TRƯỜNG ĐẠI HỌC MỞ HÀ NỘI VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC VÀ CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM LUẬN VĂN THẠC SĨ NGHIÊN CỨU TUYỂN CHỌN MỘT SỐ CHỦNG XẠ KHUẨN VÀ NẤM CÓ HOẠT TÍNH XYLANASE CAO ỨNG DỤNG VÀO QUY
TỔNG QUAN
Xylan
Xylan là thành phần cấu trúc chính của thành tế bào thực vật và sau cellulose là loại polysacarit tái tạo d i dào thứ hai trong tự nhiên [16] Nó là hemicellulose chính trong gỗ cứng từ thực vật hạt kín và ít có trong gỗ mềm từ thực vật hạt trần, chiếm khoảng 15 ÷ 30% và 7 ÷ 12% tổng trọng lƣợng khô của chúng [48] Trong các mô gỗ, xylan nằm chủ yếu ở thành tế bào thứ cấp, nơi cùng với lignin, nó tạo thành một ma trận vô định hình và gắn các vi sợi cellulose Xylan tương tác với lignin và cellulose thông qua các liên kết cộng hóa trị và không cộng hóa trị, những tương tác này có tầm quan trọng trong việc bảo vệ các vi sợi cellulose chống lại sự phân hủy sinh học và duy trì tính toàn vẹn cấu trúc của thành tế bào
Hình 1.1 Sự có mặt của xylan trong tế bào thực vật
Về mặt cấu trúc, xylan là một chất đ ng nhất của các gốc D-xylopyranose trong các liên kết β (1→4) với mức độ trùng hợp nằm trong khoảng từ 150 đến 200 Đoạn mạch này được thay thế bằng một số loại đường và axit hữu cơ, chẳng hạn nhƣ arabinose, axit glucuronic, ferulic axit, v.v Xylan đƣợc phân loại rộng rãi thành bốn nhóm chính dựa trên các nhóm thế của nó, viz., homoxylan, arabinoxylan, glucuronoxylan và glucuronoarabinoxylan Homoxylan chỉ chứa dƣ lƣợng xyloza và có thể là tuyến tính hoặc phân nhánh [43] Arabinoxylans bao g m chuỗi chính (1→4)-β-xylan, nhƣng đƣợc thay thế bằng gốc α-arabinosyl Các gốc D-xylopyranosyl đƣợc liên kết với β-(1→4) đƣợc thay thế bằng một axit 4- O - methyl- D -glucuronic được liên kết với α-(1→2) trong trường hợp kết với arabinofuranose và axit uronic [20] Chuỗi bên xác định độ hòa tan, cấu trúc vật lý và khả năng phản ứng của phân tử xylan với các thành phần hemicellulose khác, do đó, ảnh hưởng lớn đến phương thức và mức độ phân cắt enzyme.
Đặc điểm sinh học lớp vỏ cây keo
Cây keo là loại cây có tên khoa học là Acacia, thuộc chi Keo họ đậu (Fabaceae), xuất xứ từ đại lục cổ Gondwana Cây gỗ keo đƣợc tr ng ở nhiều vùng trên thế giới nên đƣợc phân ra thành các loại khác nhau Cụ thể nhƣ: wattle (loại cây gỗ keo vùng Úc), acacia (loại cây gỗ keo vùng châu Phi, châu Mỹ) Ở Việt Nam, cây keo đƣợc du nhập từ lâu, đƣợc tr ng và ứng dụng nhiều trong đời sống: lấy gỗ, sản xuất tannin… và chống xói mòn ở nhiều vùng khác nhau
Các nghiên cứu đã chứng minh tiềm năng của vỏ cây trong việc sản xuất sản phẩm mới Bên cạnh đó, việc ứng dụng vỏ cây cũng đem lại lợi ích về mặt kỹ thuật, kinh tế, xã hội và môi trường.
Vỏ cây có thành phần hóa học phức tạp, do đó có nhiều lợi ích từ giải phẫu, sinh lý, hóa học, tính chất cơ lý, cách sử dụng và bóc vỏ Có nhiều tài liệu về việc sử dụng vỏ cây nhưng chỉ sử dụng tương đối ít về mặt kinh tế do tính phức tạp và sự khác biệt lớn giữa vỏ của các loài khác nhau Vỏ của hầu hết các cây keo đều giàu tannin, đƣợc sử dụng trong thuộc da, thuốc nhuộm, mực, dƣợc phẩm và các sản phẩm khác Một số cây keo Úc là ngu n cung cấp tannin có giá trị, trong số đó có keo vàng (A pycnantha), keo xanh (A decurrens) và keo bạc
Vỏ cây chiếm 10% ÷ 25% trọng lƣợng thân cây khô và lên tới 25% thể tích thân cây, tùy thuộc vào loài cây, độ tuổi và thổ nhƣỡng Sau khi cây đổ, vỏ cây thường bước vào quá trình phân hủy trong khi vẫn còn dính vào gỗ Vỏ cây còn dính bao lâu tùy thuộc vào loài cây, độ phân hủy thời gian và điều kiện môi trường
[41] Vỏ cây là lớp ngoài cùng của thân cây, bảo vệ cây khỏi các điều kiện môi trường bất lợi bao g m thời tiết, sâu, bệnh hại Lớp vỏ bên ngoài được làm mới liên tục từ bên trong, giúp giữ ẩm khi trời mƣa, giúp cây không bị mất độ ẩm khi không khí khô Vỏ bên trong (phloem) nơi dự trữ chất dinh dƣỡng và có chức năng dẫn các chất dinh dưỡng từ lá cây xuống gốc theo thân cây để sinh trưởng và phát triển Nó chỉ sống đƣợc một thời gian ngắn r i chết đi và chuyển sang dạng bần để trở thành một phần của lớp vỏ bảo vệ bên ngoài Vỏ cây có lớp ngoài và lớp trong (phloem) tạo thành hai trong số năm lớp thân cây Ở nước ta, gỗ cây lá rộng (chủ yếu là keo và bạch đàn) được sử dụng nhiều làm nguyên liệu sản xuất giấy, cây thường có độ tuổi 4 ÷ 6 năm, đường kính thân cây tầm 1,3 m, trung bình 20 ÷ 30 cm Tùy điều kiện địa lý và khí hậu khác nhau, cây nguyên liệu vùng nhiệt đới thường không đ ng đều về kích thước, có sự chênh lệch khá lớn về đường kính giữa phần gốc và phần ngọn, do cây phát triển nhanh
Trong thành phần vỏ cây, ngoài thành phần pectin còn có thành phần hemicellulose chiếm một lƣợng khá lớn Hemicellulose là hỗn hợp của một số loại polysacarit phổ biến, đứng thứ hai trong gỗ cứng và thực vật chiếm 20 ÷ 30% Trong cấu trúc của hemicellulose, các đơn vị đường liên kết với hemicellulose theo những cách khác nhau chủ yếu tạo thành xylan, mannans, glucomannans, và xyloglucans Ngoài ra, các chuỗi polyme của hemicellulose có các nhánh ngắn và vô định hình Do hình thái vô định hình, các hemicellulose có thể hòa tan một phần hoặc hòa tan trong nước Cấu trúc chính của chuỗi hemicellulose có thể là homopolyme (thường bao g m đơn vị lặp lại đường đơn) hoặc dị trùng hợp (hỗn hợp của các loại đường khác nhau) Hemicellulose trong gỗ mềm khác với cấu trúc trong gỗ cứng Hemicellulose đƣợc chiết xuất từ các ngu n thực vật và vị trí thực vật khác nhau có cấu trúc và phân tử khác nhau [22, 36] Hemicelluloses trong vách thứ cấp của tế bào gỗ cứng chủ yếu là glucuronoxylan hoặc 4-O-methyl- glucuronoxylan với một số nhóm acetyl; trong khi đó hemicellulose của tế bào gỗ mềm chủ yếu là mannan, galactose, glucose hoặc O-ethyl-galactose, glucose, mannan [25].
Xylanase
Do tính không đ ng nhất và phức tạp của xylan nên quá trình thủy phân hoàn toàn xylan đòi hỏi nhiều loại enzyme hoạt động đƣợc gọi chung là xylanase
Xylanase đƣợc sản xuất bởi các sinh vật sống khác nhau nhƣ vi sinh vật, động vật nguyên sinh và động vật thân mềm và cũng đƣợc tìm thấy trong dạ cỏ của động vật bậc cao [11] Xylanase chủ yếu đƣợc sản xuất bởi các vi sinh vật, ví dụ nhƣ vi khuẩn, nấm và xạ khuẩn ở quy mô công nghiệp [35] Có thể nhận thấy, các nhóm vi sinh vật sinh xylanase có phân bố khá rộng và tham gia tích cực vào các chu trình tuần hoàn vật chất, nhất là các quá trình phân giải chất hữu cơ để hình thành chất mùn [49] Các loại xylanase đƣợc sinh ra bởi vi khuẩn và nấm sợi ƣa kiềm có khả năng chịu nhiệt tốt hơn nên đƣợc ứng dụng rộng rãi và cho hiệu quả cao hơn trong công nghiệp [31]
Xylanase đƣợc báo cáo lần đầu tiên vào năm 1955 Đó là enzyme thủy phân xylan, phá vỡ liên kết β-1,4-xylanosidic của xylan thành nhiều xylo-oligosaccharide có độ dài khác nhau Xylanase về cơ bản thuộc nhóm enzyme hydrolase, chính xác là hydrolase glycoside Phân loại glycoside hydrolase dựa trên trình tự đã đặt xylanase vào hai họ GH10 và GH11, nhƣng xylanase cũng đƣợc tìm thấy ở các họ glycoside hydrolase khác, chẳng hạn nhƣ GH5, 7, 8 và 43 Các enzyme thực vật, nấm và vi khuẩn bao g m họ GH10, trong khi đó họ GH11 không liên quan về mặt cấu trúc chỉ bao g m các enzyme của nấm và vi khuẩn [30] Họ GH10 bao g m kết thúc bằng 1,4-β-xylanase và 1,3-β-xylanase, nhƣng phần lớn kết thúc là1,4-β- xylanase với một ít kết thúc là 1,3-β-xylanase Chúng có tính linh hoạt xúc tác cao hơn và có thể xúc tác quá trình thủy phân thậm chí cả cellulose và aryl β- D - cellobiosides Trong xylan liên kết hỗn hợp, GH10 xylanase có thể tấn công vào các liên kết β-1,4 đứng trước liên kết β-1,3, nhưng không tấn công vào các liên kết ngay sau liên kết β-1,3 GH10 xylanase có thể tấn công các liên kết β-1,3 ở hai bên bởi các liên kết β-1,4 Họ xylanase này cũng có thể chịu đƣợc sự thay thế một hoặc hai gốc xyloza liên tiếp bằng các gốc glucose trong cơ chất Các thành viên của họ này có khả năng thủy phân aryl β-glycoside của xylobiose và xylotriose ở liên kết aglyconic Hơn nữa, các enzyme này có hoạt tính cao trên các xylooligosacarit ngắn, do đó chỉ ra các vị trí liên kết cơ chất nhỏ [37] Các phân tích về cấu trúc tinh thể, hoạt tính động học của xylooligosaccharide và sản phẩm cuối cùng đã chỉ ra rằng xylanase họ 10 thường có 4 ÷ 5 vị trí liên kết cơ chất Hầu hết các xylanase
GH 10 thường có khối lượng phân tử cao, pI thấp và cấu trúc nếp gấp (α/β)8
Các enzyme GH11 có tính đặc hiệu đơn, chỉ phân cắt các liên kết xyloid β-1,4 bên trong trong xylan Các sản phẩm hoạt động của chúng có thể bị thủy phân thêm bởi các enzyme họ 10 Được coi là "xylanase thực sự", chúng chỉ tác dụng với cơ chất chứa D-xyloza Xylanase GH11 có khối lượng phân tử thấp, điểm đẳng điện cao và phạm vi pH tối ưu rộng từ 2 đến 11 GH11 thủy phân aryl β-glycoside của xylobiose và xylotriose ở liên kết aglyconic nhưng không thể phân cắt cellulose hoặc aryl β-D-cellobioside Enzyme GH11 tốt nhất là cắt các vùng không thay thế của xylan.
[19] Xylanase GH8 có cả pI và trọng lƣợng phân tử cao Sáu enzym thuộc họ này đã đƣợc chứng minh là có hoạt tính phân hủy xylan [16]
Trong những năm vừa qua, xylanase ngày càng thu hút sự chú ý của các nhà khoa học vì tiềm năng ứng dụng của chúng trong các ngành công nghiệp Enzyme này đƣợc nghiên cứu kỹ ở vi khuẩn, xạ khuẩn và nấm để ứng dụng trong công nghệ sinh học Do cấu trúc không đ ng nhất của xylan nên để thuỷ phân hoàn toàn xylan thành các hydratcacbon đơn giản cần sự tham gia của một hệ enzym bao g m endo- 1,4--xylanase, -xylosidase, -glucuronidase và -L-arabinofuranosidase Enzyme quan trọng nhất trong số đó là endo1,4--D-xylanase, xúc tác thủy phân ngẫu nhiên mối liên kết β-1,4 glucozit có trong mạch chính của xylan tạo thành xylo- oligosaccharid Sau đó xylo-oligosaccharid đƣợc thủy phân bởi enzym -xylosidase tạo thành đường xylose Khối lượng phân tử 1,4 -D-endoxylanase từ 8 đến 150 kDa và điểm đẳng điện khoảng 3 ÷ 10 Xylanase có thể đƣợc phân loại theo cấu trúc vào 2 nhóm chính Nhóm thứ nhất có khối lượng phân tử tương đối cao, điểm đẳng điện thấp và chịu nhiệt Nhóm thứ 2, xylanase có khối lượng phân tử tương đối thấp, điểm đẳng điện cao và thường bị mất hoạt tính vì nhạy cảm với các thay đổi của điều kiện môi trường như pH, nhiệt độ và sự có mặt của các ion kim loại
Các enzyme g m cắt nhóm thế ở mạch nhánh xylan, giải phóng các nhóm thế tạo điều kiện thuận lợi cho việc thủy phân mạch chính Nhóm enzyme này bao g m: -L-arabinofuranosidase giải phóng ra arabinoza; -D – glucuronidase cắt axit D-glucuronic và axit 4-O-methyl-S-glucuronic; acetyl xylan esterase loại bỏ axit acetic; ferulic axit esterase (EC 3.2.1.73) loại bỏ axit ferulic; p-coumaric axit esterase loại bỏ axit p-coumaric.
Đặc điểm xylanase từ vi sinh vật
Vì xylan là một polyme lớn không thể xâm nhập vào tế bào nên xylanase phải được tiết ra môi trường ngoại bào để tiếp cận và thủy phân nó Hầu hết các enzyme thủy phân polysaccharide kiểu nhƣ cellulose và xylanase đƣợc biết đến với sự thủy phân các cơ chất của chúng với sự duy trì của cấu hình anomeric C1
Hình 1.2 Cấu trúc của xylan và các vị trí bị cắt bởi các enzyme phân giải xylan
Những enzyme tham gia quá trình phân hủy xylan sẽ khác nhau về tính đặc hiệu của chúng đối với polyme xylan Nhiều loại chỉ phân cắt ở những vùng không đƣợc thay thế trong khi những vùng khác lại làm chuỗi bên ở vùng lân cận của các liên kết bị cắt [17] Hầu hết, các xylanase cũng hoạt động trên các xylooligomer có mức độ trùng hợp lớn hơn 2, cho thấy tăng ái lực với các xylooligomer có chiều dài tăng dần Xylanase là loại enzyme thủy phân các liên kết bên trong xylan và hoạt động theo cơ chế ngẫu nhiên tạo ra hỗn hợp xylooligosacarit từ polyme Tuy nhiên, đặc tính xylanase của Aeromonas chỉ tạo ra một loại oligosacarit làm sản phẩm phản ứng từ xylan đã gợi ý một giải pháp thay thế phương thức thủy phân: cơ chế loại exo từ một đầu của polyme [27] tương tự như phương thức hoạt động tiến trình của exocellulase trong phân hủy cellulose [32] Tuy nhiên, vì loại cơ chế đầu tiên này sẽ yêu cầu làm cạn kiệt các chuỗi bên của xylan nên exoxylanase để phân hủy xylan dường như khó xảy ra
Enzyme xylanase được hầu hết các vi sinh vật sản sinh trong quá trình phát triển trên cơ chất chứa xylan Các oligosaccharide hòa tan được giải phóng ra nhờ hoạt động của enzyme sẽ được vận chuyển vào tế bào, gây nên sự biểu hiện xylanase Đối với nấm Cryptococcus albidus, xylobiose được xem là chất cảm ứng tự nhiên hoặc tiền chất của các hợp chất gây ra sự biểu hiện xylanase.
1.4.2 Đặc tính sinh học của xylanase
Xylanase của vi khuẩn có đặc điểm khác với enzyme của nấm Xylanase của vi khuẩn và xạ khuẩn (Bacillus spp., Pseudomonas spp., Streptomyces spp.) có dải pH hoạt động rộng từ 5 ÷ 9 và nhiệt độ từ 35 ÷ 60C, do đó đƣợc ứng dụng rộng rãi trong nhiều ngành công nghiệp, bao g m công nghiệp giấy Xylanase của nấm (Aspergillus sp., Fusarium sp., Penicillium sp.) hoạt động chủ yếu trong dải pH 4 ÷
6 và nhiệt độ dưới 50C nên phạm vi ứng dụng có hạn chế hơn enzyme của vi khuẩn Tuy nhiên, nấm lại là chủng sinh xylanase quan trọng do hoạt tính enzyme cao hơn, hiệu suất sinh enzyme cao và tiết enzyme ngoại bào Ngoài ra, nhiều chủng nấm có hoạt tính xylanase nhƣng không có hoặc có hoạt tính cellulase rất thấp [8]
Vi khuẩn sinh xylanase thuộc về các chi nhƣ Bacillus, Cellulomonas, Micrococcus,
Staphylococcus, Paenibacillus, Arthrobacter, Microbacterium, Pseudoxanthomonas, và Rhodothermus, còn phần lớn xạ khuẩn sinh enzyme thuộc các chi Streptomyces, Actinomadura, Nonomuraea Rất nhiều loại xylanase có đặc tính bền nhiệt, có khả năng thích ứng với nhiệt độ thấp hoặc tính chịu kiềm đã đƣợc thu nhận từ nhiều loài vi sinh vật khác nhau, bao g m cả vi khuẩn chịu điều kiện khắc nghiệt [47] Chi Bacillus đƣợc coi là có tiềm năng cao để sản xuất xylanase (B circulans, B stearothermophilus, B amyloliquefaciens, B subtilis, B pumilus và B halodurans [42] Xylanase bền nhiệt, có hoạt tính ở nhiệt độ cao tới 60 ÷ 70 o C, đƣợc thu nhận từ các loài nhƣ Bacillus spp., Stenotrophomonas maltophila, Rhodothermus marinus, Thermotoga sp., Clostridium thermocellum, và Streptomyces sp Xylanase thích nghi với nhiệt độ thấp hiếm gặp hơn, nhƣng có thể thu nhận từ Flavobacterium frigidarium và Clostridium sp PXLY1 Trong lên men sản xuất các xylanase, vi khuẩn có ƣu thế hơn so với nấm vì pH tối ƣu của môi trường ở trong khoảng trung tính đến kiềm, trong khi nấm cần pH axit, làm quá trình lên men và thu h i phức tạp hơn Một số chủng vi khuẩn nhƣ B pumilus, B halodurans, và Geobacillus thermoleovorans và xạ khuẩn nhƣ Streptomyces sp và Actinomadura sp sinh xylanase bền ở môi trường kiềm nên có tiềm năng ứng dụng cao [14]
1.4.3 Các yếu tố ảnh hưởng đến khả năng sinh trưởng và sinh tổng hợp xylanase từ vi sinh vật
Thành phần môi trường nuôi cấy ảnh hưởng đến hoạt động sống và quá trình sinh tổng hợp enzym của vi sinh vật Môi trường nuôi cấy phải đảm bảo sự sinh trưởng của vi sinh vật và tổng hợp enzyme, cung cấp đủ các hợp chất chứa N, C, H, O, các chất khoáng như Mg, K, Ca, P, S, Fe, Mặc dù thành phần môi trường có thể khác nhau, nhưng tất cả vi sinh vật sinh tổng hợp enzyme đều sử dụng cacbon, hydro, oxy (thường có trong hợp chất hữu cơ) và có thể đồng hóa hydro ở dạng nước và oxy phân tử Chất dinh dưỡng từ môi trường nuôi cấy đáp ứng nhu cầu năng lượng cho các quá trình trao đổi chất của vi sinh vật và xây dựng tế bào.
Ngu n nitơ có thể ở dạng vô cơ và hữu cơ:
Nitơ vô cơ: thường sử dụng các dạng muối (NH 4 ) 2 SO 4 , NaNO 3 , (NH) 4 NO 3, CH 4 N 2 O… để cung cấp nitơ Thành phần và tính chất của muối vô cơ còn làm thay đổi giá trị pH của môi trường nuôi cấy Môi trường sẽ bị axit hóa khi sử dụng muối amoni, vì lúc đó, vi sinh vật sử dụng ion NH 4 + và dƣ gốc anion, ngược lại nếu dùng muối nitrat sẽ gây kiềm hóa môi trường vì NO 3 - được vi sinh vật sử dụng và dƣ ion kim loại tự do
Nitơ hữu cơ: thường là nước chiết malt, nước chiết ngô, cao ngô, cao nấm men, pepton và một số sản phẩm phụ có chứa hemixenluloza còn nhiều protein như bã đậu nành, bã ngô nghiền ngâm nước Ngu n nitơ hữu cơ từ các axit amin kiềm đƣợc sử dụng tốt hơn các axit amin trung tính, ngoại trừ L-serin Hầu hết các nhóm xạ khuẩn có các enzym ngoại bào để có thể thuỷ phân tinh bột, protein, cellulose để tạo thành ngu n dinh dƣỡng
Các nguyên tố khoáng: Nhu cầu về chất khoáng không giống nhau đối với từng loài, từng giai đoạn phát triển của vi sinh vật Người ta nhận thấy, n ng độ cần thiết về chất khoáng đối với nấm và xạ khuẩn thường thay đổi trong phạm vi sau:
Quá trình sinh tổng hợp enzyme xylanase bị ảnh hưởng từ mức độ ức chế trung bình đến mạnh bởi AgNO 3 , Co(NO 3 ) 2 , HgCl 2 , KMnO 4 , MnCl 2 và hoạt tính xylanase bị ức chế mạnh bởi CuSO 4 , EDTA, SnCl 2 và ZnCl 2 Ngoài ra, đối với các chủng vi sinh vật, việc sử dụng hoặc chịu đƣợc n ng độ muối cao là một đặc tính quan trọng Xạ khuẩn có khả năng chịu muối từ 3 ÷ 5%, còn ở n ng độ cao hơn thì thường bị tiêu diệt
Nhiệt độ và pH là hai yếu tố quan trọng ảnh hưởng đến sự phát triển và sinh tổng hợp sản phẩm của vi sinh vật Nấm thường ưa sống trong môi trường axit (pH thấp) trong khi vi khuẩn, đặc biệt là Bacillus, phát triển tốt ở môi trường trung tính đến kiềm (pH cao) Xạ khuẩn ưa nhiệt độ từ 20-37 độ C, tuy nhiên cũng có một số loài chịu nhiệt có thể phát triển ở 45-50 độ C So với nấm, xạ khuẩn thường thích nghi với pH nuôi cao hơn Ví dụ, chủng Streptomyces olivaceoviridis E-86 có hoạt tính xylanase cao nhất ở pH 6,0.
Nhu cầu về Oxy: Đối với vi sinh vật, nhu cầu oxy là khác nhau trong các giai đoạn sinh trưởng Trong thời kỳ đầu, sinh khối còn ít, tốc độ hoà tan oxy lớn và thông khí mạnh là không cần thiết Mức độ thông khí cần tăng dần theo sự tích luỹ sinh khối trong môi trường Như vậy, nhu cầu oxy thay đổi trong quá trình nuôi cấy liên quan tới tốc độ sinh trưởng, đầu tiên nó tăng dần lên cực đại r i lại giảm xuống, thông thường nhu cầu oxy đạt cực đại khi vi sinh vật vẫn chưa ngừng sinh trưởng nhƣng đã có dấu hiệu chậm lại hoặc giảm Nhu cầu này phụ thuộc vào lƣợng sinh khối, tốc độ sinh trưởng và hoạt tính sinh lý của tế bào cũng như điều kiện môi trường xung quanh Ngoài ra, độ thông khí còn phụ thuộc vào các sản phẩm trao đổi chất được tích luỹ trong môi trường Nhìn chung, xạ khuẩn thuộc loại ưa khí trung bình, nhƣng chế độ cấp khí và khuấy trộn cần phải đƣợc điều chỉnh phù hợp tùy theo từng quá trình lên men cụ thể, nghĩa là tuỳ theo chủng giống, thành phần môi trường, nhiệt độ và mật độ tế bào Để thu đƣợc hiệu suất enzyme xylanase cao hơn cần bổ sung chất cảm ứng với tỷ lệ thích hợp, sử dụng các chất cảm ứng tổng hợp tương tự chất cảm ứng tự nhiên, hoặc sử dụng chất chuyển hóa rất chậm Chất cảm ứng tương tự như các xylobioza hoặc xylooligosacarit có chứa lưu huỳnh, không có khả năng tham gia vào quá trình trao đổi chất mà vẫn duy trì khả năng tương tác với quá trình tổng hợp enzyme trong tế bào Mặt khác, axyl este của xylobioza hoặc xylooligosacarit có ích bởi vì chúng bị chuyển hóa rất chậm Các chất cảm ứng thường sử dụng là các sản phẩm phụ rơm, lõi ngô, bã mía và bã sắn, cám và vỏ của các loại ngũ cốc, các loại mùm cưa và bã chế biến các loại quả, nước ép, dầu, cà phê Cảm ứng xylanase thường tăng cường bằng cách tăng n ng độ cơ chất Trong lên men bề mặt, cơ chất cảm ứng xylan có thể đƣợc sử dụng ở n ng độ cao để sinh ra nhiều xylanase, điều này hầu nhƣ không thể xảy ra trong lên men chìm Tuy nhiên, sử dụng hệ thống lên men bổ sung thay cho lên men chìm theo mẻ có thể tăng n ng độ cơ chất để sinh ra xylanase
1.4.4 Phân loại các chủng vi sinh vật có khả năng sinh xylanase
Hầu hết xạ khuẩn và nấm đƣợc phân loại theo sự khác nhau về đặc điểm hình thái và tính chất nuôi cấy nhƣ: màu sắc khuẩn lạc, sắc tố hoà tan, sự có mặt và không có của khuẩn ty cơ chất giả, hình dạng và kết cấu mặt bào tử Tuy nhiên, cùng một loài có thể biểu hiện khác nhau về hình thái do biến dị tự nhiên hay những loài khác nhau có thể giống nhau về mặt hình thái Do vậy, ngày nay, để phân loại vi sinh vật chính xác hơn phải dùng kết hợp các chỉ tiêu khác nhƣ các đặc điểm sinh lý, sinh hoá (khả năng đ ng hoá các ngu n cacbon và nitơ, nhu cầu chất kích thích sinh trưởng, khả năng biến đổi các chất khác nhau nhờ hệ thống enzyme), miễn dịch học hay sinh học phân tử
Các chỉ tiêu khác cũng được xác định như ảnh hưởng của pH, nhiệt độ, NaCl và các yếu tố khác của môi trường; mối quan hệ với các chất kìm hãm sinh trưởng và phát triển khác nhau; tính chất đối kháng và nhạy cảm với chất kháng sinh; khả năng tạo thành chất kháng sinh và các sản phẩm trao đổi chất đặc trƣng khác
VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Vật liệu nghiên cứu
Các mẫu vỏ cây keo tai tƣợng 3 ÷ 5 năm tuổi lấy từ vùng cây nguyên liệu của nhà máy Giấy Bãi Bằng đƣợc sử dụng để phân lập các chủng xạ khuẩn và nấm mốc.
Hóa chất và thiết bị, môi trường
Các loại hóa chất chính đƣợc sử dụng trong nghiên cứu bao g m:
(NH 4 ) 2 SO 4 , H 2 SO 4 , HCl, FeCl 3 , NaCl, I 2 , KI, NH 4 Cl, CaCO 3, MgSO 4 ,
KH 2 PO 4 , K 2 HPO 4 , Na 2 HPO 4 , NaH 2 PO 4 , C 2 H 5 OH, cao malt, cao thịt, skim milk, tinh bột tan, tryptone, pepton (Merck-Đức); indole-3-acetic acid (Sigma-Mỹ, safranin, fuchsin, congo red (Sigma-Mỹ)
Bảng 2.1 Thiết bị được sử dụng trong nghiên cứu
Thiết bị Nơi sản xuất
N i hấp tiệt trùng SA-252F Đài Loan
Máy so màu UV-VIS Halo RB-10 Trung Quốc
Máy khấy từ gia nhiệt ARE Ý
Máy cất nước 2 lần WSC/4D Anh
Tủ sấy, khử trùng khô, UN55 Đức
Tủ ổn nhiệt, ISS-3075 Hàn Quốc
Cân phân tích 4 số lẻ Trung Quốc
Tủ bảo quản mẫu MPR-S313-PK Nhật Bản
Tủ âm sâu chuyên dụng MDF-U334-PE Nhật Bản
Kính hiển vi BX53 Nhật Bản
Glassware: 100, 250, 500 ml triangular flask, glass beaker, measuring cylinder, petri dish; 1.5 ml and 2.0 ml Eppendorf tubes (Finetech – Taiwan); Glass slide, Slide (Marienfeld - Germany); 200 ul and 1000 ul tips
Môi trường Gause I (G1) (g/l): tinh bột tan 20; K 2 HPO 4 0,5; MgSO 4 0,5; KNO 3 0,5; NaCl 0,5; FeSO 4 0,01; thạch 20; nước cất 1l; pH 7,2 ÷ 7,4
Môi trường Gause II (G2) (thạch hữu cơ) (g/l): nước chiết thịt 30ml; pepton 5; NaCl 5; glucoza 10; thạch 20; nước cất 1l; pH 7,0 ÷ 7,2
Môi trường Hansen (g/l): glucose 50; KH2PO4 3; MgSO4 7H2O 3; peptone 10; thạch 20; nước cất 1l; pH=6,0
Môi trường ISP1 (I1) (g/l): trypton 5; cao nấm men 3; thạch 20; nước cất 1l; pH 7,0 ÷ 7,2
Môi trường ISP2 (I2) (g/l): cao nấm men 4; cao malt 10; glucose 4; nước cất 1l; thạch 20, pH 7,3
Môi trường ISP3 (I3) (g/l): bột yến mạch 20; dung dịch muối vi lượng 1,0 ml; thạch 20; nước cất 1l; pH 7,0
Môi trường ISP4 (I4) (g/l): tinh bột tan 10; K 2 HPO 4 1; MgSO 4 7H 2 0 1; NaCl 1; (NH 4 ) 2 SO 4 2; CaCO 3 2; dung dịch khoáng A 1ml; thạch 20; nước cất 1l; pH 7,2 ÷ 7,4
Môi trường ISP5 (I5) (g/l): L-asparagine 1; glycerine 10; K2HPO 4 ; dung dịch muối vi lượng 1,0 ml; thạch 20; nước cất 1l; pH 7,0
Môi trường ISP6 (I6) (g/l): petone 10; cao nấm men 1; citrate 0,5; thạch 20; nước cất 1l; pH 7,0
Môi trường ISP7 (I7) (g/l): glycerine 15; L- tyrosine 0,5; L- asparagine 1;
K 2 HPO 4 0,5; MgSO 4 7H 2 O 0,5; NaCl 0,5; FeSO 4 7H 2 O 0,01; dung dịch muối vi lượng 1,0 ml; thạch 20, nước cất 1l; pH 7,0
Môi trường ISP8 (I8) (nitrat) (g/l): pepton 1; NaCl 0,5; KNO3 1; thạch 20; nước cất 1l, pH 7,0
Môi trường ISP9 (I9) (g/l): (NH 4 ) 2 SO 4 2,46; KH 2 PO 4 2,38; K 2 HPO 4 3H 2 O 5,65; MgSO 4 7H 2 O 1,0; Vi lượng B 1,0 ml; thạch 20; nước cất 1l; pH 7,0
Môi trường Czapek (gl): sacarose 30; NaNO 3 2; K 2 HPO 4 1; MgSO 4 7H2O 0,5; KCl 0,5; FeSO 4 7H2O 0,01; thạch 20; nước cất 1l; pH 7,0
Môi trường MS (g/l): K2HPO 4 2,27; KH 2 PO 4 0,95; (NH 4 ) 2 SO 4 0,67; dung dịch muối vi lượng 1,0 ml; thạch 20; nước cất 1l; pH 7,0
Môi trường PDA (g/l): khoai tây 200, dextrose 20, thạch 20, nước cất 1l; pH 5,6 ± 0,2.
Phương pháp nghiên cứu
2.3.1 Phân lập và tuyển chọn các chủng xạ khuẩn và nấm mốc có hoạt tính xylanase cao Để phân lập và kiểm tra khả năng sinh xylanase của các chủng xạ khuẩn và nấm mốc, chúng tôi sử dụng môi trường Gause I (đối với xạ khuẩn) và môi trường Czapek (đối với nấm) có bổ sung thêm cơ chất xylan 0,5%, nuôi 28 ÷ 37 o C trong 2 ÷ 4 ngày Các đĩa đƣợc kết tủa xylan bằng cách đổ ethanol lên bề mặt đĩa trong 2 ÷
3 giờ ở nhiệt độ phòng Chọn khuẩn lạc có các vòng sáng trong xung quanh trên nền môi trường mờ đục Những chủng cấy có hoạt tính xylanase được giữ giống bằng môi trường Gause I (đối với xạ khuẩn) và môi trường Czapek (đối với nấm)
Xạ khuẩn được cấy chuyển từ ống nghiệm chứa dung dịch trữ giống vào ống nghiệm chứa môi trường thạch nghiêng trường Gause II và nuôi cấy trong 5 ngày Sau đó, giống được chuyển sang nuôi cấy trong bình tam giác trên máy lắc với tốc độ 180 vòng/phút và nhiệt độ duy trì trong khoảng 28 ÷ 30°C.
37 o C trong 48 giờ (giống cấp 1) Sau đó, đƣợc chuyển sang bình tam giác khác để lên men thu nhận enzyme, hoạt lực enzyme xylanase sẽ được kiểm tra theo phương pháp 2.3.2
2.3.2 Phương pháp xác định hoạt tính xylanase bằng DNS
Nguyên tắc của phương pháp này dựa trên sự thủy phân cơ chất xylan bởi enzyme xylanase Lượng đường khử sinh ra trong phản ứng này sẽ phản ứng với DNS (dinitro salicylic acid) tạo thành dung dịch có màu vàng cam Màu dung dịch được xác định bằng phương pháp so màu trên máy quang phổ ở bước sóng 540nm Cuối cùng, lượng đường khử được xác định từ đồ thị chuẩn của đường xylose.
Hỗn hợp phản ứng: 250àl dung dịch enzyme thụ (đó pha loóng) tỏc dụng với
250 àl dung dịch cơ chất xylan 1% pha trong đệm natri citrate 50mM, pH 6.5 Ủ ở 50 o C trong 30 phút Sau đó, làm lạnh ở nhiệt độ phòng trong 5 phút Ly tâm ở 10000v/p, trong 2 phút ở 4 o C, thu lấy dịch trong và định lượng đường xylose trong phản ứng
- Định lượng đường xylose: 125àl dịch đường xylose sau phản ứng enzyme tỏc dụng với 125àl dung dịch DNS, mix đều mẫu ở nhiệt độ phũng Sau đú, đun sụi trong 10 phút, làm lạnh ở nhiệt độ phòng 5 phút và đo OD 540nm
Mẫu đối chứng: 250àl dung dịch enzyme thụ (đó pha loóng) tỏc dụng với 250àl dung dịch đệm natri citrate 50mM; pH 6.5 Ủ ở 50 o C trong 10 phỳt Sau đú, làm tương tự như mẫu đối chứng và đo OD 540nm Định nghĩa: Một đơn vị hoạt độ của xylanase đƣợc định nghĩa là lƣợng enzyme cần thiết để giải phúng 1 àmol đường xylose trong một phỳt trong cỏc điều kiện thí nghiệm
Hoạt tính xylanase đƣợc tính toán theo công thức
UI/l = ×1000 Trong đó: X: Lượng đường khử tương đương được tạo ra (mg/ml)
D: Hệ số pha loãng enzyme V: Thể tích enzyme (ml) (0,25ml) T: Thời gian phản ứng (30 phút)
2.3.3 Phương pháp xác định hoạt tính cellulase bằng DNS
Hoạt tính cellulase được xác định bằng phương pháp so màu DNS, bao gồm: trộn 0,1 ml enzyme thô với 0,4 ml dung dịch cơ chất CMC và ủ 30 phút ở 30°C, sau đó dừng phản ứng bằng 0,6 ml DNS và đun sôi 5 phút Cuối cùng, để nguội ở nhiệt độ phòng 10 phút trước khi đo.
OD 540nm N ng độ glucose giải phóng được xác định bằng đường chuẩn glucose Mẫu đối chứng, làm tương tự nhưng sử dụng enzyme bất hoạt (đun sôi 10 phút) Hoạt tớnh của cellulase được biểu thị bằng lượng glucose tương đương (àg glucose) đƣợc giải phóng trên mỗi ml dung dịch enzyme thô và thời gian ủ
2.3.4 Nghiên cứu tuyển chọn chủng sinh xylanase phù hợp với quy trình bóc vỏ cây keo
Dịch lên men xylanase của các chủng sau thời gian lên men ở điều kiện nuôi lắc 160 vòng/phút ở nhiệt độ phòng trong thời gian 6 ngày, đƣợc ly tâm loại sinh khối, xác định hoạt tính enzyme theo phần 2.3.2 Dịch enzyme thô đƣợc pha loãng với nước máy với tỉ lệ 1/10 (v/v) và bổ sung gỗ keo ngâm với các điều kiện: 1 lít dịch enzyme pha loóng/ 3 khoanh gỗ keo (ỉ 8 ữ 10cm x 5 ữ 10cm) ở điều kiện nhiệt độ phòng, theo dõi sự biến động hoạt tính enzyme và khả năng tách vỏ cây khỏi phần thịt gỗ
2.3.5 Nghiên cứu đặc điểm sinh học và phân loại các chủng vi sinh vật có hoạt tính xylanase cao
Nghiên cứu đặc điểm hình thái
Chủng xạ khuẩn đƣợc nuôi trên các MT ISP1 ÷ ISP6, ở 30 o C Sau 7, 14 và
21 ngày, quan sát khuẩn lạc, màu sắc của khuẩn ty khí sinh, khuẩn ty cơ chất và sắc tố tiết ra MT, sự hình thành sắc tố melanin theo phương pháp của Tresner và Backus
Chủng nấm được nuôi trên môi trường PDA, Czapek, Hansen Sau 2 ÷ 5 ngày, quan sát khuẩn lạc, màu sắc, bào tử
Quan sát đặc điểm tế bào
Xạ khuẩn được nuôi trên MT Gause I, nấm được nuôi trên môi trường Czapek có cắm lamen nghiêng trên mặt MT, ở nhiệt độ 28 ÷ 30 o C Sau 7 ÷ 14 ngày, quan sát khuẩn ty và hình dạng cuống sinh bào tử trên lamen bằng kính hiển vi quang học Bề mặt bào tử: Dùng lưới đ ng có phủ lớp collodion đặt trực tiếp lên bề mặt khuẩn ty khí sinh có bào tử, quan sát và chụp ảnh dưới kính hiển vi điện tử
Khả năng đồng hóa các nguồn cacbon và niơ
Các nguồn đường khác nhau (D-glucose, Saccharose, D- matose, D-fructose, D-xylose, Lactose, Arabinose) được bổ sung với tỷ lệ 1% vào môi trường ISP9 dành cho vi khuẩn xạ khuẩn và môi trường Czapek dành cho nấm Môi trường Czapek sử dụng nguồn carbon glucose được chọn làm đối chứng dương, trong khi môi trường ISP9 không bổ sung đường được chọn làm đối chứng âm.
Ngu n nitơ khác nhau được bổ sung với tỷ lệ 1% vào môi trường ISP9 đối với xạ khuẩn và môi trường Czapek đối với nấm g m: cao thịt, cao nấm men, pepton, ure, (NH 4 ) 2 SO 4 , KNO 3 , NaNO 3
Phương pháp xử lý số liệu
Các kết quả phân tích đƣợc xử lý bằng các thuật toán thống kê sử dụng phần mềm Microsoft Excel.
KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN
Phân lập và tuyển chọn các chủng xạ khuẩn và nấm có hoạt tính xylanase cao
3.1.1 Phân lập các chủng nấm mốc và xạ khuẩn
Chúng tôi đã phân lập các chủng vi sinh vật từ mẫu vỏ cây keo bao gồm xạ khuẩn và nấm mốc bằng cách sử dụng môi trường nuôi cấy chuyên biệt có bổ sung vỏ cây keo Sau quá trình tách và làm sạch, khả năng sinh enzyme xylanase của các chủng vi sinh vật được kiểm tra bằng cách bổ sung cơ chất xylan 0,5% Kết quả cho thấy một số chủng có khả năng sinh enzyme xylanase với hoạt lực cao.
Hình 3.1 Mẫu gỗ keo 3 năm tuổi sau khi tách lớp vỏ ngoài
Hình 3.2 Hình ảnh một số chủng nấm mốc và xạ khuẩn trong các mẫu vỏ cây
Hình 3.3 Định tính xylanase của các chủng xạ khuẩn phân lập từ các mẫu vỏ cây keo
Hình 3.4 Định tính xylanase của các chủng nấm mốc phân lập từ các mẫu vỏ cây keo
Kết quả thể hiện ở bảng 3.1 đã phân lập đƣợc 18 chủng xạ khuẩn và 18 chủng nấm mốc kiểm tra hoạt tính xylanase bằng cách cấy chấm điểm trên môi trường có chứa xylan 0,5% (Hình 3.3 và 3.4) Kết quả đã thu được 5 chủng xạ khuẩn có vòng phân giải xylan ≤ 5 mm, 8 chủng có vòng phân giải xylan 5 ÷ 10 mm và 5 chủng có vòng phân giải xylan > 10 mm Đối với nấm mốc, số chủng có vòng phân giải xylan ≤ 5 mm là 6 chủng, có 8 chủng có vòng phân giải xylan 5 ÷ 10mm và có 4 chủng có vòng phân giải xylan > 10 mm Từ các chủng có vòng phân giải xylan > 10 mm, chúng tôi đã chọn mỗi loại 3 chủng để tiếp tục nghiên cứu
Bảng 3.1 Đường kính vòng phân giải xylanase của các chủng nấm mốc và xạ khuẩn
vòng phân giải xylan (mm)
vòng phân giải xylan (mm)
vòng phân giải xylan (mm)
3.1.2 Tuyển chọn các chủng xạ khuẩn có hoạt tính xylanase cao phù hợp với quy trình bóc vỏ
Trong 6 chủng vi sinh vật lựa chọn (3 chủng xạ khuẩn là X24, X4 và X12; 3 chủng nấm mốc N3, N11 và T1) có vòng phân giải xylan lớn hơn 10 mm, đƣợc kiểm tra hoạt độ xylanase và cellulase, kết quả thể hiện ở Bảng 3.2
Bảng 3.2 Khả năng sinh tổng hợp xylanase và cellulase của các nấm mốc và xạ khuẩn trên môi trường có bổ sung vỏ cây keo (10g/l)
Chủng Xylanase (IU/l) Cellulase (IU/l)
Kết quả thể hiện ở bảng 3.2 cho thấy, các chủng sau quá trình lên men trên môi trường có bổ sung vỏ cây keo, khả năng sinh tổng hợp xylanase của các chủng xạ khuẩn cao nhất là chủng X4 đạt 1588,08 IU/l, chủng X12 đạt 1174,67 IU/l và chủng X24 đạt 1128,46 IU/l Hoạt tính cellulase cao nhất ở chủng X24 đạt 145,32 IU/l, thấp nhất là chủng X12 đạt 110,67 IU/l Đối với các chủng nấm mốc, hoạt tính xylanase cao nhất ở chủng T1 đạt 1765,00 IU/l, chủng N3 đạt 1676,85 IU/l và chủng N11 đạt 1594,77 IU/l Hoạt tính cellulase cao nhất ở chủng N11 đạt 218,88 IU/l, thấp nhất là chủng N3 đạt 154,20 IU/l Theo nghiên cứu của một số tác giả, hemicellulose đƣợc tìm thấy trong cây gỗ cứng chủ yếu là xylan với một lƣợng nhỏ glucomannan, trong khi ở gỗ mềm, chủ yếu giàu galactoglucomannan và chỉ chứa một lƣợng nhỏ xylan Với keo tai tƣợng Acacia mangium, hàm lƣợng hemicellulose trong vỏ cây chỉ chiếm 11 ÷ 20% ở cả 3 phần gốc, thân giữa và ngọn cây Còn ở trong gỗ, hemicellulose có hàm lƣợng cao hơn hẳn 35 ÷ 36% Điều này góp phần giải thích cho kết quả hoạt tính xylanase được sinh tổng hợp trong môi trường được bổ sung cơ chất vỏ cây Đối với quá trình tạo bột giấy, việc có mặt cellulase có thể gây ra những tác động không mong muốn, các enzyme này có thể cắt đứt các liên kết trong chuỗi phân tử cellulose Tuy nhiên, sự có mặt ở một lƣợng nhỏ các enzyme này có thể tham gia cắt một số liên kết có trong lớp vỏ, thúc đẩy quá trình nong vỏ trở lên dễ dàng hơn Do vậy, chúng tôi đã chọn các chủng có hoạt tính cao nhất ở mỗi loại đối với xạ khuẩn là X4 và nấm mốc T1 để tiếp tục nghiên cứu.
Nghiên cứu đặc điểm sinh học của chủng nấm và xạ khuẩn
3.2.1 Đặc điểm hình thái khuẩn lạc và chuỗi bào tử Đặc điểm sinh học của chủng nấm mốc T1 đƣợc thực hiện theo khóa phân loại của Đặng Vũ H ng Miên, 2015 (Hình 3.5) [6], đối với chủng xạ khuẩn X4 đặc điểm sinh học đƣợc thực hiện theo theo khóa phân loại của Bergey (Holt JC, 1994) và ISP, kết quả thể hiện ở hình 3.6 [23]
Hình 3.5 Khả năng phát triển và đặc điểm khuẩn lạc của chủng nấm mốc
Hình 3.6 Khả năng phát triển và đặc điểm khuẩn lạc của chủng xạ khuẩn X4
Hình 3.7 Hình thái chuỗi bào tử và dạng bào tử của chủng nấm mốc T1
Hình 3.8 Hình thái chuỗi bào tử và dạng bào tử của chủng xạ khuẩn X4
Chủng X4 thuộc nhóm xạ khuẩn màu nâu xám, sinh trưởng tốt trên các môi trường ISP1 ÷ 3, ISP5, ISP6, Gause I và sinh trưởng yếu trên môi trường ISP4, Gause I Khuẩn ty khí sinh có màu xám nhạt trên môi trường ISP1 và ISP5, màu nâu xám trên ISP2, ISP4, ISP6 và Gause I, màu nâu trên Gause II Trên các môi trường ISP1, ISP4 và ISP6, khuẩn ty cơ chất có màu vàng nhạt và có màu vàng trên ISP2, ISP3, ISP5 và Gause II Chủng X4 không tạo sắc tố melanin trên các môi trường nghiên cứu (Hình 3.6), chuỗi bào tử có dạng xoắn (Hình 3.8) Đặc điểm sinh trưởng của chủng nấm mốc T1: có khuẩn lạc phát triển, đạt đường kính 5cm/3 ngày trên môi trường PDA, Hansen ở nhiệt độ 25C, mặt dạng bông và thưa, và tạo ra các đường tròn đ ng tâm lúc non có màu trắng về già có màu xanh lục (Hình 3.5) Chủng nấm mốc T1 có các sợi phân nhánh tạo nên các vách ngăn, sợi nấm dài phát triển dày trên môi trường thạch và tạo nên các cuống phân nhánh sinh bào tử, sinh bào tử trần đơn bào không màu, trong suốt không ngăn cách, có dạng hình trứng Các bào tử trần t n tại dạng đơn hoặc kiểu dạng đám, phát sinh từ sợi sinh dƣỡng mọc thành từng đám có cuống phình ra, phát sinh bởi sự kéo dài của gốc ghép, khi thời gian nuôi cấy dài các bào tử trần này sẽ sinh ra mảnh và gắn kết chặt chẽ với nhau thể hiện ở hình 3.5 và hình 3.7
3.2.2 Khả năng đồng hóa các nguồn cacbon và nitơ
Khả năng sử dụng ngu n cacbon của các chủng xạ khuẩn X4 đƣợc đánh giá thông qua sự phát triển trên môi trường khoáng ISP9 và nấm mốc T1 trên môi trường Czapek, trong đó ngu n cacbon được thay thế bởi các loại đường khác nhau
Sự phát triển của các chủng đƣợc thể hiện trong bảng 3.3
Bảng 3.3 Khả năng sinh trưởng của chủng X4 và T1 trên môi trường có nguồn cacbon khác nhau
Khả năng phát triển của hai chủng ở các ngu n cacbon khác nhau ĐC D- glucose Saccharose D- matose
Ghi chú: “+” Phát triển tốt bằng hoặc tốt hơn đối chứng dương; “-” Không phát triển (khoáng)
Hình 3.9 Khả năng phát triển của chủng xạ khuẩn X4 (A) và nấm mốc T1 (B) ở các nguồn đường khác nhau
Nghiên cứu khả năng đ ng hóa các ngu n đường là chỉ tiêu quan trọng để tiến hành phân loại xạ khuẩn theo khóa phân loại của Nonomura trong ISP [34] Kết quả cho thấy, chủng X4 có khả năng đ ng hoá nhiều loại đường, phát triển tốt trên các môi trường có bổ sung D-glucose, D-xylose, D-mannitol, D-fructose, L- rhamnose phát triển yếu trên môi trường có lactose, raffinose và saccharose (Hình 3.9A) Đối với chủng nấm mốc T1 có khả năng đ ng hoá và phát triển tốt trên các môi trường có bổ sung D-glucose, D-xylose, D-mannitol, D-fructose, L- rhamnose phát triển yếu trên môi trường có lactose, raffinose và saccharose (Hình 3.9B)
Nitơ là một yếu tố cấu trúc quan trọng cần thiết cho quá trình trao đổi chất trong hệ thống vi sinh vật Vì vậy, việc lựa chọn ngu n nitơ rất quan trọng đối với sự phát triển của vi sinh vật, điều này sau đó ảnh hưởng đến năng suất enzyme tổng nitơ thích hợp Yêu cầu của các ngu n nitơ này khác nhau đối với các vi sinh vật khác nhau Do đó, tối ưu hóa loại và mức độ ngu n nitơ trong môi trường là một thông số quan trọng [24, 33, 40] Do đó, việc điều chỉnh mức độ của chúng trong môi trường là rất quan trọng để điều chỉnh việc sản xuất xylanase
Bảng 3.4 Khả năng sinh trưởng của chủng X4 và T1 trên môi trường có nguồn nitơ khác nhau
Khả năng phát triển của hai chủng ở các ngu n nitơ khác nhau Đc
Cao nấm men Pepton Ure (NH 4 ) 2 SO 4 KNO 3 NaNO 3
Ghi chú: “+” Phát triển tốt bằng hoặc tốt hơn đối chứng dương và “-” Không phát triển (khoáng)
Hình 3.10 Khả năng sinh trưởng cuả các chủng nấm mốc T1 trên môi trường có nguồn nitơ khác nhau
Kết quả ở bảng 3.4 và hình 3.10 cho thấy, chủng X4 và T1 đều có khả năng đ ng hoá hầu hết các ngu n nitơ sử dụng trong nghiên cứu
3.2.3 Ảnh hưởng của nhiệt độ, pH và nồng độ muối đến sự sinh trưởng và phát triển cuả chủng nấm mốc T1 và xạ khuẩn X4
Hoạt động trao đổi chất của sinh vật được thúc đẩy bởi các phản ứng sinh hóa trong tế bào, phụ thuộc nhiều vào các yếu tố môi trường như nhiệt độ, độ pH và nồng độ muối Những yếu tố này ảnh hưởng đáng kể đến sự sinh trưởng và phát triển của sinh vật, như thể hiện trong kết quả quan sát đối với hai chủng được nghiên cứu.
Bảng 3.5 Ảnh hưởng của nồng độ muối đến sinh trưởng của 2 chủng X4 và T1
Khả năng phát triển của hai chủng ở môi trường có n ng độ
NaCl ban đầu khác nhau
Ghi chú: “+” Phát triển tốt bằng hoặc tốt hơn đối chứng dương; “-” Không phát triển (khoáng)
Hình 3.11 Khả năng phát triển của các chủng xạ khuẩn X4 ở môi trường có nồng độ NaCl ban đầu khác nhau
Hình 3.12 Khả năng phát triển của chủng nấm mốc T1 ở các nhiệt độ khác nhau
Bảng 3.5 và hình 3.11 cho thấy chủng X4 và T1 sinh trưởng được ở n ng độ NaCl từ 0 ÷ 7%, không sinh trưởng ở n ng độ NaCl.10%
Bảng 3.6 Ảnh hưởng của nhiệt độ môi trường nuôi đến sự sinh trưởng của 2 chủng X4 và T1
Khả năng phát triển của hai chủng ở các nhiệt độ (C) nuôi khác nhau
Ghi chú: “+” Phát triển tốt bằng hoặc tốt hơn đối chứng dương;
Bảng 3.6 và hình 3.12 cho thấy chủng X4 sinh trưởng tốt ở dải nhiệt độ từ 15 ± 45 o C, chủng T1 sinh trưởng tốt từ 25 ÷ 37 o C, không sinh trưởng ở 45 o C Ở nhiệt độ cao, hầu hết các vi sinh vật bị chết do protein bị biến tính, dẫn đến bất hoạt một số enzyme và màng tế bào chất bị phá hoại Nhiệt độ thấp có thể làm ảnh hưởng đến quá trình vận chuyển các chất hòa tan qua màng tế bào chất do thay đổi cấu trúc không gian của một số permease chứa trong màng hoặc ảnh hưởng đến việc hình thành và tiêu thụ ATP cần cho quá trình vận chuyển chủ động các chất dinh dƣỡng
Hình 3.13 Khả năng phát triển của chủng xạ khuẩn X4 ở pH ban đầu khác nhau
Bảng 3.7 Ảnh hưởng của pH môi trường ban đầu đến sinh trưởng của 2 chủng X4 và T1
Khoảng pH môi trường sinh trưởng của 2 chủng lựa chọn
Ghi chú: “+” Phát triển tốt bằng hoặc tốt hơn đối chứng dương;
Các nghiên cứu trước đây đã chỉ ra rằng, pH môi trường có tác động sâu sắc tới các quá trình trao đổi chất của vi sinh vật Kết quả cho thấy, chủng xạ khuẩn X4 có thể sinh trưởng được ở pH 5 ÷ 8 Đối với chủng nấm mốc T1 phát triển tốt từ pH
Kết quả nghiên cứu đặc điểm về hình thái khuẩn lạc và chuỗi bào tử của hai chủng, đối chiếu theo các khóa phân loại xạ khuẩn và nấm có thể kết luận chủng xạ khuẩn X4 thuộc về chi Streptomyces và chủng nấm mốc T1 thuộc về chi Trichoderma.
Nghiên cứu phân loại chủng xạ khuẩn và nấm dựa trên trình tự gen
3.3.1 Nghiên cứu thu nhận DNA tổng số của hai chủng
Các chủng xạ khuẩn và nấm sau quá trình tách DNA tổng số đƣợc kiểm tra bằng phương pháp chạy điện di thạch agarose và thể hiện ở hình 3.14
Hình 3.14 Kết quả tách DNA tổng số của các chủng xạ khuẩn X4 và nấm mốc
Hình 3.15 Kết quả nhân đoạn gen 16S rRNA của chủng xạ khuẩn X4 (A) và đoạn gen 5.8S rRNA nấm mốc T1(B)
Kết quả thể hiện trên hình 3.14, cho thấy sản phẩm DNA tổng số sau quá trình tách tạo thành các băng chạy có độ nét, rõ ràng không tạo ra các băng phụ, điều này chứng tỏ các đoạn DNA tổng số thu đƣợc không bị đứt và gẫy trong quá trình tách Kết quả DNA thu đƣợc từ các chủng khi đo trên máy nano drop cho giá trị là 116,6 ÷ 145,6 ng/àl (hỡnh 3.14) với chỉ số A260/A280 tương ứng là 1,8 ữ 2,1, đõy là cỏc chỉ số rất tốt cho quá trình tiếp theo, chứng tỏ sản phẩm không có sự lẫn các phân tử
3.3.2 Nhân đoạn gen 16S rRNA và 5.8S rRNA của hai chủng tuyển chọn bằng phương pháp PCR
Sản phẩm PCR thu được sau phản ứng được kiểm tra bằng phương pháp điện di, kết quả thể hiện hình 3.15
Kết quả thể hiện trên hình 3.15 cho thấy, sản phẩm đoạn gen sau phản ứng PCR tạo thành các băng duy nhất có độ nét với kích thước thu được 1,5kb (xạ khuẩn) và khoảng 500bp (đối với nấm mốc) khi đối chiếu với thang macker chuẩn và tập trung rõ ràng, không tạo ra các băng phụ, điều này chứng tỏ các đoạn gen thu đƣợc sau phản ứng PCR thu đƣợc có chất lƣợng cao, cặp m i sử dụng cho phản ứng có tính đặc hiệu Sản phẩm đủ yêu cầu để thực hiện các bước nghiên cứu tiếp theo
3.3.3 Giải trình tự gen và đối chiếu với cơ sở dữ liệu GenBank để phân loại hai chủng có khả năng sinh xylanase cao
Sản phẩm phản ứng PCR sau khi tinh sạch, giải theo phương pháp Sanger dựa trên kỹ thuật phổ biến là “chain termination- kết thúc chuỗi” bằng việc sử dụng các deoxy nucleotide đã bị chỉnh sửa làm mất nhóm hydroxyl ở đầu 3’ của phân tử đường Dựa vào sự sai khác về độ dài các đoạn DNA hiển thị trên bản gel sau điện di để xác định trình tự trong gene và phân tích, kết quả thể hiện ở hình 3.16 và hình 3.17
Hình 3.16 Trình tự gen 16S rRNA của chủng X4 Bảng 3.8 Kết quả so sánh trình tự gen mã hóa 16S rRNA của chủng X4 với gen tương ứng của các chủng xạ khuẩn được đăng ký trên GenBank
Trình tự gen 16S rRNA của chủng xạ khuẩn đƣợc so sánh
Mã số truy cập trên GenBank Độ tương đ ng (%)
CCCAACCCCAATGTGAACGTTACCAATCTGTTGCCTCGGCGGGATTCTCTTGCCCCGGGCGCGTCGCAGCCCCGGATCCCATGGCGCCCGCCGGAGGACCAACTCCAAACTCTTTTTTCTCTCCGTCGCGGCTCCCGTCGCGGCTCTGTTTTATTTTTGCTCTGAGCCTTTCTCGGCGACCCTAGCGGGCGTCTCGAAAATGAATCAAAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGTTCTGGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATAAGTAATGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACATTGCGCCCGCCAGTATTCTGGCGGGCATGCCTGTCCGAGCGTCATTTCAACCCTCGAACCCCTCCGGGGGGTCGGCGTTGGGGATCGGCCCCTCACCGGGCCGCCCCCGAAATACAGTGGCGGTCTCGCCGCAGCCTCTCCTGCGCAGTAGTTTGCACACTCGCACCGGGAGCGCGGCGCGGCCACAGCCGTAAAACACCCCAAACTTCTGAAATGTTGACCTCGGATCAGGTAGGAATACCCGCTGAACTTAAGCATATCAATAAGCCGGAGGAAA
Hình 3.17 Trình tự gen 16S rRNA của chủng T1 Bảng 3.9 Kết quả so sánh trình tự gen mã hóa 5,8S rRNA của chủng T1 với gen tương ứng của các chủng nấm được đăng ký trên GenBank
Trình tự gen 5,8S rRNA của chủng nấm đƣợc so sánh
Mã số truy cập trên GenBank Độ tương đ ng (%)
Trichoderma virens 1259 DQ093713 99,0 Đã tách thành công DNA tổng số cuả chủng xạ khuẩn X4 và chủng nấm mốc
CATGCAGTCGAACGATGAACCACTTCGGTGGGGATTAGTGGCGAACGGGTGAGTAACACGTGGGCAATCTGCCCTGCACTCTGGGACAAGCCCTGGAAACGGGGTCTAATACCGGATACAACCACTGACCGCATGGTCGGGTGGTGGAAAGCTCCGGCGGTGCAGGATGAGCCCGCGGCCTATCAGCTTGTTGGTGAGGTAACGGCTCACCAAGGCGACGACGGGTAGCCGGCCTGAGAGGGCGACCGGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAAACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGCACAATGGGCGAAAGCCTGATGCAGCGACGCCGCGTGAGGGATGACGGCCTTCGGGTTGTAAACCTCTTTCAGCAGGGAAGAAGCGAGAGTGACGGTACCTGCAGAAGAAGCGCCGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGGCGCAAGCGTTGTCCGGAATTATTGGGCGTAAAGAGCTCGTAGGCGGCTTGTCACGTCGGTTGTGAAAGCCCGGGGCTTAACCCCGGGTCTGCAGTCGATACGGGCAGGCTAGAGTTCGGTAGGGGAGATCGGAATTCCTGGTGTAGCGGTGAAATGCGCAGATATCAGGAGGAACACCGGTGGCGAAGGCGGATCTCTGGGCCGATACTGACGCTGAGGAGCGAAAGCGTGGGGAGCGAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGGTGGGCACTAGGTGTGGGCGACATTCCACGTCGTCCGTGCCGCAGCTAACGCATTAAGTGCCCCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGCTAAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGCGGAGCATGTGGCTTAATTCGACGCAACGCGAAGAACCTTACCAAGGCTTGACATACACCGGAAACGTCTGGAGACAGGCGCCCCCTTGTGGTCGGTGTACAGGTGGTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTGTCCCGTGTTGCCAGCAGGCCCTTGTGGTGCTGGGGACTCACGGGAGACCGCCGGGGTCACTCGGAGGAAGGTGGGGACGACGTCAAGTCATCATGCCCCTTATGTCTGGGCTGCNACGTGCTACATGGCCGGTAC tinh sạch và giải trình tự và so sánh trình tự đoạn gene mã hóa 16S và 5,8S rRNA của chủng thuộc cùng chi được công bố trên GenBank cho kết quả: Chủng T1 tương đ ng với loài Trichoderma saturnisporum (NR103704) và chủng X4 tương đ ng với loài Streptomyces sennicomposti RCPT1-4 (NR181931)
Kết quả phân loại cho thấy, hai chủng T1 và X4 có khả năng sinh tổng hợp xylanase Theo một số nghiên cứu, xylanase của xạ khuẩn hoạt động trong dải pH khá rộng từ 5 ÷ 9, nhiệt độ từ 25 ÷ 60C và bền ở môi trường kiềm, do đó được ứng dụng rộng rãi trong nhiều ngành công nghiệp, bao g m cả công nghiệp giấy [14] Đối với nấm, khả năng sinh xylanase đã đƣợc nghiên cứu nhiều, một số nghiên cứu đã công bố các chi nấm Aspergillus; Trichoderma có khả năng sinh tổng hợp nhiều loại enzyme xylannase, amylase, protease, trong đó phần lớn là xylanase từ nấm có đặc tính bền và hoạt động tốt trong môi trường axit 2,5 ÷ 6,0, xylanase thô có thể thủy phân cả xylan tinh khiết trong vỏ lúa yến mạch (oat spelts xylan) cũng nhƣ các cơ chất có xylan trong gỗ, vỏ cây Chính vì vậy, xylanase từ hai chủng này rất có tiềm năng ứng dụng
3.3.4 Đặc điểm xylanase của chủng Streptomyces senicomposti X4 và chủng nấm Trichoderma saturnisporum T1 Để khẳng định và mở rộng tiềm năng ứng dụng của hai chủng, trong điều kiện ứng dụng ngoài thực tế, theo nhƣ một số nghiên cứu ở các cơ chất tự nhiên hàm lượng đường xylose tạo ra chậm hơn khi xúc tác với cơ chất xylan, lượng sản phẩm xylose và oligoxylose mạch ngắn tăng dần theo thời gian phản ứng Trong thời gian đầu của phản ứng, các endoxylanase phân cắt xylan thành oligoxylose mạch ngắn và một lƣợng nhỏ xylose, sau đó -xylose phân cắt các oligoxylose mạch ngắn thành các đơn phân xylose
Các chủng xạ khuẩn X4 và nấm mốc T1 lên men trên môi trường MS có bổ sung thêm 1 % (w/v) vỏ cây keo, điều kiện lên men tốc độ lắc 160 vòng/phút, 30C trong 7 ngày Dịch sau lên men đƣợc li tâm 8000 vòng/phút, ở 4C trong 5 phút để loại bỏ sinh khối thu đƣợc dịch enzyme thô Dịch enzyme thô đƣợc dùng để phản ứng với cơ chất xylan và kiểm tra sản phẩm bằng phương pháp chạy sắc kí bản mỏng TLC Kết quả chạy TLC định tính sự có mặt của xylose sau phản ứng hai chủng T1 và X4 đƣợc thể hiện ở hình 3.18
Hình 3.18 Sản phẩm chuyển hoá của enzyme xylanase từ chủng X4 và nấm mốc T1 với cơ chất xylan (Đường chạy 1: Xylose tinh khiết; Đường chạy 2, 3: Dịch sau phản ứng giữa cơ chất với enzyme của chủng T1 và đường 4,5: Dịch sau phản ứng giữa cơ chất với enzyme của chủng X4; Đường chạy 6: Cơ chất và enzyme đã bất hoạt)
Kết quả kiểm tra sản phẩm sau quá trình xúc tác giữa enzyme và cơ chất xylan tạo thành các điểm màu đen (Hình 3.18), ở các đường chạy 2 ÷ 5 có Rf tương ứng với xylose chuẩn (Hình 3.18, đường chạy 1) Mẫu đối chứng (enzyme thô bất hoạt) không thấy xuất hiện các điểm màu đen tương ứng (Hình 3.18, đường chạy số
6) Nhƣ vậy, dịch sau lên men của chủng X4 và T1 có enzyme xylanase và đã xúc tác thủy phân cơ chất xylan để giải phóng đường xylose
Dịch chứa enzyme thô đƣợc dùng để đánh giá khả năng bóc lớp vỏ gỗ keo: Dịch enzyme thô pha với nước máy với tỉ lệ 1/10 (v/v) và bổ sung khoanh gỗ keo cứng dạng trục ngâm với các điều kiện: 1 lít dịch enzyme pha loãng: 3 khoanh gỗ keo ( 8 ÷10cm x 5 ÷ 10cm) ở điều kiện nhiệt độ phòng, sau 24 giờ đánh giá hiệu quả bóc vỏ của enzyme thông qua khả năng tách lớp vỏ ra khỏi phần thịt gỗ bằng cách bóc tay Kết quả đƣợc thể hiện ở bảng 3.10
Bảng 3.10 Tác động của enzyme thô từ dịch sau lên men từ chủng xạ khuẩn X4 và nấm mốc T1 đến quá trình tách vỏ gỗ keo trong điều kiện phòng thí nghiệm
Một số đặc điểm của vỏ và khúc gỗ keo sau quá trình ngâm Màu của thịt gỗ keo
Hiệu quả bóc vỏ Đặc tính của lớp vỏ sau khi tách
Màu đặc trƣng của gỗ keo, không có hiện tƣợng thay đổi
Tác động nhẹ vào phần vỏ, rất khó tách phần vỏ với phần thịt gỗ, lớp vỏ có hiện tƣợng xé nhỏ trong quá trình tách
Vỏ gỗ nguyên trạng thái, vỏ rách thành những mảnh nhỏ và rách khi kéo, không tách thành những mảng lớn
Dịch enzyme thô của chủng
Màu đặc trƣng của gỗ keo, không có hiện tƣợng thay đổi
Tác động nhẹ vào phần vỏ sẽ dễ dàng tách phần vỏ với phần thịt gỗ, lớp vỏ có hiện tƣợng bị xé nhỏ và khá mềm và dễ bị đứt trong khi tách
Vỏ gỗ nguyên trạng thái, không có hiện tƣợng mềm và mủn, vụn và bị xé thành các mảng nhỏ khi kéo
Dịch enzyme thô của chủng
Màu đặc trƣng của gỗ keo, không có hiện tƣợng thay đổi
Tác động nhẹ vào phần vỏ sẽ dễ dàng tách giữa phần vỏ với phần thịt gỗ, lớp vỏ có hiện tƣợng dễ xé nhỏ khi tách
Vỏ gỗ ở trạng thái nguyên trạng không có tượng mủn, khi kéo dễ bị xé nhỏ, phía bên trong có nhiều sợi nhỏ, tạo thành mảng lớn khi tách khỏi phần thịt gỗ.
Nghiên cứu nâng cao khả năng sinh tổng hợp enzyme xylanase của chủng nấm T1
3.4.1 Nghiên cứu chọn môi trường nhân giống phù hợp chủng nấm T1
Trên cơ sở tìm kiếm các môi trường nhân giống phù hợp cho quá trình lên men, môi trường nhân giống đã được sử dụng cho chủng nấm mốc T1 là các môi trường Hansen, PDA và Czapek, kết quả khả năng phát triển của chủng nấm mốc trên các môi trường được sử dụng nhân giống được trình bày ở hình 3.19 và bảng 3.11
Bảng 3.11 Khả năng sinh trưởng của chủng nấm mốc T1 trên các môi trường khác nhau sau 48 giờ nuôi ở lắc 180 vòng/phút, nhiệt độ 37 C
Kí hiệu chủng Khả năng phát triển trên môi trường (CFU/ml)
Hình 3.19 Khả năng phát triển cuả chủng nấm mốc T1 trên môi trường Hansen sau
48 giờ nuôi lắc 180 vòng/phút và nhiệt độ 37 C
Sau 48 giờ nhân giống, kiểm tra số lượng tế bào có trong môi trường, kết quả môi trường Hansen là môi trường cho số lượng tế bào lớn nhất đạt 4,55x10 8 CFU/ml, môi trường Czapek cho số lượng tế bào thấp nhất đạt 3,7x10 7 CFU/ml, và môi trường PDA có số lƣợng khuẩn lạc 2,37x10 8 CFU/ml (Hình 3.19)
3.4.2 Ảnh hưởng của môi trường lên men đến khả năng sinh enzyme xylanase của nấm mốc T1
3.4.2.1 Ảnh hưởng của môi trường
Thực tế hiện nay là việc sản xuất enzyme phân giải xylan bị ảnh hưởng bởi môi trường lên men và cacbon, nitơ và muối khoáng Do đó, thành phần dinh dưỡng của môi trường lên men là một khía cạnh quan trọng của sản xuất enzyme ở quy mô công nghiệp vì 1/3 chi phí sản xuất enzyme chủ yếu liên quan đến chi phí cho môi trường nuôi cấy Việc lựa chọn các thành phần môi trường phù hợp và hiểu được sự tương tác giữa các thành phần là rất quan trọng Hơn nữa, tối ưu hóa thành phần của môi trường cũng là một yếu tố thiết yếu, hỗ trợ giảm thiểu chi phí sản xuất và nâng cao năng suất thực tế Vì vậy, chúng tôi đã đưa ra 3 môi trường lên men cơ bản để nghiên cứu khả năng sinh tổng hợp xylanase, kết quả thu đƣợc thể hiện ở bảng 3.12
Bảng 3.12 Ảnh hưởng của môi trường lên men khác nhau đến khả năng sinh tổng hợp enzyme xylanase của nấm mốc T1
Hoạt tính enzyme xylanase trong môi trường lên men khác nhau (IU/l)
MS Czapek-dox Czapek + vỏ cây keo 1%
Theo kết quả ở bảng 3.13 cho thấy, thành phần môi trường có ảnh hưởng đáng kể đến sự tăng trưởng và sản xuất xylanase của chủng T1 Hoạt lực xylanase cao nhất đối với chủng T1 trên môi trường Czapek có bổ sung vỏ cây keo 1% đạt giá trị (1734,35 IU/l), tiếp đến là MS với giá trị thu đƣợc (1720,79 IU/l) Nhƣ vậy, hai môi trường phù hợp với các nghiên cứu và đặc trưng cho nấm là môi trường Czapek có bổ sung vỏ cây keo 1% và MS
3.4.2.2 Ảnh hưởng của nguồn cacbon
Ngu n cacbon là ngu n vật chất cung cấp cacbon trong quá trình sinh trưởng của vi sinh vật Vi sinh vật sử dụng một cách chọn lọc các ngu n cacbon Các ngu n đường nói chung là ngu n cacbon tốt cho sinh trưởng và cũng tạo ra tiền chất kích thích sinh enzyme Kết quả ảnh hưởng của một số ngu n cacbon nên khả năng sinh enzyme của chủng nấm mốc T1 đƣợc thể hiện ở hình 3.20 (và phụ lục 1)
Hình 3.20 Ảnh hưởng của một số nguồn cacbon trong môi trường lên men đến hoạt tính xylanase của chủng T1
Glucose Fructose Xylose Lactose Saccharose Rỉ đường Glycerol
Dựa vào kết quả trên cho thấy, khi chủng T1 được lên men trên môi trường Czapek có bổ sung vỏ cây keo 1% thì hoạt tính enzyme xylanase cao nhất khi sử dụng ngu n cacbon là rỉ đường (2098,81 IU/l) Khi ngu n cacbon là lactose thì hoạt tính enzyme xylanase của chủng T1 không có sự biểu hiện Có một số nghiên cứu cũng khẳng định rằng khi sử dụng đ ng thời các đường đơn vào môi trường làm ngu n cacbon thì hoạt tính enzyme xylanase bị giảm đi Điều đó là do quá trình sinh trưởng của các chủng không ưu tiên sinh enzyme mà ưu tiên sử dụng các ngu n đường có sẵn trong môi trường để sinh trưởng
Hình 3.21 Ảnh hưởng của nồng độ cacbon trong môi trường lên men đến hoạt tính enzyme xylanase của chủng T1
Theo kết quả của hình 3.21 cho thấy, khi chủng T1 đƣợc lên men trên môi trường Czapek có bổ sung ngu n cacbon là rỉ đường với n ng độ thay đổi (20, 25,
30, 35 và 40 g/l) và vỏ cây keo 1% thì hoạt tính enzyme xylanase cao nhất khi n ng độ rỉ đường đạt 35 g/l với hoạt tính xylanase đạt 2554,78 IU/l Với các giá trị thu được, chúng tôi tiếp tục nghiên cứu ảnh hưởng của ngu n nitơ
3.4.2.3 Ảnh hưởng của nguồn nitơ
Vi sinh vật cần một lƣợng lớn nitơ để tổng hợp tất cả các thành phần chính của tế bào, bao g m axit amin, pyrimidine và purin, NAD và đường amino Axit amin đóng vai trò là ngu n nitơ và năng lƣợng và đƣợc hầu hết các vi sinh vật sử dụng Một số vi sinh vật có khả năng chuyển hóa peptide và các protein phức tạp hơn Các ngu n nitơ khác bao g m, ví dụ: pepton, bột cá urê, amoniac, creatinine, bột đậu tương, cao ngô, cao thịt, cao nấm men, các muối ammone và muối nitrate… Chủng nấm mốc T1 đã sử dụng chọn lọc đối với ngu n nitơ khác nhau, đã thu đƣợc
Rỉ đường 20% Rỉ đường 25% Rỉ đường 30% Rỉ đường 35% Rỉ đường 40%
Hình 3.22 Ảnh hưởng của nguồn nitơ trong môi trường lên men đến hoạt tính enzyme xylanse của chủng T1
Hình 3.23 Ảnh hưởng của hàm lượng nitơ trong môi trường lên men đến hoạt tính enzyme xylanase của chủng T1
Dựa vào kết quả của hình 3.22 và 3.23 cho thấy, khi chủng T1 đƣợc lên men trên môi trường Czapek với ngu n nitơ hữu cơ là cao thịt ở hàm lượng 0,8 g/l sẽ cho hoạt tính enzyme xylanase cao nhất, đạt 3254,24 IU/l
3.4.2.4 Ảnh hưởng của nguồn cơ chất cảm ứng Để thu đƣợc hiệu suất enzyme xylanase cao hơn cần bổ sung chất cảm ứng với tỷ lệ thích hợp, sử dụng các chất cảm ứng tổng hợp tương tự chất cảm ứng tự nhiên,
Cao thịt Peptone Cao nấm men
Cao malt Bột đậu tương Ure NH4NO3 (NH4)2SO4
Cao thịt 0,4 g/l Cao thịt 0,6 g/l Cao thịt 0,8 g/l Cao thịt 1 g/l Cao thịt 1,5 g/l
Hàm lƣợng xylanase (UI/l) hoặc sử dụng chất chuyển hóa rất chậm Chất cảm ứng tương tự như các xylobioza hoặc xylooligosacarit có chứa lưu huỳnh, không có khả năng tham gia vào quá trình trao đổi chất mà vẫn duy trì khả năng tương tác với quá trình tổng hợp enzyme trong tế bào Mặt khác, axyl este của xylobioza hoặc xylooligosacarit có ích bởi vì chúng bị chuyển hóa rất chậm Thường sử dụng các sản phẩm phụ rơm, lõi ngô, bã mía và bã sắn, cám và vỏ của các loại ngũ cốc, các loại mùn cưa và bã chế biến các loại quả, nước ép, dầu, cà phê làm chất cảm ứng Kết quả ảnh hưởng của chất cảm ứng đến quá trình sinh enzyme của chủng T1 đƣợc thể hiện ở hình 3.24 và hình 3.25
Hình 3.24 Ảnh hưởng của nguồn cơ chất trong môi trường lên men đến hoạt tính enzyme xylanase của chủng T1
Vỏ cây keo Bột rơm Bột gỗ keo Bột tre Cám
H o ạt t ín h xy lan ase (UI/l)
Bột rơm 5g/l Bột rơm 10g/l Bột rơm 15g/l Bột rơm 20g/l Bột rơm 25g/l
Hình 3.25 Ảnh hưởng của hàm lượng cơ chất cảm ứng trong môi trường lên men đến hoạt tính enzyme xylanase của chủng T1
Dựa vào hình 3.24 và 3.25 cho thấy, khi chủng T1 đƣợc lên men trên môi trường Czapek có bổ sung ngu n chất cảm ứng là bột rơm với hàm lượng 15 g/l thì hoạt tính enzyme xylanase cao nhất đạt 3554,84 IU/l
Như vậy, sau quá trình nghiên cứu tối ưu, môi trường thích hợp cho chủng T1 giúp chủng có khả năng sinh xylanase cao với các thành phần (g/l): rỉ đường 35; cao thịt 0,8; bột rơm 15; NaNO 3 2; K 2 HPO 4 1; MgSO 4 7H2O 0,5; KCl 0,5; FeSO 4 7H2O 0,01
3.4.3 Nghiên cứu một số điều kiện ảnh hưởng đến quá trình sinh enzyme xylanase của chủng T1
3.4.3.1 Ảnh hưởng của tỉ lệ tiếp giống
Trong điều kiện lý tưởng, một số loài vi sinh vật có thể tăng số lượng gấp đôi cứ sau 10 ÷ 15 phút Tỉ lệ tiếp giống được cấy truyền sang môi trường lên men sẽ có ảnh hưởng mạnh đến khả năng sinh tổng hợp enzyme xylanase của chủng nấm mốc T1 Kết quả ảnh hưởng được thể hiện ở hình 3.26
Hình 3.26 Ảnh hưởng của tỉ lệ tiếp giống đến hoạt tính enzyme xylanase của chủng nấm mốc T1
Kết quả từ Bảng 3.26 chỉ ra rằng tỷ lệ cấy thích hợp là 2 ÷ 5% v/v so với môi trường lên men sẽ mang lại hiệu suất sinh enzyme cao và ổn định hơn so với tỷ lệ 1%.
Tỉ lệ 1% Tỉ lệ 2% Tỉ lệ 5% Tỉ lệ 10%
Đánh giá một số đặc tính enzyme xylanase của chủng T1 đến lớp vỏ cây keo
vỏ cây keo trong quá trình ngâm
Dịch sau lên men đƣợc li tâm 8000 vòng/phút, ở 4C trong 5 phút, loại bỏ sinh khối, thu đƣợc dịch enzyme thô dùng để đánh giá khả năng bóc lớp vỏ gỗ keo: Dịch enzyme thô pha với nước máy với tỉ lệ 1/10 (v/v) và bổ sung khoanh gỗ keo cứng dạng trục ngâm với các điều kiện: 1 lít dịch enzyme pha loãng/ 3 khoanh gỗ keo (ỉ 8 ữ 10cm x 5ữ 10cm) ở điều kiện nhiệt độ phũng, sau 24 giờ đỏnh giỏ hiệu quả bóc vỏ của enzyme thông qua khả năng tách lớp vỏ ra khỏi phần thịt gỗ bằng cách bóc tay Kết quả đƣợc thể hiện ở bảng 3.11 và hình 3.30
Hình 3.30 Các khúc gỗ keo trước, trong và sau quá trình xử lý ở điều kiện phòng thí nghiệm
Phần vỏ cây sau khi bóc vỏ đƣợc phơi khô và đƣợc chụp Sem, kết quả thể hiện ở hình 3.31
Hình 3.31 Phần vỏ cây sau quá trình ngâm A - với nước máy và
B - Nước máy có bổ sung dịch enzyme thô của chủng T1
Bước đầu nghiên cứu tác động của dịch enzyme thô của chủng T1 lên vỏ gỗ cây keo cho thấy: sau khi ngâm vỏ gỗ nguyên trạng thái không có tƣợng mủn, dễ bị xé nhỏ khi kéo, phía trong có các sợi nhỏ, tạo thành mảng lớn khi tách khỏi phần thịt gỗ, kết quả chụp Sem đã khẳng định, enzyme xylanase từ chủng T1 đã tác động vào các liên kết ngang có trong vỏ cây, giúp quá trình bóc vỏ trở nên dễ dàng hơn
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
1 Phân lập đƣợc 18 chủng xạ khuẩn và 18 chủng nấm mốc Trong đó, có hai chủng là xạ khuẩn X4 và nấm mốc T1 đã đƣợc lên men thu dịch, có hoạt xylanase cao hơn 1500 IU/l Chủng T1 tương đ ng với loài Trichoderma saturnisporum
(NR103704) và chủng X4 tương đ ng với loài Streptomyces sennicomposti RCPT1-
2 Đã nghiên cứu một số điều kiện thu nhận enzyme xylanase từ chủng T1 có kết quả: Môi trường thích hợp cho lên men thu nhận xylanase của chủng T1 (g/l): rỉ đường 35; cao thịt 0,8; NaNO3 2; K 2 HPO 4 1; MgSO 4 7H2O 0,5; KCl 0,5; FeSO 4 7H2O 0,01; bột rơm 15 Nấm Trichoderma saturnisporum T1 có điều kiện lên men thích hợp là 37C; pH môi trường lên men ban đầu 6,0; tỉ lệ tiếp giống 2% và thời gian là 5 ngày với môi trường thích hợp cho lượng enzyme thu được xylanase 3480,5 IU/l
3 Bước đầu nghiên cứu tác động của dịch enzyme thô của chủng T1 lên vỏ gỗ cây keo sau khi ngâm cho kết quả: vỏ gỗ nguyên trạng thái, không bị mủn, dễ bị xé nhỏ khi kéo, phía trong có các sợi nhỏ, tạo thành mảng lớn khi tách khỏi phần thịt gỗ
Việc ứng dụng chủng xạ khuẩn T1 vào bóc vỏ gỗ keo trong sản xuất dăm mảnh có tính khoa học và ý nghĩa thực tiễn cao Đây là vấn đề cần đƣợc nghiên cứu thêm về quy mô và cách ứng dụng để hiệu quả, bền vững và thân thiện với môi trường.