suất 65% vào năm 2010.
Đột biến K13-C580Y trở nên phổ biến trong các chủng lâm sàng từ năm 2014 Chỉ hai alen kháng artemisinin khác (E252Q và R561H) đạt tần số alen trên 10% trước năm 2012 Độ dị hợp tử tại vùng gen K13 tăng từ 0 năm 2001 lên 0,8 năm 2011, sau đó giảm xuống 0,5 khi C580Y chiếm ưu thế 23/25 đột biến không đồng nghĩa ảnh hưởng đến tốc độ thanh thải.
Các đột biến K13 liên quan đến tốc độ thanh thải chậm hơn so với chủng hoang dại, với mức độ khác nhau giữa các SNPs E252Q thanh thải chậm hơn chủng hoang dại nhưng nhanh hơn nhiều đột biến khác như C580Y Sự khác biệt về tốc độ thanh thải và ảnh hưởng đến tỷ lệ thất bại điều trị cho thấy đột biến K13 gây mất chức năng một phần Alen C580Y, đang lan rộng nhanh chóng ở Đông Nam Á, có độ thích nghi cao hơn các alen kháng artemisinin khác do cơ chế tác động (phá vỡ liên kết disulfide) khác biệt.
Dữ liệu cho thấy alen kháng artemisinin độ thích nghi trung bình (E252Q) lan truyền trước, nhưng bị C580Y thay thế sau 2011 Điều này phù hợp với mô hình phân bố cấp số nhân của hiệu ứng thích nghi đột biến: nhiều đột biến có lợi ích nhỏ, ít đột biến có lợi ích cao C580Y, một alen có độ thích nghi cao, xuất hiện muộn nhưng lan rộng nhanh ở biên giới Thái Lan - Myanmar do sự hiếm hoi ban đầu.
Việc sử dụng artemisinin kết hợp với các thuốc khác để chống lại sự kháng thuốc đang gặp khó khăn do sự tiến triển nhanh chóng của tình trạng này Kết quả nghiên cứu cho thấy cần sử dụng phối hợp nhiều hơn hai loại thuốc để hạn chế kháng thuốc hiệu quả, tuy nhiên, việc này bị hạn chế bởi tính khả dụng của thuốc Nghiên cứu phát hiện đột biến F446I trong gen K13 với tỷ lệ đáng kể (16,67% tại Đắk Nông), cùng với các đột biến khác như R539T, A578S, và Y493H, tương tự kết quả nghiên cứu khác trong khu vực và quốc tế, cho thấy sự đa dạng và phổ biến của các đột biến liên quan đến kháng artemisinin.
Tỷ lệ kháng artemisinin ở Myanmar đạt 32.7%, một đột biến liên quan đến quá trình thanh thải chậm của P falciparum sau điều trị.
4.2.2 Xác định biến thể đa hình của gen Plasmepsin 2