TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA TRẦN ANH VỸ BÁN TỔNG HỢP MỘT SỐ DẪN XUẤT CỦA ALPHA MANGOSTIN TỪ QUẢ MĂNG CỤT Chuyên ngành: Công nghệ hóa học Mã số: 60 52 75 LUẬN VĂN THẠC SĨ TP... Sau khi
TỔNG QUAN
GIỚI THIỆU VỀ MĂNG CỤT VÀ ALPHA MANGOSTIN
Măng Cụt (Garcinia mangostana L ), là một loài cây thuộc họ Bứa (Clusiaceae) Nó cũng là loại cây nhiệt đới cho quả ăn được, rất quen thuộc tại Đông Nam Á Cây cao từ 7 mét đến 25 mét, đường kính 0,6 đến 0,8 met Thân có vỏ màu nâu đen sậm, dáng cây thẳng đứng, vững chắc, tán hình chóp tròn, cây tăng trưởng chậm Rễ phát triển chậm, yếu, rễ cây không có hệ thống lông hút nên khả năng hút nước hạn chế
Lá hình bầu dục hoặc hình thuẫn, có gân giữa nổi rõ Hoa đa tính, thường là hoa cái và lưỡng tính Hoa mọc đơn hay từng đôi Hoa lưỡng tính có màu trắng hay hồng nhạt có bốn lá đài và bốn cánh hoa Hoa đực có mọc thành cụm tự 3 đến 9 hoa, có lá đài dày, có bốn thùy
Măng Cụt nổi bật với lớp vỏ dày, xanh lục khi còn non, chuyển sang tím đậm khi chín Bên trong ẩn chứa múi trắng ngà chua ngọt, tỏa hương thơm hấp dẫn, xứng đáng với danh xưng "nữ hoàng trái cây nhiệt đới" Không chỉ chứa lượng dinh dưỡng dồi dào, Măng Cụt còn là một kho thuốc quý với khả năng chữa bệnh độc đáo Gần đây, các nghiên cứu đã tập trung vào tiềm năng chống ung thư đáng kinh ngạc của loại trái cây này, mang đến hy vọng mới trong lĩnh vực y học.
Mảnh vỏ quả màu đỏ nâu, hơi cong queo, kích thước từ 3-5 cm Vỏ quả ngoài có màu nâu sậm, khá nhẵn, vỏ quả giữa có màu đỏ nâu, vết bẻ ở phần này cho thấy có những ống tiết chứa chất nhựa màu vàng hay vàng cam Vỏ quả trong màu nâu nhạt nhẵn, nhìn thấy rõ những mạch dẫn nhựa nhỏ và những vết hằn của múi, đôi khi còn sót lại những lá đài đồng trưởng có hình gần như tròn, đính trên cuống
Bột vỏ Măng Cụt màu nâu, không mùi, vị hơi chát Soi kính hiển vi: tế bào mô cứng có kích thước thay đổi, hình dạng biến thiên, thành rất dày, lỗ trao đổi rõ
Mảnh mô mềm gồm những tế bào có màng mỏng, mang chất màu (đỏ, nâu) Khối nhựa có màu (cam, đỏ cam, nâu ) Hạt tinh bột hình tròn, hình trứng kích thước 5- 10 m có khi đến 15 m, nằm riêng rẻ hay chụm lại thành đám Mảnh mạch xoắn kích thước rất nhỏ
Thành phần chính vỏ măng cụt đã được xác định là một loạt xanthon mà những chất chính là alpha-mangosteen, beta-mangosteen, gama-mangosteen, các isomangosteen, normangosteen, bên cạnh trioxyxanthon, pyranoxanthon, dihydroxy methyl butenyl xanthon, trihydroxy methyl butenyl xanthon, pyrano xanthenon Các garcinon A, B, C, D, E, mangostinon, garcimangoson A, B, C, gartanin, egonol, epicatechin, procyanidin, benzophenon glucosid cũng được tìm ra từ măng cụt nguồn gốc Việt Nam.[3, 5, 6]
Trong luận văn, chỉ khảo sát, phân lập, chiết xuất hoạt chất chính là alpha Mangostin từ vỏ quả Măng Cụt và thực hiện các phản ứng tổng hợp dựa trên hoạt chất cơ bản này
Phân bố và phát triển[1, 2]
Măng Cụt có nguồn gốc từ Malaysia và Indonesia được trồng từ hàng chục thế kỉ trước Ngày nay phân bố ở khắp Ấn Độ, Đông Nam Á cũng như Sri Lanka
…Chi Garcinia là chi lớn nhất của họ bứa với hơn 300 loài, ở Việt Nam Chi này có 29 loài và Măng Cụt là một trong số đó
Tại Việt Nam, Măng Cụt được các nhà truyền giáo du nhập vào miền nam, Vua Minh Mạng đã cho trồng ở các lăng tẩm, chùa chiền ở Huế Ngày nay, Măng Cụt được trồng nhiều ở đồng bằng sông Cửu Long và miền Đông Nam Bộ Trong đó, đồng bằng sông Cửu Long có diện tích khoảng 4,9 nghìn hecta, Đông Nam Bộ có khoảng 5,4 nghìn hecta Tập trung ở các tỉnh như Bến Tre, Cần Thơ, Hậu Giang, Bình Dương, Sóc Trăng, Đồng Nai… Trong đó Bến Tre là tỉnh có diện tích dẫn đầu
Cây Măng Cụt sinh trưởng và phát triển ở vùng khí hậu nóng ẩm, với khoảng nhiệt độ thích hợp từ 25-30 O C Ở nhiệt độ thấp hơn 20 O C cây phát triển chậm, từ 38 O C trở lên hoặc dưới 5 O C có thể làm chết cây Lượng mưa phân bố đều trong năm và không mưa ở giai đoạn cây ra quả là tốt nhất
Măng Cụt thích hợp với đất sét pha hay đất phù sa, thoát nước và giữ ẩm tốt, không thích hợp với loại đất cát Cây bắt đầu cho trái sau 10-15 năm trồng Măng cụt bắt đầu trổ hoa và tháng 1-2 dương lịch và cho thu hoạch vào tháng 5-7 dương lịch hàng năm
Hình 1.1: cây, hoa và quả Măng Cụt
Hình 1.2: công thức cấu tạo alpha, beta, gama Mangostin
Alpha Mangostin được tìm thấy trong vỏ quả, áo hạt, rễ, thân Dạng tinh thể hình kim, màu vàng sáng
1,3,6-Trihydroxy-7-methoxy-2,8-bis(3-methyl-2-butenyl)-9H-xanthen-9-one 1,3,6-Trihydroxy-7-methoxy-2,8-di(3-methyl-2-butenyl) xanthone
1,3,6-Trihydroxy-7-methoxy-2,8-bis(3,3-dimethylallyl)xanthone
Công thức phân tử : C24H26O6, Khối lượng phân tử : 410 g/mol, Nhiệt độ nóng chảy : 180-182°C
HOẠT TÍNH SINH HỌC CỦA ALPHA MANGOSTIN VÀ CÁC HOẠT CHẤT CHIẾT XUẤT TỪ VỎ QUẢ MĂNG CỤT
Vỏ quả măng cụt đã được sử dụng trong y học dân gian để điều trị tiêu chảy, chấn thương, các loại nhiễm trùng Vỏ quả được sắc dùng uống trị tiêu chảy và kiết lị, nước sắc cũng được dùng để rửa vệ sinh phụ nữ Ngoài ra vỏ quả được nấu để súc miệng, trị lở trong miệng [3, 7]
Một số bài thuốc dân gian từ vỏ quả Măng Cụt[1, 8]
Trị độc, chữa rối loạn tiêu hóa
Khi gặp các vấn đề về tiêu hóa như nôn mửa, rối loạn tiêu hóa do ăn đồ ôi thiu hoặc ngộ độc, người bệnh có thể sử dụng một phương pháp dân gian hiệu quả bằng cách dùng vỏ quả phơi khô, thái nhỏ, tẩm rượu, sao thơm rồi tán thành bột mịn Lúc này, chỉ cần hòa tan một muỗng bột với nước đun sôi, thêm chút muối trắng rồi uống ngay khi còn nóng sẽ giúp cải thiện đáng kể các chứng bệnh kể trên.
Trị tiêu chảy, kiết lị
Ngâm vỏ quả Măng Cụt khô khoảng 60 gam vào 1200 ml nước, thêm 5 gam hạt thìa, 5 gam hạt mùi rồi đun sôi, sắc kĩ đến khi còn một nữa Uống mỗi ngày 2 lần, mỗi lần 100 ml
Trị lị mãn tính, lị ra máu
Vỏ quả Măng Cụt, nhân hạt đều, rau má mỗi vị 20 gam dược liệu khô, thêm 3 gam hạt câu già Tất cả thái nhỏ, sắc đặc thêm mật ong và ngày uống một lần
Vỏ quả Măng Cụt chứa xanthone có tính chống oxy hóa, chống vi khuẩn, chống lao và hơn thế nữa là gây chết của các tế bào khối u Những xanthone đặc biệt gồm alpha Mangostin, beta Mangostin và gama Mangostin Alpha và beta Mangosteen có tác động trong phòng thí nghiệm chống dòng tế bào ung thư bạch cầu ở người và vi trùng lao Mycobacterium tuberculosis Alpha và gamma- mangostin cũng có tính chẹn thụ thể serotonin và histamine Alpha Mangostin chống ký sinh trùng sốt rét, hoạt tính gây độc tế bào Ngoài ra hợp chất này còn có khả năng làm giảm đau, kháng nấm, kháng dị ứng, kháng ung thư, chống vi khuẩn, vi rút [5, 9-25]
1.2.3 Một số nghiên cứu dược học
- Tác dụng đè nén hệ thần kinh trung ương:
Mangostin tạo ra những phản ứng ức chế thần kinh trung ương gây các triệu chứng như sụp mi mắt(ptosis), dịu đau, giảm hoạt động của thần kinh vận động, tăng cường hoạt tính gây ngủ và gây mê của pentobarbital
- Tác dụng trên hệ tim mạch:
Mangostin-3,6-di-O-glucoside tạo ra các hiệu ứng rõ rệt trên hệ tim mạch của ếch và chó: gây kích thích cơ tim, tăng huyết áp nơi thú vật thử nghiệm Cả hai tác dụng này đều bị ức chế một phần bởi propranolol
- Tác dụng chống ung loét bao tử:
Mangostin có hoạt tính chống ung loét khi thử trên chuột - Hoạt tính kháng sinh
Có nhiều nghiên cứu ghi nhận khả năng kháng sinh của măng cụt Các vi khuẩn thử nghiệm thuộc nhóm gây kiết lỵ như Shigella dysenteria, Sh Flexneri, Sh
Sonnei và Sh Boydii hoặc thuộc nhóm gây tiêu chảy như E coli, Streptococcus faecalis, Vibrio cholerae
1.2.4 Tác dụng chống sưng viêm, giảm đau
Alpha Mangostin có những hoạt tính chống sưng khi dùng chích qua màng phúc mô hay khi cho uống nơi chuột bị gây phù chân bằng carrageenan
Alpha Mangostin làm giảm sự sản sinh LPS của các tế bào cytokine gây viêm TNF-α, làm giảm biểu hiện gen trong sự truyền tín hiệu, làm giảm tiến trình phosphor hóa của kinase MAPK 3/MAPK 6 Alpha Mangostin làm yếu đi hoạt tính LPS của MAPK, STAT1, c-Fos,c-Jun và ElK-1, ức chế sự sản sinh TNF-α và IL-4 trong các tế bào U937.[16]
Alpha Mangostin và Gama Mangostin có tác dụng giảm đau lên thần kinh ngoại biên và thần kinh trung ương, và có thể sử dụng để sản xuất thuốc giảm đau và thuốc kháng viêm mới.[15]
1.2.5 Tác dụng chống dị ứng, chống nấm, vi khuẩn
Alpha Mangostin và gama Mangostin có thể điều chỉnh việc tạo ra IL-6, PGD2 và LTC4 cũng như các histamine thích hợp để chống lại các dị ứng.[19]
Các dẫn xuất của Alpha Mangostin có khả năng hoạt động ức chế chống lại ba loại nấm phytopathogenic là Fusarium oxysporumvasinfectum, Alternaria tenuis, và Dreschlera oryzae.[18]
Alpha Mangostin có khả năng tiêu diệt nấm Candida albicans, tác nhân gây bệnh nấm miệng phổ biến Hiệu quả tiêu diệt C albicans của Alpha Mangostin cao hơn cả Clotrimazole và Nystatin, hai loại thuốc trị nấm thông thường Nghiên cứu này mở ra triển vọng phát triển một loại thuốc trị nấm mới có hiệu quả cao hơn.
Alpha Mangostin có khả năng kháng khuẩn cao đối với chủng B subtilis, vi khuẩn sâu răng Streptococcus mutans.[11]
Các thử nghiệm trên in vitro đã chứng minh alpha Mangostin và các dẫn xuất có khả năng chống lại vi khuẩn Gram -[12]
Alpha Mangostin và các dẫn xuất Mangostin 3-sulfate, Mangostanin 6- sulfate, 17,18-dihydroxymangostanin 6-sulfate và isoMangostanin 3-sulfate có khả năng chống lại các loại vi khuẩn lao (Mycobacterium tuberculosis).[9]
1.2.6 Tác dụng kháng oxi hóa[13, 14]
Alpha Mangostin và các hoạt chất chiết xuất từ vỏ quả Măng Cụt (Xanthone) là chất chống oxy hóa cao cấp và được ví như dưỡng chất thực vật đa năng trong lĩnh vực dinh dưỡng Chúng đã được chứng minh chống các phần tử gây lão hóa gấp bội lần Vitamin C, cải thiện lão hóa đối với hệ thần kinh trung ương của bộ não
Qua đó nhằm tránh các bệnh như rối loạn thần kinh, đãng trí, tay chân run lẩy bẩy
1.2.7 Tác dụng chống ung thư
Nhiều nghiên cứu cho thấy các hợp chất xanthone trong vỏ măng cụt có khả năng chống ung thư gan, máu, các dòng tế bào ung thư liên quan đến dạ dày và phổi [20, 21, 24-29]
Bộ môn ung thư đại học y khoa Ryukyus, Okinawa Nhật-bản cho thấy alpha Mangostin có tác dụng phòng ngừa tiền ung thư ở ruột già [30]
Bộ môn vi sinh đại học Mahidol Bangkok Thái-lan thử tính chống tăng sinh của 9 dược liệu ở dòng tế bào ung thư tuyến vú bằng dịch chiết ethanol cho thấy các hoạt chất từ vỏ Măng Cụt có tiềm năng chống ung thư mạnh nhất [31]
Nghiên cứu từ Bộ môn Sinh học phân tử, Đại học Tohoku, Nhật Bản chỉ ra rằng alpha-Mangostin có tác dụng kích hoạt con đường chết tế bào theo ty lạp thể (mitochondrial apoptotic pathway) và ức chế Ca2+-ATPase đáng kể Alpha-Mangostin được đánh giá là một hợp chất có tiềm năng trong điều trị u tế bào ưa crôm (pheochromocytoma).
Bộ môn vi sinh đại học Mahidol Bangkok Thái Lan cũng chứng minh dịch chiết thô Methanol vỏ măng cụt tác dụng trên dòng tế bào ung thư vú [33]
Viện kỹ thuật sinh học quốc tế Gifu Nhật bản xem tác dụng của 6 xanthone từ vỏ măng cụt lên sự tăng trưởng tế bào của dòng tế bào ung thư bạch cầu HL60 ở người Tất cả xanthone đều có tác dụng ức chế Alpha Mangosteen ức chế hoàn toàn ở nồng độ 10 microM bằng cách cảm ứng tế bào tự hủy [34]
THỰC NGHIỆM
NỘI DUNG NGHIÊN CỨU
Đề tài “ bán tổng hợp một số dẫn xuất của alpha Mangostin từ vỏ quả măng cụt ” với mục đích chiết tách được Alpha Mangostin và sau các phản ứng tổng hợp tìm ra được hoạt chất có hoạt tính dược học cao Mục tiêu nghiên cứu của đề tài gồm các nội dung chính sau :
Phân lập, chiết tách alpha Mangostin từ vỏ quả măng cụt
Tổng hợp các phản ứng như : este hóa, oxy hóa, epoxy hóa
Thử nghiệm hoạt tính sinh học của các dẫn xuất đã tổng hợp.
QUI TRÌNH THỰC HIỆN
Qui trình thực hiện luận văn được tham khảo qua một số tài liệu được công bố [15] [36-38] và mô tả theo hình minh họa bên dưới
Reactions of extracted alpha-Mangostin were carried out with reagents 2-Fluoro Benzoyl Chloride, 3-Fluoro Benzoyl Chloride, 4-Fluoro Benzoyl Chloride, 2-Bromo Benzoyl Chloride, 4-Bromo Benzoyl Chloride, meta-Chloroperoxybenzoic acid (m-CPBA), and 3-Chloro Benzoyl Chloride.
Hình 2.1: sơ đồ qui trình thực nghiệm
Ngâm trong dung môi Ethyl Acetate
Sản phẩm Đo hoạt tính sinh học Thực hiện các phản ứng với alpha Mangostin alpha Mangostin tinh Tách alpha Mangostin tinh bằng sắc ký cột Đo phổ NMR, MS
HÓA CHẤT VÀ THIẾT BỊ
Hệ thống triển khai cột sắc ký
Hệ thống triển khai sắc ký bản mỏng
Hệ thống cô quay chân không
Hệ thống ngâm lọc chân không
Bộ dụng cụ hoàn lưu
Bộ dụng cụ chưng cất
Máy xay nghiền vỏ quả măng cụt
Bếp khuấy từ hỗ trợ gia nhiệt
Một số dụng cụ cơ bản khác của phòng thí nghiệm …
Alpha Mangostin 2-Florobenzoyl Cloride 3-Florobenzoyl Cloride 4-Florobenzoyl Cloride 2-Bromobenzoyl Cloride 3-Bromobenzoyl Cloride 4-Bromobenzoyl Cloride 3-Cloromobenzoyl Cloride NBS m-CPBA
THF Silicagel bản mỏng Acid Sulphuric loãng Iod (rắn)
Silicagel (chạy cột) Sodium Sunphate Một số chất khác …
CÁC PHƯƠNG PHÁP SỬ DỤNG TRONG QUÁ TRÌNH THỰC NGHIỆM
Phương pháp sắc ký bản mỏng (Thin layer chromatography - TLC)
Quá trình thực nghiệm sử dụng sắc ký bản mỏng TLC Silicagel 60 F254 của Công Ty Merck (Đức)
Phương pháp sắc ký cột cổ điển
Trong quá trình thực nghiệm, sử dụng cột thủy tinh đường kính 1,5cm, 2cm và 5 cm, dài 30 - 40 cm, chất nhồi cột là Silicagel 230 - 400 mesh của công ty Himedia (Ấn Độ)
Phương pháp sắc ký lỏng cao áp (High-performance liquid romatography)
Quá trình đo mẫu được thực hiện trên máy HPLC 1260 Agilent tại Bộ môn Hữu Cơ - Khoa Kỹ Thuật Hóa Học, trường Đại Học Bách Khoa TP Hồ Chí Minh, với cỏc thụng số của mỏy là: Đầu dũ DAD, Cột pha đảo C18 (150ì4.6 mm, 5àm)
Dựa trên một số tài liệu tham khảo đã được công bố [39-42], phương pháp và các điều kiện để đo mẫu được thực hiện trên máy HPLC như sau :
Dung môi: dung dịch 0.1% Phosphoric acid trong nước (dung dịch A) và Methanol (dung dịch B)
Tốc độ dòng 1 mL.min -1
Chế độ gradient dung môi : Đối với các mẫu 20 phút : Ở thời gian 0 phút : 30% dung dịch A, 70% dung dịch B Ở thời gian 15 phút : 100% dung dịch B Ở thời gian 20 phút : 100% dung dịch B Đối với các mẫu 30 phút : Ở thời gian 0 phút : 30% dung dịch A, 70% dung dịch B Ở thời gian 15 phút : 100% dung dịch B Ở thời gian 30 phút : 100% dung dịch B
Phương pháp phổ khối lượng (mass spectrometry - MS)
Các mẫu trong thực nghiệm được đo trên máy khối phổ Micro OTOF-Q 10187 (Brucker- Đức) tại trung tâm phân tích – bộ môn Hóa Lý, trường Đại học Khoa Học Tự Nhiên TP.Hồ Chí Minh
Phương pháp phổ cộng hưởng từ hạt nhân ( 1 H-NMR, 13 C-NMR)
Các hoạt chất trong luận văn được đo phổ 1 H-NMR, 13 C-NMR trên máy Ultrashield 500 (Brucker - Đức) tại trung tâm phân tích – bộ môn Hóa Lý, trường Đại Học Khoa Học Tự Nhiên TP.Hồ Chí Minh.
NỘI DUNG THỰC NGHIỆM
Tham khảo một số qui trình chiết tách alpha Mangostin từ vỏ quả Măng Cụt trên các tài liệu đã công bố [1, 6, 7, 11, 43], tiến hành thực hiện chiết tách alpha Mangostin như sau :
Bột vỏ măng cụt sau khi bỏ cuống được đem phơi khô rồi xay thành bột Cân 500g bột vỏ măng cụt, ngâm trong 1 lít Ethyl Acetate trong điều kiện nhiệt độ thường trong 6 ngày đêm Tiếp theo tiến hành lọc dung dịch ngâm bằng máy lọc chân không, đối chiếu dung dịch với alpha Mangostin bằng sắc ký bản mỏng Dung dịch được cô quay đuổi dung môi, cho silicagel (230-400 mesh) để tạo thành dạng cao khô, chuẩn bị cho quá trình chạy cột Bã vỏ măng cụt còn lại được ngâm với dung môi Ethyl Acetate 2 lần x 6 ngày Sau lần thứ 3, thử TLC thấy vết alpha Mangostin rất mờ.
Từ cao khô ở bước trên, tiến hành chạy sắc ký cột với hệ dung môi phân giải E : H (Ethyl Acetate : Hexan) là 30 : 70 Kiểm tra sản phẩm tạo thành trên TLC
2.5.2 Tổng hợp dẫn xuất ester hóa tại chức rượu C3 và C6 của alpha Mangostin với tác chất 2-Flouro Benzoyl Chloride (phản ứng 1)
Sơ đồ thực hiện phản ứng alpha Mangostin sản phẩm 1
Hình 2.2: sơ đồ phản ứng 1
Hòa tan 100,00 mg (0,20 mmol) alpha Mangostin trong bình chứa 5 ml dung môi CH 2 Cl 2, dùng micro pipet lấy 0.10 ml (0,60 mmol) Triethyl Amin và 0,07 ml (0,60 mmol) 2-Flouro Benzoyl Chloride cho vào bình phản ứng Thực hiện khuấy phản ứng ở nhiệt độ phòng Kiểm tra phản ứng bằng TLC cho đến khi không còn thấy tác chất (sau 48 giờ) Tách sản phẩm 1 bằng hệ dung môi E : H với tỉ lệ thể tích 20 : 80
2.5.3 Tổng hợp dẫn xuất ester hóa tại chức rượu C3 và C6 của alpha Mangostin với tác chất 3-Floro Benzoyl Chloride (phản ứng 2)
Sơ đồ thực hiện phản ứng alpha Mangostin sản phẩm 2
Hình 2.3: sơ đồ phản ứng 2
Hòa tan 100,00 mg alpha Mangostin vào 5 ml CH2Cl2 Thêm 0,10 ml Triethyl Amin và 0,07 ml 3-Flouro Benzoyl Chloride vào bình phản ứng Khuấy phản ứng ở nhiệt độ phòng trong 60 giờ, cho đến khi vệt alpha Mangostin trên sắc ký bản mỏng rất mờ.
Tách sản phẩm 2 bằng hệ dung môi E : H với tỉ lệ thể tích 20 : 80
2.5.4 Tổng hợp dẫn xuất ester hóa tại chức rượu C3 và C6 của alpha Mangostin với tác chất 4-Floro Benzoyl Chloride (phản ứng 3)
Sơ đồ thực hiện phản ứng alpha Mangostin sản phẩm 3
Hình 2.4: sơ đồ phản ứng 3
Hòa tan 100,00 mg (0,20 mmol) alpha Mangostin vào bình phản ứng chứa 5 ml dung môi CH 2 Cl 2, dùng micro pipet lần lượt lấy 0.10 ml (0,60 mmol) Triethyl Amin và 0,07 ml (0,60 mmol) 4-Flouro Benzoyl Chloride cho vào bình phản ứng
Phản ứng được thực hiện ở nhiệt độ phòng bằng cách khuấy Theo dõi phản ứng bằng TLC, sau 55 giờ vết alpha Mangostin trên sắc ký bản mỏng mờ hẳn Tách sản phẩm 3 bằng hệ dung môi E : H với tỉ lệ thể tích 20 : 80
2.5.4 Tổng hợp dẫn xuất ester hóa tại chức rượu C3 và C6 của alpha Mangostin với tác chất 2-Bromo Benzoyl Chloride (phản ứng 4)
Sơ đồ thực hiện phản ứng alpha Mangostin sản phẩm 4
Hình 2.5: sơ đồ phản ứng 4
Hòa tan 100 mg (0,20 mmol) alpha Mangostin cho vào bình phản ứng chứa 5 ml dung môi CH2Cl2, Dùng micro pipet lần lượt hút 0,10 ml(0,60 mmol) Triethyl Amin và 0,08 ml (0,60 mmol) 2-Bromo Benzoyl Chloride cho vào bình phản ứng
Ở nhiệt độ phòng, khuấy đều hỗn hợp phản ứng Theo dõi sắc ký bản mỏng cho đến khi vết alpha-Mangostin mờ dần (khoảng 50 giờ) Tiếp theo, tách sản phẩm 4 bằng hệ dung môi E:H có tỷ lệ thể tích là 20:80.
2.5.5 Tổng hợp dẫn xuất ester hóa tại chức rượu C3 và C6 của alpha Mangostin với tác chất 4-Bromo Benzoyl Chloride (phản ứng 5)
Sơ đồ thực hiện phản ứng alpha Mangostin sản phẩm 5
Hình 2.6: sơ đồ phản ứng 5
Tương tự phản ứng 4, hòa tan 100,00 mg (0,20 mmol) alpha Mangostin cho vào bình chứa 5 ml dung môi CH2Cl2, cho 0.10 ml(0,06 mmol) Triethyl Amin và 133,90 mg (0,06 mmol) 4-Bromo Benzoyl Chloride vào bình phản ứng Khuấy phản ứng ở nhiệt độ phòng, kiểm tra sắc ký bản mỏng đến khi vết tác chất mờ hẳn (65 giờ) Tách sản phẩm 6 bằng hệ dung môi E : H với tỉ lệ thể tích 20 : 80
2.5.6 Nghiên cứu phản ứng epoxy hóa alpha Mangostin tại C12 và C17 với tác chất m-CPBA (phản ứng 6)
Theo lý thuyết và một số tài liệu [44-47] anken phản ứng với m-CPBA tạo thành epoxy với sơ đồ như sau:
Hình 2.7: sơ đồ phản ứng epoxy hóa của m-CPBA
Alpha Mangostin có hai nối đôi tại vị trí C12 và C17, vì vậy phản ứng với m- CPBA có thể tạo thành như sơ đồ sau : alpha Mangostin m-CPBA dự kiến sản phẩm 6
Hình 2.8: sơ đồ 1 dự kiến phản ứng 6
Hòa tan 50 mg (0,10 mmol) alpha Mangostin cho vào bình cầu chứa 5 ml dung môi CH2Cl2 Tiếp theo hòa tan 52,30 mg m-CPBA (0,30 mmol) cho vào bình phản ứng Thực hiện phản ứng với hệ thống hồi lưu ở nhiệt độ sôi của dung môi
Kiểm tra phản ứng bằng TLC.Tách sản phẩm bằng hệ dung môi E : H với tỉ lệ thể tích 20 : 80
Sau khi kiểm tra sản phẩm của phản ứng bằng 1 H-NMR, thấy xuât hiện thêm các peak proton từ 6,5 ppm đến 8,5 ppm đặc trưng của vòng Benzen Sản phẩm dự kiến không tạo thành, có thể xảy ra phản ứng este hóa tại C3 và C6 alpha Mangostin
Hình 2.9: sơ đồ 2 dự kiến phản ứng 6 Để kiểm chứng cho điều này, tiếp tục thực hiện phản ứng 7
2.5.7 Tổng hợp dẫn xuất ester hóa tại chức rượu C3 và C6 của alpha Mangostin với tác chất 3-Cloro Benzoyl Chloride (phản ứng 7)
Sơ đồ thực hiện phản ứng alpha Mangostin sản phẩm 8
Hình 2.10: sơ đồ phản ứng 7
Để tổng hợp dẫn xuất 7, Hòa tan 100 mg (0,20 mmol) alpha Mangostin vào 5 ml CH2Cl2, sau đó thêm 0,10 ml Triethyl Amin và 0,07 ml (0,60 mmol) 3-Chloro Benzoyl Chloride vào bình phản ứng Khuấy phản ứng ở nhiệt độ phòng cho đến khi phản ứng hoàn toàn (50 giờ) Tách sản phẩm 7 bằng sắc ký bản mỏng, sử dụng hệ dung môi E:H với tỷ lệ thể tích 20:80.
2.5.8 Nghiên cứu phản ứng tại C12 và C17 của alpha Mangostin với tác chất NBS (phản ứng 8)
Theo lý thuyết và một số tài liệu tham khảo [48-50], anken có thể phản ứng với NBS theo sơ đồ sau
Hình 2.11 sơ đồ phản ứng anken hóa bằng NBS
Alpha Mangostin có hai vị trí nối đôi mạch nhánh tại vị trí C12 và C17, dự kiến phản ứng với NBS như sau:
Dự kiến các sản phẩm
Hình 2.12: sơ đồ phản ứng 8 với 4 đồng phân sản phẩm
Hòa tan 50,00 mg (0,10 mmol) alpha Mangostin cho vào bình cầu chứa 2,5 ml dung môi THF (Tetrahydrofuran) và 2,5 ml nước cất Sau đó cho 54,30 mg (0,30) NBS cho vào bình phản ứng Thực hiện phản ứng với hệ thống hồi lưu ở nhiệt độ sôi của dung môi Kiểm tra phản ứng bằng TLC cho đến khi vết tác chất mờ hẳn.Tách sản phẩm bằng hệ dung môi E : H với tỉ lệ thể tích 20 : 80.
KẾT QUẢ - BÀN LUẬN
KẾT QUẢ CHIẾT TÁCH ALPHA MANGOSTIN TỪ VỎ QUẢ MĂNG CỤT
500 gam vỏ quả Măng Cụt đã được xay nghiền, độ ẩm của bột được đo 3 lần trên máy đo độ ẩm Sartorius, với nhiệt độ của buồng đo 105 o C, tại trường Đại học Bách Khoa TP Hồ Chí Minh và cho kết quả như sau:
Lần 1: khối lượng mẫu : 1,347 gam , độ ẩm là 19,52 % , với thời gian đo 4,7 phút
Lần 2 : khối lượng mẫu : 1,352 gam , độ ẩm là 19,41 % , với thời gian đo 4,6 phút
Lần 3 : khối lượng mẫu : 1,384 gam , độ ẩm là 19,40 % , với thời gian đo 4,8 phút
Vậy độ ẩm trung bình của vỏ quả măng cụt khoảng 19,44 %
Sau khi phân lập, tinh chế alpha Mangostin bằng sắc ký cột với hệ dung môi Ethyl Acete : Hexane Kết quả thu được 2,8 g alpha Mangostin Hiệu suất chiết tách được là :
Hình 3.1: kết quả sắc ký bản mỏng cao thô alpha Mangostin
Giá trị Rf ≈ 0,55(Silicagel, Ethyl Acetate: Hexan ≈ 3: 7)
Hình 3.2: kết quả sắc ký bản mỏng cao tinh alpha Mangostin
Từ phổ 1 H-NMR ở phụ lục 1, được tóm tắt ở bảng 3.1, kiểm tra và so sánh kết quả với các tài liệu đã công bố [1, 6, 11, 51]
Bảng 3.1: Dữ liệu phổ 1 H-NMR của alpha Mangostin
Qua phép đo HPLC tại phụ lục 23, kết quả dung tích đỉnh đạt 96,81%, thời gian lưu là 11,90 phút phù hợp với nghiên cứu đã xuất bản [39-42].
Từ các kết quả trên, xác định công thức cấu tạo của alpha Mangostin là :
KẾT QUẢ TỔNG HỢP CÁC PHẢN ỨNG
3.2.1 Kết quả tổng hợp phản ứng 1
Trước và sau khi tách chiết, sản phẩm 1 được thể hiện trên TLC như Hình 3.4 và 3.5, sử dụng hệ dung môi E : H với tỷ lệ 3 : 7 Sản phẩm hiển thị màu vàng trên hơi Iốt Kết quả thu được 133,8mg, hiệu suất 83.8%
Hình 3.4: kết quả TLC của sản phẩm 1 sau phản ứng
Giá trị R f ≈ 0,83(Silicagel, Ethyl Acetate: Hexan ≈ 20 : 80)
Hình 3.5: kết quả TLC của sản phẩm 1 sau khi tách
Với kết quả 1 H-NMR ở phụ lục 2 và 13 C-NMR ở phụ lục 10, được tóm tắt ở bảng 3.2, đã xác định cấu trúc khung cơ bản của alpha Mangostin Ngoài ra, xuất hiện thêm các vị trí cacbon 2’, 2’’, 3’, 3’’, 4’, 4’’, 5’, 5’’, 6’, 6’’, 7’, 7’’, 8’,8’’ cùng một số vị trí proton 5’, 5’’, 6’, 6’’, 7’, 7’’, 8’,8’’ của hai vòng aromatic
Bảng 3.2: Dữ liệu phổ 1 H-NMR và 13 C-NMR của sản phẩm 1
13C-NMR (CDCl3 δ(ppm)) 1 H-NMR(CDCl3 δ(ppm))
Kết quả phổ HR-MS tại phụ lục 16, theo lý thuyết [C38H32F2O8+Na] + là 677,1957 g/mol, đo được là 677,1958 g/mol, phù hợp
Kết quả HPLC ở phụ lục 24, phần trăm diện tích peak của sản phẩm 1 là 94,81 %, thời gian lưu là 28,87 phút
Từ kết quả của TLC, dữ liệu phổ 1 H-NMR, 13 C-NMR và HR-MS công thức phân tử của sản phẩm 1 là C38H32F2O8 và công thứccấu tạo như sau
Hình 3.6: công thức cấu tạo của sản phẩm 1
3.2.2 Kết quả tổng hợp phản ứng 2
Sản phẩm 2 trước và sau khi chiết tách được thể hiện trên TLC như Hình 3.7 và 3.8, sử dụng hệ dung môi E : H với tỷ lệ 3 : 7 Sản phẩm hiển thị màu vàng trên hơi Iốt Kết quả chiết tách là 138,5 mg, hiệu suất 86.7%
Hình 3.7: kết quả TLC của sản phẩm 2 sau phản ứng
Giá trị Rf ≈ 0,65(Silicagel, Ethyl Acetate: Hexan ≈ 10 : 90)
Hình 3.8: kết quả TLC của sản phẩm 2 sau khi tách
Từ kết quả 1 H-NMR ở phụ lục 3 và 13 C-NMR ở phụ lục 11, được tóm tắt ở bảng 3.3, đã xác định được cấu trúc khung cơ bản của alpha Mangostin Ngoài ra, còn xuất hiện thêm các vị trí cacbon 2’, 2’’, 3’, 3’’, 4’, 4’’, 5’, 5’’, 6’, 6’’, 7’, 7’’, 8’, 8’’ cùng một số vị trí proton 4’, 4’’, 6’, 6’’, 7’, 7’’, 8’, 8’’ của hai vòng aromatic
Bảng 3.3: Dữ liệu phổ 1 H-NMR, 13 C-NMR của sản phẩm 2
13C-NMR (CDCl3 δ(ppm)) 1 H-NMR(CDCl3 δ(ppm))
Với kết quả HR-MS ở phụ lục 17, theo lý thuyết [C38H32F2O8+H] + là 655,2138 g/mol, đo được là 655,2134 g/mol, phù hợp
Kết quả HPLC đo được thể hiện ở phụ lục 25, phần trăm diện tích peak của sản phẩm 2 là 92,45 %, thời gian lưu là 19,38 phút
Từ kết quả của TLC, dữ liệu phổ 1 H-NMR, 13 C-NMR, HR-MS công thức phân tử của sản phẩm 2 là C38H32F2O8 và công thức cấu tạo như sau
Hình 3.9: công thức cấu tạo của sản phẩm 2
3.2.3 Kết quả tổng hợp phản ứng 3
Kết quả TLC của sản phẩm 3 được thể hiện như hình 3.10 và 3.11, sử dụng hệ dung môi E : H với tỷ lệ 3 : 7 Sản phẩm hiển thị màu vàng trên hơi Iốt Kết quả thu được 129,9 mg, hiệu suất 81.3%
Hình 3.10: kết quả TLC của sản phẩm 3 sau phản ứng
Giá trị Rf ≈ 0,69(Silicagel, Ethyl Acetate: Hexan ≈ 10 : 90)
Hình 3.11: kết quả TLC của sản phẩm 3 sau khi tách
Từ kết quả 1 H-NMR ở phụ lục 4 và 13 C-NMR ở phụ lục 12, được tóm tắt ở bảng 3.4, đã xác định được cấu trúc cơ bản của alpha Mangostin Ngoài ra, trên phổ còn xuất hiện thêm các vị trí cacbon 2’, 2’’, 3’, 3’’, 4’, 4’’, 5’, 5’’, 6’, 6’’, 7’, 7’’, 8’, 8’’ cùng một số vị trí proton 4’, 4’’, 5’,5’’, 7’, 7’’, 8’, 8’’ của hai vòng aromatic
Bảng 3.4: Dữ liệu phổ 1 H-NMR, 13 C-NMR của sản phẩm 3
13C-NMR (CDCl3 δ(ppm)) 1 H-NMR(CDCl3 δ(ppm))
162,92 116,52 163,25 100,46 153,83 116,75 154,15 146,95 139,31 117,02 182,96 107,27 155,18 22,39 121,39 132,37 25,63 17,80 26,52 122,63 132,39 18,21 25,82 61,92 161,11 149,56 125,25 và 124,88 132,98 và 132,40 133,10 và 133,03 116,04 và 115,86 116,22 và 116,04 167,45 (d; J ,25) 165,42 (d; J ,38)
Kết quả của HR-MS tại phụ lục 18, theo lý thuyết [C 38 H 32 F 2 O 8 +Na] + là 677,1957 g/mol, đo được 677,1953 g/mol là phù hợp
Thực hiện phân tích dữ liệu từ kết quả đo HPLC ở phụ lục 26, phần trăm diện tích peak của sản phẩm 3 là là 89,39 %, thời gian lưu là 18,82 phút
Với kết quả của TLC, 1 H-NMR, 13 C-NMR, và HR-MS công thức phân tử sản phẩm 3 là C 38 H 32 F 2 O 8 và công thức cấu tạo của là
Hình 3.12: công thức cấu tạo của sản phẩm 3
3.2.4 Kết quả tổng hợp phản ứng 4
Trước và sau khi chiết tách, sản phẩm 4 được phân tích trên bản đồ mỏng TLC với hệ dung môi E: H theo tỷ lệ 3:7 Sản phẩm có màu vàng sau khi qua hơi I-ốt, thu được 112,5 mg Hiệu suất của quá trình chiết tách là 59,4%.
Hình 3.13: kết quả TLC của sản phẩm 4 sau phản ứng
Giá trị Rf ≈ 0,60(Silicagel, Ethyl Acetate: Hexan ≈ 15 : 85)
Hình 3.14: kết quả TLC của sản phẩm 4 sau khi tách
Kết quả 1 H-NMR ở phụ lục 5 và 13 C-NMR ở phụ lục 13 được tóm tắt ở bảng 3.5.Từ các dữ liệu phổ NMR, đã xác định được cấu trúc cơ bản của Alpha Mangostin Ngoài ra, xuất hiện thêm các vị trí cacbon 2’, 2’’, 3’, 3’’, 4’, 4’’, 5’, 5’’, 6’, 6’’, 7’, 7’’, 8’, 8’’ cùng một số vị trí proton 5’, 5’’, 6’, 6’’, 7’, 7’’, 8’, 8’’ của hai vòng aromtic
Bảng 3.5: Dữ liệu phổ 1 H-NMR và 13 C-NMR của sản phẩm 4
13C-NMR (CDCl3 δ(ppm)) 1 H-NMR(CDCl3 δ(ppm))
26,56 122,67 132,50 18,23 25,81 61,07 161,18 149,31 132,60 và 132,00 122,80 và 122,71 134,99 và 134,89 133,71 và 133,50 130,57 và 130,24 127,48 và 127,36
Với kết quả của HR-MS tại phụ lục 19, theo lý thuyết [C38H32Br2O8+H] + là 799,0339 g/mol, đo được là 799,0353 g/mol, phù hợp
Kết quả đo HPLC ở phụ lục 27, phần trăm diện tích peak của sản phẩm 4 là 50,68 %, thời gian lưu là 19,18 phút
Từ kết quả của TLC, 1 H-NMR, 13 C-NMR, và HR-MS công thức phân tử sản phẩm 4 là C 38 H 32 Br 2 O 8 và công thức cấu tạo như sau
Hình 3.15: công thức cấu tạo của sản phẩm 4
3.2.5 Kết quả tổng hợp phản ứng 5
Kết quả TLC của sản phẩm 5 được thể hiện như hình 3.16 và 3.17, sử dụng hệ dung môi E : H với tỷ lệ 3 : 7 Sản phẩm hiển thị màu vàng trên hơi Iốt Kết quả thu được 127,3 mg, hiệu suất 67,2%
Hình 3.16: kết quả TLC của sản phẩm 5 sau phản ứng
Giá trị Rf ≈ 0,79(Silicagel, Ethyl Acetate: Hexan ≈ 10 : 90)
Hình 3.17: kết quả TLC của sản phẩm 5 sau phản ứng
Từ kết quả 1 H-NMR ở phụ lục 6 và 13 C-NMR ở phụ lục 14, với kết quả được tóm tắt ở bảng 3.6, đã xác định được cấu trúc cơ bản của alpha Mangostin Ngoài ra xuất hiện thêm các vị trí cacbon 2’, 2’’, 3’, 3’’, 4’, 4’’, 5’, 5’’, 6’, 6’’, 7’, 7’’, 8’, 8’’ cùng một số vị trí proton 4’, 4’’, 5’, 5’’, 7’, 7’’, 8’, 8’’ của hai vòng aromatic
Bảng 3.6: Dữ liệu phổ 1 H-NMR của sản phẩm 5
13C-NMR (CDCl3 δ(ppm)) 1 H-NMR(CDCl3 δ(ppm))
Kết quả của HR-MS tại phụ lục 20, theo lý thuyết [C38H32Br2O8+H] + là 799,0339 g/mol, đo được 799,0317 g/mol là phù hợp
Thực hiện phân tích dữ liệu từ kết quả đo HPLC ở phụ lục 28, phần trăm diện tích peak của sản phẩm 5 là 97,20 %, thời gian lưu là 21,82 phút
Từ kết quả của TLC, 1 H-NMR, 13 C-NMR và HR-MS có công thức phân tử sản phẩm 5 là C 38 H 32 Br 2 O 8 và có công thức cấu tạo là
Hình 3.18: công thức cấu tạo của sản phẩm 5 3.2.6 Kết quả phản ứng 6
Trước và sau khi tách chiết, sản phẩm của phản ứng 6 được thể hiện trên bản mỏng TLC như Hình 3.19 và 3.20 Sử dụng hệ dung môi E : H với tỷ lệ 3:7
Hình 3.19: kết quả TLC của sản phẩm 6 sau phản ứng
Hình 3.20: kết quả TLC của sản phẩm 6 sau khi tách
Dựa vào phổ 1H-NMR (Phụ lục 7), cấu trúc khung của alpha-Mangostin được xác định cơ bản Tuy nhiên, trong phổ xuất hiện thêm một số đỉnh proton của vòng thơm trong vùng dịch chuyển từ 6,5 đến 8,5 ppm.
Kết quả phổ HR-MS tại phụ lục 21, xuất hiện peak cao nhất đo được là 433,1636 g/mol phù hợp với [C 24 H 26 O 6 +H] +
3.2.7 Kết quả tổng hợp phản ứng 7
Kết quả TLC của sản phẩm 7 được thể hiện như hình 3.21 và 3.22, sử dụng hệ dung môi E : H với tỷ lệ 3 : 7 Kết quả thu được 121,6 mg, hiệu suất 72,5%
Hình 3.21: kết quả TLC của sản phẩm 7 sau phản ứng
Giá trị R f ≈ 0,83(Silicagel, Ethyl Acetate: Hexan ≈ 25 : 75)
Hình 3.22: kết quả TLC của sản phẩm 7 sau khi tách
Từ kết quả 1 H-NMR ở phụ lục 8 và 13 C-NMR ở phụ lục 15, với kết quả được tóm tắt ở bảng 3.7, xác định được cấu trúc cơ bản của alpha Mangostin Ngoài ra xuất hiện các vị trí cacbon 2’, 2’’, 3’, 3’’, 4’, 4’’, 5’, 5’’, 6’, 6’’, 7’, 7’’, 8’, 8’’ cùng một số vị trí proton 4’, 4’’, 6’, 6’’, 7’, 7’’, 8’, 8’’ của hai vòng thơm
Bảng 3.7: Dữ liệu phổ 1 H-NMR và 13 C-NMR của sản phẩm 7
13C-NMR (CDCl3 δ(ppm)) 1 H-NMR(CDCl3 δ(ppm))
132,50 18,21 25,82 62,00 161,15 149,43 130,76 và 130,36 130,36 và 130,31 135,10 và 134,94 134,21 và 133,95 130,15 và 130,00 128,47 và 128,38
Kết quả của HR-MS tại phụ lục 22, theo lý thuyết [C38H32Cl2O8+H] + là 709,1366 g/mol, đo được 709,1366 g/mol, phù hợp
Kết quả đo HPLC ở phụ lục 29, phần trăm diện tích peak của sản phẩm 7 là 96,51 %, thời gian lưu là 21,519 phút
Từ kết quả của TLC, 1 H-NMR, 13 C-NMR, HR-MS sản phẩm 7 có công thức phân tử là C38H32Cl2O8 và công thức cấu tạo là
Hình 3.23: công thức cấu tạo của sản phẩm 7
3.2.9 Kết quả tổng hợp phản ứng 8
Trước và sau khi tách chiết, sản phẩm của phản ứng 8 thu được được thể hiện trên bản mỏng TLC như Hình 3.24 và 3.25, sử dụng hệ dung môi E : H với tỷ lệ 3:7.
Hình 3.24: kết quả TLC của sản phẩm 8 sau phản ứng
Hình 3.25: kết quả TLC của sản phẩm 8 sau khi tách
Kết quả 1 H-NMR ở phụ lục 8, chỉ xác định được một số peak cơ bản của alpha Mangostin, xuất hiện một số peak lạ không xác định được.
KẾT QUẢ ĐO HOẠT TÍNH CHỐNG OXY HÓA CỦA CÁC SẢN PHẨM TỔNG HỢP
Sau khi tách xong các sản phẩm, kiểm tra khả năng kháng oxi hoá theo cơ chế bắt gốc tự do của alpha Mangostin và 6 sản phẩm: sản phẩm 1, 2, 3, 4, 5, 7 với chỉ tiêu cần xác định là phần trăm bắt gốc tự do của mẫu Với phương pháp đo đươc thực hiện là phương pháp bắt gốc tự do DPPH (1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl)
Các chất nghiên cứu có tác dụng kháng oxi hóa theo cơ chế bắt gốc tự do sẽ chuyển gốc tự do DPPH từ màu tím sang màu vàng nhạt Xác định khả năng bắt gốc tự do của chất nghiên cứu bằng phương pháp đo độ hấp thu của mẫu tại bước sóng λ = 517 nm Trong đó, Ascorbic acid được sử dụng làm chất đối chiếu
Xác định hoạt tính kháng oxi hóa bằng phương pháp DPPH :
Thực hiện với mẫu thử ở 3 nồng độ khác nhau
DPPH hoà tan trong dung môi methanol ở nồng độ 6mM, dịch mẫu ở nồng độ ban đầu 30, 15, 3 mg/ml Cho 100 μl dung dịch DPPH nồng độ 6mM vào 2800 μl methanol, sau đó bổ sung 100 μl dịch mẫu Dung dịch được lắc đều, thực hiện phản ứng ở điều kiện nhiệt độ phòng trong thời gian 30 phút, rồi đem mẫu đo độ hấp thu ở bước sóng λ = 517 nm
Thực hiện với mẫu đối chiếu và mẫu trắng
Hòa tan Ascorbic Acid (vitamine C) trong DMSO ở nồng độ ban đầu 3mg/ml
Mẫu đối chiếu (ascorbic acid): Cho 100 μl dung dịch DPPH nồng độ 6mM vào 2800 μl methanol, sau đó bổ sung 100 μl dung dịch ascorbic acid nồng độ
Mẫu trắng: Cho 100 μl DPPH vào 2900 μl methanol
Cả hai dung dịch được lắc đều, thực hiện phản ứng ở điều kiện nhiệt độphòng trong thời gian 30 phút, rồi đem mẫu đo độ hấp thu ở bước sóng λ 517 nm
Phần trăm bắt gốc tự do DPPH của chất nghiên cứu được tính theo công thức sau:
Trong đó: A là độ hấp thu của dung dịch chứa mẫu thử
A 0 là độ hấp thu của DPPH khi không có mẫu Ac là độ hấp thu của dung dịch chứa chất đối chiếu
Hình 3.26 : giản đồ kháng oxi hóa của các sản phẩm và alpha Mangostin
Từ kết quả đo được, alpha Mangostin có hoạt tính kháng oxy hóa khá tốt, sáu sản phẩm còn lại có hoạt tính yếu
Bảng 3.8: Khả năng kháng oxy hóa của các sản phẩm và alpha Mangostin
Sản phẩm 1 Sản phẩm 2 Sản phẩm 3 Alpha
Sản phẩm 4 Sản phẩm 5 Sản phẩm 7
1 mg/ml0,5 mg/ml0,1 mg/ml
KẾT QUẢ ĐO HOẠT TÍNH CHỐNG UNG THƯ CỦA CÁC SẢN PHẨM TỔNG HỢP
Phương pháp SRB được dùng để đo hoạt tính kháng ung thư của các sản phẩm, và được thực nghiệm tại phòng thí nghiệm Sinh Học Phân Tử, bộ môn Di Truyền, Trường Đại Học Khoa Học Tự Nhiên, TP Hồ Chí Minh
Các sản phẩm được kiểm tra trên bốn dòng tế bào:
1 Dòng tế bào ung thư cổ tử cung HeLa 2 Dòng tế bào ung thư phổi NCI-H460 3 Dòng tế bào ung thư vú MCF-7 4 Dòng tế bào ung thư gan Hep G2
Đo độc tính tế bào bằng kiểm tra SRB (Sulforhodamine B) là phương pháp nhuộm màu đơn giản và nhạy.Thuốc nhuộm SRB mang điện tích âm, liên kết tĩnh điện với protein tích điện dương.
Lượng thuốc nhuộm liên kết sẽ phản ánh lượng protein tổng của tế bào
- Trong thử nghiệm, tế bào được cố định, rửa và nhuộm với SRB Sau đó SRB liên kết với protein tế bào được hòa tan tạo dung dịch trong suốt có màu hồng
Mật độ quang đo được của dung dịch tương quan với lượng protein tổng hay số lượng tế bào Sự thay đổi lượng tế bào so với mẫu chứng phản ánh độc tính tế bào của chất nghiên cứu
Quy trình khảo sát hoạt tính gây độc bằng phương pháp SRB
- Giải đông nguồn tế bào ung thư bảo quản trong Nitơ lỏng nuôi cấy tế bào đến thế hệ thứ 4 (P4)
- Nuôi tế bào trong bình nuôi cấy đạt độ phủ khoảng 70 - 80%
Theo thiết kế nghiên cứu, phù tế bào được phân bổ vào các giếng đĩa 96 giếng với mật độ tế bào ban đầu là 104 tế bào trên mỗi giếng đối với dòng tế bào HeLa và MCF-7, trong khi dòng tế bào NCI-H460 được gieo cấy ở mật độ 7,5 x 103 tế bào trên mỗi giếng.
- Bổ sung môi trường chứa chất thử với nồng độ gấp đôi nồng độ muốn thử (chú ý: không loại bỏ môi trường cũ đã có ở trong giếng)
- Cố định tế bào trong giếng với Trichloroacetic acid (TCA) :
+ Đối với những dòng tế bào bám dính: sử dụng dung dịch TCA 50% lạnh vào mỗi giếng (cho vào từ từ không quá nhanh)
+ Đối với những dòng tế bào lơ lửng: sử dụng dung dịch TCA 80% lạnh vào mỗi giếng
Đặt đĩa trên vào trong tủ lạnh (4 o C), 1-3 giờ
Loại bỏ chất lỏng trong mỗi giếng
Rửa nhẹ nhàng với nước (200àl/giếng) 5 lần
Để khô tự nhiên ở nhiệt độ phòng, 12-24 giờ
+ Cho dung dịch SRB 0,2% vào mỗi giếng
+ Loại bỏ dung dịch SRB
+ Rửa nhẹ nhàng bằng dung dịch acetic acid 1% (5 lần) + Để khô tự nhiên ở nhiệt độ phòng 12-24 giờ
- Đọc kết quả + Cho 200 àl Tris-base 10mM vào mỗi giếng
+ Lắc trên máy lắc khoảng 10-15 phút cho đến khi SRB tan hoàn toàn
+ Đo mật độ quang ở bước sóng 492nm và 620nm
- 1 mẫu chứng dương: tế bào với CPT (camptothecin) ở nồng độ 0.01(àg/ml)
Mẫu chứng âm sử dụng dung môi hòa tan chất thử là DMSO (0,25%), đóng vai trò như điểm chuẩn so sánh Các mẫu thử nghiệm hoạt tính gây độc được pha loãng ở nhiều nồng độ khác nhau (trong trường hợp xác định IC50) để xác định nồng độ ức chế 50% (IC50) và đánh giá mức độ độc tính của chất thử trên tế bào.
- Thiết kế thử nghiệm của 1 mẫu, gồm:
+ 2 giếng tế bào có môi trường nuôi cấy chứa chất thử ở nồng độ khảo sát
+ 2 giếng không có tế bào có môi trường nuôi cấy chứa chất thử ở nồng độ khảo sát (2 giếng blank)
Sau khi có giá trị mật độ quang ở bước sóng 492nm và 620nm (ký hiệu là OD492 và OD 620 ):
- Tính giá trị OD = OD492 - OD620 (1) - Tính OD492 (hoặc OD620) = ODtb - ODblank (2) - Tính tỉ lệ (%) gây độc tế bào theo công thức:
Trong phương pháp ELISA, các giá trị quang trắc sau được sử dụng để tính kết quả:- ODblank: Giá trị quang trắc của giếng blank- ODtb: Giá trị quang trắc của giếng chứa tế bào- ODTN: Giá trị quang trắc của mẫu thử, tính theo công thức (1) và (2)- ODC: Giá trị quang trắc của mẫu chứng (control), tính theo công thức (1) và (2)
IC 50 được xác định như sau:
Vẽ đồ thị tỷ lệ gây độc tế bào theo nồng độ khảo sát, sau đó nội suy để tìm nồng độ gây độc tế bào 50% bằng cách dựa vào đồ thị để xác định điểm có tỷ lệ gây độc tế bào là 50%.
Tính phương trình đường thẳng qua 2 điểm có tỉ lệ gây độc tế bào gần 50% nhất (1 điểm có tỉ lệ gây độc tế bào nhỏ hơn 50%, điểm còn lại có tỉ lệ gây độc tế bào lớn hơn 50%)
Từ phương trình trên (có dạng y = ax + b), thế y = 50 vào, ta suy ra được giá trị nồng độ x chính là IC50
Các sản phẩm 2, 3, 5, 7 không tan nên không thực hiện thử nghiệm
Sản phẩm 1 và alpha Mangostin bị nhiễm khuẩn nên sau khi hòa tan trong DMSO, được pha loãng đến nồng độ yêu cầu trong môi trường nuôi cấy tế bào rồi lọc loại khuẩn bằng màng lọc 0.2 àm
Kết quả sàng lọc thụ ở nồng độ 100 àg/ml
Phần trăm gây độc tế bào (%) Lần 1 Lần 2 Lần 3 TB ± ĐLC
Sản phẩm 1 -14.22 -5.94 -1.22 -7.13 ± 6.58 Sản phẩm 4 0.11 -8.22 -9.15 -5.75 ± 5.10 CPT (1 àg/ml) 58.84 61.33 57.97 59.38 ± 1.75
Sản phẩm 1 -13.57 -4.70 -9.81 -9.36 ± 4.45 Sản phẩm 4 -1.06 -7.44 -12.23 -6.91 ± 5.60 CPT (0.07 àg/ml) 51.10 51.80 53.02 51.97 ± 0.97
Kết quả thực nghiệm cho thấy sản phẩm 1 và sản phẩm 4 có hoạt tính kháng bốn dòng ung thư MCF-7, NCI-H460, HeLa, Hep G2 yếu hơn so với alpha Mangostin
Phần trăm gây độc tế bào (%) của alpha Mangostin ở các nồng độ khác nhau trên 4 dòng tế bào
Phần trăm gây độc tế bào (%) Lần 1 Lần 2 Lần 3 TB ĐLC
Hình 3.27 : giản đồ IC50 với bốn dòng ung thư của alpha Mangostin
Kết quả xác định IC 50 của alpha Mangostin
IC 50 (àg/ml) Lần 1 Lần 2 Lần 3 TB ± ĐLC
TB, ĐLC: trung bình, độ lệch chuẩn
CPT 0.01 ppm alpha Mangostin 10ppm
Hình 3.28: thử nghiệm dòng tế bào MCF-7
CPT 0.01ppm alpha Mangostin 10ppm Hình 3.29: thử nghiệm dòng tế bào NCI-H460
CPT 1ppm alpha Mangostin 10ppm Hình 3.30: thử nghiệm dòng tế bào HeLa
CPT 0.07ppm alpha Mangostin 10ppm Hình 3.31: thử nghiệm dòng tế bào Hep G2
4 KẾT LUẬN - KIẾN NGHỊ 4.1 KẾT LUẬN
Phân lập được alpha Mangostin từ vỏ quả măng cụt với hiệu suất 0,7 %
Tổng hợp được 6 dẫn xuất của alpha Mangostin
6 dẫn xuất có hoạt tính kháng oxy hóa, kháng ung thư trên 4 dòng tế bào:
MCF-7, NCI-H460, HeLa và Hep G2 yếu hơn alpha Mangostin
Các sản phẩm đã tổng hợp được :
Sản phẩm Công Thức Cấu Tạo
KIẾN NGHỊ
Cần có nhiều nghiên cứu về alpha Mangostin và các dẫn xuất.
