Nghiên cứu Ảnh hưởng của chế phẩm vi sinh Đến khả năng chịu mặn, chịu hạn của một số giống lúa việt nam

Nghiên cứu Ảnh hưởng của chế phẩm vi sinh Đến khả năng chịu mặn, chịu hạn của một số giống lúa việt nam

-

Lương Thị Thu Hương

NGHIÊN CỨU ẢNH HƯỞNG CỦA CHẾ PHẨM VI SINH ĐẾN KHẢ NĂNG CHỊU MẶN, CHỊU HẠN CỦA MỘT SỐ GIỐNG LÚA

VIỆT NAM

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

Hà Nội – Năm 2023

-

Lương Thị Thu Hương

NGHIÊN CỨU ẢNH HƯỞNG CỦA CHẾ PHẨM VI SINH ĐẾN KHẢ NĂNG CHỊU MẶN, CHỊU HẠN CỦA MỘT SỐ GIỐNG LÚA

VIỆT NAM

Chuyên ngành: Sinh thái học

Mã số: 8420101.20

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC

TS HỒ TÚ CƯỜNG

TS PHẠM THỊ DẬU

Hà Nội – Năm 2023

Lời đầu tiên, em xin được bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc và chân thành nhất đến

TS Hồ Tú Cường, phòng Vi sinh vật Môi trường, Viện Công nghệ Môi trường và

TS Phạm Thị Dậu, Bộ môn Sinh thái học, Khoa Sinh học, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội đã tận tình định hướng và giúp đỡ em trong quá trình làm luận văn này

Bên cạnh đó, em cũng xin chân thành cảm ơn các thầy cô Khoa Sinh học nói chung và Bộ môn Sinh thái, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia

Hà Nội nói riêng đã truyền đạt kiến thức và tạo điều kiện giúp đỡ em trong suốt quá trình học tập và thực hiện luận văn

Em cũng xin bày tỏ lòng cảm ơn tới chị Đặng Thị Mai Anh, chị Nguyễn Minh Thư thuộc Viện Công nghệ môi trường và em Hoàng Hải Long, sinh viên trường Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội đã giúp đỡ

em hoàn thành nghiên cứu này

Cuối cùng, em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới gia đình và bạn bè đã động viên

và giúp đỡ em rất nhiều để em có được kết quả như ngày hôm nay

Em xin chân thành cảm ơn tất cả mọi người!

Học viên

Lương Thị Thu Hương

MỤC LỤC

MỞ ĐẦU 1

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

1.1 Đặc điểm sinh học của các giống lúa nghiên cứu 3

1.2 Hiện trạng hạn và mặn tại Việt Nam 4

1.2.1 Ảnh hưởng của khô hạn và xâm nhập mặn đến cây lúa 4

1.2.2 Tình hình khô hạn tại các vùng trồng lúa ở Việt Nam 5

1.2.3 Tình hình xâm nhập mặn tại các vùng trồng lúa ở Việt Nam 6

1.3 Tình hình nghiên cứu các giải pháp chống chịu hạn mặn 7

1.3.1 Tình hình nghiên cứu các giải pháp chống chịu hạn, mặn 7

1.3.2 Tình hình nghiên cứu sử dụng vi sinh vật trong giải pháp hỗ trợ chống chịu hạn, mặn của cây lúa 9

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 12

2.1 Đối tượng và nội dung nghiên cứu 12

2.1.1 Đối tượng nghiên cứu 12

2.1.2 Nội dung nghiên cứu 12

2.2 Địa điểm và thời gian nghiên cứu 13

2.3 Phương pháp nghiên cứu 13

2.3.1 Vật liệu nghiên cứu 13

2.3.2 Phương pháp nghiên cứu 13

2.3.2.1 Tuyển chọn các chủng vi khuẩn PGPR tạo chế phẩm vi sinh 14

2.3.2.2 Tối ưu hoá điều kiện môi trường tạo chế phẩm vi sinh 15

2.3.2.3 Đánh giá ảnh hưởng của chế phẩm vi sinh đến khả năng chịu hạn, mặn của lúa 16

2.3.3 Phương pháp xử lý số liệu 23

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 24

3.1 Đặc điểm của vi sinh vật tạo chế phẩm 24

3.1.1 Khả năng tổng hợp chất kích thích sinh trưởng thực vật của các chủng vi sinh vật tuyển chọn 24

3.1.2 Ảnh hưởng của điều kiện môi trường đến hoạt tính kích thích sinh trưởng thực vật của các chủng tuyển chọn 27

3.2 Ảnh hưởng của chế phẩm vi sinh đến sự sinh trưởng và phát triển của cây lúa trong điều kiện mặn 32

3.2.1 Đặc điểm lý hoá của môi trường trồng lúa trong điều kiện mặn 32

3.2.2 Khả năng sinh trưởng, phát triển và năng suất của lúa trong điều kiện mặn 36

3.2.3 Sự thay đổi về hàm lượng vi sinh trong đất trong điều kiện mặn 46

3.2.4 Ảnh hưởng của các thông số lý hoá đến các chỉ tiêu sinh trưởng và năng suất cây lúa trong điều kiện mặn 50

3.3 Ảnh hưởng của chế phẩm vi sinh đến sự sinh trưởng và phát triển của cây lúa trong điều kiện hạn 52

3.3.1 Đặc điểm lý hoá của môi trường trồng lúa trong điều kiện hạn 52

3.3.2 Khả năng sinh trưởng, phát triển của lúa trong điều kiện hạn 55

3.3.3 Ảnh hưởng của các thông số lý hoá đến các chỉ tiêu sinh trưởng và năng suất

cây lúa trong điều kiện hạn 60

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 62

Kết luận 62

Kiến nghị 63

TÀI LIỆU THAM KHẢO 64

PHỤ LỤC 71

Danh mục bảng

Bảng 1: Đặc tính sinh hoá của các chủng PGPR tuyển chọn 26 Bảng 2: Khảo sát độ mặn trong thời gian thí nghiệm 35 Bảng 3: Ảnh hưởng của chế phẩm vi sinh đến tỷ lệ cây chết, số bông lúa trung bình và

tỷ lệ hạt chắc của giống ST25 trong điều kiện mặn 41 Bảng 4: Ảnh hưởng của chế phẩm vi sinh đến tỷ lệ cây chết, số bông lúa trung bình và

tỷ lệ hạt chắc của giống Bắc Thịnh 8 trong điều kiện mặn 42 Bảng 5: Ảnh hưởng của chế phẩm vi sinh đến tỷ lệ cây chết, số bông lúa trung bình và

tỷ lệ hạt chắc của giống Sơn Lâm 1 trong điều kiện mặn 44 Bảng 6: Hệ số tương quan các thông số lý hoá với chiều cao và năng suất cây lúa 51 Bảng 7: Độ ẩm khảo sát trong khoảng thời gian thí nghiệm 54 Bảng 8: Ảnh hưởng của chế phẩm vi sinh đến tỷ lệ cây chết trong điều kiện hạn tại thời điểm 6 tuần 58 Bảng 9: Ảnh hưởng của chế phẩm vi sinh đến chỉ số chịu hạn của ba giống lúa 59 Bảng 10: Hệ số tương quan các thông số lý hoá đến khả năng sinh trưởng và chống chịu của cây lúa 61

Danh mục hình

Hình 1: Sơ đồ tóm tắt nghiên cứu 13 Hình 2: Sơ đồ thí nghiệm đánh giá ảnh hưởng của chế phẩm vi sinh đến khả năng chịu mặn của ba giống lúa 17 Hình 3: Sơ đồ thí nghiệm đánh giá ảnh hưởng của chế phẩm vi sinh đến khả năng chịu hạn của ba giống 19 Hình 4: Theo dõi các thông số lý hoá (nhiệt độ, ánh sáng, pH, độ mặn, độ ẩm) và sinh trưởng của lúa (chiều cao cây, số cây chết) trong thời gian thí nghiệm 20 Hình 5: Khả năng tổng hợp IAA của bốn chủng PGPR trong môi trường KSB bổ sung Tryptophan 24 Hình 6: Cây phát sinh loài chủng GL8 (A) và GY9 (B) và hình ảnh nhuộm gram hai chủng vi khuẩn (GL8–C, GY9–D) 25 Hình 7: Ảnh hưởng của hàm lượng bột đậu tương tới khả năng sinh trưởng của bốn chủng PGPR 28 Hình 8: Ảnh hưởng của hàm lượng bột đậu tương tới khả năng tổng hợp IAA của các chủng vi khuẩn PGPR 29 Hình 9: Ảnh hưởng của nhiệt độ tới khả năng tổng hợp IAA của hỗn hợp chủng vi khuẩn PGPR 30 Hình 10: Ảnh hưởng của pH tới khả năng tổng hợp IAA khi nuôi cấy hỗn hợp chủng vi khuẩn PGPR trong các điều kiện pH 31 Hình 11: Cường độ ánh sáng trong thời gian thí nghiệm 32 Hình 12: Nhiệt độ đất khảo sát (A) và nhiệt độ không khí (B) (nguồn: Worldweather) trong thời gian thí nghiệm 33

Hình 13: Giá trị pH của đất trong thời gian thí nghiệm 34

Hình 14: Ảnh hưởng của chế phẩm vi sinh đến tăng trưởng chiều cao cây giống ST25 trong điều kiện mặn 36

Hình 15: Ảnh hưởng của chế phẩm vi sinh đến tăng trưởng chiều cao cây giống Bắc Thịnh 8 trong điều kiện mặn 38

Hình 16: Ảnh hưởng của chế phẩm vi sinh đến tăng trưởng chiều cao giống lúa Sơn Lâm 1 trong điều kiện mặn 39

Hình 17: Hàm lượng vi sinh vật thay đổi ở giống lúa ST25 trong thí nghiệm chịu mặn 46

Hình 18: Hàm lượng vi sinh vật thay đổi ở giống lúa Bắc Thịnh 8 trong thí nghiệm chịu mặn 47

Hình 19: Hàm lượng vi sinh vật thay đổi ở giống lúa Sơn lâm 1 trong thí nghiệm chịu mặn 48

Hình 20: Tương quan các thông số lý hoá với các thông số sinh trưởng năng suất của lúa trong điều kiện mặn 50

Hình 21: Cường độ ánh sáng khảo sát trong thời gian thí nghiệm 52

Hình 22: Nhiệt độ đất khảo sát trong thời gian thí nghiệm 53

Hình 23: pH đất khảo sát trong thời gian thí nghiệm 53

Hình 24: Ảnh hưởng của chế phẩm vi sinh đến tăng trưởng chiều cao cây lúa giống ST25 trong điều kiện hạn 55

Hình 25: Ảnh hưởng của chế phẩm vi sinh đến tăng trưởng chiều cao cây lúa giống Bắc Thịnh 8 trong điều kiện hạn 56

Hình 26: Ảnh hưởng của chế phẩm vi sinh đến tăng trưởng chiều cao cây lúa giống Sơn Lâm 1 trong điều kiện hạn 57 Hình 27: Tương quan các thông số lý hoá với thông số sinh trưởng và thông số chịu hạn trong điều kiện hạn 60

Danh mục các từ viết tắt

PGPR Plant growth promoting Rhizobacteria – Vi sinh vật

MỞ ĐẦU

Nông nghiệp là ngành có đóng góp rất lớn cho nền kinh tế Việt Nam Trong đó, lúa là cây lương thực vai trò quan trọng nhất và có tỷ trọng lớn nhất trong sản xuất nông nghiệp Việt Nam không chỉ đang dẫn đầu về sản lượng gạo xuất khẩu mà còn có sự đa dạng về giống cây lúa rất cao [3] Sự phát triển của nền nông nghiệp hiện nay đang ngày càng gặp nhiều khó khăn do ảnh hưởng của biến đổi khí hậu Với đặc thù địa hình có đường bờ biển dài, hai vùng trọng điểm sản xuất lúa gạo lớn nhất cả nước là đồng bằng sông Hồng và đồng bằng sông Cửu Long đều nằm ven biển Trong những năm qua, tác động của biến đổi khí hậu đã ảnh hưởng đáng kể đến khu vực này, gây ra hiện tượng mực nước biển dâng ở các vùng đất thấp ở cửa sông, gia tăng số lượng các hiện tượng thời tiết cực đoan, nhiệt độ trung bình tăng và xâm nhập mặn gia tăng [6] từ đó làm giảm diện tích đất canh tác, giảm năng năng suất, gây áp lực lớn đến sự phát triển của nền nông nghiệp Xâm nhập mặn làm phá huỷ cấu trúc đất, giảm khả năng phát triển của rễ cây và khả năng thẩm thấu, thoát nước trong đất, gây thiếu khí cho sự phát triển bộ rễ Tại các vùng nhiễm mặn cao, cây trồng có khả năng bị sốc mặn, vàng lá, rụng hoa, hạt lép làm giảm năng suất Bên cạnh đó, lúa là loài sinh trưởng trong môi trường ngập nước,

do vậy sự thiếu hụt nước, khô hạn sẽ dẫn tới làm giảm sức sinh trưởng, sinh sản của lúa

và gây chết

Hiện nay, các hệ vi khuẩn liên hiệp thực vật (PAB – Plant Associated Bacteria), bao gồm cả vi khuẩn vùng rễ và vi khuẩn nội sinh, có khả năng cải thiện sự tăng trưởng của thực vật Chúng có thể ví như các loại phân bón tổng hợp hoặc thuốc trừ sâu, thuốc trừ cỏ nhưng bên cạnh đó lại có thể hỗ trợ cho việc duy trì tính bền vững trong năng suất cây trồng và sự an toàn của môi trường [52] Trong số đó, có một nhóm gồm vi khuẩn

có khả năng kích thích sinh trưởng ở thực vật (Plant growth promoting rhizobacteria – PGPR) PGPR có thể thúc đẩy tăng trưởng thực vật do khả năng cố định đạm, hòa tan

thực vật [52], tăng khả năng chống chịu của cây trồng bao gồm khả năng chịu mặn, chịu hạn Các loại phân bón vô cơ ngày càng thể hiện những tác động tiêu cực đến môi trường đồng thời giá thành tăng cao đã dẫn tới việc sử dụng các chế phẩm vi sinh với thành phần hữu cơ trở thành hướng đi mới được nhận được nhiều sự quan tâm Nhiều nghiên cứu khai thác các ưu điểm của nhóm vi khuẩn trên nhằm ứng dụng sản xuất phân bón sinh học ứng dụng trong nông nghiệp góp phần phát triển nền nông nghiệp sạch và bền vững

Đề tài “Nghiên cứu ảnh hưởng của chế phẩm vi sinh đến khả năng chịu mặn, chịu hạn của một số giống lúa Việt Nam” được thực hiện với hai mục tiêu chính:

– Tuyển chọn các chủng vi sinh vật kích thích sinh trưởng thực vật và tối ưu điều kiện môi trường lên men nhằm tạo ra chế phẩm vi sinh hữu cơ

– Ứng dụng chế phẩm trên vào việc hỗ trợ tăng khả năng chống chịu hạn, mặn của hai giống lúa mới (Bắc Thịnh 8, Sơn Lâm 1) và giống lúa chất lượng cao (ST25) nhằm phục vụ mở rộng vùng trồng của chúng tại các vùng hạn, mặn

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Đặc điểm sinh học của các giống lúa nghiên cứu

Lúa nước là một trong 5 loại cây lương thực quan trọng nhất trên thế giới Chúng được trồng tại các vùng nhiệt đới ẩm hoặc cận nhiệt đới Khoảng nhiệt độ phù hợp cho

sự phát triển của lúa dao động từ 20 – 30oC trong đó khoảng chống chịu nhiệt dao động

từ 10 – 36oC Giá trị pH tối ưu cho sự phát triển của lúa dao động trong khoảng 5,5 – 7 với khoảng chống chịu dao động từ 4,5 – 9 [8] Lúa nước yêu cầu môi trường đất với độ

ẩm luôn đạt tối thiểu 60% [29] Cây lúa quang hợp và phát triển với cường độ ánh sáng thấp nhất ở 400 lux và phát triển tỷ lệ thuận với cường độ ánh sáng khi đạt ngưỡng 40.000 – 60.000 lux [64]

Giống lúa thuần Sơn Lâm 1 (hay TQ1) được phát triển bởi Viện nghiên cứu hợp tác Khoa học kỹ thuật Châu Á – Thái Bình Dương kết hợp với công ty cổ phần Sơn Lâm và được trồng khảo nghiệm năm 2012–2013 trong mạng lưới khảo nghiệm quốc gia qua ba

vụ tại Hưng Yên và Hà Nội và được cấp phép lưu hành trên thị trường từ 2017 [5] Giống Bắc Thịnh 8 do công ty giống cây trồng Bắc Trung Bộ phối hợp với Trung tâm nghiên cứu ứng dụng KHKT Giống cây trồng nông nghiệp Thanh Hóa chuyển giao nghiên cứu

và sản xuất, đến năm 2015 được chính thức công nhận bởi Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn Giống lúa này được trồng tại khu vực Thanh Hóa, vùng trồng Bắc Trung Bộ

và miền Trung [14] Cả hai giống lúa mới này đều là giống cảm ôn, năng suất cao, có nhiều đặc tính tốt, có thể trồng được 2 vụ đông xuân và hè thu Năng suất trung bình đạt trên 50 tạ/ha với năng suất tối đa có thể đạt tới 70 tạ/ha Hai giống đều có khả năng chịu rét, cứng cây, chống chịu sâu bệnh tốt [5, 14]

Trung tâm giống cây trồng Sóc Trăng kết hợp với viện lúa Đồng bằng sông Cửu Long và Viện nghiên cứu phát triển Đồng bằng sông Cửu Long – ĐH Cần Thơ đã khảo nghiệm và đưa ra nhiều đặc tính tốt của giống ST25 như gieo cấy 2 vụ trong năm, có đặc

tính chịu mặn đến khoảng 2‰, kháng đạo ôn cấp 2 và bệnh bạc lá, năng suất cao, chất lượng gạo ngon cùng nhiều đặc tính tốt khác [10, 11]

Hiện tại vẫn chưa có các nghiên cứu hay công bố của đơn vị sản xuất về khả năng chịu mặn, chịu hạn của hai giống lúa Sơn Lâm 1 và Bắc Thịnh 8 Bên cạnh đó, ba giống lúa trên hiện vẫn chỉ được trồng phổ biến tại các khu vực đã khảo nghiệm và phát triển Việc mở rộng vùng trồng của các giống còn gặp nhiều khó khăn cụ thể như giống ST25 khi trồng tại các tỉnh miền Bắc không đạt được năng suất và chất lượng như khi trồng tại vùng bản địa [11]

1.2 Hiện trạng hạn và mặn tại Việt Nam

1.2.1 Ảnh hưởng của khô hạn và xâm nhập mặn đến cây lúa

Lúa là loài nhạy cảm với độ ẩm và độ mặn đặc biệt trong giai đoạn nảy mầm và sinh trưởng ban đầu (giai đoạn mạ, đẻ nhánh)

Hạn hán ức chế khả năng hút nước và làm giảm khả năng nảy mầm của hạt thóc Thiếu nước dẫn tới mất cân bằng trong quá trình trao đổi chất ở cấp độ tế bào, suy giảm khả năng vận chuyển chất qua màng, giảm khả năng tổng hợp ATP Ở các giai đoạn phát triển của lúa, sống trong điều kiện hạn sẽ làm giảm chiều cao cây, giảm diện tích mặt lá, ảnh hưởng đến khả năng quang hợp từ đó ảnh hưởng đến năng suất cây lúa [29]

Hàm lượng muối cao trong đất dẫn tới ức chế khả năng hấp thụ các chất dinh dưỡng khác trong đất Các chất dinh dưỡng dư thừa vận chuyển trong hệ thống ruộng, mương dẫn nước dẫn tới sự phát triển quá mức của các vi sinh vật, tảo có thể gây hại tới cây trồng ảnh hưởng tới hệ sinh thái Các ion trong nước mặn như natri, clo trong nước

là các khoáng chất không cần thiết cho sự phát triển của thực vật, chúng tích tụ trong cây với hàm lượng lớn sẽ dẫn tới gây độc Muối trong đất khi tương tác với các tế bào nội bì

ở rễ nhánh, chúng kích thích sinh ra các hormone ức chế ở vùng rễ, làm hạn chế sự phát triển của rễ Muối cũng gây ra hiện tượng hạn hán hoá học trong đó nước trong vùng rễ

bị khuếch tán ra môi trường đất mặn [59] Sự tích tụ các muối trong thực vật trực tiếp

làm rối loạn quá trình trao đổi chất, từ đó ảnh hưởng đến sự sinh trưởng phát triển (chiều cao cây, độ dài rễ) và năng suất (số nhánh, số bông lúa, sinh khối hạt, sinh khối cây) [41]

1.2.2 Tình hình khô hạn tại các vùng trồng lúa ở Việt Nam

Tại Việt Nam, hạn hán là một trong những thiên tai thường xuyên xảy ra chỉ sau bão lũ và ngày càng trở nên nghiêm trọng hơn do ảnh hưởng của biến đổi khí hậu Hạn hán thường xảy ra vào mùa khô từ khoảng tháng 11 – 4 Hai loại hạn hán chính ảnh hưởng tại Việt Nam là hạn khí tượng và hạn thuỷ văn

Khu vực chịu ảnh hưởng lớn nhất của hiện tượng khô hạn tại Việt Nam gồm vùng trồng đồng bằng sông Cửu Long, khu vực Bắc Trung Bộ và Duyên hải miền Trung Trong đó, vùng bị hạn hán thường xuyên hàng năm là các tỉnh từ Khánh Hoà đến Bình Thuận, với tổng số diện tích hạn hán thường xuyên là 300.000 ha Tại khu vực Trung

Bộ, phía tây là địa hình đồi núi dốc, bề ngang hẹp, dẫn tới khả năng tự điều tiết và trữ nước tại đây kém Vào mùa hè xuất hiện gió mùa tây nam thổi ngược làm cho thời tiết khô nóng Độ ẩm thấp cùng với lượng mưa hạn chế, địa thế khó dự trữ nước khiến cho khu vực này chịu ảnh hưởng lớn bởi khô hạn [1] Tại đồng bằng sông Hồng, hạn thuỷ văn là nguyên nhân chủ yếu do việc suy giảm lượng mưa mùa khô kết hợp với sự thiếu hụt về dòng chảy Trước khi xây dựng hồ chứa Hoà Bình, khu vực này thường xảy ra hạn nặng đặc biệt trong giai đoạn 1960 –1987 [6] Theo số liệu thống kê đến 2014, trong vòng 50 năm, Việt Nam đã trải qua 40 năm xảy ra hạn hán trên phạm vi khắp cả nước [31] Hạn hán tác động mạnh đến nền nồng nghiệp và kinh tế địa phương Năm 2019, báo cáo của TS Hải Dương và cộng sự thống kê tình hình hạn hán tại các tỉnh thành cho thấy từ năm 2014 – 2016, có tới 52 tỉnh chịu ảnh hưởng của hạn hán do ảnh hưởng của hiện tượng El nino [36] Cụ thể đã có 23.000 ha tại khu vực Nam Trung Bộ phải dừng sản xuất đặc biệt là ở Khánh Hoà, Ninh Thuận, Bình Thuận, 2.350 ha lúa tại Tây Nguyên phải dừng sản xuất cùng với hơn 4.000 ha diện tích trồng lúa phải chuyển sang cây trồng

cạn [1] Diện tích lúa ảnh hưởng lên tới 159.000ha, 10 tỉnh thành thông báo tình trạng khẩn cấp, ước tính thiệt hại lên tới 67 triệu USD [27] Hiện nước ta đang đối mặt với hạn khí tượng nghiêm trọng với tần suất diễn ra hàng năm khoảng 4%, được xác định bởi chỉ

số bay hơi (SPEI) thấp hơn 2,2 Chịu ảnh hưởng bởi biến đổi khí hậu, Trái đất nóng lên toàn cầu, dự đoán của Ngân hàng thế giới về tần suất diễn ra hạn hán sẽ tăng đến 10%

từ năm 2020 – 2100 [60]

1.2.3 Tình hình xâm nhập mặn tại các vùng trồng lúa ở Việt Nam

Báo cáo của Ngân hàng thế giới về biến đổi khí hậu đã đưa ra các đánh giá mức

độ chịu ảnh hưởng của biến đổi khí hậu theo từng vùng tại Việt Nam

Tại đồng bằng sông Hồng, bốn tỉnh ven biển gồm Hải Phòng, Thái Bình, Nam Định, Ninh Bình chịu ảnh hưởng từ hiện tượng xâm nhập mặn Các kết quả quan trắc từ Viện Quy hoạch Thuỷ lợi cho thấy vào mùa khô kiệt, khi lượng mưa giảm, lưu lượng nước về hạ du giảm, mực nước sông xuống thấp cùng với nước biển dâng cao, triều cường gây ra hiện tượng xâm nhập mặn với độ sâu từ biển vào có thể dao động khoảng 21,3 – 40 km [12] Tại các trạm quan trắc các lưu vực sông hạ du đồng bằng sông Hồng,

độ mặn có thể dao động từ 0,3 – 5,7‰ trong đó cao nhất tại các lưu vực sông Thái Bình – Đông Xuyên, Văn Úc – Trung Trang (4,1‰), Đá Bạch – Đồn Sơn (5.7‰) [66].Tại khu vực này, diện tích trồng lúa bị ảnh hưởng mặn lên đến 75.187 ha [13].Nghiên cứu của nhóm tác giả tại Viện Công nghệ môi trường năm 2020 ghi nhận độ mặn tại các vùng trồng lúa của tỉnh Nam Định dao động từ 0,68‰ – 2,17‰ [37]

Khu vực đồng bằng sông Cửu Long tiếp tục chịu ảnh hưởng lớn bởi xâm nhập mặn và thiếu hụt nước ngọt vào mùa khô, khu vực Bắc Trung Bộ và Duyên hải miền Trung tiếp xúc và chịu ảnh hưởng nặng nhất do hạn hán [60] Mực nước sông Cửu Long trong tháng 6 và tháng 7/2019 giảm mạnh so với các năm trước, dẫn tới tình trạng hạn hán và xâm nhập mặn cho toàn vùng ĐBSCL trong mùa khô 2019–2020 Hàng năm, có tới hơn 50% diện tích ĐBSCL bị nhiễm mặn như Long An, Tiền Giang, Bến Tre, Trà

Vinh, Sóc Trăng, Bạc Liêu, Cà Mau và Kiên Giang thuộc lưu vực sông Vàm Cỏ Đông

và Vàm Cỏ Tây, Cửa Tiểu và Cửa Đại, sông Hàm Luông, sông Cổ Chiên, sông Hậu, sông Cái Lớn [9] với các rãnh mặn chủ yếu từ 1‰ – 4‰ [4] Độ mặn ghi nhận cao kỷ lục tại đây vào năm 2019 tại các tỉnh như Châu Đốc, Phước Long, An Thuận hay Cà Mau dao động từ 25 – 29,4‰ [4] Thống kê năm 2020, xâm nhập mặn tiếp tục gia tăng, lấn vào các vùng cửa sông Cửu Long từ 45 – 66 km, sâu hơn so với mùa khô năm 2016

từ 6 – 17 km Tổng cộng có 13 tỉnh thành chịu ảnh hưởng trong đó hai tỉnh Tiền Giang

và Bến Tre đã công bố tình trạng khẩn cấp [58] Năm 2022, độ sâu xâm nhập mặn lớn nhất xảy ra vào cuối tháng 2 đầu tháng 3, rãnh mặn 1g/lít trên các nhánh sông lớn là sông Hậu, sông Tiền và sông Vàm Cỏ Tây vào sâu từ 1 – 3km [22]

1.3 Tình hình nghiên cứu các giải pháp chống chịu hạn mặn

1.3.1 Tình hình nghiên cứu các giải pháp chống chịu hạn, mặn

Hạn hán và xâm nhập mặn có liên quan mật thiết và tác động mạnh đến nền nông nghiệp, ảnh hưởng đến an ninh lượng thực quốc gia Nhiều chiến lược, giải pháp, chính sách đã được nghiên cứu và ứng dụng nhằm ứng phó với các hiện tượng thiên tai này hàng năm

Hệ thống quan trắc, dự báo sớm tình hình hạn mặn không ngừng được bổ sung và hoàn thiện Tại các lưu vực sông, cửa biển trên cả nước, các trạm quan trắc được xây dựng Thông tin về khí tượng, thuỷ văn được tổng hợp, phân tích và đưa ra các dự báo, kịch bản hạn mặn hàng năm để các khu vực có sự chuẩn bị ứng phó

Xây dựng và triển khai hoàn chỉnh hệ thống thuỷ lợi như kênh, hồ, cống, đập, trạm bơm Tăng cường tích trữ nước ngọt thu gom nước mưa, xây đập nước ngăn mặn, đắp đê vùng biển, trồng rừng ngập mặn Từ năm 2017, tỉnh Kiên Giang đã cho xây dựng 150km đê biển và 52 cống ngăn mặn xâm nhập sâu vào đất liền và hoàn thành vào năm

2019 [58] Khoan giếng tầng sâu thay thế tạm thời nguồn nước mặt bị nhiễm Phát triển

các hệ thống lọc nước mặn đảm bảo nguồn nước ngọt tưới tiêu và sinh hoạt Áp dụng phương pháp tưới tiết kiệm

Tại các khu vực ngập mặn, chuyển đổi cơ cấu nông nghiệp, kết hợp trồng lúa với các loại hình nông nghiệp khác Một trong số mô hình đang được áp dụng thành công hiện nay đó là mô hình luân canh lúa – tôm Mô hình này đã bắt đầu xuất hiện tại Việt Nam từ năm 1980 với hệ thống đơn giản là trồng lúa mùa mưa và chuyển đổi nuôi tôm mùa khô Do ĐBSCL có mạng lưới kênh rạch phức tạp, vào mùa khô các cống ngăn mặn

có thể mở dẫn nước mặn tràn vào kênh tưới để nuôi tôm Tuy nhiên, đến mùa mưa năm sau việc thau chua rửa mặn gặp khó khăn dẫn tới mô hình này còn hạn chế Đến năm

1984, sau một loạt các nghiên cứu cải tiến quy trình, sửa đổi chính sách, quy mô ứng dụng mô hình tăng lên 5.000 ha, năm 2002 tăng lên 40.000 ha và đến năm 2016 đã lên đến 160.000ha Mô hình này được ứng dụng tại Sóc Trăng, Cà Mau, Kiên Giang, Bến Tre và Trà Vinh [32] Áp dụng mô hình canh tác này, chi phí trồng trọt giảm 20–30% do dinh dưỡng từ vụ nuôi tôm, chất thải sinh vật, ngược lại rơm rạ cùng chất dinh dưỡng sót lại trên ruộng trở thành thức ăn cho các sinh vật phù du là nguồn thức ăn cho tôm [57] Mô hình này không chỉ mang lại nguồn lợi kinh tế, tăng sản lượng và giá trị sản phẩm, đáp ứng an toàn thực phẩm mà còn có tác động tốt đến hệ sinh thái

Tuyển chọn, phát triển các giống lúa chịu mặn, chịu hạn và ứng dụng tại các vùng trồng khắc nghiệt Các nghiên cứu đánh giá, chọn lọc các giống chịu hạn mặn cho kết quả là các giống lúa đã được triển khai trồng thực tế trong nhiều năm qua như các giống

OM 5464, OM 5166, OM9916, OM9921, OM9584, OM9577 và OM9579 (chịu mặn nồng độ 4 – 6‰) và các giống OM7347, OM5464, OM6162, OM7398, OM7364, OM8928 và OM6677 (chịu hạn từ cấp 1 đến cấp 3) [18] Nhiều nghiên cứu tại Việt Nam hiện nay đã về phân lập, chuyển gene chống chịu vào cây trồng, phát triển các dòng lúa chịu hạn mặn đã được tiến hành Các nhóm gene như AREB/ABF, AP2/ERF [30], NAC, bZIP, MYB, Zinc fingers, HD–Zip protein [20] được nghiên cứu cho thấy đóng vai trò

quan trọng trong sự phát triển và đáp ứng với điều kiện khắc nghiệt của môi trường như hạn mặn Nghiên cứu của Nguyễn Thị Lang và cộng sự đã nghiên cứu thành công chuyển gene từ tổ hợp OM6162/Pokkali/OM6162 mang cả đặc tính chịu hạn và chịu mặn vào cây lúa [17]

Vi sinh vật đặc biệt là các chủng vi sinh vật vùng rễ (plant growth promoting rhizobacteria – PGPR) đã được nghiên cứu trong thời gian dài cho thấy nhiều hoạt tính tốt và khả năng chống chịu các điều kiện khắc nghiệt như hạn mặn Hướng nghiên cứu

sử dụng nhóm vi sinh vật này trong nông nghiệp trở thành một giải pháp nông nghiệp sạch bền vững trong việc hỗ trợ sự tăng trưởng, phát triển và tăng năng suất cây trồng

1.3.2 Tình hình nghiên cứu sử dụng vi sinh vật trong giải pháp hỗ trợ chống chịu hạn, mặn của cây lúa

Trước tình hình biến đổi khí hậu, suy thoái môi trường đất nông nghiệp, ảnh hưởng tiêu cực đến sự sinh trưởng, phát triển và năng suất cây trồng, trong các phương pháp phát triển nông nghiệp bền vững, hiệu quả thay thế việc sử dụng phân bón hoá học,

ứng dụng vi sinh vật là một trong những hướng đi tiềm năng

Vi sinh vật vùng rễ kích thích sinh trưởng thực vật được tìm thấy tại vùng rễ hoặc trên bề mặt rễ Chúng cung cấp chất dinh dưỡng cho cây qua quá trình hoạt động phân giải của chúng, đồng thời chúng còn tiết ra các chất dinh dưỡng và chất sinh trưởng có lợi đối với cây trồng Bên cạnh đó, chúng còn tạo ra một lượng lớn polyme dẫn đến sự kết tụ của đất từ đó cải thiện cấu trúc đất ở tầng sinh quyển, cải thiện khả năng giữ nước

và trao đổi khí [39, 50] PGPR có thể thúc đẩy tăng trưởng thực vật do khả năng cố định đạm, hòa tan lân, tăng hấp thu sắt, ức chế vi sinh vật gây bệnh, góp phần điều hòa lượng hoóc môn thực vật, tăng khả năng chống chịu của cây trồng bao gồm khả năng chịu mặn, chịu hạn [52]

Trên thế giới đã có nhiều nghiên cứu, phân lập các chủng vi khuẩn, đặc biệt là

thực vật Nghiên cứu của Tripathi và cộng sự cho thấy sự đa dạng của các vi khuẩn chịu mặn hiện diện trong vùng rễ của cây lúa nước (Oryza sativa) [55] 14 chủng vi khuẩn, được phân lập sau khi làm giàu trong môi trường không có nitơ, cho thấy chúng chịu

được nồng độ NaCl 3%, trong đó 5 chủng được biết là thuộc chi Azospirillum [56]

Chaiharn và Lumyong đã phân lập được tổng cộng có 216 vi khuẩn hòa tan phosphate

từ đất trồng lúa khác nhau ở miền Bắc Thái Lan [28] Những chủng này được sàng lọc

in vitro cho các hoạt động thúc đẩy tăng trưởng thực vật của chúng như hòa tan phosphate

vô cơ, tổng hợp amoniac (NH3), hoạt động enzyme catalase và các enzyme làm thoái hóa tế bào Kết quả cho thấy 100% các chủng có khả năng hòa tan phosphate vô cơ, 77,77% tổng hợp được NH3 và hầu hết các chủng phân lập đều dương tính với catalase Ngoài ra, một số chủng cũng sản sinh ra các enzyme phân giải như protease (7%), chitinase (1%), cellulase (3%) và β–glucanase [28] Các chủng phân lập có thể biểu hiện nhiều hơn hai hoặc ba đặc tính thúc đẩy tăng trưởng thực vật (PGPR), có thể thúc đẩy tăng trưởng thực vật trực tiếp hoặc gián tiếp Đặc biệt, nghiên cứu còn cho thấy, chủng

Acinetobacter CR 1.8 có thể phát triển ở nồng độ muối lên tới 25% [28] Các chủng vi

khuẩn như Bacillus pumilus [46], Acinetobacter sp., Azospirillum lipoferum, Bacillus

amyloliquefaciens, Frankia spp., Pseudomonas sp., Serratia [25] có khả năng làm tăng

sức chống chịu mặn của cây lúa Pseudomonas, Trichoderma [30] Azotobacter spp

Burkholderia phytofirmans [25] được bổ sung giúp làm tăng khả năng chịu hạn của cây

lúa

Tại Việt Nam, đã có nhiều nghiên cứu về các vi khuẩn vùng rễ được thực hiện cho thấy khả năng kích thích sinh trưởng thực vật từ các hoạt tính của PGPR như hoà tan lân, cố định đạm, phân giải cellulose Nghiên cứu của Vũ Thị Ngọc Diệp cùng cộng

sự đã đánh giá và cho thấy các chủng PGPR có khả năng sản sinh ACC deaminase giúp điều hoà quá trình sinh trưởng thực vật trong môi trường khắc nghiệt như hạn hay mặn [7] Một số chủng vi khuẩn đã được phân lập cho thấy khả năng chịu mặn có thể kể đến

như Bacillus megaterium, Bukholderia cenocepacia [15], Pseudomonas [21] Hai chủng

vi khuẩn chịu mặn Burkholderia sp PL9 và Acinetobacter sp GH1–1 đã cho thấy hiệu

quả giúp tăng khả năng chịu mặn, tăng năng suất ở mô hình lúa tôm khi thử nghiệm tại Sóc Trăng [16]

IAA (Indole–3–Acetic Acid) là chất kích thích sinh trưởng thực vật quan trọng

và được phát hiện sớm nhất trong nhóm hoóc môn thực vật Auxin [67] IAA được tổng hợp ở tất cả các thực vật bậc cao, tảo, nấm và vi khuẩn và có vai trò giúp kích thích kéo dài tế bào và sự hình thành rễ bên [44] Một số chủng vi khuẩn có khả năng sản sinh chất

điều hòa sinh trưởng thuộc nhóm auxin IAA như Rhizobium, Microbacterium,

Sphingomonas, Mycobacterium, Bacillus, Pseudomonas và Azotobacter được đánh giá

là có ý nghĩa to lớn đối với nền sản xuất nông nghiệp [15, 44, 67]

Nhiều nghiên cứu phân lập, tuyển chọn dòng vi khuẩn kháng mặn, kháng hạn đã được thực hiện tuy nhiên các nghiên cứu về ứng dụng PGPR làm chế phẩm vi sinh hữu

cơ vẫn còn hạn chế Do đó, nghiên cứu này được thực hiện nhằm tuyển chọn một số chủng vi khuẩn vùng rễ có khả năng chịu mặn, chịu hạn và có các hoạt tính tốt giúp kích thích sinh trưởng ở thực vật trong môi trường dinh dưỡng hữu cơ, từ đó tạo ra chế phẩm

vi sinh hữu cơ giúp tăng khả năng chống chịu hạn mặn cho cây lúa

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Đối tượng và nội dung nghiên cứu

2.1.1 Đối tượng nghiên cứu

– Bốn chủng vi khuẩn thúc đẩy sinh trưởng thực vật PGPR:

+ Hai chủng mới phân lập tại Nam Định: GL8, GY9

+ Hai chủng thuộc bộ sưu tập chủng vi khuẩn của phòng Vi sinh vật môi trường (Viện Công nghệ môi trường): DT6, DT8

– Hai giống lúa mới được phát triển tại khu vực miền Bắc và miền Trung là Bắc Thịnh

8 và Sơn Lâm 1 cùng với giống lúa cao sản ST25 được phát triển tại miền Nam

2.1.2 Nội dung nghiên cứu

– Tuyển chọn các chủng vi sinh vật kích thích sinh trưởng thực vật và tối ưu điều kiện môi trường lên men nhằm tạo ra chế phẩm vi sinh hữu cơ

• Tuyển chọn, định danh và mô tả đặc tính sinh hoá các chủng vi khuẩn có hoạt tính chịu mặn, chịu hạn và có khả năng tổng hợp chất kích thích sinh trưởng IAA

• Nghiên cứu ảnh hưởng của các điều kiện môi trường (thành phần môi trường, nhiệt độ, pH) đến khả năng tổng hợp IAA của các chủng vi khuẩn

– Nghiên cứu ảnh hưởng của chế phẩm vi sinh hữu cơ đối với khả năng sinh trưởng, phát triển và năng suất của ba giống lúa ST25, Bắc Thịnh 8 và Sơn Lâm 1 trong điều kiện hạn

và điều kiện mặn thông qua đánh giá các điều kiện môi trường cùng với thông số sinh trưởng và năng suất của cây lúa

• Các điều kiện môi trường gồm nhiệt độ, cường độ ánh sáng, pH, độ mặn, độ ẩm, tổng vi sinh vật trong đất

• Các thông số sinh trưởng của cây lúa gồm chiều cao cây, tỷ lệ cây chết, chỉ số chịu hạn và năng suất được thể hiện qua chỉ tiêu số bông lúa, tỷ lệ hạt chắc

2.2 Địa điểm và thời gian nghiên cứu

Địa điểm nghiên cứu: Phòng Vi sinh vật môi trường – Viện Công nghệ môi trường Thời gian nghiên cứu: 1/2021 – 10/2022

2.3 Phương pháp nghiên cứu

2.3.1 Vật liệu nghiên cứu

– Môi trường King B (KSB) để tuyển chọn các chủng vi khuẩn thúc đẩy sinh trưởng thực vật gồm: 20g Peptone, 1,5g K2HPO4, 1,5g MgSO4.7H2O, 10ml Glycerol, 0,5g Tryptophan hoà tan trong 1 lít nước [24]

– Môi trường dinh dưỡng cho các chủng vi khuẩn được tuyển chọn gồm: 5/10/20g bột đậu tương nghiền mịn, 10g đường, 0,3g cao nấm men hoà tan trong 1 lít nước

– Thuốc thử Salkowski cho thí nghiệm xác định hàm lượng IAA gồm 15 ml FeCl3 0,5M, 300ml H2SO4 đặc và 500ml nước cất [24]

– Nước muối sinh lý gồm: 8,5g NaCl hoà tan trong 1 lít nước cất [26]

2.3.2 Phương pháp nghiên cứu

Hình 1: Sơ đồ tóm tắt nghiên cứu

2.3.2.1 Tuyển chọn các chủng vi khuẩn PGPR tạo chế phẩm vi sinh

Tuyển chọn một số chủng vi khuẩn kích thích sinh trưởng dựa trên khả năng tổng hợp chất kích thích sinh trưởng thực vật auxin (IAA) Trong đó, hai chủng được phân lập tại ruộng lúa khu vực ngập mặn tại tỉnh Nam Định, hai chủng thuộc bộ sưu tập chủng giống đã được lưu trữ tại phòng Vi sinh vật môi trường, Viện Công nghệ môi trường Hai chủng vi khuẩn phân lập được tiến hành xác định hình thái khuẩn lạc, hình thái tế bào vi khuẩn và định danh bằng phương pháp giải trình tự gen 16S [45]

Quan sát hình thái khuẩn lạc trên đĩa thạch, nhuộm gram tế bào vi khuẩn và quan sát dưới kính hiển vi Định danh hai chủng vi khuẩn bằng phương pháp giải trình tự 16S rDNA: Hai chủng phân lập đã được chọn và xác định bằng cách sử dụng trình tự 16S rDNA Các chủng này được nuôi cấy để tạo ra sinh khối tinh khiết và chiết xuất DNA

Để khuếch đại ~ 1,5kb gen từ DNA bộ gen phân lập, bộ mồi phổ 16S rDNA [27F: 5'–AGA GTT RGA TCM TGG CTC AG–3 'và 1492R: 5'–CGG YTA CCT TGT TAC GAC TT–3 '] đã được sử dụng Giai đoạn ủ được đặt ở điều kiện nhiệt độ 55°C Các sản phẩm PCR được giải trình tự bằng Macrogen (Seoul, Hàn Quốc) Trình tự 16S rDNA của mỗi chủng được so sánh với các chủng tương đồng tại ngân hàng gen NCBI Sau đó, các trình

tự DNA được căn chỉnh với các trình tự giống nhau cao từ cơ sở dữ liệu NCBI bằng cách

sử dụng công cụ ClustalW trong phần mềm Mega X 21 để so sánh nhận dạng trình tự Các cây phát sinh loài được xây dựng từ các trình tự được căn chỉnh bằng phần mềm Mega X 21 [36] Phương pháp khả năng tối đa và mô hình Tamura–Nei đã được sử dụng

để suy ra lịch sử tiến hóa và phương pháp Bootstrap với 1000 lần lặp lại đã được áp dụng

để tái tạo cây phát sinh loài [40, 53, 54]

Xác định các đặc tính sinh hóa vi khuẩn được tham khảo từ tác giả Qinyuan Li và cộng sự gồm các thí nghiệm về Methyl Red–Voges Proskauer, khử citrate, khử nitrate, phân giải ure, sinh ammoniac, thủy phân gelatin, thủy phân tinh bột, phân hủy protein, phân hủy cellulose, phân hủy lipid [48] Khả năng sử dụng các nguồn cacbon của hai

chủng vi khuẩn được xác định bằng cách cấy hai chủng vào các môi trường dinh dưỡng khác nhau gồm canh Luria–Bertani (LB), canh dinh dưỡng (NA), canh peptone chiết xuất từ thịt (MPA), và môi trường khoáng bổ sung 6 loại carbonhydrate (glucose, saccharose, maltose, mannose, mannitol, xylose) [48]

2.3.2.2 Tối ưu hoá điều kiện môi trường tạo chế phẩm vi sinh

Đánh giá ảnh hưởng của các điều kiện môi trường đến khả năng tổng hợp IAA và khả năng sinh trưởng, phát triển của một số chủng vi sinh vật tuyển chọn Các chủng vi khuẩn có hoạt tính sản sinh chất kích thích sinh trưởng cao, chịu mặn và chịu hạn tốt được nuôi cấy trong môi trường dinh dưỡng trong 3 ngày Sau 3 ngày, mẫu được ly tâm tách lấy phần dịch nổi để xác định hàm lượng chất kích thích sinh trưởng IAA Đồng thời, sự phát triển sinh khối vi khuẩn được theo dõi theo thời gian bằng phương pháp đo mật độ quang tại thời điểm 0 – 8 – 24 – 48 – 96 giờ Thí nghiệm lặp lại 3 lần Các điều kiện được nghiên cứu gồm:

Tỷ lệ bột đậu tương 1%

Sự phát triển của vi khuẩn được đo tại thời điểm 0 – 8 – 24 – 48 – 96 giờ ở bước sóng

600 nm bằng máy quang phổ UV–Vis Lasany LI–294/296, Ấn Độ [37]

Phương pháp xác định khả năng sinh tổng hợp IAA theo TCVN 10784:2015 do

vi khuẩn tổng hợp, các chủng vi khuẩn được nuôi cấy trong môi trường KSB có bổ sung Tryptophan 2,5 mM, lắc 150 vòng/phút và ủ ở nhiệt độ phòng (28–30oC) trong 3 – 5 ngày Sau đó mẫu được ly tâm ở tốc độ 6000 vòng/phút trong 5 phút Hút 2ml dịch nổi vào bình định mức 10ml, bổ sung thuốc thử Salkowski đến vạch định mức Đặt mẫu trong tối khoảng 25 phút [24] IAA khi phản ứng với thuốc thử sẽ tạo nên phức chất có màu dải từ cam đến hồng [34] Hàm lượng chất kích thích sinh trưởng được xác định bằng cách đo độ hấp thụ quang ở bước sóng 530 nm trên máy quang phổ UV–Vis Lasany LI–294/296, Ấn Độ Dựa vào đường chuẩn chất kích thích sinh trưởng để tính toán hàm lượng [24]

2.3.2.3 Đánh giá ảnh hưởng của chế phẩm vi sinh đến khả năng chịu hạn, mặn của lúa

Phương pháp chuẩn bị thóc giống và đất trồng cho thí nghiệm tham khảo hướng dẫn kỹ thuật thâm canh cây trồng của Bộ Khoa học và Công nghệ [2]

Chuẩn bị nước ấm pha nước theo tỷ lệ 3 sôi 2 lạnh và bổ sung 10 – 15g/l muối để ngâm thóc giống trong 10 – 15 phút làm sạch thóc Thóc giống sau khi được xử lý tiến hành đãi sạch và ngâm trong nước sạch 48 – 60 giờ đối với lúa thuần Trong quá trình ngâm thóc, cứ 8 – 10 tiếng cần thay nước một lần Khi hạt thóc hút no nước (vỏ trấu vàng trong nhìn rõ được phôi trắng bên trong hạt) thì đãi sạch, để ráo nước Bọc trong khăn vải hoặc giấy ẩm ủ trong tủ ấm 30oC từ 3 – 4 ngày cho hạt thóc nứt nanh, nhú mầm

và rễ ra thì bắt đầu gieo được [2] Ba giống lúa được xử lý tương tự là ST25, Bắc Thịnh

lý hoá của đất được xác định gồm: độ ẩm đất đạt 47%, pH đạt 6,8, độ mặn 0% Đất được tán nhỏ, phơi khoảng 10 ngày Đất sau đó được bổ sung thêm đất sạch Tribat với tỷ lệ 1:1 và phân NPK với tỷ lệ 0,6 kg phân NPK loại 5N:10P:3K/30kg đất [2] Sau khi đất được xử lý tại phòng thí nghiệm, các thông số trên được xác định lại trước khi tiến hành trồng lúa Độ ẩm đất đạt 6,8%, pH = 6,9, độ mặn 0% Đất thu được là đất phù sa có giá trị pH, độ mặn và độ ẩm phù hợp với đa số các cây trồng Đất được xử lý tại phòng thí nghiệm và tiến hành trồng lúa Các thông số lý hoá tiếp tục được khảo sát trong quá trình thí nghiệm Chế phẩm vi sinh được bổ sung vào đất khi gieo mạ với tỷ lệ 1 – 5 – 10% với mẫu đối chứng không bổ sung chế phẩm

Hình 2: Sơ đồ thí nghiệm đánh giá ảnh hưởng của chế phẩm vi sinh đến khả năng chịu

mặn của ba giống lúa

(Chú thích: M: độ mặn; CP: Hàm lượng chế phẩm)

Thí nghiệm đánh giá ảnh hưởng của các nhân tố mặn và sự ảnh hưởng của phân bón vi sinh sử dụng các chủng vi khuẩn tuyển chọn đối với sự sinh trưởng và phát triển của 3 giống lúa nghiên cứu trong điều kiện mặn được bố trí dựa trên sự tham khảo phương pháp đánh giá khả năng chịu hạn của lúa từ IRRI 1997 [35] Nước muối (dung dịch NaCl) và chế phẩm vi sinh được bổ sung vào hỗn hợp đất ở các nồng độ khác nhau gồm: 1–2–4–8‰ (tương đương g/lít) với mẫu đối chứng không bổ sung nước muối Các nồng độ mặn được xây dựng dựa trên các ghi nhận độ mặn tại Nam Định và ĐBSCL [4, 37] Thí nghiệm này không được lặp lại do số lượng mẫu thí nghiệm lớn Tiến hành đo các thông số lý hoá, thông số sinh trưởng và phát triển của cây lúa từ khi gieo mạ đến khi thu hoạch

Hình 3: Sơ đồ thí nghiệm đánh giá ảnh hưởng của chế phẩm vi sinh đến khả năng chịu

hạn của ba giống

(Chú thích: CP: Hàm lượng chế phẩm; U: Tưới đủ nước; K: Gây hạn)

Thí nghiệm đánh giá ảnh hưởng của nhân tố hạn và sự ảnh hưởng của phân bón

vi sinh sử dụng các chủng vi khuẩn tuyển chọn đối với sự sinh trưởng và phát triển của

3 giống lúa nghiên cứu trong điều kiện hạn được xây dựng dựa thêm sự tham khảo nghiên cứu đánh giá khả năng chịu hạn trên lúa của Xiaofeng Zu và cộng sự năm 2017 [63] Tiến hành gây hạn tại giai đoạn đẻ nhánh (khoảng 4 tuần sau khi gieo mạ) bằng cách tháo nước và dừng tưới hoàn toàn tại các lô thí nghiệm Mẫu đối chứng tưới đủ nước,

đảm bảo độ ẩm đạt trên 100% Thí nghiệm lặp lại 2 lần Tiến hành đo các thông số lý hoá, thông số sinh trưởng và phát triển của cây lúa sau 1 và 2 tuần thí nghiệm

Hình 4: Theo dõi các thông số lý hoá (nhiệt độ, ánh sáng, pH, độ mặn, độ ẩm) và sinh

trưởng của lúa (chiều cao cây, số cây chết) trong thời gian thí nghiệm

Các thông số lý hoá sinh và thông số sinh trưởng của hai thí nghiệm chịu hạn và chịu mặn được ghi nhận như sau:

Mặn Hạn Thông số lý hoá sinh

Nhiệt độ môi trường đất được đo bằng nhiệt kế X X Giá trị pH được đo bằng máy đo pH SCHOTT Lab850, Đức X X Cường độ ánh sáng được đo bằng máy đo cường độ ánh sáng

Kuoki 3423 Lux Hitester, Nhật Bản Thông số này được đo đạc

theo ngày tại các thời điểm 8–12–17 giờ trong suốt thời gian thí

Mặn Hạn

Độ ẩm đất được xác định hàng tuần dựa trên phương pháp xác định

hệ số khô kiệt của đất trồng trọt theo phương pháp khối lượng

TCVN 4048–85 [23]

X

Phương pháp đếm khuẩn lạc được sử dụng để xác định mật độ tế

bào vi khuẩn trong đất Để xác định số lượng tế bào, mẫu được pha

loãng bằng muối sinh lý (0,85%) đã khử trùng theo dãy thập phân

Dùng pipet lấy 1ml từ mẫu dung dịch gốc hoặc 1g mẫu gốc dạng

rắn cho vào ống nghiệm chứa 9ml nước muối sinh lý khử trùng ta

được dung dịch có nồng độ bằng 10–1 mẫu gốc (hoặc dung dịch có

độ pha loãng 10 lần hoặc hệ số pha loãng 10–1) Dùng pipet lấy 1ml

dung dịch có nồng độ 10–1 cho vào ống nghiệm chứa 9ml nước

muối sinh lý khử trùng ta được dung dịch có độ pha loãng 102 (hoặc

hệ số pha loãng 10–2) Lặp lại các bước ta được các dung dịch có

độ pha loãng cao hơn Mẫu pha loãng (0,1ml) được cấy trên đĩa

thạch chứa môi trường thích hợp và được ủ ở 30oC trong 24h để

cho khuẩn lạc phát triển hoàn thiện Số lượng tế bào được ước

lượng thông qua đếm khuẩn lạc mọc trên môi trường thạch, mỗi

nồng độ pha loãng được lặp lại 3 đĩa Số khuẩn lạc trên đĩa thạch

dao động 30 – 300 khuẩn lạc Kết quả thể hiện bằng số khuẩn lạc

hình thành trên ml (cfu/ml) [26] Công thức xác định số lượng tế

bào và bào tử:

X = a.b.10 (cfu/ml) a: số lượng khuẩn lạc xuất hiện trên đĩa petri b: hệ số pha loãng

X

Mặn Hạn Thông số sinh trưởng, phát triển của lúa

Chiều cao cây (cm) được xác định từ gốc đến ngọn X X

Tỷ lệ hạt chắc (%): hạt chắc là các hạt tròn, mẩy, cứng và có chứa

hạt gạo bên trong vỏ

X

Tỷ lệ chết (%): cây chết có đặc điểm là lá và thân vàng, khô, không

tăng trưởng chiều cao

Giá trị chịu hạn được xác định theo công thức: Xj=(F1/F2 + S1/S2

+ T1/T2)/3 Trong đó F1: chiều dài phần lá còn xanh của lá đầu

tiên, F2: tổng chiều dài lá đầu tiên tính từ ngọn, S1: chiều dài phần

lá còn xanh của lá thứ 2, S2: tổng chiều dài lá thứ 2, T1: chiều dài

phần lá còn xanh của lá thứ 3, T2: tổng chiều dài lá thứ 3 [63]

X

2.3.3 Phương pháp xử lý số liệu

Các số liệu về khảo sát thông số lý hoá và các thông số sinh trưởng phát triển được tổng hợp và xử lý bằng phần mềm Excel, R studio Đồ thị được vẽ bằng phần mềm Originlab 2019 Phương pháp phân tích thành phần chính được sử dụng để mô tả mức ảnh hưởng của các nhân tố lý hoá sinh (pH, nhiệt độ, cường độ ánh sáng, độ mặn, độ ẩm, hàm lượng vi sinh vật thay đổi) đối với các chỉ tiêu sinh trưởng, phát triển và năng suất của cây lúa (chiều cao trung bình, tỷ lệ chết, tỷ lệ hạt chắc, chỉ số chịu hạn) [68] được

xử lý bằng phần mềm R studio Các dữ liệu được logarit tự nhiên nhằm đưa chúng về giá trị không có đơn vị

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN

3.1 Đặc điểm của vi sinh vật tạo chế phẩm

Dựa vào khả năng kháng hạn và kháng mặn của các chủng vi khuẩn, bốn chủng

vi khuẩn được lựa chọn cho nghiên cứu bao gồm hai chủng thuộc bộ sưu tập vi sinh vật

của phòng Vi sinh vật môi trường (Bacillus aerophilus DT6, Halobacillus sp DT8) và

hai chủng vi khuẩn phân lập từ đất ruộng tại vùng ngập mặn Nam Định (GL8 và GY9) Chủng DT6 và DT8 cho thấy khả năng chịu mặn trong môi trường chứa 10% NaCl [37] trong khi chủng GL8 và GY9 có khả năng sinh trưởng trong môi trường có nồng độ NaCl lần lượt là 12,5% và 15% Bên cạnh đó, hai chủng DT6 và DT8 còn có khả năng chống chịu hạn khi trong dung dịch polyethylene glycol 10% [37]

3.1.1 Khả năng tổng hợp chất kích thích sinh trưởng thực vật của các chủng vi sinh vật tuyển chọn

Bốn chủng trên được tiến hành nuôi cấy trong môi trường KSB bổ sung tryptophan nhằm xác định khả năng tổng hợp chất kích thích sinh trưởng thực vật IAA

Hình 5: Khả năng tổng hợp IAA của bốn chủng PGPR trong môi trường KSB bổ sung

Tryptophan

Khả năng tổng hợp IAA của bốn chủng được thể hiện tại hình 5 Cả bốn chủng đều có khả năng tổng hợp IAA với hàm lượng dao động từ 4,2 – 8 mg/l sau ba ngày thí

nghiệm Trong đó, hàm lượng IAA cao nhất được sản sinh bởi chủng GL8 và thấp nhất bởi chủng GY9

Chủng DT6 và DT8 đã được định danh và xác định một số hoạt tính sinh học trong nghiên cứu của tác giả Hồ Tú Cường và cộng sự [37] Kết quả giải trình tự gene

16S rDNA cho thấy chủng DT6 tương đồng với chủng Bacillus aerophilus và chủng DT8 tương đồng với chủng Halobacillus sp Hai chủng trên có khả năng chịu mặn, chịu

hạn và tổng hợp IAA trong môi trường có bổ sung Tryptophan [37] Cây phát sinh loài

và hình thái tế bào của hai chủng phân lập GL8 và GY9 được thể hiện ở hình 6

Hình 6: Cây phát sinh loài chủng GL8 (A) và GY9 (B) và hình ảnh nhuộm gram hai

chủng vi khuẩn (GL8–C, GY9–D)

Hình thái của chủng GL8 và GY9 được mô tả trong hình 6C và 6D Cả hai chủng đều là vi khuẩn gram dương, hình que Trên môi trường thạch, khuẩn lạc của chúng có hình tròn, đục và bóng Chủng GL8 có khuẩn lạc màu vàng nhạt và chủng GY9 có khuẩn lạc màu trắng (phụ lục 1) Giải trình tự gen hai chủng trên và so sánh với các trình tự gen

trên ngân hàng gen, phân tích cây phát sinh loài cho thấy hai chủng này tương đồng với

chi Bacillus Cụ thể, chủng GL8 có tỷ lệ tương đồng 100% với chủng Bacillus

megaterium DMS 32 và chủng GY9 có tỷ lệ tương đồng 100% với chủng Bacillus altitudinis DSM 26896

Các đặc tính sinh hoá của hai chủng phân lập cũng được xác định và so sánh với

các chủng đối chứng Bacillus megaterium DMS 32 và Bacillus altitudinis DSM 26896

tại bảng 1

Bảng 1: Đặc tính sinh hoá của các chủng PGPR tuyển chọn

(*: Chủng đối chứng B megaterium; **:Chủng đối chứng B.altitudinis; ni: không có thông tin Dữ liệu của các chủng đối chứng được tham khảo từ website: https://bacdive.dsmz.de/)

Chủng GL8 có phản ứng dương tính với thử nghiệm urease, ammonia và VP trong

khi chủng đối chứng B megaterium DSM 32 không có thông tin Chủng GY9 và chủng đối chứng B altitudinis DSM 26896 có cùng kết quả dương tính với thử nghiệm thuỷ

phân gelatin và khử citrate Tuy nhiên ở thử nghiệm khử nitrate, chủng GY9 có phản ứng âm tính trong khi chủng đối chứng có phản ứng dương tính Thử nghiệm khả năng lên men đường, cả hai chủng đều sinh trưởng tốt trong môi trường có bổ sung đường glucose, saccharose, mannitol nhưng không sinh trưởng trong môi trường có bổ sung đường xylose, mannose và maltose Trong khi đó chủng đối chứng DSM 32 sinh trưởng được trong môi trường chứa maltose (không có thông tin đối với các loại đường còn lại) Tuy có 100% tương đồng về trình tự đoạn gen 16S rDNA, một số kết quả thử nghiệm sinh hoá cho thấy chủng phân lập có đặc điểm khác với chủng đối chứng có thể do các gen mã hoá chức năng có trình tự khác biệt Cần phải giải trình tự toàn bộ hệ gen của chủng và so với đối chứng để xác định thêm Bên cạnh đó, đã có nhiều nghiên cứu về chủng hai chủng trên cho thấy chủng có khả năng sinh trưởng trong điều kiện mặn và ô nhiễm kim loại nặng [44, 47] với hoạt tính tổng hợp IAA [47, 67]

3.1.2 Ảnh hưởng của điều kiện môi trường đến hoạt tính kích thích sinh trưởng thực vật của các chủng tuyển chọn

Đậu tương là nguyên liệu hữu cơ đã được nghiên cứu và ứng dụng nhiều trong thực phẩm và thức ăn chăn nuôi bởi chúng có hàm lượng chất dinh dưỡng cao gồm 38% protein, 30% carbohydrate, 18% dầu và khoảng 14% các thành phần khác như độ ẩm, tro, hoóc môn (isoflavone, saponin, lecithin) [38] Do đó, bột đậu tương cho thấy tiềm năng là nguồn cung cấp carbon, nito và phospho giá rẻ khi ứng dụng làm nguyên liệu lên men vi sinh vật Trong nghiên cứu này, bốn chủng vi khuẩn sau khi khảo sát khả năng sinh IAA được nuôi cấy trong sáu môi trường có bổ sung bột đậu tương ở các nồng độ khác nhau nhằm đánh giá khả năng sinh trưởng và tổng hợp IAA trong môi trường dinh dưỡng hữu cơ Kết quả được thể hiện tại hình 7

Hình 7: Ảnh hưởng của hàm lượng bột đậu tương tới khả năng sinh trưởng của bốn

chủng PGPR

(Chú thích: S1: 2% BĐT; S2: 1% BĐT, 1% đường; S3: 1% BĐT, 1% đường, 0,03% cao nấm

men; S4: 1% BĐT, 0,03% cao nấm men; S5: 1% BĐT; S6: 0,5% BĐT)

Sau ba ngày nuôi cấy, kết quả đo mật độ quang cho thấy các chủng phát triển tốt nhất trong môi trường S2 (1% đường và 1% bột đậu tượng) với độ hấp thụ dao động từ 0,31 – 0,45 abs (bước sóng 600 nm), trong khi ở các môi trường khác, độ hấp thụ quang dao động từ 0,2 – 0,343 abs

Hình 8: Ảnh hưởng của hàm lượng bột đậu tương tới khả năng tổng hợp IAA của các

chủng vi khuẩn PGPR

(Chú thích: S1: 2% BĐT; S2: 1% BĐT, 1% đường; S3: 1% BĐT, 1% đường, 0,03% cao nấm

men; S4: 1% BĐT, 0,03% cao nấm men; S5: 1% BĐT; S6: 0,5% BĐT)

Tuy nhiên, các chủng vi khuẩn tổng hợp hàm lượng IAA khác nhau tùy thuộc vào môi trường nuôi cấy Hàm lượng IAA thấp nhất trong môi trường S2 Trong môi trường S5 (tỷ lệ 1% bột đậu tương), hầu hết các chủng cho kết quả hàm lượng IAA được tổng hợp là cao nhất (13,77 – 19,14 mg/l) ngoại trừ chủng GY9 (13,57 mg/l) Hàm lượng IAA của chủng GY9 tổng hợp được cao nhất trong môi trường S4 đạt 14,79 mg/l (1% bột đậu tương và 0,03% nấm men) Kết quả thí nghiệm cho thấy việc tăng hàm lượng bột đậu tương tỷ lệ thuận với việc tăng hàm lượng IAA tổng hợp khi đạt đến nồng độ 1% Nấm men và đường có thể ức chế khả năng tổng hợp IAA của vi khuẩn Do đó, môi trường S5 được lựa chọn để nuôi cấy hỗn hợp các chủng vi khuẩn trên trong các điều kiện pH

và nhiệt độ khác biệt nhằm tối ưu hoá điều kiện nuôi cấy

Sử dụng phương pháp nuôi cấy hỗn hợp vi khuẩn trên đĩa thạch [26,45], kết quả chỉ ra khuẩn lạc của cả bốn chủng đều phát triển tốt trên môi trường S5 Các chủng được