Luận văn thạc sĩ Công nghệ sinh học: Phân tích hệ vi sinh vật lên men trà kombucha

Tuy nhiên, vẫn còn nhiều hạn chếtrong quá trình lên men loại trà này, như: chưa sản xuất ở quy mô công nghiệp, dễtạp nhiễm dẫn đến hư hỏng sản phẩm trong quá trình lên men truyền thống:

ĐẠI HỌC QUOC GIA TP HO CHI MINHTRUONG DAI HOC BACH KHOA

PHAM PHƯƠNG DIEN

PHAN TICH HE VI SINH VAT LEN MEN

ĐẠI HỌC QUOC GIA TP HO CHÍ MINHTRUONG DAI HOC BACH KHOA

KHOA KY THUAT HOA HOC

BO MON CONG NGHE SINH HOC

‘

LUAN VAN THAC SI

CHUYEN NGANH CONG NGHE SINH HOC

CÔNG TRÌNH ĐƯỢC HOÀN THÀNH TẠITRƯỜNG ĐẠI HỌC BACH KHOA —DHQG -HCMCán bộ hướng dẫn khoa học : PGS TS NGUYEN THUY HƯƠNG

Cán bộ cham nhận xét 1 : PGS TS NGUYEN TIEN THANG

Cán bộ cham nhận xét 2 : TS NGUYEN HỮU PHÚC

Luận văn thạc sĩ được bảo vệ tại Trường Dai học Bách Khoa, DHQG TP.HCM ngày 12 thang 01 năm 2018

Thanh phan Hội đồng đánh giá luận văn thạc sĩ gồm:1 PGS TS LÊ THỊ THỦY TIEN

2 PGS TS NGUYEN TIEN THANG3 TS NGUYEN HUU PHUC

4 TS VO DINH LE TAM5 TS HUYNH NGOC OANHXác nhận của Chu tịch Hội đồng đánh giá LV va Trưởng Khoa quan lý

chuyền ngành sau khi luận van đã được sửa chữa (nêu có).

CHỦ TỊCH HỘI ĐÔNG TRƯỞNG KHOA

ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP.HCM CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAMTRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA Độc lập - Tự do - Hạnh phúc

NHIỆM VỤ LUẬN VĂN THẠC SĨHọ tên học viên: Phạm Phương Điền MSHV:1570254Ngày, tháng, năm sinh: 02/12/1982 Nơi sinh: TP Hồ Chí MinhChuyên ngành: Công nghệ sinh học Mã số : 60420201

I TEN DE TÀI:PHAN TÍCH HE VI SINH VAT LEN MEN TRÀ KOMBUCHAIl NHIEM VU VA NOI DUNG:

1 Mục tiêu nghiên cứu

Phân lập tuyến chọn, định danh hệ vi sinh vật chính lên men trà Kombucha nhằmlàm tiền đề cho lên men công nghiệp

2 Nội dung nghiên cứu

- Phan lập và định danh hệ vi sinh vật bằng phương pháp truyền thống.- _ Phân tích và định danh hệ vi sinh vat bang phương pháp PCR-DGGE.- So sánh kết quả của hai phương pháp va tuyển chọn giống vi sinh vật.- _ Xây dựng lý lịch bộ giống sau định danh

- Luu trữ và bảo quản bộ giốngII NGÀY GIAO NHIỆM VU : 16/01/2017IV NGÀY HOÀN THÀNH NHIỆM VU: 18/12/2017V CÁN BỘ HƯỚNG DÂN: PGS.TS NGUYÊN THÚY HƯƠNG

Tp HCM, ngày 18 thang 12 năm 2017CÁN BỘ HƯỚNG DÂN CHỦ NHIỆM BỘ MÔN ĐÀO TẠO

(Họ tên và chữ ký) (Họ tên và chữ ký)

TRUONG KHOA

(Họ tên và chữ ký)

LỜI CÁM ƠNĐề hoàn thành luận văn tốt nghiệp này, em xin gửi lời cảm ơn và sự biết ơnchân thành, sâu sắc tới cô giáo PGS.TS Nguyễn Thúy Hương Người đã tạo mọiđiều kiện thuận lợi, động viên, hướng dẫn sâu sát và giúp đỡ em hoàn thành luận

văn.

Xin chân thành cảm ơn toản thé quý Thay, Cô trong Bộ môn Công nghệ Sinhhọc trường Đại Học Bách Khoa TP Hồ Chí Minh đã truyền đạt kién thức và kinhnghiệm quý báu; tạo điều kiện thuận lợi cho em hoàn thành luận văn và chương

trình học này.

Xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành đến các em: Ánh, Ngọc Anh, Hậu, Nhân,Ngọc đã giúp đỡ, động viên anh trong quá trình học và thực hiện luận văn tốt

nghiệp.Xin chân thành cảm on!

TP Hô Chí Minh, tháng 12 năm 2017

Học viên

Phạm Phương Điền

TÓM TATTrà lên men Kombucha đã được chứng minh có nhiều ích lợi cho sức khỏe conngười nhờ chứa nhiều hoạt tính sinh học quý Tuy nhiên, vẫn còn nhiều hạn chếtrong quá trình lên men loại trà này, như: chưa sản xuất ở quy mô công nghiệp, dễtạp nhiễm dẫn đến hư hỏng sản phẩm trong quá trình lên men truyền thống: chưachủ động được nguồn giống vi sinh vật nên chất lượng không đồng nhất giữa cáclần lên men Quá trình lên men trà Kombucha có sự xuất hiện của nhiều nhóm visinh vật Thế nhưng, không phải tất cả các nhóm vi sinh vật đều có lợi trong quátrình lên men Do đó, nghiên cứu tiễn hành phân lập, định danh hệ vi sinh vật lênmen có trong trà Kombucha băng phương pháp truyền thống và hiện đại PCR-DGGE là cần thiết nhăm tạo tiền để quan trọng cho lên men công nghiệp và xâydựng được lý lịch bộ giống vi sinh vật, bảo quản giống cho các nghiên cứu liênquan khác Qua kết quả nghiên cứu, mac du có những sự khác biệt về hệ vi sinh vật,song, cả hai phương pháp vẫn thể hiện sự thống nhất cao Kết quả nghiên cứu chothay có sự hiện diện của các chung nắm men: Brettanomyces bruxellensis, Candidatropicalis, Dekkera bruxellensis, Saccharomyces cerevisiae Cac ching vi khuan

acetic: Komagataeibacter nataicola, Pseudomonas geniculata, Acetobacter

tropicalis và các chủng vi khuẩn lactic: Enterococcus faecium, Lactobacilluspentosus.

Kombucha tea has been shown to be beneficial for human thank to its rich bioactiveproperties However, there are still many restrictions on the fermentation process ofthis tea, such as: not produced on industrial scale, susceptible to contamination anddamage to the product in the traditional fermentation; not active in control thesource of microorganism so the quality is not uniform between fermentations Thereare many groups of microorganisms appear during the fermentation of Kombuchatea However, not all of them are good Therefore, the study of isolation andidentification of fermentation microorganisms in Kombucha tea using traditionaland modern methods of PCR-DGGE is necessary to create an important premise forindustrial fermentation, construction a biography of microorganisms andpreservation them for other related research Based on the results, although there aredifferences in the microbial population, both methods still show high consistency.Research results show that the presence of yeast strains: Brettanomycesbruxellensis, Candida tropicalis, Dekkera bruxellensis, Saccharomyces cerevisiae.Acetic acid bacteria: Komagataeibacter nataicola, Pseudomonas geniculata,Acetobacter tropicalis and lactic acid bacteria: Enterococcus faecium, Lactobacillus

pentosus.

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi.Các sô liệu và kêt quả nghiên cứu trong luận văn này là trung thực và chưa

từng được công bồ trong bất kỳ công trình nào trước đây

Người nghiên cứu

Phạm Phương Điền

MỤC LỤC

LOT CAM ĐOANN 4H HH HH HH HH HH 701g pnksetesrtsee ivDANH MỤC CÁC CHU VIET 'TÁẮTT 2-5 5-55 5< 5< << sseseseseeeeee ViiDANH MỤC BÁNG << << sư 9 g9 cư cư geeeeeesee ixDANH MUC HINH 0101 X00710177 1CHƯƠNG 1: TONG QUAN TÀI LIIỆPU 5 5-5-5552 << + =sesesese 31.1 Tổng quan về trà Kombucha o- 5-5-5 << << s9 99SeEeEeeeeeeeseses 31.1.1 NQUOM ĐỐC ánh TT TH HH HH HH tt 3

1.1.2 Hệ vi sinh vát trong trà KOIMD1CÏ Ă 2221111111111 53211 k2 4

1.1.2.1 Nam men trong trà Kombucha c- kk+E#E+E+E+ESEEEEEEEEcEekekeeeeeeeree 51.1.2.2 Vi khuẩn acetic trong tra Kombucha - - - + + SE +k+vexeeeeeessee 71.1.2.3 Vi khuẩn lactic trong trà Koimbucha - - - + + SE +k£k+k+kexeeeeeessee 81.1.3 Thành phan hóa học của trà KOMbUCHA ecececeececcscscscscscscssesesesvsvsvsvevsvevevereneees 8

1.1.4 Cơ sở khoa học cua qua trình lên men trà KombDuch -«««- 101.1.5 Các hoạt tính sinh học quý và công dụng của trà Kombucha 13

1.1.5.1 Hoạt tính kháng khuẩn - =3 EEEEEESESEEE SE grerreg 14

1.1.5.2 Hoạt tính như probiotic -GG 2222222632329 11 111111111111 888233555 1k4 151.1.5.3 Hoạt tính kháng oxy hoa ececcsssssssceeeeecceeeeesseesssssncaeeeeeeeeeeeeeeeeeeaas 16

1.1.5.4 Hoạt tinh chong ung thư - <6 SE EE#E#ESESEEE SE tre gerree 17

1.1.5.5 Hoạt tính giải độc của acid øÏUCUTOTIC << 55555 S****+++++++ssssssssssss2 18

1.1.6 Những han chế của trà Kombucha truyền thong ceccccccccccccscscscsscsesvevsvevsvsveveees 19

1.2 Cac phương pháp phan tích hệ vi sinh vật lên men trà Kombucha 21

1.2.1 Phương pháp vi sinh truyện thong ccccccccccccccccccsssscscsvsvscsvsvssssesvsvsvsvsvevsustetseseeees 211.2.2 Phân tích bằng kỹ thuật điện di trên gel gradient biến tinh (DGGE) 21

1.2.2.2 Những ưu điểm và nhược điểm của kỹ thuật DGGE - 2s «se: 231.2.3 Một số kỹ thuật phân tích khác ceececccccccscscescsesescsvsvsvsvscsvssssssssvevsvsvsveveussseseceeees 23

1.3 Các nghiên cứu ngoài VA fFO'Ø HƯỚC c5 036 99996666666999556 24

I NI, 4, 0 SA EERE EEE EEE 25

CHUONG 2 VAT LIEU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 272.1 Thời gian và địa điỂm - «Gv cư ưu geevee 272.2 Nguyên liệu, môi trường và trang thiết bị - 5-5 << << s<sesesssesese 27

2.2.2 Hóa chat, môi trường và trang thiết Đị chen 272.2.2.1 Hóa chất, môi trường «c3 E11 EE9E9 5E 1111111 1 1111 negerreg 272.2.2.2 Trang thiẾt Dị - - tk S115 1111111111 111111111 111101 11111111 greg 28

2.3 Phương pháp nghiÊn CỨU G555 9.99996589999999 60658 29

2.3.1 Sơ đồ nghiên cứu tong UG ccececcccccccccccccccscscsvssescsvsvsvsvsvsvsestssesesevevavsvsvsvsneeeeees 29

2.3.2 Phương pháp thí HĐ HIỆHH c1 1111 EEEE1 1111559911111 11k k KTS 1 1111k ket 30

2.3.2.1 Phương pháp lay mẫu trà Kombbucha - - - + + + + +k+E+E£EeEeeeeeeee 30

2.3.2.2 Phân lập và xác định mật độ vi sinh vật trong mẫu trà Kombucha 30

2.3.2.3 Kiểm tra khuẩn lạc thuần các nhóm vi sinh vật trong hệ vi sinh vật lên men

Kombucha - - - - G11 kí 312.3.2.4 Đánh giá và định danh các chung vi sinh vật phan lập - 32

2.3.2.5 Phân tích hệ vi sinh vật bằng kỹ thuật PCR-DGGE - 5 +c+cscse 332.3.2.6 Phân tích, so sánh kết quả và tuyển chọn giỐng ¿26s +s+xsx+esesese 362.3.2.7 Xây dung lý lịch bộ giống vi sinh vật phân lập từ trà Kombucha 36CHƯƠNG 3 KET QUÁ VÀ BIEN LUẬN 5-5-5- 5< < 5< << << cscscsesese 373.1 Biến động mật độ của hệ vi sinh vật lên men trà Kombucha 373.2 Kết qua phân lập hệ vi sinh vật lên men trà Kombucha bằng phương pháptruyen 87 1) 2177 393.2.1 Kết quả phân lập NGM HI€H SE EEEEE S122 Hưng 39PT S.C7./:1/)/)2).17.8/08 ,1 1 108 ngaat 433.2.3 Kết quả phân lập vì khuẩn Lactic St ve rgrgrrưn 473.3 Kết quả phân tích hệ vi sinh vật lên men trà Kombucha bằng kỹ thuật PCR

— DGGE G0000 0 0 0 0.0 00 00 004 00 4 00.04 080804 0609096 49

3.3.1 Kết quả phân tich Gm I€H SE EEEE S122 HH 493.3.2 Kết quả phân tích vi khuẩn - ST TT 1111111 537

3.4 Xây dựng lý lịch và bảo quản bộ giống Vi sinh vật - <5 =<2 56CHƯƠNG 4 KET LUẬN VÀ KIÊN NGHỊ, 5- << << << sscsesese 58AV K@t 1UAD cc aaa 58VU; 0081110 +41 2 58TÀI LIEU THAM KHAO) 5-5-5 << << 5955 eEeE e9 s52 59

PHỤ LỤC 1PHỤ LỤC 2PHỤ LỤC 3PHỤ LỤC 4

Chữ viết tắt

AABLABDGGEFDA

PCR và điện di trên gel gradient biến tính - Polymerase chain

reaction denaturing gradient gel electrophoresisVi sinh vat

DANH MỤC BANGBảng 1.1 So sánh nồng độ khoáng anion của trà Kombucha và tra đen 10Bảng 1.2 Một số thành phần của trả Kombucha lên men từ trà xanh và trà đen liênquan đến sức KAGE HH HT HT TT TT grờt 14Bang 1.3 Ưu, nhược điểm của kỹ thuật điện DGGE 26 56s+s+E+esesese 23Bảng 3.1 Các chủng nắm men được phân lập - - - + + xxx +k+x+xexeeeeseee 39Bang 3.2 Các chủng vi khuẩn acetic được phân lập - 5-5 6 565s+x+x+x+esesese 43Bảng 3.3 Các chủng vi khuẩn lactic được phân lập + 66x +x+xex+eseseee 47Bảng 3.4 Ly lịch bộ giống vi sinh vật lên men trà Kombucha - 56

DANH MỤC HINHHình 1.1 Trà Kombucha truyền thỐng -¿-¿- - S+E#E#E#ESESESEEEEEEEEckekekeeeerreree 4Hình 1.2 Nắm giống -¿- -kE SE SE E9 5 1 1 1151511111151 11111111111 0 4Hình 1.3 Vi khuẩn acetic (a) và nam men (b) trong mang cellulose 5Hình 1.4 Nam men Saccharomyces Cerevisie secccccccscsecessvscssssssssssssvsssveverststssssavens 6Hình 1.5 Vi khuẩn Acetobacter ACCC eceecccscsssssssssssssessssssssesestssevsvsvssavevsvsvsneavevsen 8Hình 1.6 Các acid hữu co phố biến va amino acid trong quá trình lên men tra

KOMbDUChA 0 4 9

Hình 1.7 Cơ chế phân giải đường trong tế bao nắm men 22s se: 11Hình 1.8 Quá trình chuyển hóa glucose thành cellulose c.ccesesesesessctstseseseeeeees 13Hình 1.9 Một số polyphenol trong tra o.c.cceecscscsesesesesssssessescecscscsescecscscecesasevavens 16Hình 1.10 Các nhóm có chức năng chống oxy hóa của các polyphenol 17Hình 1.11 Quá trình tong hợp acid gÏlu€urOnic - + 2 - + + +£+k+k+E+EeErezxeeereee 19Hình 1.12 Nắm trà giống bị hỏng (nhiễm mốc) - - + + + SE +E£EeEeeeeseee 20Hình 1.13 Sơ đỗ chung về quy trình kỹ thuật DGGE 2 6ss+s+E+E+Esxse 22Hình 2.1 Sơ đỗ nghiên cứu tong quát - %6 k+k+k#E+E+ESESESEEEEEEEkckckekekreeerree 29Hình 3.1 Biến động của hệ vi sinh vật trong quá trình lên men trà Kombucha 37

Hình 3.2 Trinh tự đoạn gen 28S rRNA của chung NMI (Brettanomyces

Hình 3.9 Trinh tự đoạn gen 16S rRNA của chủng A4 (Pseudomonas geniculata) 46Hình 3.10 Trinh tự đoạn gen 16S rRNA của chủng L1 (Enterococcus faecium) 48Hình 3.11 Trinh tự đoạn gen 16S rRNA của chung L2 (Lactobacillus pentosus) 48

Hình 3.12 Kết quả phân tích nam men trong mẫu trà Kombucha lên men băng

phurong phap PCR-DGGE 2200010177 49

Hình 3.13 Kết quả phân tích vi khuẩn trong mẫu trà Kombucha lên men bang

phurong phap PCR-DGGE 2200010177 52

MỞ DAUTính cấp thiết cúa dé tài

Kombucha đã được Cục quản lí thực phẩm va dược phẩm của Mỹ (FDA)chứng nhận là an toàn đối với con người Hoạt tính sinh học trong Kombucha giúplàm tăng hiệu quả của tuyến nước bọt, dạ dày và đường ruột; hỗ trợ chống xơ cứng

động mach, thải độc, giảm lo âu và lão hóa [33 |, giảm triệu chứng bệnh tri, bệnh gut

và bệnh thấp khớp, giảm táo bón và khó tiêu [14] Thành phan acid lactic trongKombucha cần thiết cho hệ tiêu hóa, giúp lưu thông máu và cân băng độ acid vàkiềm trong cơ thé Acid acetic trong trà giúp chống lại sự xâm nhập của vi khuẩn cóhại Acid glucuronic giúp giải độc gan [20][23] Cac hợp chất tanin trong trà có khảnăng giúp cơ thể kháng khuẩn và phòng chống bệnh ung thư, làm chậm quá trình

lão hóa.

Hạn chế về sản lượng so với nhu cau con người: ở Việt Nam, phan lớn tràKombucha chỉ sản xuất nhỏ lẻ ở quy mô gia đình, dễ bị tạp nhiễm, cũng như quátrình lên men còn mang tính truyền thống, chưa có sự kiểm soát chất lượng Thànhphan hé vi sinh vat lén men thay đôi tùy vùng, điều kiện khí hậu, chưa chủ độngđược nguén giống vi sinh vật Vì thế chưa thé lên men công nghiệp một cách ồn

định.

Trên thế giới chưa có nhiều nghiên cứu về phân lập, định danh hệ vi sinh vậtlên men trà Kombucha Ở Việt Nam chưa có nghiên cứu nào, đặc biệt là nghiên cứuphân lap, định danh băng phương pháp truyền thong và phương pháp sinh học phântử Do đó, sự hiểu biết đầy đủ về hệ vi sinh vật cộng sinh này trong Kombucha cònnhiều hạn chế Phương pháp truyền thống và phương pháp sinh học phân tử đều cócác thế mạnh khác nhau Phương pháp truyền thống cho phép bẫy được chủng visinh vật, trong khi phương pháp PCR-DGGE cho phép hình dung toàn cảnh tổ hợp

hệ vi sinh vật trong mâu.Quá trình lên men trà Kombucha có sự xuât hiện cua nhiêu nhóm vi sinh vat.

Thế nhưng, không phải tat cả các nhóm vi sinh vật đều có lợi trong quá trình lên

men Do đó, nghiên cứu tiễn hành phân lập, định danh hệ vi sinh vật lên men tràKombucha băng phương pháp truyền thống và hiện đại PCR-DGGE là cần thiết,nhằm cung cấp hiểu biết và cơ sở lý thuyết quan trọng vẻ hệ vi sinh vật lên men tràKombucha ở Việt Nam, nhằm tạo tiền dé quan trong cho lên men công nghiệp; các

nghiên cứu liên quan khác.Mục tiêu nghiên cứu

Phân lập, tuyển chọn, định danh hệ vi sinh vật chính lên men trà Kombuchanhằm làm tiền dé cho lên men công nghiệp

Nội dung nghiên cứu

Dựa vào mục tiêu trên, nghiên cứu tiên hành các nội dung sau:

Phân lập và định danh hệ vi sinh vật băng phương pháp truyền thống.- Phan tích và định danh hệ vi sinh vật bằng phương pháp PCR-DGGE.- So sánh kết quả của hai phương pháp va tuyến chọn giống vi sinh vật.- _ Xây dựng lý lịch bộ giống sau định danh

- Luu trữ và bao quản bộ gidng.

CHƯƠNG 1: TONG QUAN TAI LIEU

1.1 Tong quan về trà Kombucha1.1.1 Nguén gốc

Kombucha có nguồn gốc ở Đông Bắc Trung Quốc (Mãn Châu), khoảng năm220 trước công nguyên Sau đó, Kombucha được biết đến ở Nga với tên gọiTeakwas Năm 414, nhà vật lí Kombu đã đưa nắm trà đến Nhật Bản và sử dụng đểchữa các bệnh về tiêu hóa của hoàng dé Inkyo Trong thé chiến thứ II, Kombuchađược đưa vào sử dụng ở Đức Những năm 1950, Kombucha được tiêu thụ pho biénở Pháp, Y, Bắc Phi Những năm 1960, tra Kombucha trở nên phố biến hon nữa khicác nghiên cứu của các nhà khoa học Thụy Sĩ đã báo cáo việc uống trà Kombuchacó lợi như khi ăn sữa chua Ngày nay, trà Kombucha được thương mại trên toàn thế

giới với những hương vi khác nhau [27].

Trà Kombucha được lên men và sử dụng rộng rãi ở nhiều nơi, nhiều địaphương như những sản phẩm đồ uống lên men truyền thống khác do nhiều ích lợiđối với sức khỏe con người, đặc biệt là dễ dàng thực hiện lên men tại nhà với những

nguyên liệu và dụng cụ đơn giản Huong vi của trà Kombucha cũng đặc trưng tùy

nguyên liệu trà ban đầu thêm vào Độ ngọt cũng dễ dàng điều chỉnh theo ý thích củangười sử dụng Điều này góp phần đa dạng số người sử dụng loại trà lên men này.Lượng tra, đường và nam trà giống cũng khác nhau ở mỗi vùng, mỗi địa phương.Quy trình lên men truyền thong như sau: Dun sôi | lít nước, sau đó b6 sung 5 gamtrà Lọc bỏ xác trà sau 10-15 phút B6 sung 50 gam đường sucrose, khuấy tan và dénguội ở nhiệt độ phòng Sau đó cho hỗn hợp dịch trà đường vào bình chứa tiệttrùng, bố sung 24 gam nam trà giống và 0.2 lít dịch trà Kombucha đã lên men (lầnlên men trước) nhằm ức chế sự phát triển của những vi sinh vật tạp nhiễm, giúp sựlên men thuận lợi Đậy miệng bình băng vải sạch, u 7-10 ngày ở nhiệt độ âm 26°C-30°C Trong 1-2 ngày đầu, | màng mỏng trên bề mặt bình chứa được hình thành,dịch trà bat đầu có mùi lên men và có bong bóng khí CO, xuất hiện Sau 10 ngàylên men, một lớp nắm trà mới che kín bề mặt bình chứa và dày khoảng 2 em

[14][27].

1.1.2 Hệ vi sinh vật trong trà Kombucha

Kombucha được lên men nhờ sự cộng sinh của tổ hợp hệ vi sinh vật phongphú, chủ yếu giữa vi khuẩn acetic (AAB) và nắm men Hệ vi sinh vật cộng sinh này

còn gọi là SCOBY (symbiotic culture of bacteria and yeast) [27] Trà Kombucha

gôm hai phan: lớp mang cellulose ở bề mặt của bình nuôi cấy (do vi khuẩnAcetobacter xylinum tạo nên) va chat dich lỏng có vi chua [4][12]

Các loại nắm men chủ yếu được tìm thấy trong Kombucha như:

Saccharomyces cerevisiae, Dekkera bruxellensis, Saccharomycodes ludWigi,Schizosaccharomyces pombe, Zygosaccharomyces bailii, Brefanomyces,Torulospora delbrueckii, Brettanomyces spp; Pichia sp; Torulosis sp [33].

Các vi khuẩn acetic chủ yếu được tìm thấy trong trà Kombucha gồm:

Gluconacetobacter spp (chiém tỷ lệ cao nhất khoảng 85%) [4] Các chủng vi khuẩn

acetic khác như: Acetobacter xylinum, Acetobacter xylinoides, Acetobacter aceti,

Acetobacter oxydans, Gluconobacter oxydans, Bacterium gluconicum [6|[33] Nammen và vi khuẩn acetic là hai nhóm vi sinh vat chủ dao giúp lên men trà Kombucha.Ngoài ra, nhóm vi khuẩn lactic mặc dù chiếm một số lượng rất nhỏ nhưng cũng gopphan quan trọng tạo nên thức uống có nhiều giá trị ích lợi cho sức khỏe con người

[35].

Thanh phan hệ vi sinh vat trong trà Kombucha không thé xác định chính xácvì chúng rat đa dạng va thay đổi tùy vào nguồn cơ chat sử dụng dé lên men và thời

Hình 1.3 Vi khuẩn acetic (a) và nắm men (b) trong mang cellulose [33].1.1.2.1 Nam men trong tra Kombucha

Phan loai nam menNam men có hai nhóm chủ yếu: nhóm nam men có bao tử (lớp Ascomycetes)và nhóm nắm men không tạo thành bào tử (lớp Fungi imperfect) Trong côngnghiệp thường sử dụng nhóm nam lớp Ascomycetes như các giống: Saccharomyces,

Zygosaccharomyces, Toruiaspors

Giống Saccharomyces quan trong nhất là loài Saccharomyces cerevisiae, đượcdùng nhiều trong công nghiệp thực phẩm như: men nở bánh mì, công nghiệp bia,men thức ăn chăn nuôi, rượu, sản xuất glyxerol, enzym invertase Saccharomycesfragilis lên men đường lactose đóng vai trò quan trọng trong sản xuất sữa và sản

phẩm từ sữa [40].Hình thái, cầu tạo nam men

Tế bao nim men có nhiều hình dạng: hình cầu, oval, elip, hình quả chanh,

hình trụ, hình chùy, hình tam giác hoặc đôi khi kéo dài ra thành sợi Nam men có

thé thay đổi hình dáng và kích thước trong các giai đoạn phát triển và điều kiện môitrường xung quanh Kích thước tế bào nam men rất lớn (gấp từ 5-10 lần tế bào vikhuẩn) Kích thước trung bình khoảng dài (3zm-5zm) và rộng (5um-10m) [37].

Hình 1.4 Nâm men Saccharomyces cerevisiae

Nam men là sinh vật đơn bào Vách tế bào khi còn non mỏng sau đó day lêndan Vách tế bao chủ yếu là glucan, mangan, protein, lipid, kiin Màng tế bào chatgdm các hop chất phức tạp như protein (50%), lipid (20%), còn lai làpolysaccharide Màng tế bào chất có 4 chức năng cơ bản: tác dụng như rào chắnthâm thấu, điều chỉnh các chất dinh dưỡng, muối khoáng vào trong tế bào và ngượclại cho các chất trao đối chất ra ngoài tế bao; nơi khu trú của một số enzym và cơquan của tế bào; thực hiện sinh tổng hop một số hợp phan của tế bào TẾ bao chấtcó cấu trúc không đồng nhất và ở thể keo chứa ty thể, ribosome, mạng lưới nội chất,không bào, các thé vùi của hợp chat lipoit, hydratcacbon tự nhiên trong nội bào Tếbào chất có độ nhớt cao tương ứng với glyxerin, khi tế bao gia độ nhớt giảm Tế bàogià có không bào lớn hơn tế bào non TẾ bào nắm men có nhân thật, có hình tròn

hoặc elip, đường kính của nhân khoảng 2um [40].

Sinh sản nắm menNam men có 2 hình thức sinh sản: hữu tính (bằng bào tử) và vô tinh (nảy chỗi

tính hay hữu tính Sinh sản bang cách nảy chồi là hình thức sinh sản từ tế bàotrưởng thành, mọc ra một chéi nhỏ, một phần nhân chuyền sang chéi và nhân lớnlên cùng với sự lớn lên của chôi Sinh sản bằng nảy chdi là hình thức khi hai tế bàonăm sát vách nhau, hợp ghép để phối nhân phối chất thành túi bào tử, rồi tách thànhcác tế bào mới Nắm men có thời gian thế hệ rất ngăn (khoảng 30 phút), do đó, conngười đã và đang khai thác tối đa loại vi sinh vật này cho nhiều ứng dụng trong đó

có lĩnh vực tao dòng [40].

1.1.2.2 Vi khuẩn acetic trong trà KombuchaVi khuẩn acetic thuộc họ Acetobacteraceae, chia thành 2 nhóm: Acetobactervà Gluconobacter [27] Hình dang chung của vi khuẩn acetic có hình que thanghoặc hơi cong, hình elip Tế bảo đứng riêng lẻ hoặc kết thành chuỗi Kích thước tếbào khoảng (0,3-0,6) x (1-4,2) pm Khuan lạc có kích thước khoảng 3-5 mm, tròn,nhỏ, đều, bề mặt trơn bóng phan giữa lỗi và sam màu hơn vùng xung quanh Vikhuẩn acetic là loài hiếu khí bắt buộc, Gram âm, những tế bào già và môi trườngnuôi cấy làm cho Gram của chúng có thé thay đổi, có thé di động hoặc không diđộng, không sinh bào tử Đa số vi khuẩn acetic chịu được môi trường ethanol vànồng độ acid cao Cac chủng Gluconobacter chịu nong do ethanol va acid kém honchủng Acetobacter Nhiệt độ sinh trưởng từ 9-40°C, nhiệt độ tối ưu là 30 °C pHthuận lợi sinh trưởng là 5-6 Khi pH =3, nhiều chung acetic van ton tại (nhất làchủng nhóm Acetobacter) Các chủng nhóm Acetobacter đều có khả năng chuyểnhóa ethanol thành CO, và H;O, nhóm Gluconobacter thì đa sỗ không có khả năngnày Các chủng acetic có khả năng tạo màng cellulose trên bề mặt môi trường lỏng

Tùy chủng mà mang cellulose tạo ra có khác nhau, như: Acetobacter xylinum tạo

màng cellulose dày, chắc; Acetobacter orleanoe tạo màng mong, chắc; Acetobacter

suboxydans tao mang mỏng, dễ phân tách; Acetobacter pasteurianum tạo mang khô,nhăn nheo 5 chủng vi khuẩn acetic đã tìm thấy trong trà Kombucha: Acetobacter

aceti, Acetobacter xylinum, Acetobacter pasteurianus, Acetobacter intermedius vàAcetobacter nitrogenifigen [13].

Hình 1.5 Vi khuẩn Acetobacter aceti1.1.2.3 Vi khuẩn lactic trong trà Kombucha

Vi khuẩn lactic thuộc họ Lactobacillaceae Hình dạng tế bào của chúng códạng hình que hay hình cầu Kích thước thay đổi tùy loài Điều kiện môi trườngnuôi cay, thời gian nuôi cay, nồng độ oxy có liên quan đến sự khác nhau của hìnhdạng tế bào vi khuẩn lactic Tất cả các chủng vi khuẩn lactic đều có Gram dương,catalase âm tính, không sinh bào tử và hầu hết không di động Vi khuẩn lactic là vikhuẩn lên men bắt buộc, có thé lên men đồng hình hay dị hình Chúng sinh trưởngđược cả ở môi trường hiếu khí lẫn yếm khí, nhưng sinh trưởng tốt trong điều kiệnyếm khí Nhiệt độ tối ưu dé chúng phát triển từ 30°C — 40°C, pH tối ưu là 5,5 — 5.8.Tùy thuộc vào hình dạng và cách sắp xếp tế bao, người ta chia vi khuẩn lactic thành4 chi: Lactobacillus, Pediococcus, Streptococcus và Leuconostoc [13] Vi khuẩnlactic có khả năng sinh bacteriocin, góp phan ức chế sự phát triển của nhiều vi sinhvật tạp nhiễm cho sản phẩm lên men Một số chủng vi khuẩn lactic đã được tìm thaytrong trà Kombucha chủ yếu thuộc loài Lactobacillus như Lactobacillus plantarum

[20].

1.1.3 Thanh phan hóa học của trà KombuchaCác nghiên cứu phân tích về thành phần hóa học của trà Kombucha đều thấy

có sự hiện diện của các acid hữu cơ như: acetic, gluconic, glucuronic, L-lactic,

citric, malic, tartalic, oxalic, malonic, pyruvic, usnic Nhiéu loại đường như:sucrose, glucose và fructose Ngoài ra, trong thành phần hóa học của Kombucha có

(trong đó theanine chiễm 50% tong s6 amino acid) [5]; Protein, lipid, ethanol, mộtsố enzyme thủy phân, nhiều anion, hoạt chất kháng khuẩn, D-Saccharic acid 1 4-Lactone (DSL) và các chất chuyển hóa của vi khuẩn và nắm men [27].

Acid usnic Theanine

Hình 1.6 Các acid hữu cơ phô biến va amino acid trong quá trình lên men

trà Kombucha [5][18].

Bang 1.1 So sánh nồng độ khoáng anion của tra Kombucha và trà đen.

Anion Trà Kombucha (mg/g) Tra den (mg/g)

[30].1.1.4 Co so khoa hoc cua quá trình lên men tra Kombucha

Qua trình lên men tra Kombucha xảy ra các quá trình: lên men ethanol, lênmen acetic và lên men lactic.

Lên men ethanol va vai trò của nam menEnzyme invertase do nam men tiết ra thủy phân đường sucrose thành glucoseva fructose Phan lớn đường fructose sau thủy phân được nam men sử dụng chuyểnhóa theo chu trình đường phân tạo thành acid pyruvic Sau đó, acid pyruvic chuyển

hóa thành ethanol và giải phóng khí CO Quá trình lên men tao ethanol và CO,

trong điều kiện yếm khí như hình 1.7Phương trình tổng quát của quá trình lên men tao ethanol trong môi trường pH

acid như sau:

C¿H¡;Os + 2ADP + 2PI — 2C,H5OH + 2CO, + 2ATP

Ethanol va CO, trong tế bào chat sẽ được nắm men thải vào môi trường lênmen và nhiều sản phẩm phụ khác như glycerol, aldehyde, acid hữu co, este giúp

trà Kombucha có mùi thơm đặc trưng.

HexokinazaGlucose — 6 — phosphat

| Photphoglucoza isomeraza

Fructose — 6 — phosphat

PhosphoFructokinazaFructose — 1.6 — diphosphat

EnoiazaAcid phosphoenolpyruvic

Pyruvat kinazaAcid — ehol — pyruvic

Lên men acetic và vai trò của vi khuẩn aceticEthanol sau khi được nam men giải phóng ra môi trường nuôi cấy, vi khuẩnacetic sẽ oxy hóa thành acetaldehyde và sau đó chuyền thành acid acetic Song songđó, vi khuẩn acetic sử dụng đường glucose do nam men thủy phân từ đường sucroseban đầu để tạo sản phan sinh hoa thir cap acid glucunic [5] Acid acetic sinh ra lamgiảm PH môi trường, tao điều kiện thuận lợi cho nắm men sản xuất thêm nhiềuethanol Ethanol sinh ra nhiễu, thì khả năng sinh acid acetic tiếp tục tăng lên Nông

độ ethanol và acid acetic giúp trà Kombucha tránh tạp nhiễm và được chứng minh

là có kha năng kháng khuẩn khi sử dung ở liều lượng thích hợp [15].Phương trình tổng quát quá trình lên men acetic của vi khuẩn acetic:

C,H50H + O› — CH3CHO (acetaldehyde) + H,OCH3CHO + H;O — CH3CH(OH), (hydrat acetaldehyde)CH3CH(OH)>2 + O2 — CH3COOH + HạO PH

Bên cạnh việc oxy hoa ethanol thành acetaldehyde thi vi khuẩn acetic đượcchứng minh giữ vai trò chủ đạo trong quá trình tạo màng cellulose ở bề mặt môi

trường lên men trà Kombucha Quá trình tạo màng cellulose đòi hỏi có sự tham gia

của khí oxy, do đó màng cellulose chỉ hình thành chủ yếu ở bề mặt môi trường lênmen Đầu tiên, Glucose được vi khuẩn acetic chuyển hóa thành Glucose-6-Phosphate dưới tác động của enzyme glucokinase Tiếp đến, enzyme phosphoglucomutase tham gia chuyển hóa Glucose-6-Phosphat thành Glucose-1-Phosphat

và sau đó thành UDP-Glucose (uridine diphosphoglucose) bởi enzyme UDPGle

pyrophosphorylase Cuối cùng cellulose synthase chuyển hóa UDP-Glucose thànhmang cellulose Sự tạo thành mang cellulose có sự kích thích của một số thành phanhóa học trong tra như caffein, hop chat theophylline, thyobromine

GlucokinaseOxy hóa

Hình 1.8 Quá trình chuyển hóa glucose thành cellulose [32].Lên men lactic và vai trò cúa vi khuẩn lactic

Trong quá trình lên men lactic, vi khuẩn lactic sử dụng glucose chuyển hóa

thành nhiều sản phẩm: acid lactic, acid acetic, ethanol, CO» Ngoài ra, trong dịch lên

men còn xuất hiện nhiều hợp chat hóa hoc mới khác Chúng là sản phẩm trung gianhoặc sản phẩm phụ của quá trình lên men Một số hợp chất trong nhóm trên rất dễbay hơi Chúng đóng vai trò quan trọng trong việc góp phân hình thành nên mùi vị

đặc trưng cho trà Kombucha.

Phương trình tổng quát:

C¿H¡zOs—> CHạCHOHCOOH+C H:COOH+C2HzOH+COOH(CH¿)2COOH+CO;

Lượng sản phẩm phụ tạo thành hoàn toàn phụ thuộc vào giống vi sinh vật, vào

môi trường dinh dưỡng và điều kiện ngoại cảnh.1.1.5 Các hoạt tính sinh học quý và công dụng cúa trà Kombucha

Trà lên men Kombucha được chứng minh có nhiều hoạt tính sinh học quý,mang lại nhiều ích lợi cho sức khỏe con người như hoạt tính kháng khuẩn, hoạt tínhnhư probiotic, hoạt tính kháng oxy hóa, hoạt tính chồng ung thư, hoạt tính giải độc

của acid glucuronic cùng nhiêu ích lợi khác.

1.1.5.1 Hoạt tính kháng khuẩn

Nghiên cứu của Steinkraus và cộng sự năm 1996, chứng minh trà Kombucha

có hoạt tính kháng khuẩn mạnh nhờ ethanol và acid acetic sinh ra trong môi trườngdịch trà lên men [15] Nhiều nghiên cứu khoa học về hoạt tính này đã chứng minhtrà Kombucha ức chế nhiều vi sinh vật gây bệnh Gram âm và Gram dương như

Helicobacter pylori (vi sinh vật gây loét dạ dày), Escherichia coli (vi sinh vật gâytiêu chảy), Entamoeba cloacae, Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus,Staphylococcus epidermis, Agrobacterium tumefaciens, Bacillus cereus, Salmonellatyphimurium, Salmonella enteritidis, Leuconostoc monocytogenes, Yersiniaenterocolitica, Candida albicans |4|[10].

Ngoài ethanol va acetic do tổ hợp vi sinh vật trong quá trình lên men tràKombucha tạo ra, các hợp chất acid usnic, tanin, polyphenol cũng có tác dụngkháng khuẩn Một số nghiên cứu cũng chứng minh dịch trà Kombucha có khả năngkháng nắm Nghiên cứu cũng cho thấy khả năng kháng khuẩn của trà Kombucha lên

men từ nguyên liệu trà xanh có hoạt tính cao hơn lên men từ nguyên liệu trà đen[18].

Bang 1.2 Một số thành phan của trà Kombucha lên men từ trà xanh va tra đen liên

(ngay 15) (ngày 15)Acid 157+0.14 1540.17

Không xác địnhglucuronic (ngay 15) (ngay 15)

Chat duoc FDAyêu cau bố sung

0.15 +0.012 0.33+ 0.07 ,Acid lactic truc tiép vao thuc

(ngay 15) (ngày 15)

phâm cho người vađược công nhận an

Thành phần Dinh lượng trong Dinh lượng trong ,

Mức tôi dahóa học trà xanh Kombucha | trà đen Kombucha

toàn (GRAS)3000mg / kg /Acid citric Khong xac dinh Không xác định -

ngay0.14 mg / kg /ngay (Co so khoahoc chua xac dinhAcid oxalic 0.03 (ngay 3) 0.11 (ngày 3) do đó chưa xác

nhận vẻ liều lượng

an toàn cho axItoxalic)

0-25mg / kg /Acetaldehyde Không xác định Không xác định Ộ

ngay

[18].1.1.5.2 Hoat tinh nhw probiotic

Probiotic được biết là những sản phẩm chứa vi sinh vat sống có lợi cho vikhuẩn đường ruột con người Những vi sinh vật sống này giúp cân băng hệ vi sinhvật đường ruột, ôn định các quá trình trong ruột, tang cường hệ thống miễn dịch,ngăn cản vi khuẩn có hại phát triển quá mức gây hại đến hệ tiêu hóa và ảnh hưởng

xấu đến cuộc sống, tâm ly con người [18] Nhiều nghiên cứu đã chứng minh hệ vi

khuẩn và nam men có trong trà Kombucha có tác dụng như probiotic giúp tăng hiệuquả cũng như tăng sự phát triển của vi khuẩn có lợi trong ruột người [21] Ngoài ra,acid butyric (được sản xuất bởi hệ vi khuẩn cộng sinh trong quá trình lên menKombucha) khi kết hợp với acid glucuronic tạo thành một phức hợp có kha nănggiúp thành ruột khỏe mạnh, chống tác hại của nhiều ký sinh trùng [5]

Các nhà khoa học đang xem xét hoạt tính này của loại nước giải khát

Kombucha nhằm sử dụng cho các phi hành gia như là một sự bố sung cho chế độ ănuống của họ ngoài không gian [21]

1.1.5.3 Hoạt tính kháng oxy hóa

Các nghiên cứu đã chứng minh được tính kháng oxy hóa về nhiều bệnh ởngười như ung thư, tiểu đường [30] Hoạt tính kháng oxy hóa của trà Kombucha làdo sự hiện diện của hợp chất polyphenol, acid ascorbic và DSL Cơ chế chính củahoạt tính này là loại bỏ các gốc tự do trung gian được tạo ra trong các phản ứng oxyhóa xảy ra trên khắp cơ thể con người Các gốc tự do gây tốn hại tế bào hoặc gâychết tế bào [18] Trạng thái thiếu oxy gây ra bởi các gốc tự do là nguyên nhân củanhiều bệnh thường gặp ở người như bệnh Parkinson, bệnh mạch vành và ung thư

[30].

Hợp chat polyphenol trong trà nguyên liệu được coi là có nhiều chất khángoxy hóa cao, vì chúng có khả năng loại bỏ gốc tự do và phản ứng loại oxy (ROS).Ba loại polyphenol nỗi bật trong trà gồm: epigallocatechin-3-gallate, epicatechin-3-

1.1.5.4 Hoạt tính chống ung thưTác nhân chống ung thư là do các polyphenol và chất chuyển hóa thứ cấp sảnsinh trong quá trình lên men Bốn cơ chế chống lại ung thư của các chất có trong tràKombucha là: giảm sự đột biến gen, ức chế tăng sinh các tế bảo ung thư, cảm ứngquá trình tự chết tế bào ung thư (cảm ứng chu trình apoptosis), ngăn chặn khả năng

di căn [27].

Bệnh nhân ung thư thường thiếu acid L-lactic trong mô liên kết Điều này cóthé được cải thiện khi sử dụng Kombucha, khi acid lactic được sinh ra trong quátrình lên men như một sản phẩm phụ Các chat polyphenol, acid gluconic, acid

glucuronic, acid lactic và vitamin C được chứng minh làm giảm ung thư da dày.Bên cạnh đó, acid D-saccharic-14-lactone (DSL) trong Kombucha có tác dụng ức

chế hoạt động của enzyme glucorunidase_ một enzyme gián tiếp liên quan đến ung

thư Glucorunidase thủy phân glucuronit và tạo ra các aglycones gây ung thu [17].

Cơ quan nghiên cứu ung thư Trung ương, viện hàn lâm khoa học ở Nga đã

tuyên bố rằng Kombucha có chất kháng ung thư [5]

1.1.5.5 Hoạt tính giai độc cua acid glucuronic

Bệnh gout, thấp khớp, viêm khớp hay sỏi thận có thể hình thành do sự tích tụchất độc trong cơ thé [5] Trà lên men Kombucha được chứng minh có khả nănggiải độc nhờ san sinh hàm lượng acid glucuronic cao Cac chất độc kim loại nặnghoặc các chất gây ô nhiễm môi trường được bài tiết nhờ quá trình glucuronidation.Acid glucuronic (GIcUA) được tong hop boi tổ hợp hệ vi sinh vật cộng sinh của tràKombucha Năng suất GIcUA khác nhau tùy thuộc điều kiện lên men, thời gian lênmen, giống vi sinh vật, lượng đường và lượng trà sử dung [12] Acid glucuronic làmột trong những hợp chất quan trọng làm nên giá trị dinh dưỡng của trà Kombucha.GIcUA là một phân tử phân cực, bình thường được tạo ra bởi tế bào gan khỏe mạnh,giúp co thé giải độc GleUA là một chất quan trọng trong việc liên kết và đào thảicác chất độc nhờ vào sự chuyển hóa sinh học của các sản phẩm trao đối chất nội

sinh như bilirubin, các hormone steroid dư thừa và các acid béo bi oxy hóa Sự liên

kết của GICUA với các chất không mong muốn trên giúp làm giảm độc tố và làmtăng tính tan của độc tố và loại bỏ chúng ra khỏi cơ thé nhờ thận và ruột [26] Ngoàihoạt tính giải độc, GlcUA có thé được chuyển hóa thành glucosamine và

chondroitin-sulfate (những chất này liên quan đến collagen) và hoạt động như chất

bôi tron cho các khớp xương [22] Mat dù acid glucuronic (Cs¿H¡oO>;) không phải là

dạng hoạt tính khi tham gia trực tiếp đến quá trình giải độc khi so với glucuronic acid, nhưng việc hấp thu GIcUA từ việc uống trà Kombucha giúp cácđộc tố được thải ra dưới dạng glucuronide đã được kiểm chứng và tìm thấy trongnước tiêu [5] Tuy chưa có giải thích day đủ về cơ chế hoạt động, nhưng GleUA vẫnlà hợp chất có giá trị cao Quá trình tong hợp GIcUA như hình 1.11

tác enzym slucosepyrophosphorylas Sau đó, enzym

glucosedehydrogenase chuyển hóa glucose thành glucuronate glucuronate tổng hop các hợp chất glucuronide, proteoglycan vàglycosaminoglycans Trong quá trình này, các hợp chất hóa học như endobiotic,sterol, xenobiotic tạo liên kết với UDP-GIcUA nhờ các liên kết ester va amide Độctố được hap thu từ máu thông qua các tế bào biểu mô vào gan rồi được chuyển hóa,sau đó chúng đồ vào mật hoặc thận rồi được bài tiết ra ngoài cơ thể Quá trình nàydiễn ra chủ yếu ở gan Ở các cơ quan khác như mô tim, tuyến thượng thận, lá lách,da, ruột, tinh hoàn quá trình này diễn ra rất thấp Hiện nay, có rất nhiều nghiên cứuở nhiều nước trên thé giới và Việt Nam nhằm cải thiện hàm lượng acid glucuronic.1.1.6 Những han chế của trà Kombucha truyền thong

UDP-Tạp nhiễm là van dé đầu tiên cần quan tâm trong quá trình lên men trà

Kombucha, đặc biệt là lên men tại nhà Tạp nhiễm dễ xảy ra khi không đảm bảo quy

trình tiệt trùng Dụng cụ chuẩn bị lên men không đảm bảo tiệt trùng, hay con giỗng

(màng cellulose) bị nhiễm trước khi lên men, hoặc con giống được truyền từ nhà

này sang nhà khác mà không có sự bảo quản phù hợp, đó là những nguy cơ tạp

nhiễm trà thành phẩm [24] Mang cellulose có màu vàng nhạt là bình thường Canloại bỏ ngay những con nam giống khi có những biểu hiện khác thường về màu sắcđể đảm bảo an toàn khi sử dụng

Hình 1.12 Nắm trà giống bị hỏng (nhiễm mốc)Một số vi sinh vật có hại cho sức khỏe con người, cũng như gây hỏng sảnphẩm cũng được phát hiện trong trà Kombucha truyền thống như: Candida

albicans, Penicillium spp, Torula, Torulopsis, Mycoderma, Mycotorula, Kloeckera,

Kluyveromyces [2] Một SỐ chúng gây cho trà có mùi vị khó chịu Tiêu thụ trà

Kombucha bị tạp nhiễm có những triệu chứng như nôn ói, nhức đầu, chóng mặt

[18].

Một van dé khác can quan tâm, mặc dù ít xảy ra nhưng cũng đã có bang chứngcho thấy ngộ độc chì khi sử dụng trà Kombucha được lên men trong bình gốm Hauhết các đồ gdm có hàm lượng chi rất thấp sẽ không có bat kì nguy hiểm khi pha trà.Tuy nhiên, néu Kombucha được ngâm trong một thời gian dài, lượng chì cao có thé

hòa tan trong trà lên men [18].

1.2 Các phương pháp phân tích hệ vi sinh vật lên men tra Kombucha

1.2.1 Phương pháp vi sinh truyền thongTiến hành lay mẫu đại diện và nuôi cấy trên thạch đĩa Petri với các môi trườngđặc hiệu nham thu được khuẩn lạc thuần Dem khuẩn lạc thuần, kiểm tra Gram,quan sát hình dạng đại thể, vi thể Sau đó, kiểm tra một số tính chất sinh hóa nhưcatalase, oxydase, dé định danh sơ bộ vi sinh vật [36]

1.2.2 Phan tích bang kỹ thuật điện di trên gel gradient biến tính (DGGE)

1.2.2.1 Cơ sớ khoa học của kỹ thuật DGGE

Phương pháp điện di trên gel gradient biến tinh (DGGE_Denaturing Gradient

Gel Electrophoresis) là kỹ thuật có kha năng phan biệt các phan đoạn DNA cùng độ

dài nhưng khác nhau về thành phần nucleotide Trên gel DGGE, các phân đoạn

DNA sợi kép bị nóng chảy không hoàn toàn ở những vi trí khác nhau do gradient

các chất biến tính, kết qua là chúng di chuyền tới những vi trí khác nhau trên gel.Các phân đoạn DNA nóng chảy ở những vùng nóng chảy nhất định, nghĩa là cáccặp base ở đây duỗi xoắn ở nhiệt độ nóng chảy tương ứng Khi một vùng có nhiệtđộ nóng chảy thấp nhất tiễn đến nhiệt độ nóng chảy của nó ở vi trí đặc biệt trên gelgradient biến tính thì một sự biến đổi của chuỗi xoăn sẽ xuất hiện và sự di chuyểncủa các phân tử gần như dừng lại Sự khác nhau của các trình tự nucleotide trong

những vùng như vậy sẽ gây ra nhiệt độ nóng chảy và các trình tự khác nhau sẽ

phải ngừng di chuyên ở các vị trí khác nhau trên gel [29]

Khi sử dụng kỹ thuật DGGE, khoảng 50% sự khác nhau của các trình tự

nucleotide có thể được phát hiện trong những phân đoạn DNA có kích thước phântử > 500 bp Tỷ lệ này có thể tăng lên tới gần 100% nếu gắn thêm trình tự giàu GC(còn được gọi là kẹp GC) vào một đầu của phân đoạn DNA [29] Một trình tự giàuguanine va cytosine được bố sung vào đầu 5 của môi PCR, sau khi tiễn hành PCR,kẹp GC đó sẽ được đưa vao sản phẩm PCR Trình tự giàu GC này làm nhiệm vụnhư là vùng nóng chảy cao để ngăn cản sự phân tách hoàn toàn của 2 sợi DNA

thành những sợi đơn Độ dài của kẹp GC trong khoảng 30-50 bp [9] Những vạch

DGGE có thể được quan sát dưới ánh sáng UV bằng mắt thường sau khi đã nhuộm

với EtBr (ethidium bromide) [29].

Mau can phan tich

rN

Phanlap <¢-[ -.

Ù

NỈNuôi cay _ 1

1.2.2.2 Những ưu điểm và nhược điểm của kỹ thuật DGGEBảng 1.3 Ưu, nhược điểm của kỹ thuật điện DGGE

- Phân tích nhanh chóng sự đa dạng của

quan xã vi sinh vật về thành phan, cautrúc, hoạt tính, trạng thái ôn định, chứcnăng của từng cá thể mà phương pháptruyền thống chưa thực hiện được [9]

- Có thê phan tích nhiêu mâu trên cùng1 ban gel [9].

- Lượng mẫu phân tích nhỏ nhưng

thông tin thu được lớn.

- Sau khi đọc trình tự các band đã cắt từgel, có thé nhận biết đến loài [40]

- Chỉ cho kết quả phân tách các đoạnDNA trên gel tốt khi những đoạn DNAcó kích thước khoảng 500 bp, hạn chếsố lượng thông tin về nucleotid [29].- Chỉ phân tách tốt những đoạn gen 16srRNA của những cá thể chiếm ưu thế

trong quan xã vi sinh vật.

- Thiết kế primer và các điều kiện tốiưu cho phản ứng PCR để sử dụng cho

DGGE khá khó khăn.- Không có chung vi sinh vật, phải sử

TGGE (Temperature Gradient Gel Electrophoresis): tương tự như kỹ thuật

DGGE, tuy nhiên các đơn vị khuếch đại sẽ di chuyển qua gradient nhiệt độ, cònDGGE thì di chuyển qua gradient biến tính TGGE va DGGE đều thường được sửdụng để phân tích nhanh cộng đồng hệ vi sinh vật trong nhiều mẫu thực phẩm, bệnhphẩm Đây là những phương pháp có giá thành tương đối cao [11]

T-RFLP (Terminal Restriction Fragment — Length polymorphism): Các đoạn

gen mục tiêu được khuếch đại băng các đoạn mỗi được đánh dẫu huỳnh quang Sauđó, các đoạn gen bị cắt bởi các enzyme cắt giới hạn, điện di và phân tích trên gel

nhuộm Đề so sánh sự khác biệt của các đoạn gen bị cắt, người ta sử dụng cơ sở dữ

liệu hoặc thư viện dong [28].1.3 Các nghiên cứu ngoài và trong nước1.3.1 Ngoài nước

Trên thế giới, đã có rất nhiều bài báo và nghiên cứu về Kombucha Nhưng chủyếu tập trung nghiên cứu về công dụng của trà Kombucha đến sức khỏe con người,như Bacinskaja (1914) và các cộng sự cho rang Kombucha tốt cho hệ tiêu hóa, làmkhỏe đường ruột, chống táo bón Steinknaus K.H và cộng sự (1996) đã nghiên cứuvề hoạt động kháng sinh của trà nắm Kombucha [15] Nghiên cứu cua C Dufresne,E Farnworth năm 1999 chỉ ra rang Kombucha cải thiện sức dé kháng, chỗng bệnh

ung thư, ngăn ngừa bệnh tim mạch, tăng cường hệ miễn dịch, giảm viêm [5]

Nghiên cứu cua Velincanski (2007) và cộng sự đã cho biết hoạt động kháng khuẩnvà chong oxy hóa của Kombucha [3] Nghiên cứu của Ola Ali Gharib năm 2009,kết luận acid ølucuronic trong Kombucha có tác dụng bảo vệ thận đối với chất độc

Trichloroethylene (TCE) [23] Nghiên cứu của Kursad Yapar và cộng sự (2010) cho

thay trà Kombucha làm giảm độc tố phenol ở chuột [16] Nghiên cứu của R.Jayabalan và cộng sự (2010) cũng chứng tỏ tác dụng chống nhiễm độc gan chuộtbởi độc tố Aflatoxin BI [25] Nghiên cứu của Debashish Banerjee va cộng sự(2010) được tiến hành trên chuột cũng chứng minh được thành phan trong

Kombucha có tác dụng tăng cường miễn dịch, giảm stress Nghiên cứu chứng minh

Kombucha làm giảm loét dạ dày do ức chế acid dạ dày tiết ra quá nhiều khi bị stress[7] Năm 2012, N O Kozyrovska và cộng sự nghiên cứu đánh giá lợi khuẩn trongtrà Kombucha giúp hệ tiêu hóa khỏe mạnh, tương tự như sản phẩm probiotic [21]

Nghiên cứu của Monia Deghrigue và cộng sự (2013) khảo sát được hoạt tính kháng

khuẩn của Kombucha đối với nhiều vi sinh vật gây bệnh như Escherichi coli,

Zoran Kovacevic và cộng sự (2014) chứng minh Kombucha tốt cho gan khi dùng

đúng liều, ngược lại sẽ hại gan Nghiên cứu của Mohammad Saber Jalalivà cộng sự

(2016) đánh giá ảnh hưởng của Kombucha lên hệ thông miễn dịch, sự thay đối cácyếu tổ trong mau của chim cut ở Nhật [19]

Các nghiên cứu về hướng định danh các chủng vi sinh vật và ứng dung các

chủng phân lập được, như: Năm 2001, Kurtzman CP và cộng sự phân lập từ trà

Kombucha được chủng nam men mới (đặt tên là Zygosaccharomyces kobuchaensis)[6] Năm 2006, Dutta D và cộng sự thành công với nghiên cứu về khả năng cố định

đạm của chung Acetobacter nitrogen nifigens sp.nov được phan lập từ tràKombucha [10] Yong Wang va cộng sự (2013) nghiên cứu chủng

Gluconacetobacter sp A4 có khả năng sinh tông hop D-Saccharic acid Lactose, giúp giải độc tố cho gan chuột, như độc tố acetaminophen, carcinogen[34] Nghiên cứu cua Alan J Marsh và cộng sự (2014) tién hanh phan tich trinh tycủa vi sinh vật trong tra Kombucha ở 5 vùng khác nhau, ở 2 thời điểm lên men khácnhau Kết quả cho thấy có sự hiện diện của vi khuẩn Gluconacetobacter,Acetobacter, Lactobacillus, nắm men Zygosaccharomyces Tuy nhién, phan tichvan chưa day đủ vẻ vi sinh vật trong tra Kombucha [1] Nghiên cứu cải thiện cáchoạt tính sinh học của trà Kombucha của Aleksandra và cộng sự (2014) băng VIỆCthay thế nguồn cơ chất trà tự nhiên bang lá tia tô đất Kết qua của nghiên cứu saulên men 7 ngày cho thấy hoạt tính kháng oxy hóa khi dùng lá tía tô làm cơ chất cao

1,4-hơn dùng trà tự nhiên với giá tri [C59 (DPPH) là 91,2 „L/mL so với 30,2 ¿Lm

nhờ lượng acid rosmarinic (hợp chất phenolic trong lá tía tô đất) Hoạt tính khángkhuẩn cũng tang sau khi khảo sát trên 11 loại vi sinh vật gây bệnh [34]

1.3.2 Trong nước

Ở Việt Nam, những nghiên cứu về Kombucha còn khá mới mẻ, các công trìnhnghiên cứu còn rất ít, hiện tại chưa có nhiều công trình nghiên cứu về hệ vi sinh vậtcó trong dịch lên men trà Kombucha Các nghiên cứu gần đây, hầu hết tập trung vềcông dụng và hoạt tính của Kombucha, như: Nghiên cứu của Lê Nguyễn Thị HồngNgọc (2012) và các cộng sự về “Hệ vi sinh vật của trà Kombucha và hiệu quả tác