Nâng cao giới hạn phát hiện cảm biến sinh học Điện hóa sử dụng vật liệu nano

1.2 Cảm biến sinh học điện hóaĐiện hóa học là một nhánh của hóa học liên quan đến sự phân tách điện tích,thường là trong môi trường chất lỏng, sự phân tách điện tích thường liên quan đến

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ

Phạm Tiến Mạnh

NÂNG CAO GIỚI HẠN PHÁT HIỆN

CẢM BIẾN SINH HỌC ĐIỆN HÓA SỬ DỤNG

VẬT LIỆU NANO

LUẬN VĂN THẠC SĨ Ngành: Công nghệ kỹ thuật điện tử, truyền thông

HÀ NỘI - 2024

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ

Phạm Tiến Mạnh

NÂNG CAO GIỚI HẠN PHÁT HIỆN

CẢM BIẾN SINH HỌC ĐIỆN HÓA SỬ DỤNG

VẬT LIỆU NANO

Ngành: Công nghệ kỹ thuật điện tử, truyền thông

Chuyên ngành: Kỹ thuật điện tử

Mã số: 8510302.01

LUẬN VĂN THẠC SĨ Ngành: Công nghệ kỹ thuật điện tử, truyền thông

Cán bộ hướng dẫn: TS Nguyễn Đăng Phú

TS Vũ Thị Huyền

HÀ NỘI - 2024

TÓM TẮT

Luận văn “Nâng cao giới hạn phát hiện cảm biến sinh học điện hóa

sử dụng vật liệu nano” tập trung vào việc phát triển quy trình chức năng hóa

bề mặt các loại cảm biến sinh học điện hóa để phát hiện protein mục tiêu một cáchnhanh chóng và chính xác Để chứng minh hiệu quả của quy trình chức năng hóa

bề mặt, luận văn đã sử dụng hai loại cảm biến khác nhau là điện cực thương mạihóa - điện cực in carbon và điện cực tự phát triển trên bảng mạch in, cả hai đềuđược chức năng hóa bề mặt để tăng cường độ nhạy và độ chọn lọc Quá trình chứcnăng hóa bề mặt sử dụng axit 11-mercaptoundecanoic (11-MUA) để hình thànhđơn lớp tự lắp ráp (self-assembled monolayer - SAM), lớp SAM này sau đó đượchoạt hóa nhóm cacboxyl, cuối cùng liên kết các kháng thể đặc hiệu với proteinmục tiêu là albumin huyết thanh bò được gắn huỳnh quang

Điện cực sau khi biến đổi được sử dụng để phát hiện protein mục tiêu thôngqua việc sử dụng các phép đo điện hóa như điện thế quét vòng, phổ trở kháng.Ngoài ra, phép đo quang trên kính hiển vi điện tử cũng được thực hiện nhằm chứngminh khả năng bắt giữ protein của cảm biến

Kết quả đã chứng minh rằng phương pháp chức năng hóa bề mặt điện cựccảm biến điện hóa mới này có độ nhạy cao, độ chọn lọc tốt và thời gian đáp ứngnhanh chóng Điều này mở ra tiềm năng ứng dụng rộng rãi của cảm biến trongnhiều lĩnh vực, bao gồm y sinh học, nông nghiệp và môi trường, v.v

Từ khóa: Cảm biến sinh học điện hóa, chức năng hóa bề mặt, GCE, ENIG

PCB

LỜI CẢM ƠN

Tôi xin được gửi lời cảm ơn sâu sắc đến TS Nguyễn Đăng Phú, TS Vũ ThịHuyền và ThS Trần Như Chí luôn đồng hành, tận tình chỉ bảo, giúp đỡ và góp ýchi tiết cho tôi trong quá trình nghiên cứu và hoàn thiện luận văn này

Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành đến các thầy cô, các bạn sinh viên và họcviên trong bộ môn Vi cơ điện tử và vi hệ thống, khoa Điện tử viễn thông và TrườngĐại học Công nghệ, Đại học Quốc gia Hà Nội đã hỗ trợ tôi trong quá trình họctập và rèn luyện trong thời gian thực hiện đề tài nghiên cứu tại trường

Cuối cùng tôi muốn gửi lời cảm ơn đến gia đình, bạn bè đã động viên và giúp

đỡ tôi trong quá trình học tập và nghiên cứu để hoàn thành luận văn này

Xin chân thành cảm ơn!

Hà Nội, ngày tháng năm 2024

Tác giả

Phạm Tiến Mạnh

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan luận văn thạc sĩ này là công trình nghiên cứu của riêngtôi, không làm lại, không sao chép của ai Luận văn được thực hiện trên cơ sở tìmkiếm, nghiên cứu lý thuyết tiến tới đề xuất giải pháp sau đó áp dụng triển khaithí nghiệm và đánh giá dưới sự hướng dẫn của TS Nguyễn Đăng Phú và TS VũThị Huyền

Nội dung nghiên cứu của luận văn được xây dựng dựa trên các tài liệu chuyênngành và tham khảo các nội dung công bố trên hội nghị và tạp chí uy tín trên thếgiới trong danh mục tài liệu tham khảo

Các số liệu thống kê, thông số kết quả của luận văn là chính xác dựa trênnhững kết quả đã đạt được trên thế giới và dựa trên kiến thức và kinh nghiệm củabản thân trong quá trình triển khai thí nghiệm, chưa từng được công bố dưới bất

kỳ hình thức nào trước khi trình bày bảo vệ trước “Hội đồng đánh giá luận vănThạc sĩ”

Hà Nội, ngày tháng năm 2024

Tác giả

Phạm Tiến Mạnh

Mục lục

1.1 Tổng quan về cảm biến sinh học 6

1.2 Cảm biến sinh học điện hóa 9

1.3 Các kỹ thuật đo điện hóa 10

1.3.1 Amperometric 10

1.3.2 Voltammetry 11

1.3.3 Potentiometry 11

1.3.4 Impedance 11

1.3.5 Conductometric 12

1.4 Chức năng hóa bề mặt điện cực 12

1.4.1 Self–Assembled Monolayer (SAM) 13

1.4.2 Hoạt hóa nhóm cacboxyl (–COOH) của SAM 14

1.5 Cảm biến điện hóa sử dụng điện cực trên nền bảng mạch in 15

1.6 Các nghiên cứu về cảm biến sinh học 18

1.6.1 Các nghiên cứu ở trong nước 18

1.6.2 Các nghiên cứu ở nước ngoài 20

1.7 Kết luận 22

2 THỰC NGHIỆM 24 2.1 Hóa chất thí nghiệm 24

2.2 Dụng cụ thí nghiệm 27

2.2.1 Điện cực in carbon 27

2.2.2 Điện cực PCB hoàn thiện Niken hóa nhúng vàng (ENIG-PCB) 27 2.2.3 Các dụng cụ khác 29

2.3 Quy trình thí nghiệm với điện cực in carbon 29

2.3.1 Rửa điện cực 29

2.3.2 Chức năng hóa bề mặt điện cực 30

2.4 Quy trình thí nghiệm với điện cực ENIG PCB 33

2.4.1 Rửa điện cực 33

2.4.2 Chức năng hóa bề mặt điện cực ENIG PCB 33

2.5 Thiết lập thí nghiệm đo quang với kính hiển vi 34

3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 36 3.1 Kết quả thí nghiệm trên điện cực in carbon 36

3.1.1 Kết quả đo điện hóa 36

3.1.2 Kết quả đo quang 44

3.2 Kết quả thí nghiệm trên điện cực ENIG PCB 45

3.2.1 Kết quả đo điện hóa 45

3.2.2 Kết quả đo quang 47

3.3 Thảo luận 52

dịch KCl 0.1 M chứa 5 mM K3F e (CN)6 sử dụng điện cực PCB(đường màu xanh) và điện cực PCB mạ vàng (đường màu đỏ) Tốc

độ quét là 50 mV/s [2] 161.4 So sánh giữa điện cực PCB mạ Au trước và sau khi làm sạch: (A)tín hiệu thu được từ các điện cực PCB mạ Au trong dung dịch PBS

chứa 4 mM K3F e (CN)6 trước khi làm sạch (i) và sau khi làm sạch( ii); (B) hình ảnh dưới kính hiển vi của các điện cực PCB mạ Authu được trước khi làm sạch và (C) sau khi làm sạch [3] 171.5 Sơ đồ minh họa quá trình chuẩn bị cảm biến sinh học điện hóa đượcphát triển để xác định CRP và đo điện hóa [4] 211.6 Minh họa trường hợp sử dụng cảm biến protein tăng đột biến SARS-CoV-2 trong nước bọt được kích hoạt bằng cảm biến miễn dịch chiphí thấp sử dụng điện cực ENIG PCB [5] 222.1 Công thức và cấu trúc phân tử của Axit 11-MUA 242.2 Liên kết cộng hóa trị của kháng thể đối với SAM trên bề mặt vàng [6] 252.3 Cấu tạo điện cực in carbon 272.4 Mô hình điện cực và mô hình mạch tương đương 282.5 Quy trình làm sạch điện cực 29

2.6 Quy trình chức năng hóa bề mặt điện cực in carbon 30

2.7 Sơ đồ thiết lập thí nghiệm với hệ thống đo PalmSens4 31

2.8 Quy trình làm sạch điện cực ENIG PCB 33

2.9 Quy trình chức năng hóa bề mặt điện cực ENIG PCB 34

2.10 Thiết lập thí nghiệm đo quang với kính hiển vi 35

3.1 Điện cực carbon khi được quét PANI (a) Biểu đồ điện thế quét vòng cho quá trình tổng hợp màng PANI trên điện cực carbon trong 0.1 M aniline và 0.5 M H2SO4, quét 10 chu kỳ với tốc độ quét 50 mV/s (b) So sánh màu sắc điện cực sau khi quét PANI 36

3.2 Điện cực carbon khi lắng đọng nano vàng (a) Biểu đồ điện thế quét vòng cho quá trình lắng đọng nano vàng trên điện cực carbon trong 0.2 mM HAuCl4 và 0.5 M H2SO4, quét 20 chu kỳ với tốc độ quét 50 mV/s (b) Bề mặt điện cực sau quá trình lắng đọng nano vàng 39

3.3 Hình ảnh SEM của các điện cực (a-b) Điện cực trơn (CE); (c-d) CE/AuNPs; (e-f) CE/PANI; (g-h) CE /PANI/AuNPs 40

3.4 Phổ Raman của (a) AuNP/CE; (b) PANI/CE; và (c) AuNP/PANI/CE 41 3.5 Sự thay đổi tín hiệu CV sau mỗi bước của quá trình chức năng hóa bề mặt điện cực carbon trong dung dịch Fe(CN)3−/4− 6 từ -0.4 V đến 0.6 V tại tốc độ quét 50 mV/s 42

3.6 Biên độ của đỉnh oxy hóa ở mỗi bước trong quy trình 43

3.7 Bề mặt điện cực dưới kính hiển vi (a) Điện cực được thực hiện đầy đủ các bước trong quy trình và gắn kháng thể anti-BSA; (b) Điện cực đối chứng khi bỏ qua bước tổng hợp hạt nano vàng; (b) Điện cực đối chứng khi bỏ qua bước ủ axit 11-MUA; (d) Điện cực đối chứng khi không gắn kháng thể anti-BSA 44

3.8 Biểu đồ trở kháng các bước chức năng hóa bề mặt điện cực từ 0 đến 200 kHz trong dung dịch Fe(CN)3−/4− 6 , (a) Biểu đồ trở kháng bề mặt điện cực sau mỗi bước của quá trình chức năng hóa bề mặt, (b) Trở kháng bề mặt điện cực sau mỗi bước của quy trình chức năng hóa bề mặt điện cực tại 200 kHz 45

3.9 Kết quả đo trở kháng bề mặt điện cực với các nồng độ BSA-FITCkhác nhau từ 0 đến 200 kHz trong dung dịch Fe(CN)3−/4−

6 , (a) Biểu

đồ trở kháng bề mặt điện cực với các nồng độ BSA-FITC khác nhau,(b) Trở kháng bề mặt điện cực với các nồng độ BSA-FITC khácnhau tại 200 kHz 463.10 Bề mặt điện cực dưới kính hiển vi (a) Điện cực ENIG PCB đượcthực hiện đầy đủ các bước trong quy trình; (b) Điện cực PCB (điệncực đồng) được thực hiện đầy đủ các bước trong quy trình; (c) Điệncực ENIG PCB đối chứng khi bỏ qua bước ủ axit 11-MUA; (d) Điệncực ENIG PCB đối chứng khi bỏ qua bước gắn Anti BSA 483.11 Kết quả đo quang điện cực ENIG với các nồng độ BSA khác nhau 493.12 Kết quả phân tích cường độ huỳnh quang trên điện cực ENIG PCB 503.13 Khảo sát thời gian ủ SAM 513.14 Kết quả phân tích cường độ huỳnh quang trên các điện cực có thờigian ủ SAM khác nhau 52

Danh sách bảng

1.1 Bảng tóm tắt một số nghiên cứu về cảm biến sinh học điện hóa trênPCB 182.1 Bảng thông số chế tạo điện cực cảm biến 28

DANH MỤC CÁC THUẬT NGỮ VIẾT TẮT

STT Chữ viết tắt Nghĩa tiếng Anh Nghĩa tiếng Việt

1 ELISA Enzyme linked-immunosorbent assay Xét nghiệm ELISA

2 PCB Printed Circuit Board Bảng mạch in

3 ENIG Electroless Nickel Immersion Gold Quy trình Nickel hóa nhúng vàng

4 CV Cyclic Voltammetry Điện thế quét vòng

5 EIS Electrochemical Impedance Spectroscopy Phổ trở kháng điện hóa

6 PBS Phosphate-Buffered Saline Muối phốt phát

8 SAM Self Assembled Monolayer Đơn lớp tự lắp ráp

13 11 - MUA 11-Mercaptoundecanoic Acid A xít 11 - Mercaptoundecanoic

14 AuNP Gold Nanoparticle Hạt nano vàng

có một phương pháp thay thế đơn giản, nhanh chóng và hiệu quả về chi phí để pháthiện protein Hiện nay, phương pháp sử dụng cảm biến sinh học điện hóa đang thuhút sự chú ý ngày càng cao do tính đơn giản, độ nhạy cao, khả năng tương thíchvới các thiết bị điện tử di động và yêu cầu mẫu thấp Tuy nhiên, trong thực tế cácchỉ số cần phát hiện trong mẫu thường có nồng độ rất thấp nên việc xác định cácchỉ dấu đó thông qua đo đạc dòng điện là rất nhỏ (cỡ microampe) và rất khó đểphát hiện sự thay đổi nồng độ chỉ dấu sinh học thông qua dòng điện đo được Vìvậy, việc xác định các chỉ dấu bằng phương pháp điện hóa hiện nay chủ yếu đượcthực hiện trên các thiết bị điện hóa chuyên dụng (auto lab, potentiostat, v.v), các

hệ đo này thường rất lớn và cố định tại các phòng thí nghiệm Do đó, các hệ đophát hiện chỉ dấu sinh học tại chỗ bằng phương pháp điện hóa vẫn là một tháchthức trong lĩnh vực phân tích và chẩn đoán Các thiết bị nhỏ gọn có thể sử dụngtrong gia đình hay xét nghiệm tại chỗ thường nhỏ gọn và không đo được dòng điệnquá nhỏ dẫn đến giới hạn phát hiện của các hệ đo này chưa đáp ứng các yêu cầu

về phân tích và chẩn đoán Để sử dụng các hệ điện hóa nhỏ gọn trong việc pháthiện và xác định nồng độ chỉ dấu sinh học thì một trong những công việc nghiêncứu là phải làm tăng độ dẫn và độ nhạy của các cảm biến sinh học Để làm đượcđiều này, các nhà khoa học trên thế giới hiện nay tập trung sử dụng các vật liệu

có cấu trúc nano để nâng cao giới hạn phát hiện và độ nhạy của thiết bị Việc biếntính bề mặt điện cực bằng các vật liệu nano có thể giúp tăng diện tích bề mặt điệncực hoặc tăng độ dẫn của điện cực Một số vật liệu nano hiện đang được nghiêncứu như nano Au, Ag, ZnO, NiO, Pt, v.v Các kết quả nghiên cứu cho thấy, khi

sử dụng điện cực cảm biến sinh học được biến tính bề mặt bằng các vật liệu nano

có thể tăng giới hạn phát hiện các chỉ dấu sinh học lên cỡ micromol thậm chí cỡnanomol nồng độ chất Từ những lý do trên, việc phát triển phương pháp để tăng

độ nhạy và giới hạn phát hiện các chỉ dấu sinh học bằng cách biến tính bề mặtđiện cực là thách thức được đặt ra Trong số các cảm biến điện hóa, cảm biến dựatrên điện cực in và điện cực trên nền bảng mạch in (Printed Circuit Board - PCB)

đã được sử dụng rộng rãi để phát hiện protein do tính đơn giản, chi phí thấp vàkhả năng mở rộng cao Do đó, luận văn này đã tiến hành nghiên cứu phương phápchức năng hóa bề mặt điện cực điện hóa dựa trên các loại điện cực này để nângcao giới hạn phát hiện protein Albumin huyết thanh bò (Bovine Serum Albumin

- BSA) được chọn làm protein mục tiêu vì nó là một trong những protein dồi dàonhất trong huyết thanh của bò và thường được sử dụng làm protein mẫu trongnghiên cứu và phát triển cảm biến sinh học

Mục đích của luận văn

Luận văn này tập trung vào việc phát triển quy trình chức năng hóa bề mặtđiện cực cảm biến sinh học điện hóa, nhằm nâng cao khả năng phát hiện protein

và hướng tới mục tiêu xây dựng thiết bị xét nghiệm nhỏ gọn, tiện lợi cho việc chămsóc và theo dõi sức khỏe tại chỗ Điểm đặc biệt của quy trình này là tính linh hoạt,

có thể áp dụng được vào nhiều loại điện cực sinh học điện hóa khác nhau mở ratiềm năng ứng dụng rộng rãi trong lĩnh vực cảm biến sinh học điện hóa

Đối tượng nghiên cứu

Luận văn này tập trung vào việc nghiên cứu chi tiết các khía cạnh quan trọngtrong quá trình chức năng hóa bề mặt cảm biến sinh học điện hóa, cụ thể là:

• Sự hình thành lớp vật liệu nano lên bề mặt điện cực: tập trung vào

việc tìm hiểu và tối ưu hóa các phương pháp phủ lớp vật liệu nano lên bề mặtđiện cực cảm biến Các yếu tố như loại vật liệu nano, phương pháp phủ và các

điều kiện phản ứng sẽ được đánh giá để đảm bảo sự hình thành lớp phủ đồngđều, ổn định và hiệu quả Mục tiêu là tạo ra một bề mặt điện cực có diện tíchlàm việc lớn hơn, tăng khả năng tiếp xúc với các phân tử protein và nâng cao

độ nhạy của cảm biến

• Sự hình thành đơn lớp tự lắp ráp (Self Assembled Monolayer - SAM)

và hoạt hóa lớp carboxyl của SAM: tập trung vào việc tạo ra một lớpSAM trên bề mặt điện cực, đánh giá sự ảnh hưởng của SAM trong quy trình.Lớp SAM này sẽ được hoạt hóa nhóm carboxyl (-COOH) ở đầu tự do, tạođiều kiện thuận lợi cho việc liên kết với kháng thể thông qua phản ứng hóahọc Quá trình hoạt hóa nhóm carboxyl sẽ được tối ưu hóa để đảm bảo hiệusuất liên kết cao nhất

• Sự bắt cặp đặc hiệu giữa kháng nguyên và kháng thể trên bề mặt

điện cực: tập trung vào việc đánh giá khả năng bắt cặp đặc hiệu giữa khángnguyên (protein mục tiêu) và kháng thể đã được cố định trên bề mặt điện cực.Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình bắt cặp như nồng độ kháng nguyên, thờigian ủ, v.v được đánh giá kỹ lưỡng Mục tiêu là đạt được sự bắt cặp đặc hiệucao nhất, giảm thiểu nhiễu từ các phân tử khác và đảm bảo độ chính xác củacảm biến

Phương pháp nghiên cứu

Các phương pháp nghiên cứu trong luận văn này bao gồm phương pháp xâydựng quy trình, tính toán lý thuyết kết hợp với các phương pháp thí nghiệm, chếtạo cấu trúc và đo đạc trên những thiết bị hiện đại Dựa trên những phép phântích, quy trình chức năng hóa bề mặt đã được xây dựng nhằm nâng cao giới hạnphát hiện protein của cảm biến sinh học điện hóa Các kết quả đo trên các máy đođược thương mại hóa cũng như mạch đo điện hóa được phát triển đã chứng minhhiệu quả của quy trình chức năng hóa bề mặt được phát triển

Đóng góp

Luận văn đã đề xuất một quy trình để phát hiện protein nhanh chóng và hiệuquả, sử dụng cảm biến sinh học điện hóa Quy trình này sử dụng điện thương mạihóa là cực in carbon và điện cực tự phát triển trên tấm nền PCB được hoàn thiện

Nikel hóa nhúng vàng (Electroless Nickel Immersion Gold Printed Circuit Board

- ENIG PCB) để cố định protein và phát hiện chúng thông qua các phép đo điệnhóa Những đóng góp chính của luận văn này bao gồm:

• Phát triển quy trình chức năng hóa bề mặt điện cực: quy trình chức

năng hóa bề mặt điện cực in carbon và điện cực ENIG PCB để phát hiệnprotein được trình bày chi tiết Quy trình này liên quan đến việc lắng đọngpolyme dẫn điện (Polyaniline - PANI), hạt nano vàng (AuNPs), và lớp SAM

để tạo ra một bề mặt điện cực nhạy và chọn lọc đối với protein

• Sử dụng điện cực tự phát triển: Luận văn cũng đề xuất việc sử dụng điện

cực tự phát triển trên bảng mạch in để phát hiện protein, giảm chi phí so vớiđiện cực in carbon thương mại

• Tối ưu hóa quy trình phát hiện: Nghiên cứu đã tiến hành các thí nghiệm

để tối ưu hóa quy trình phát hiện protein, bao gồm cả việc xác định các thông

số tối ưu cho việc lắng đọng PANI và AuNPs, cũng như việc lựa chọn các điềukiện phản ứng tốt nhất cho việc gắn và phát hiện protein

• Đánh giá hiệu suất: Luận văn đánh giá hiệu suất của quy trình phát hiện

protein được đề xuất bằng cách sử dụng các mẫu protein đã biết Kết quả chothấy quy trình này có độ nhạy và độ chọn lọc cao, đồng thời có khả năng pháthiện protein trong một khoảng nồng độ rộng

Luận văn đã đóng góp vào việc phát triển các phương pháp mới để phát hiệnprotein nhanh chóng và hiệu quả Các kết quả của nghiên cứu này có tiềm năngứng dụng trong nhiều lĩnh vực, bao gồm y học, công nghệ sinh học và khoa họcmôi trường

Bố cục

Trong phần tiếp theo, luận văn được trình bày như sau:

• Chương 1: Cảm biến sinh học, chương này trình bày tổng quan về cảm biếnsinh học, các loại cảm biến sinh học và cấu tạo của cảm biến sinh học Ngoài

ra trong chương này cũng trình bày về những nghiên cứu về cảm biến sinhhọc trong nước và trên thế giới

• Chương 2: Nguyên liệu, công cụ và xây dựng quy trình thí nghiệm, chươngnày tập trung trình bày về quy trình thí nghiệm cho hai loại điện cực thươngmại hóa - điện cực in carbon và điện cực tự phát triển - điện cực ENIG PCB.

• Chương 3: Kết quả và thảo luận, trình bày về kết quả thí nghiệm và thảo luận

về kết quả thí nghiệm

CHƯƠNG 1

CẢM BIẾN SINH HỌC

Trong thời đại của sự tiến bộ công nghệ và y học, việc sử dụng cảm biến sinhhọc đã trở thành một phần không thể thiếu trong nghiên cứu và ứng dụng tronglĩnh vực y học Với khả năng phát hiện chính xác, linh hoạt và không xâm lấn, cáccảm biến này đã mở ra một loạt các ứng dụng mới, từ việc chẩn đoán đến điều trị.Mục tiêu của chương này là cung cấp thông tin tổng quan về cảm biến sinh học,các kỹ thuật phát hiện protein sử dụng cảm biến sinh học, đồng thời tập trungvào các nghiên cứu trong lĩnh vực này cả ở trong nước và quốc tế

1.1 Tổng quan về cảm biến sinh học

Cảm biến sinh học được định nghĩa là một thiết bị phát hiện và phân tích cáckích thích sinh học bắt nguồn từ những thay đổi của môi trường và chuyển nhữngthay đổi này thành các dạng tín hiệu khác như quang, điện, hóa, v.v cho phép đo

và định lượng trong thời gian thực [7]

Về mặt kỹ thuật, cảm biến sinh học là một thiết bị tích hợp nhỏ gọn có đầu dòsinh học, được kết nối với hệ thống chuyển đổi để phát hiện tín hiệu Đầu dò sinhhọc được tạo ra bằng cách cố định yếu tố nhận biết sinh học (enzym, kháng thể,oligonucleotide, protein thụ thể, vi sinh vật hoặc toàn bộ tế bào) trên bề mặt cảmbiến sinh học (hình 1.1) Đầu dò sinh học phải có tính chọn lọc sinh học và có độnhạy cao để thu được chất phân tích thích hợp (enzym, kháng nguyên, DNA/RNA,độc tố, vi rút, kim loại nặng, thuốc trừ sâu, v.v.) và mô tả chính xác sự kiện nhậnbiết sinh học Các đặc điểm khác nhau của đầu dò sinh học cho phép phát hiệncác mầm bệnh hoặc hóa chất cụ thể trong môi trường, ngay cả ở nồng độ thấp [8],cảm biến sinh học tích hợp tính chọn lọc của các phân tử sinh học và khả năng xử

lý của vi điện tử và quang điện tử hiện đại [9]

Hình 1.1: Nguyên lý hoạt động của cảm biến sinh học và các thành phần chính: chất phân tích được phát hiện bởi đầu dò sinh học, cố định trên đầu dò Phản ứng sinh học được chuyển đổi thành tín hiệu điện, quang hoặc điện hóa bằng đầu dò, sau đó được xử

lý [1]

Với đặc tính đơn giản, có thể sử dụng nhiều lần và mang tính di động cao đối vớicác mẫu phức tạp là những ưu điểm cảm biến sinh học Do đó, công nghệ cảmbiến sinh học có thể cung cấp nhiều khả năng ứng dụng khác nhau trong các lĩnhvực công nghiệp khác nhau như y tế, sức khỏe, môi trường và thực phẩm [10] Dựatrên phương pháp phát hiện và hệ thống đầu dò, cảm biến sinh học có thể đượcphân loại tương ứng thành điện hóa, vật lý hoặc quang học như hình 1.2

Cảm biến sinh học điện hóa được định nghĩa là các thiết bị tích hợp cung cấpthông tin phân tích định lượng hoặc bán định lượng cụ thể bằng cách sử dụng yếu

tố nhận dạng sinh học, tiếp xúc với nguyên tố truyền dẫn điện hóa Cảm biến sinhhọc điện hóa thường dựa trên các phép đo như điện thế quét vòng hay cường độdòng điện (amperometric), v.v Cảm biến sinh học amperometric là thiết bị đượcthương mại hóa thành công nhất trong số nhiều loại cảm biến sinh học [11]

Cảm biến sinh học vật lý bao gồm các loại cảm biến sinh học áp điện và nhiệt

kế Cảm biến sinh học áp điện dựa trên điện thế xen kẽ và tạo ra sóng đứng trongtinh thể ở tần số đặc trưng Tần số này rất nhạy cảm với các tính chất bề mặtcủa tinh thể Nếu một tinh thể được phủ một yếu tố nhận dạng sinh học, liên kếtcủa chất phân tích mục tiêu với thụ thể sẽ tạo ra sự thay đổi tần số cộng hưởng.Cảm biến sinh học nhiệt kế được xây dựng bằng cách kết hợp các enzyme với cảmbiến nhiệt độ Khi chất phân tích tiếp xúc với enzyme, nhiệt của phản ứng enzyme

Hình 1.2: Phân loại cảm biến dựa trên đầu dò sinh học [1]

được đo và hiệu chuẩn so với nồng độ chất phân tích [12]

Cảm biến sinh học quang học phát hiện những thay đổi về độ hấp thụ, phátquang hoặc huỳnh quang của một chỉ số thích hợp và thay đổi chỉ số khúc xạ [13]

Ý tưởng cơ bản của cảm biến sinh học quang học là tạo ra tín hiệu điện tử, tỷ

lệ thuận về cường độ hoặc tần số với nồng độ của một chất phân tích hoặc nhómchất phân tích cụ thể, mà yếu tố cảm biến sinh học liên kết [14]

Ngày nay, nhờ những tiến bộ về khoa học công nghệ, định nghĩa về cảm biến sinhhọc đã phát triển từ khái niệm cổ điển về điện cực enzyme sang nhiều phươngpháp phân tích dựa trên xúc tác sinh học và ái lực sinh học [15] Việc cải tiến cácthành phần sinh học, thực hiện các công nghệ micro và nano để phát triển cácphương pháp tích hợp mới giữa các thụ thể sinh học và đầu dò hứa hẹn tiến bộnhanh chóng trong công nghệ cảm biến sinh học [16] Do đó, nghiên cứu cảm biếnsinh học đã trở thành một lĩnh vực liên ngành tích hợp những thành tựu đột phátrong vật lý, sinh học, hóa học, khoa học vật liệu, kỹ thuật, toán học và công nghệthông tin Trong vài thập kỷ qua, các cảm biến sinh học có nhiều kích cỡ và hìnhdạng khác nhau đã được sử dụng trong nhiều ứng ứng dụng, chẳng hạn như giámsát môi trường và công nghiệp, y học, công nghệ sinh học, phân tích thực phẩm

và giám sát sản xuất, chăm sóc sức khỏe, nông nghiệp, cũng như an ninh và quốcphòng [17]

1.2 Cảm biến sinh học điện hóa

Điện hóa học là một nhánh của hóa học liên quan đến sự phân tách điện tích,thường là trong môi trường chất lỏng, sự phân tách điện tích thường liên quan đến

sự truyền điện tích, có thể xảy ra đồng nhất trong dung dịch giữa các loại hóa chấtkhác nhau hoặc không đồng nhất trên bề mặt điện cực [18,19] Mỗi chất phân tích

bị oxy hóa hoặc khử ở một điện thế cụ thể và dòng điện đo được tỷ lệ thuận vớinồng độ Kỹ thuật này là một phương pháp hướng tới phân tích sinh học [20].Cảm biến sinh học điện hóa sử dụng các phương pháp điện hóa để phát hiện và đolường sự tương tác giữa kháng thể và kháng nguyên Việc sử dụng điện hóa trongcảm biến miễn dịch để phát hiện chất phân tích có một số ưu điểm vì kỹ thuậtnày tiết kiệm, dễ vận hành, di động và đơn giản để xây dựng Vì điện hóa học làmột phương pháp dựa trên bề mặt, lượng phản ứng không quan trọng khi các mẫuchỉ được yêu cầu cho mục đích phát hiện [21] Các phương pháp điện hóa thườngđược áp dụng bao gồm:

• Phản ứng oxi hóa khử: trong đó kháng thể được gắn trên điện cực và kháng

nguyên được thêm vào mẫu Nếu kháng nguyên tương ứng với kháng thể, sẽxảy ra phản ứng oxi hóa khử tạo ra dòng điện

• Phương pháp truyền dẫn điện: trong đó kháng thể được gắn trên điện cực

và kháng nguyên được thêm vào mẫu Nếu kháng nguyên tương ứng với khángthể trên điện cực, sẽ xảy ra thay đổi trạng thái truyền dẫn điện của điện cực

• Phương pháp điện dung: trong đó kháng thể được gắn trên điện cực và

kháng nguyên được thêm vào mẫu Nếu kháng nguyên tương ứng với khángthể trên điện cực, sẽ xảy ra thay đổi điện dung của điện cực [22,23]

Các kỹ thuật điện hóa bao gồm rất nhiều loại từ đơn giản như điện thế quét vòng(Cyclic Voltammetry - CV) hay chronopotentiometry, đến các kỹ thuật phức tạpnhư phổ trở kháng (EIS) Với mỗi đặc tính điện hóa của bề mặt điện cực thì cóthể thực hiện được nhiều kỹ thuật khác nhau, tuy nhiên thường thì chỉ có một

kỹ thuật cho kết quả tốt nhất [24] Về nguyên tắc, các phép đo điện hóa chỉ cầnhai điện cực việc thiết lập hai điện cực được sử dụng trong một vài trường hợp lànhững phép đo có mức điện áp đặt lên ổn định ví dụ như pin, siêu tụ điện, v.v.Tuy nhiên, trong thực tế, rất khó để giữ một điện thế ổn định không đổi trong khi

đo điện trở giữa điện cực làm việc và dung dịch Vì vậy thí nghiệm với ba điện cực

được thiết lập giúp cho kết quả của phép đo được chính xác hơn [2] Ba điện cựcđược sử dụng đó là:

• Điện cực làm việc (WE): là điện cực chỉ thị, là nơi mà phản ứng xảy ra,

vật liệu chế tạo điện cực làm việc được lựa chọn để mang lại đặc tính chuyểnđiện tử tốt về phía chất nền, đồng thời thể hiện năng lượng hoạt hóa cao đểchuyển điện tử trong phản ứng

• Điện cực đếm (CE): là điện cực cấp nguồn Tất cả các thí nghiệm điện hóa

(với dòng điện khác không) đều phải có cặp điện cực working – counter Tronghầu hết các thí nghiệm, CE là dòng cấp nguồn do đó các vật liệu tương đốitrơ như than chì hoặc bạch kim được sử dụng Điện cực đếm phải có diện tích

bề mặt lớn để cho phép dòng điện chạy qua cao ngay cả khi điện thế thấp.Bằng cách này, tránh được sự phân tách nước, tạo khí hoặc tạo ra các gốc tự

do trong quá trình điện hóa

• Điện cực tham chiếu (RE): Điện cực tham chiếu phải cung cấp điện thế

không đổi trong suốt quá trình thí nghiệm do dòng điện chạy qua điện cựcdẫn đến phản ứng điện hóa sẽ làm thay đổi thành phần môi trường của điệncực làm thay đổi điện thế Một số điện cực được sử dụng rất phổ biến và cósẵn trên thị trường như Ag/AgCl, Hg/HgO, Cu/CuSO4, v.v [25]

1.3 Các kỹ thuật đo điện hóa

1.3.1 Amperometric

Mối quan tâm đến cảm biến sinh học cường độ dòng điện bắt đầu khi người

ta nhận thấy rằng các quy trình điện thế có khả năng phát hiện những thay đổi vềtính chất điện môi của bề mặt điện cực [26] Đo cường độ dòng điện hoặc mật độdòng điện ở một giá trị điện thế không đổi trong một khoảng thời gian xác địnhtrong tế bào điện hóa Khi một điện thế cố định được đặt vào giữa điện cực làmviệc và điện cực tham chiếu, quá trình oxy hóa và khử sẽ diễn ra dẫn đến dòng điệnđầu ra có thể đo được, tỷ lệ thuận với nồng độ của chất phân tích quan tâm [27].Các điện cực được sử dụng trong kỹ thuật đo cường độ dòng điện thường hiển thị

độ ổn định trong thời gian dài với ít nhiễu và phản ứng tuyến tính trải rộng Một

ưu điểm khác của loại này đầu dò có tính chất chọn lọc cao vì khả năng oxy hóahoặc khử đặc trưng cho mục tiêu được sử dụng để xác định được chất phân tích

mục tiêu [21] Với phương pháp này dòng điện tạo ra ở điện cực làm việc thôngqua chuyển đổi các gốc điện động được đo khi đặt một điện thế nhất định lên điệncực tham chiếu Dòng điện được tạo ra có liên quan trực tiếp đến quá trình oxyhóa hoặc khử các loại chất phân tích sau khi tương tác cụ thể với cơ quan thụ cảmsinh học tỷ lệ với nồng độ của các thành phần mục tiêu Kỹ thuật này tương đốiđơn giản và dễ sử dụng đồng thời mang lại độ nhạy tương đối cao [28–30].

1.3.2 Voltammetry

Voltammetry liên quan đến việc đo dòng điện và điện thế trong đó điện thếđược quét trên phạm vi điện thế đặt trước Dòng điện thu được được chuyển đổithành đỉnh đại diện cho chất phân tích mục tiêu và chiều cao của đỉnh tương ứngvới lượng chất phân tích trong mẫu Việc phát hiện nhiều chất phân tích trongmột mẫu dựa trên các đỉnh đặc trưng khác nhau của chất phân tích là cách tiếpcận hợp lý làm cho phương pháp này trở thành một kỹ thuật có tính ứng dụng caotrong cảm biến sinh học điện hóa [31] Kỹ thuật này cho phản ứng nhạy, nhanh,chính xác và tuyến tính nên phù hợp hơn cho sản xuất hàng loạt Tuy nhiên, độchọn lọc kém và dễ bị ảnh hưởng bởi các chất điện động khác là nhược điểm của

kỹ thuật này [28,32,33]

1.3.3 Potentiometry

Phép đo thế năng thường được sử dụng để tìm nồng độ chất tan trong dungdịch Đây là một trong những phương pháp của hóa học phân tích điện Trong cácphép đo thế năng, điện thế giữa hai điện cực được đo bằng vôn kế trở kháng cao

Nó quy định thế năng tích điện khối lượng ở một điện cực làm việc so với điện cựctham chiếu mà tại đó dòng điện bằng không

Phép đo thế năng của dung dịch giữa hai điện cực được sử dụng trong hóa phântích điện để đo thế điện hóa của các chất tích điện Tuy nhiên, cần có điện cựctham chiếu có độ ổn định cao và chính xác đó chính là hạn chế việc áp dụng đođiện thế trong phân tích sinh học [28]

1.3.4 Impedance

Phổ trở kháng điện hóa (EIS) đo trở kháng điện bề mặt bằng cách đặt mộtđiện áp hình sin nhỏ ở tần số cụ thể và dòng điện tạo ra được ghi lại, đồng thời quy

trình này có thể được thực hiện ở nhiều tần số khác nhau Tỷ lệ giữa dòng điện vàđiện áp cung cấp trở kháng bề mặt của cảm biến [34] Đây là một kỹ thuật hiệuquả để phát hiện sự tương tác giữa thụ thể sinh học cố định trên bề mặt điện cực

và chất phân tích bằng cách kiểm tra sự thay đổi về tính chất điện phát sinh từcác biến đổi sinh học trên bề mặt của các điện cực đã được chức năng hóa [28,35]

1.3.5 Conductometric

Phương pháp đo độ dẫn điện có thể được sử dụng trong xúc tác enzym đểxác định nồng độ chất và hoạt tính của enzym, tính chọn lọc trong trường hợpnày được cung cấp bởi các enzym, chúng chỉ xúc tác cho một số phản ứng nhấtđịnh [36] Kỹ thuật này định lượng sự thay đổi độ dẫn điện giữa cặp điện cực dophản ứng điện hóa (thay đổi tính chất dẫn điện của chất phân tích) [28]

1.4 Chức năng hóa bề mặt điện cực

Chức năng hóa bề mặt điện cực là quá trình xử lý bề mặt của điện cực nhằmcải thiện độ nhạy và độ chọn lọc của nó trong các ứng dụng cảm biến và các ứngdụng điện hóa khác Việc chức năng hóa bề mặt điện cực nhằm tạo ra các lớp phủtrên bề mặt của điện cực, điều này có thể cải thiện tính chất hóa học, tính chấtvật lý và tính chất điện hóa của điện cực [37, 38] Có nhiều phương pháp để chứcnăng hóa bề mặt điện cực bao gồm [39]:

• Phương pháp hóa học: Sử dụng các hợp chất hóa học để tạo ra các lớp phủ

trên bề mặt điện cực như: sử dụng các kỹ thuật phủ màng để tạo ra một lớpphủ bảo vệ trên bề mặt điện cực, bảo vệ chúng khỏi ăn mòn và cải thiện tínhchất điện hóa; sử dụng các phản ứng hóa học trực tiếp trên bề mặt của điệncực để tạo ra các lớp phủ có tính chất mong muốn, như các phản ứng trùnghợp hoặc trùng nguyên trên bề mặt; sử dụng các dung dịch chứa các chất hóahọc để tạo ra các lớp phủ trên bề mặt điện cực thông qua các phản ứng hóahọc trong dung dịch, như phản ứng điện phân hoặc phản ứng kết tủa

• Phương pháp vật lý: Sử dụng các phương pháp vật lý để tạo ra các lớp phủ

mỏng và đồng nhất trên bề mặt của điện cực như sử dụng một dòng hơi chứacác hợp chất hoá học hoặc vật lý để tạo ra các hạt sương nhỏ, sau đó đưachúng đến bề mặt điện cực để tạo ra lớp phủ (phun sương); sử dụng plasma

để tạo ra các phản ứng hoá học trên bề mặt điện cực, tạo ra các lớp phủ cótính chất mong muốn (phun plasma); sử dụng các dòng ion để tạo ra các lớpphủ trên bề mặt của điện cực thông qua quá trình kết tủa hoặc phản ứng trên

bề mặt (phun ion)

• Phương pháp tự lắng kết: Tự lắng kết phân tử - Sử dụng các chất phân

tử có tính chất hút ẩm để tạo ra các lớp phủ trên bề mặt điện cực Phươngpháp này có thể bao gồm quá trình tự lắng kết của các phân tử từ dung dịchlên bề mặt điện cực Tự lắng kết đa phân tử - Sử dụng các chất đa phân tử

để tạo ra các lớp phủ phức tạp hơn trên bề mặt điện cực

• Phương pháp tự lắng kết điện hóa: Sử dụng các phản ứng điện hóa để

tạo ra các lớp phủ trên bề mặt điện cực Các phương pháp này bao gồm sửdụng dòng điện để kích thích phản ứng hóa học trên bề mặt điện cực, tạo racác lớp phủ mới (điện phân), sử dụng một điện cực phụ để tạo ra các điềukiện điện hóa khác nhau trên bề mặt điện cực chính, tạo ra các lớp phủ khácnhau (điện phân mao quản), sử dụng sự khác biệt về điện thế giữa các điểmtrên bề mặt điện cực để tạo ra các lớp phủ khác nhau (điện phân đốt cực)

1.4.1 Self–Assembled Monolayer (SAM)

Đơn lớp SAM (Self-Assembled Monolayer) là một lớp màng mỏng có độ dàychỉ khoảng vài nanometer, được tạo ra bằng cách tự lắp ghép các phân tử trên bềmặt của một điện cực SAM được tạo thành thông qua quá trình tự tổ chức củacác phân tử hữu cơ trên bề mặt của điện cực, thông qua các liên kết hóa học giữacác phân tử và bề mặt của điện cực Mặc dù độ dày của SAM rất nhỏ, chỉ khoảngvài nanometer, nhưng nó có thể tạo ra một lớp bảo vệ cho bề mặt của điện cực vàcải thiện tính chất của nó trong các ứng dụng cảm biến và điện hóa SAM được sửdụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực như điện hóa, điện tử, cảm biến và công nghệnano [40] Cấu trúc của SAM bao gồm ba phần [41]:

• Phần đầu: Đây là phần đầu của phân tử SAM, được tùy chỉnh để tương tác

với bề mặt của vật liệu mà SAM được gắn vào Phần này chịu trách nhiệmcho tính chất tương tác của SAM với bề mặt, và có thể được thiết kế để tạo

ra các liên kết hóa học hoặc tương tác Van der Waals mạnh mẽ với bề mặtvật liệu Sự lựa chọn của phần này phụ thuộc vào tính chất hóa học và cấutrúc của bề mặt vật liệu cũng như các yếu tố khác như mục đích ứng dụng

của SAM.

• Phần mạch chính: Phần này nằm giữa phần đầu và phần đuôi của phân tử

SAM Phần trung gian thường được thiết kế để cung cấp độ linh hoạt và diđộng cho phân tử SAM, giúp nó có thể tự tổ chức và tự lắp ghép trên bề mặtmột cách hiệu quả Nó cũng có thể được tinh chỉnh để kiểm soát khoảng cáchgiữa các phần tử SAM trên bề mặt

• Phần đuôi: Phần đuôi của phân tử SAM là phần kết thúc của nó và thường

tương tác với môi trường xung quanh hoặc với các phần tử khác trong hệthống Phần này có thể được thiết kế để cung cấp tính chất phobic hoặc phíchcực cho SAM, hoặc để tạo ra tương tác phân tử với môi trường xung quanhnhư dung môi, ion, hoặc phân tử khác trong dung dịch Sự lựa chọn của phầnđuôi có thể ảnh hưởng đến tính chất của SAM trên bề mặt và hiệu suất của

nó trong các ứng dụng cụ thể

Tổng quát lại, các phân tử SAM tự tổ chức trên bề mặt vật liệu thông qua cácphần chính bao gồm phần đầu, phần mạch chính và phần nhóm chức năng Phầnđầu của phân tử tương tác trực tiếp với bề mặt vật liệu, trong khi phần mạchchính tạo ra các tính chất đặc biệt cho SAM như hydrophobic, hydrophilic, chống

ăn mòn, hoặc tính chất nhận biết đặc biệt Phần nhóm chức năng có thể đượctùy chỉnh để tạo ra các tính chất đặc biệt khác nhau như khả năng tương tác vớicác phân tử mục tiêu cụ thể, khả năng phản ứng hóa học, hoặc tính chất khác

Sự tương tác giữa các phần này tạo ra một lớp màng mỏng SAM với tính chất vàchức năng được tùy chỉnh, phù hợp cho mục đích ứng dụng cụ thể Quá trình tự

tổ chức và tự lắp ghép của các phân tử SAM này là cơ sở cho việc điều chỉnh vàtối ưu hóa các tính chất của lớp màng để đáp ứng yêu cầu của các ứng dụng khácnhau

1.4.2 Hoạt hóa nhóm cacboxyl (–COOH) của SAM

Sau khi hoàn thiện việc tạo lớp SAM trên bề mặt điện cực, bước tiếp theo làgắn kháng thể lên lớp SAM để tạo ra một cảm biến hoặc hệ thống phát hiện mụctiêu Tuy nhiên, trước khi có thể gắn trực tiếp kháng thể lên lớp SAM, cần thực hiệnmột bước hoạt hóa để tạo điều kiện liên kết lý tưởng Để kích hoạt nhóm carboxyl(-COOH) trong lớp SAM, có thể sử dụng phương pháp hóa học hoặc vật lý Mộtphương pháp hóa học phổ biến là sử dụng các chất như N-hydroxysuccinimide

(NHS) và 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide (EDC) Các hợp chấtnày tạo liên kết amide giữa nhóm carboxyl của lớp SAM và các phân tử khác, nhưkháng thể hoặc antigen Một cách khác là sử dụng plasma, một phương pháp vật

lý, để kích hoạt nhóm carboxyl trong lớp SAM Plasma tạo ra radicals hoặc iontác động lên bề mặt của lớp SAM, gây ra phản ứng hóa học và hình thành nhómchức năng mới, bao gồm nhóm carboxyl

Sau khi hoạt hóa, các nhóm carboxyl trong lớp SAM có thể tạo liên kết hóa họcvới các phân tử khác để tạo ra các tính chất đặc biệt cho cảm biến hoặc trong cácứng dụng khác Ví dụ, chúng có thể tạo liên kết ion với cation kim loại như Fe3+hoặc Cu2+, hoặc liên kết hydrogen với các phân tử kháng thể hoặc antigen Điềunày mở ra những tiềm năng sáng tạo trong việc phát triển các ứng dụng cảm biến

và phát hiện chất phân tích mục tiêu đa dạng và hiệu quả [42]

1.5 Cảm biến điện hóa sử dụng điện cực trên nền bảng mạch in

Công nghệ bảng mạch in (Printed Circuit Board - PCB) là một ngành côngnghiệp lâu đời và phổ biến rộng rãi trên toàn thế giới Ngoài các thiết bị điện tử,công nghệ này còn được sử dụng để chế tạo các bộ phận điện khác, bao gồm cácđiện cực cho các cảm biến sinh học và hóa học khác nhau Khả năng sản xuất hàngloạt đạt được thông qua các quy trình tiêu chuẩn và giá thành sản xuất thấp làmcho phương pháp chế tạo này trở thành phương pháp hàng đầu cho việc tạo mẫucác điện cực và các bộ phận điện của cảm biến sinh học Việc áp dụng phươngpháp này trong chế tạo các nền tảng cảm biến tạo điều kiện thuận lợi cho việc tíchhợp thiết bị điện tử và vi lỏng với cảm biến sinh học

Đồng (Cu) là vật liệu được sử dụng phổ biến nhất trong chế tạo PCB Tuy nhiên,vấn đề dễ dàng bị oxy hóa của đồng đã hạn chế ứng dụng của nó trong việc pháttriển các cảm biến điện hóa [43] Để vượt qua hạn chế này, một lớp kim loại trơmỏng như vàng (Au) hoặc bạch kim (Pt) được lắng đọng trên bề mặt của tấmPCB Phân tích điện thế quét vòng (CV) được thực hiện trên điện cực Cu PCBtrần cho thấy biểu đồ không đặc trưng vì đồng có thể dễ dàng bị oxy hóa Mặtkhác, việc sử dụng điện cực PCB mạ vàng mang lại điện thế ổn định với cửa sổđiện thế rộng có thể chấp nhận được đối với các ứng dụng cảm biến sinh học điệnhóa như trong hình 1.3 [2]

Các kỹ thuật khác nhau có thể được sử dụng để lắng đọng vàng trên các điệncực PCB, bao gồm phương pháp điện phân, phun xạ Các dịch vụ sản xuất PCB

Hình 1.3:Điện thế quét vòng từ −100 đến 500 mV (Ag/AgCl), trong dung dịch KCl 0.1

M chứa 5 mM K3F e (CN)6 sử dụng điện cực PCB (đường màu xanh) và điện cực PCB

mạ vàng (đường màu đỏ) Tốc độ quét là 50 mV/s [2].

cung cấp các quy trình hoàn thiện bề mặt khác nhau như một phần của quy trìnhchế tạo tiêu chuẩn, trong đó phổ biến nhất là quy trình Nickel hóa nhúng vàng(ENIG) [44] Trong đó, lớp Nickel (Ni) mạ giữa lớp mạ vàng và tấm đồng trên nềnPCB để cải thiện độ bám dính của vàng và hoạt động như một rào cản khuếch tán

để giảm sự xâm nhập vào đồng qua lớp vàng và tránh cho lớp đồng tiếp xúc với

bề mặt và bị oxy hóa [45,46] Ngoài ra, sloder mask được mở rộng để che các cạnhđiện cực nhằm tránh để đồng ở các cạnh bị lộ dẫn tới ăn mòn điện cực [47] Mộtlớp mạ vàng dày hơn đã được phát hiện là có thể tạo ra biểu đồ CV đặc trưng và

ổn định hơn [48]

Làm sạch bề mặt điện cực:

Với cảm biến sinh học điện hóa, các đặc tính vật lý bề mặt và tính chất hóa họccủa các điện cực cảm biến có tầm quan trọng rất lớn trong việc phát hiện chínhxác và đáng tin cậy chất phân tích mục tiêu Việc mạ vàng lên bề mặt PCB manglại bề mặt rộng hơn và khả năng dẫn điện tốt hơn Tuy nhiên, dựa trên nghiên cứucủa Dutta và cộng sự [3], sau khi mạ vàng lên bề mặt điện cực PCB, Cu tiếp xúc

và lớp hữu cơ có hàm lượng Carbon và Oxi cao vẫn còn trên bề mặt khiến điệncực không hoạt động về mặt điện hóa Họ đã đề xuất một quy trình làm sạch bằngcách sử dụng axeton, ethanol và nước, sau đó rung siêu âm trong dung dịch nướcchứa amoni hydroxit và hydro peroxit làm cho các điện cực hoạt động điện hóa và

Hình 1.4: So sánh giữa điện cực PCB mạ Au trước và sau khi làm sạch: (A) tín hiệu thu

được từ các điện cực PCB mạ Au trong dung dịch PBS chứa 4 mM K3F e (CN)6 trước khi làm sạch (i) và sau khi làm sạch ( ii); (B) hình ảnh dưới kính hiển vi của các điện cực PCB mạ Au thu được trước khi làm sạch và (C) sau khi làm sạch [3]

giảm độ nhám bề mặt có nguồn gốc từ lớp hữu cơ (hình 1.4)

Điện cực tham chiếu: Trong cảm biến sinh học điện hóa, điện cực tham chiếuduy trì điện áp ổn định trong suốt quá trình thí nghiệm Điện cực bạc clorua(Ag/AgCl) là một trong những điện cực tham chiếu được sử dụng rộng rãi trongphân tích điện hóa Một điện cực tham chiếu tương tự có thể được tích hợp trêncác cảm biến sinh học điện hóa dựa trên PCB bằng cách mạ điện hoặc lắng đọngđiện phân, một lớp Ag bổ sung, sau đó rửa bằng dung dịch HCl [49] hoặc natrihypoclorit [50]

Công nghệ bảng mạch in cung cấp một phương pháp mới, chi phí thấp để chế tạocác loại cảm biến khác nhau, do đó có rất nhiều nghiên cứu đang tập trung vàophát triển các loại cảm biến sinh học dựa trên loại vật liệu này như trình bày trongbảng 1.1 Cách tiếp cận này cũng tạo điều kiện thuận lợi cho việc chuyển đổi cáccảm biến nguyên mẫu đến người dùng cuối do ngành sản xuất PCB đang pháttriển nhanh chóng Ngoài ra, khả năng tích hợp của chất lỏng và thiết bị điện tửvới nền tảng cảm biến sinh học dựa trên PCB khiến chúng trở thành công nghệquan trọng cho các hệ thống chẩn đoán điểm chăm sóc độc lập Hơn nữa, sự giốngnhau trong quy trình chế tạo mở ra những cơ hội mới để áp dụng các thiết kế cảmbiến sinh học đã được nghiên cứu và triển khai trực tiếp trên bảng mạch in đểgiảm chi phí chế tạo cũng như thúc đẩy khả năng thương mại hóa

Bảng 1.1: Bảng tóm tắt một số nghiên cứu về cảm biến sinh học điện hóa trên PCB.

Phương pháp thực hiện

Tài liệu tham chiếu

ENIG,

Electroplated Au

Red phenol, GOx Glucose Amperometry [49]

Electroplated

Ni, Au

DNA probes

mRNA markers Amperometry [58]

1.6 Các nghiên cứu về cảm biến sinh học

1.6.1 Các nghiên cứu ở trong nước

Cảm biến sinh học đang thu hút được sự quan tâm lớn và được nhóm các nhàkhoa học ở trong nước tiến hành nghiên cứu và phát triển tại các trường đại học

và các viện nghiên cứu

• Tại Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam:

Nhóm của Phó Giáo sư (PGS.) Tiến sĩ (TS.) Nguyễn Thanh Bình tại Việnkhoa học Vật liệu đã phát triển cảm biến sinh học lactose bằng cách đồng

cố định β-galactosidase và glucose oxidase trên các vi điện cực được biến tính

trước bằng Pt/graphene/P (1,5-DAN) để ước lượng lactose trong các sản phẩmsữa để ngăn ngừa tình trạng không dung nạp lactose [59] Nhóm của Giáo sư

(GS.) TS Trần Đại Lâm tại Viện Kỹ thuật Nhiệt đới đã trình bày một cáchtiếp cận mới để chế tạo cảm biến hóa học đo màu cho H2O2 và một cảm biếnsinh học glucose dựa trên việc sử dụng hoạt động giống như peroxidase củacác hạt nano bạc được đặt trên các tấm oxit graphene [60], và các nghiên cứuphát triển các cảm biến sinh học sử dụng các hạt nano được cấy trên nền điệncực cảm biến nơi gắn các đầu dò DNA để phát hiện vi rút HIV [61].

• Tại Đại học Bách khoa Hà Nội:

Nhóm của TS Trần Thị Luyến đã phát triển cảm biến sinh học điện hóa sửdụng hệ ba điện cực với điện cực so sánh là Ag/AgCl được tích hợp với mộtbình phản ứng mini để phát hiện virus Newcastle [62] và phương pháp điệnhóa đơn giản để chế tạo cảm biến điện hóa không nhãn và không thuốc thử đểphát hiện microRNA dựa trên việc tự lắp ráp một lớp đa chức năng trên cácđiện cực carbon thủy tinh biến đổi hạt nano vàng (AuNP / GCE) [63] Nhómcủa PSG TS Trần Quang Huy đã phát triển cảm biến sinh học điện hóa dựatrên kháng thể huyết thanh người với các phương pháp cố định khác nhau đểphát hiện virus viêm não Nhật Bản [64] Nhóm của TS Chu Thị Xuân đã thiết

kế và chế tạo cảm biến sinh học vi lỏng bao gồm vi kênh PDMS và ba nền tảngđiện cực để đo điện hóa [65], phát triển kỹ thuật để cố định DNA dễ dàng đếncác dây nano polypyrrole polymer dẫn điện [66] Nhóm của PGS TS TrươngThị Ngọc Liên đã đề xuất phương pháp enrofloxacin-MIP mô phỏng sinh học

để phát hiện kháng nguyên enrofloxacin (ENRO) bằng cách sử dụng các hạtnano vàng (AuNPs) kết hợp phương pháp polyme in dấu phân tử [67] Nhómcủa TS Ngụy Phan Tín đã phát triển cảm biến đo trở kháng để phát hiện axitamin sarcosine không nhãn với các thụ thể polymer được in dấu phân tử [68]

• Tại Đại học Quốc gia Thành phố Hồ Chí Minh

Trung tâm Nghiên cứu triển khai - Khu Công nghệ cao hợp tác với Trung tâmNghiên cứu và Đào tạo thiết kế vi mạch - Đại học Quốc gia Thành phố HồChí Minh thực hiện nghiên cứu về cảm biến sinh học đã chế tạo thành cônglinh kiện vi cân tinh thể thạch anh (QCM - Quartz Crystal Microbalance) ứngdụng trong cảm biến sinh học Cảm biến QCM có ưu điểm là độ nhạy cao,thời gian phản ứng nhanh, có thể hoạt động trong môi trường lỏng và môitrường khí Tiềm năng ứng dụng cảm biến QCM rất rộng như chẩn đoán bệnhsớm, giải mã gen, phân tích ảnh hưởng chuyển gen lên sự phát triển của thựcvật cũng như môi trường sống, hoặc ảnh hưởng của một số chủng virus gâybệnh lên cơ thể sống và có khả năng phát hiện virus ở nồng độ cực thấp [69]

1.6.2 Các nghiên cứu ở nước ngoài

Cảm biến sinh học điện hóa từ lâu đã là một công cụ phân tích phổ biến dohiệu suất phát hiện cao về tính chọn lọc và độ nhạy Những tiến bộ gần đây củacảm biến sinh học cho phép phát hiện được kết hợp với công nghệ kỹ thuật số mớinhất và để chúng được thu nhỏ mà không ảnh hưởng đến hiệu suất làm việc.Một trong những lĩnh vực chính mà cảm biến có lợi nhất là trong xét nghiệm đểchẩn đoán lâm sàng [70] Từ những ứng dụng đầu tiên sử dụng cảm biến sinh học

để phát hiện glucose dựa trên glucose oxidase [71] được ứng dụng rất phổ biếntrong các bệnh viện và phòng khám chẩn đoán vì chúng rất cần thiết cho bệnhnhân tiểu đường để theo dõi lượng đường trong máu định kỳ đã mở đường choviệc khám phá các cảm biến sinh học điện hóa khác Gần đây, Jampasa và cộng sự

đã chế tạo cảm biến sinh học điện hóa sử dụng điện cực graphene in lụa (SPGE)được biến đổi bằng L-cysteine và vàng để phát hiện CRP theo sơ đồ kiểu bánhsandwich Anthraquinone được chọn làm nhãn oxi hóa khử do tính ổn định, đơngiản và tương thích với các phân tử sinh học cảm biến sinh học được đề xuất đãphát hiện CRP trong khoảng 0,01–150 µg mL−1 với giới hạn phát hiện là 1,5 ng

mL−1 [4]

Độ nhạy của cảm biến sinh học có thể được tăng cường bằng cách sửa đổi bề mặtcủa điện cực bằng vật liệu nano để tăng diện tích bề mặt hoạt động [72], Li vàcộng sự đã sử dụng các hạt nano vàng (AuNP) để phát triển cảm biến sinh họcđiện hóa để phát hiện thụ thể yếu tố tăng trưởng biểu bì 2 ở người (HER2), mộtchỉ dấu sinh học về ung thư vú Nhóm đã báo cáo giới hạn phát hiện là 0,5 pg

mL−1 và việc phát hiện tuyến tính với HER2 từ 1 pg mL−1 đến 1 ng mL−1 Trongnghiên cứu này, AuNP được sử dụng làm vật liệu hỗ trợ để cố định chuỗi peptideđặc trưng cho HER2 và tạo ra dòng điện hóa lớn do diện tích bề mặt lớn củaAuNP [73] Ruchira và cộng sự đã trình bày các phương pháp để tận dụng điệncực PCB hoàn thiện ENIG để phát triển cảm biến miễn dịch điện hóa, nhóm đãđánh giá hiệu suất của các thông số khác nhau ảnh hưởng đến hiệu suất cảm biếnnhư phương pháp làm sạch tạp chất trên bề mặt PCB, tối ưu hóa nồng độ đầu

dò oxy hóa khử và đã cố định thành công các kháng thể trên các điện cực bằngquy trình hỗ trợ cysteamine và glutaraldehyde, dựa trên phương pháp này nhóm

đã đưa ra ứng dụng của điện cực PCB hoàn thiện ENIG để phát hiện protein gaiSARS-CoV-2 tăng đột biến trong các mẫu nước bọt nhân tạo [5]

Một yếu tố khác ảnh hưởng đến độ nhạy của cảm biến sinh học là lượng khángthể được tiếp xúc theo đúng hướng để cho phép thu giữ tối đa và do đó phát

Hình 1.5: Sơ đồ minh họa quá trình chuẩn bị cảm biến sinh học điện hóa được phát triển để xác định CRP và đo điện hóa [4]

hiện được chất phân tích Để đạt được điều này, các lớp đơn lớp tự lắp ráp cyanopropyltrimethoxysilane đã được lắng đọng trên các tấm oxit thiếc indiumdùng một lần trong nỗ lực xác định nồng độ CRP bằng cách sử dụng cảm biếnsinh học đo trở kháng thông qua định hướng cụ thể của kháng thể Điện trở truyềnđiện tích thu được cho thấy độ tuyến tính cao trong khoảng 3,25–208 fg mL−1 vàgiới hạn phát hiện ấn tượng là 0,455 fg mL−1 [74] v.v

3-Ngoài ra, cảm biến sinh học điện hóa cũng được ứng dụng trong các lĩnh vực côngnghiệp thực phẩm, cho phép sàng lọc các mẫu thực phẩm trước khi kết thúc quátrình sản xuất, cung cấp thông tin theo thời gian thực và giám sát nhanh chóngtại chỗ về quá trình sản xuất [75] Raj và cộng sự đã phát triển một cảm biến sinhhọc đơn giản, không nhãn và có độ nhạy cao dựa trên phát hiện điện hóa bằngcách sử dụng nanocompozit Au@MoS2–PANI để phát hiện E.coli trong thực phẩm

Độ dẫn điện của điện cực carbon thủy tinh được tăng cường đáng kể bằng cách

sử dụng hỗn hợp nano Au@MoS2–PANI và một lớp đơn axit mercaptopropionic

tự lắp ráp trên bề mặt hạt nano vàng được sử dụng để cố định cộng hóa trị của

Hình 1.6: Minh họa trường hợp sử dụng cảm biến protein tăng đột biến SARS-CoV-2 trong nước bọt được kích hoạt bằng cảm biến miễn dịch chi phí thấp sử dụng điện cực ENIG PCB [5]

kháng thể nhằm giảm thiểu sự hấp phụ không đặc hiệu của mầm bệnh vi khuẩntrên bề mặt bề mặt điện cực [76] Jiang và cộng sự đã xây dựng một cảm biến điệnhóa 3D để phát hiện norovirus - một trong những nguyên nhân gây nhiễm trùngđường tiêu hóa ở mức độ cao, chủ yếu là do nước bị ô nhiễm hoặc thực phẩm bị ônhiễm [77] v.v

1.7 Kết luận

Với sự phát triển mạnh mẽ của công nghệ vi cơ điện tử ứng dụng trong sinhhọc và hóa học, các cảm biến sinh học đang ngày càng được quan tâm và nghiêncứu để ra đời những sản phẩm ứng dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực của sinh họcnhư y tế, thực phẩm và môi trường Các nghiên cứu về cảm biến sinh học điện hóa

ở Việt Nam cũng đã nhận được nhiều sự quan tâm và đang phát triển mạnh mẽcùng những nghiên cứu trên thế giới Các nghiên cứu đang tập trung vào việc sửdụng các vật liệu nano chức năng hóa bề mặt điện cực cảm biến để tăng khả năngphát hiện protein Các loại cảm biến này đang được phát triển ngày càng nhỏ gọn,tối ưu quy trình thực hiện nhằm giảm thiểu thời gian thí nghiệm để sớm cho ra kếtquả Đặc biệt là các cảm biến xét nghiệm protein sử dụng phương pháp điện hóacho những ưu điểm vượt trội như tính chọn lọc cao, có thời gian đáp ứng nhanhchóng với những thay đổi của môi trường và các tác nhân sinh học, có thiết kế đơn

giản và khả năng đo lường chính xác, có khả năng tái tạo cao và độ nhạy lớn, v.v.Cảm biến sinh học điện hóa sử dụng điện cực PCB cũng đang được chú trọng do

sử dụng vật liệu phổ biến, dễ dàng sản xuất hàng loạt và thương mại hóa

mặt cảm biến Công thức phân tử của axit 11-MUA là HS(CH2)10CO2H, trong đóphần đầu là nhóm thiol (-SH) và phần cuối là nhóm carboxyl (-COOH) Điều nàytạo ra một phân tử có khả năng tạo ra liên kết với các bề mặt vật liệu và cũng cóthể tham gia vào các phản ứng hóa học khác nhau Trong thí nghiệm này sử dụngAxit 11-mercaptoundecanoic của Sigma Aldrich (Sigma Aldrich - 71310-21-9).

Hình 2.1: Công thức và cấu trúc phân tử của Axit 11-MUA

N-(3-Dimethylaminopropyl)-N′-ethylcarbodiimide, thường được gọi là EDChoặc EDAC, là một hợp chất hóa học được sử dụng trong sinh hóa và hóa học hữu

cơ Thường được sử dụng như một chất liên kết các nhóm carboxyl với các nhóm

amin chính trong peptide, protein và oligonucleotide Phản ứng này tạo ra liên kếtamide, làm cho EDC trở thành một thành phần chính trong các ứng dụng sinhhóa và sinh học vật lý khác nhau, bao gồm nghiên cứu tương tác protein-protein,liên kết peptide và đánh dấu kháng thể Các nhóm carboxyl của một phân tử phảnứng với các nhóm amin chính của một phân tử khác dưới sự hiện diện của EDC,tạo điều kiện cho việc hình thành các liên kết amide ổn định Trong thí nghiệmnày sử dụng N-(3-Dimethylaminopropyl)-N′-ethylcarbodiimide của Sigma Aldrich(Sigma Aldrich - 25952-53-8).

Hình 2.2: Liên kết cộng hóa trị của kháng thể đối với SAM trên bề mặt vàng [6]

N-Hydroxysuccinimide (NHS)là một hợp chất hóa học có công thức phân tử

là C4H5NO3, là một chất rắn màu trắng tinh khiết được sử dụng rộng rãi tronghóa học hữu cơ và sinh học, đặc biệt là trong lĩnh vực tổng hợp peptide và sửa đổiprotein NHS được biết đến với khả năng phản ứng với nhóm amino chính (–NH2)dưới điều kiện nhẹ để tạo ra liên kết amide ổn định Phản ứng này thường được

sử dụng trong quá trình kết hợp các nhóm carboxyl (–COOH) với nhóm aminochính để tạo ra liên kết amide Các phản ứng như vậy thường được áp dụng trongviệc kết hợp protein, peptide và các hợp chất sinh học khác với bề mặt, chất manghoặc nhãn trong các kỹ thuật kết hợp sinh học Chức năng este NHS trong các esteN-hydroxysuccinimide, chẳng hạn như este được kích hoạt N-hydroxysuccinimide(este NHS), đặc biệt hữu ích trong hóa học kết hợp sinh học Este NHS thườngđược sử dụng như là các trung gian phản ứng trong việc sửa đổi protein và các hợpchất sinh học khác, phản ứng chọn lọc với nhóm amino chính để tạo ra liên kếtamide ổn định Trong thí nghiệm này sử dụng N-Hydroxysuccinimide của Sigma

Aldrich (Sigma Aldrich - 6066-82-6).

Bovine Serum Albumin-Fluorescein Isothiocyanate (BSA-FITC) là mộthợp chất sinh học được tạo ra từ việc kết hợp Bovine Serum Albumin (BSA) vớiFluorescein Isothiocyanate (FITC) BSA là một protein phổ biến được tìm thấytrong huyết tương của bò, trong khi FITC là một phân tử fluorescein được gắnvới nhóm isothiocyanate, có khả năng phát quang mạnh khi được kích thích bằngánh sáng UV hoặc ánh sáng xanh Khi BSA và FITC phản ứng với nhau, FITC

sẽ gắn vào các nhóm amino trên chuỗi protein của BSA thông qua liên kết amidehoặc liên kết thio-urethane, tạo ra hợp chất kết hợp BSA-FITC Điều này tạo ramột phức chất protein có khả năng phát quang khi kích thích, cho phép nó được

sử dụng trong nhiều ứng dụng sinh học và hóa học, bao gồm nghiên cứu các chỉdấu sinh học và hình ảnh hóa học, kỹ thuật immunoassay, và nhiều ứng dụng kháctrong phân tích sinh học Hợp chất này thường được sử dụng làm nhãn trong cácphương pháp như immunofluorescence và flow cytometry để đánh dấu và phát hiệnprotein hoặc các cấu trúc sinh học khác trong mẫu thử Điều này giúp cho việcquan sát và theo dõi sự tương tác và phân bố của các thành phần sinh học trongmẫu nghiên cứu được dễ dàng hơn Trong thí nghiệm này sử dụng Anti BovineSerum Albumin của Sigma Aldrich (Sigma Aldrich - A9771)

Anti Bovine Serum Albumin là các kháng thể được tạo ra chống lại BovineSerum Albumin Các kháng thể này được tạo ra bằng cách tiêm protein BSA chođộng vật, dẫn đến việc sản xuất ra các kháng thể cụ thể nhận diện và liên kết vớiBSA Các kháng thể Anti-BSA thường được sử dụng trong các phương pháp và kỹthuật miễn dịch học khác nhau như ELISA, western blotting, immunoprecipitation

và immunohistochemistry Chúng cho phép phát hiện và định lượng BSA trongmẫu, cũng như tinh chế BSA hoặc các protein được đánh dấu bằng BSA Cáckháng thể này là công cụ trong nghiên cứu y sinh học, chẩn đoán và các ứngdụng công nghệ sinh học, cho phép các nhà nghiên cứu nghiên cứu các quy trìnhliên quan đến BSA, theo dõi mức độ biểu hiện protein và điều tra các tương tácprotein-protein Trong thí nghiệm này sử dụng Anti Bovine Serum Albumin củaSigma Aldrich (Sigma Aldrich - 9048-46-8)

Ngoài ra các hóa chất khác cũng được sử dụng trong thí nghiệm bao gồm: Axit

Acetic, cồn isopropyl, nước khử ion, khí N2, Anilin, HAuCl4, Skim milk, dung dịch1X phosphate-buffered saline, ethanol, v.v

2.2 Dụng cụ thí nghiệm

2.2.1 Điện cực in carbon

Hình 2.3: Cấu tạo điện cực in carbon

Luận văn sử dụng điện cực in carbon - một sản phẩm thuộc dòng DEP-ChipSeries for Electrochemical Biosensors của công ty BIODEVICE TECHNOLOGY.Hình 2.3 mô tả cấu tạo điện cực in carbon bao gồm bốn bộ phận chính Tấm nền

là phần cơ bản của điện cực in carbon, được làm bằng vật liệu polymer có tính vilỏng để lưu chất lỏng trên mặt nền của điện cực Điện cực làm việc carbon là phầnquan trọng nhất, tạo ra tín hiệu điện hóa từ các phản ứng sinh học Đối với điệncực làm việc, carbon được in trực tiếp trên nền polymer để tăng độ bền và độ ổnđịnh Điện cực tham chiếu bạc/bạch kim clorua (Ag/AgCl RE) là điện cực thamchiếu giúp đo thế điện thế và đảm bảo độ ổn định của tín hiệu điện hóa Điện cựcđếm được làm từ carbon, cung cấp dòng điện và giúp tạo ra một mạch điện hoànchỉnh Điện cực đếm được đặt ở xa so với điện cực làm việc Tất cả các phần trongđiện cực in carbon được thiết kế để hoạt động hiệu quả và đáp ứng các yêu cầucủa các ứng dụng điện hóa sinh học

2.2.2 Điện cực PCB hoàn thiện Niken hóa nhúng vàng (ENIG-PCB)

Bên cạnh sử dụng điện cực thương mại, luận văn này đồng thời sử dụng mộtđiện cực tự phát triển dựa trên các đặc tính về hóa học, sinh học của các loại cảm