Luận văn thạc sĩ Công nghệ thực phẩm: Thủy phân Gluten lúa mì bằng enzyme

= Khảo sát ảnh hưởng của tỷ lệ enzyme/co chất, nhiệt độ, pH, thời gian thủyphân đến quá trình thủy phân bang enzyme Flavourzyme sau khi xử lý với enzymeAlcalase= Xác định thành phan của

ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP HCMTRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA

CÔNG TRÌNH ĐƯỢC HOÀN THÀNH TẠITRUONG ĐẠI HOC BACH KHOA —DHQG- TPHCM

Cán bộ hướng dẫn khoa học: TS Phan Ngọc Hòa

ĐẠI HOC QUOC GIA TP HO CHÍ MINH CONG H_ A XÃ HỘI CHU NGHĨA VIỆT NAMTRUONG DAI HOC BACH KHOA ĐỘC LAP —TU DO-—HANH PH C

NHIEM VU LUAN VAN THAC SI

Ho tên hoc viên: Hỗ Hồng Tuyết MSHV: 12110223Ngày sinh: 09/08/1989 Nơi sinh: Long AnChuyên ngành: CN Thực Phẩm & Đồ Uống Mã ngành: 605402I Tên đề tài

THUY PHAN GLUTEN LUA MI BẰNG ENZYME

II Nhiệm vu va nội dung

Nội dung“Xác định thành phan nguyên liệu gluten lúa mi: hàm lượng protein, âm, lipid,tinh bột, khối lượng phân tử của bột gluten

= Xác định hoạt tính enzyme Alcalase va Flavourzyme= Khảo sát ảnh hưởng của tỷ lệ enzyme/co chất, nhiệt độ, pH, thời gian thủyphân đến quá trình thủy phân bang enzyme Alcalase

= Khảo sát ảnh hưởng của tỷ lệ enzyme/co chất, nhiệt độ, pH, thời gian thủyphân đến quá trình thủy phân bang enzyme Flavourzyme sau khi xử lý với enzymeAlcalase

= Xác định thành phan của dịch thủy phân: hàm lượng nito tong, hàm lượngamoniac, khối lượng phân tử, thành phân acid amin tự do

III Ngày giao nhiệm vụ

20/06/2014

IV Ngày hoàn thành nhiệm vụ

23/05/2014V Cán bộ hướng dẫn

TS Phan Ngọc HoaTS Nguyễn Lệ Hà

Tp Hỗ Chí Minh, ngày 10 tháng 7 năm 2014Cán bộ hướng dẫn Chủ nhiệm bộ môn

Trưởng khoa Kỹ Thuật Hóa Học

Cudi cùng, tôi xin cảm on ban bè đã quan tam, chia sẻ và giúp đỡ tôi trong quatrình học tập tại trường cũng như hoàn thành luận văn tốt nghiệp nảy.

TP Hồ Chí Minh, ngay tháng năm 2014

Học viên thực hiện

TOM TAT DE TÀI

Luận văn tập trung nghiên cứu qua trình thủy phan gluten lúa mì lần lượt với haienzyme: Alcalase và Flavourzyme nhằm thu dịch thủy phân giàu peptide mạch ngắn vàacid amin Gluten lúa mì có ham âm 7.8%, chứa 75.7% protein, bao gồm các glutenincó khối lượng phân tử 52-70 kDa, các gliadin có khối lượng phân tử từ 30-38 kDa,ngoài ra còn có các tiểu đơn vị trong thành phan của glutenin có khối lượng phân tửthấp hơn nằm trong khoảng 12-15 kDa Quá trình thủy phân được thực hiện lần lượt:ban đầu xúc tác là enzyme Alcalase, một endo-protease, sau đó là xúc tácFlavourzyme Các thông số thích hợp của quá trình thủy phân gluten lúa mì vớiAlcalase thu được như sau: ty lệ enzyme/cơ chất là 0.116 AU/ g, nhiệt độ 60°C, pH 8.0,thời gian thủy phân 120 phút Dịch thủy phân thu được có hàm lượng nitơ tổng 17.76 +0.202 g/L, hàm lượng amoniac 0.273 + 0.01 g/L, hàm lượng acid amin tự do là 30.166mg/g Sản phẩm thủy phân với Alacalase tiếp tục được thủy phân với Flavourzymenhăm thu dịch thủy phân giàu acid amin tự do và các peptide ngắn Điều kiện thủyphân với Flavourzyme là: ty lệ enzyme/co chất 0.204 AU/g, pH 6.5, nhiệt độ 45°C, thờigian 210 phút Sản phẩm thủy phân với quy trình này có hàm lượng nitơ tổng là 18.497+ 0.369 g/L, hàm lượng ammoniac là 0.474 + 0.012 g/L, và hàm lượng acid amin tự do102.527 mg/g Dịch thủy phân thu được bao gồm các peptide có khối lượng phân tử 35kDa và dưới 10 kDa.

In this work, we focused on process of wheat gluten hydrolyzed utilizingenzymes Alcalase and Flavourzyme to enrich peptides and acids amine Proteinconcentration of wheat gluten is 75.7%, including glutenins and gliadins molecular arerange from 52 to/0 kDa and from 30 to 38 kDa, respectively In addition, glutenincontain low molecular weight subunits fluctuating between 12 and 15 kDa Theparameters of hydrolysis using Alcalase and Flavourzyme were determined Pre-hydrolysis process was carried out by enzymes Alcalase, an endo-protease At theoptimal of enzyme Alcalase concentration of 0.116 AU/g, temperature of 60°C, pH of8.0 and hydrolysis time of 120 minutes, hydrolyzate reached total nitrogen content of17.76 + 0.202 g/L, ammonia content of 0.273 + 0.01 g/L and free acid amine content of30.166 mg/g Product was continued to hydrolyze by Flavourzyme to obtain free acidamine and smaller peptides The optimal parameters of hydrolysis using Flavourzyme

were enzyme concentration of 0.204 AU/g, pH of 6.5, temperature of 45°C and

hydrolysis time of 210 minutes Total nitrogen, ammonia and free acid amine contentof product were 18.497 + 0.369 g/L, 0.474 + 0.012 g/L and 102.527 mg/g, respectively.The final product presented peptides whose molecular weight is 35 kDa and less than

10 kDa.

iil

LỜI CAM ĐOAN

Tác giả xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của bản thân tác giả Các kếtquả nghiên cứu và các kết luận trong luận án nảy là trung thực, và không sao chép từbat kỳ một nguồn nào và dưới bat kỳ hình thức nào Việc tham khảo các nguồn tài liệuđã được thực hiện trích dẫn và ghi nguồn tài liệu tham khảo đúng theo yêu cau

Tác giả luận ánHồ Hồng Tuyết

MỤC LỤC

TÓM TAT DE TAL 52252222222 H2 ii989 )/09097 90001 ivMUC LUC VDANH MUC BANG 0 ixDANH MUC HINH 2 XDANH MỤC TU VIET TẮTT - 5 tt 5% E331 E9 31128 1E 918151 11 gen gkei xiiGIGI 2010 |CHUONG 1 TONG QUAN - - c1 1 1T 11111 11111111511151511 1101011111 Tk HH 31.1 Thanh phan gluten lúa mi ¿<< E6 SE k‡E£E#E#ESESESEEEEEEEEEEEEEkEkrkrkrkrrrree 31.1.1 Giới thiệu chung về gluten lúa mì + ¿5£ + 2£ +E£E+E+Ez£ezerereererered 31.1.2 Thành phan protein trong lúa mì - + 2 55£+E+E£E£E£E+EzEEErkrerrererered 41.2 Tính chất dich gluten lúa mì sau thủy phân và ứng dụng trong thực pham 61.2.1 Tinh chất dịch gluten lúa mì sau thủy phân ¿-5- - 2 2 s+s+s+sz£ecszs¿ 61.2.2 Ung dụng dich đạm thủy phân - 5+ 2 252 E+EE2£E£E£E£EzEEErErerrererered 913 Cac phương pháp thủy phân prOf€IT 555 111 1 9 111 he 101.3.1 Phương pháp sinh hỌC - - << 1900010 ng 101.3.2 Phương pháp kết hợpp - - + + 56k SE SE2E£E9 E1 1211515151111 71 15111, 1]14 Giới thiệu về enzyme protease Alcalase và Flavourzyme -s 121.4.1 Enzyme Alcalase G G ng nọ 121.4.2 Enzyme FÏaVOUTZVIT€ G00 141.5 Một số nghiên cứu trong va ngoài nước về quá trình thủy phân gluten 14CHƯƠNG 2 NGUYEN VAT LIEU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 17

2.1 Nguyên vật liệu và hóa chất c csccctsrxisrirttrrrrrrrrrirrrrrrirrrrrrerriee 17

DAA Gluten 10a mÌì - - - - + - G + s90 0000 380938090009 38093009 009 0093 10 90v vn vn sa 172.1.2 Enzyme Alcalase và FlavourZyme -G SH ngư 172.1.3 HOa na 192.2 Dụng cụ và thiét bị 5-56 5c 1 1E E123 1511111111111 1111101111111 11 01111111 cv 192.3 Noi dung va phương pháp nghiÊn CỨU - 311111999 311 re 202.3.1 Nội dung nghiÊn CỨU - - ( ( < S1 900010 ngờ 202.3.2 Bố trí thí nghiệm - + 25656 EE9 SE SE 19151511 21111115 1111111151111 212.3.3 Phương pháp phân tÍch: - (<< <1 111139001011 9 ngư 3224 Phương pháp xử lý kết quả thí nghiệm + 2 25 +52 2££+E+E+£z£cszereee 33CHUONG 3 KET QUÁ VA BAN LUẬN «<< 1333k re rereg 343.1 Cac thơng số cơ bản của nguyên vật liệu dùng trong thí nghiệm 34

3.1.1 Khảo sát hoạt tinh enzyme - ngư 343.1.2 Khao sát thành phần nguyên liệu + ¿22 + 2 2 £2+E£E+E£££EzEzEzeerersred 353.2 Nghiên cứu các yếu tơ ảnh hưởng đến quá trình thủy phân gluten lúa mì vớiENZYME A [CaÌÏ2ASG - cọ ọ k 363.2.1 Khảo sát ảnh hưởng của tỷ lệ enzyme/cơ chất đến quá trình thủy phân vớiENZYME ẠCaÏaAS€- - - -G G0 TH nọ 363.2.1.1 Khảo sát ảnh hưởng của tỷ lệ enzyme/co chất đến mức độ thủy phân 363.2.1.2 Khảo sát ảnh hưởng của tỷ lệ E/S đến hàm lượng protein hịa tan 383.2.2 Khao sát anh hưởng cua nhiệt độ lên quá trình thủy phân với enzyme2e 0 ea 403.2.2.1 Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ đến DH - 25-5 c55s5s252 403.2.2.2 Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ đến hàm lượng protein hịa tan 433.2.3 Khảo sát ảnh hưởng của pH đến quá trình thủy phân với enzyme Alcalase 453.2.3.1 Khảo sát ảnh hưởng của pH đến DH - 225 52 2£2+£££+£z£scscxd 453.2.3.2 Ảnh hưởng của pH đến hàm lượng protein hịa tan -.- 5-5552 473.2.4 Khao sát ảnh hưởng thời gian đến quá trình thủy phân với enzyme Alcalase

3.24.1 Khảo sát mức độ thủy phan theo thời Ø1an «55555 << exseesss 493.2.4.2 Khảo sát hàm lượng protein hịa tan theo thời ø1an -««- 503.3 Nghiên cứu các yếu tổ ảnh hưởng đến quá trình thủy phân protein vớiFlavourzyme sau khi xử lý với ACaÏaSG - << 9n ngờ 523.3.1 Khảo sát ảnh hưởng của ty lệ enzyme Flavourzyme/co chất 523.3.1.1 Khảo sát ảnh hưởng của ty lệ enzyme Flavourzyme/co chất đến hàm lượng

3.3.1.2 Khảo sát ảnh hưởng của ty lệ enzyme Flavourzyme/cơ chất đến DH 533.3.2 Khao sát ảnh hưởng của nhiệt độ đến quá trình thủy phân với enzymeFIAVOULZYME -G G0 Họ TH Họ 563.3.2.1 Khao sát ảnh hưởng của nhiệt độ đến hàm lượng aa ««- 563.3.2.2 Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ đến DH - 5-5-5 sec: 593.3.3 Khảo sát ảnh hưởng của pH đến quá trình thủy phân với enzymeFIAVOULZYME -G G0 Họ TH Họ 603.3.3.1 Khảo sát ảnh hưởng của pH đến hàm lượng aa - 5 2 5 55c: 603.3.3.2 Khảo sát anh hưởng của pH đến DH - 2255 2 2£2+E££+£z£cscsd 623.3.4 Khao sát ảnh hưởng của thời gian đến quá trình thủy phân với enzymeFIAVOULZYME -G G0 Họ TH Họ 643.3.4.1 Khảo sát ảnh hưởng của thời gian đến hàm lượng aa -. - 643.3.4.2 Khảo sát anh hưởng của thời gian đến DH - 2 2 55555+csc<£scs2 653.4 _ Phân tích thành phan dịch thủy phân - - + 255 +2 2££+E+E+£z££szszeeẻ 673.4.1 Ham lượng nito tổng và amoniac trong dịch thủy phân -. - 67342 Kết quả phân tích khối lượng phân tử của dịch thủy phân va nguyên liệu 683.43 Kết quả phân tích thành phan acid amin tự do băng HPLC 69CHƯƠNG 4 KẾT LUẬN - - - + + SE E333 E3 11111515115 515 11111111111 re 724.1 KẾt luận CS t1 S11 1 1511111111111 111111111111 0101 01.01010111 Hy 72AQ Kiến nghị 5 5c St 1 S11 111 1111111101 1111010111 111101 0111201011111 Hy 74

Vil

Vili

DANH MỤC BANG

Bảng 1 2 Hàm lượng protein và hàm lượng protein hòa tan khi thủy phân bằng cácenzyme khác nhau - - -< s E0 119301090 kh 10Bảng 2 1 Thanh phan gluten lúa mi do nha sản xuất cung cấp - 5-55: 17Bang 2 2 Các đặc tinh của enzyme Alcalase do nhà sản xuất cung cấp 18Bảng 2 3 Các đặc tinh của enzyme Flavourzyme do nha sản xuất cung cấp 18Bảng 3 1 Hoạt tính enzyme Alcalase và Flavourzyme -««««sssssssssss 34Bảng 3 2 Thành phan nguyên liệu gluten lúa mì - ¿2-2 + 2 2+2+s+£+£z£z£ezxzescze 35Bảng 3 3 Hàm lượng Nito tong và amoniac trong dịch thủy phân - 67Bang 3 4 Thanh phan aicd amin tự do trong dịch thủy phân - - - 5: 69

IX

DANH MỤC HINH

Hình 1 1 Kích thước hat protein trong mang gluten ở trạng thai tự do (a) và kéo căng2 6Hình 1.2 Mức độ thủy phân của gluten theo thời gian với các enzyme khác nhau 11Hình 1 3 Cơ chế phản ứng thủy phân cơ chất protein của Substilisin Carlsberge 14Hình 2 1 Nội dung nghiÊn CỨU (<< 1 399991001011 ngờ 20Hình 2 2 Sơ đồ tiễn hành thủy phân gluten bằng enzyme A lcalase -. - 21Hình 2 3 So dé khảo sát ảnh hưởng ty lệ E/S đến quá trình thủy phân bang Alcalase 23Hình 2 4 Sơ đồ khảo sát ảnh hưởng nhiệt độ đến quá trình thủy phân bằng Alcalase.24Hình 2 5 Sơ đồ khảo sát ảnh hưởng pH đến quá trình thủy phân bang Alcalase 25Hình 2 6 Sơ đồ khảo sát ảnh hưởng thời gian đến quá trình thủy phân bằng Alcalase26Hình 2 7 Sơ đồ thủy phân bang enzyme Flavourzyme cĩ tiền xử lý Alealase 27Hình 2 8 Sơ đồ khảo sát ảnh hưởng của tỷ lệ E/S đến quá trình thủy phân bangFlavourzyme sau khi xử lý AlcaÏase Ăn ni 29Hình 2 9 So dé khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ đến quá trình thủy phân bằngFlavourzyme sau khi xử lý AlcaÏase Ăn ni 29Hình 2 10 Sơ đồ khảo sát ảnh hưởng của pH đến quá trình thủy phân băngFlavourzyme sau khi xử lý AlcaÏase Ăn ni 30Hình 2 11 Sơ đồ khảo sát ảnh hưởng của thời gian đến quá trình thủy phân bằngFlavourzyme sau khi xử lý AlcaÏase Ăn ni 3lHình 3 1 Đồ thị biểu diễn mức độ thủy phân của gluten theo thời gian ở các tỷ lệ E/S41a: 07 36Hình 3 2 Mức độ thủy phân sau 120 phút với các ty lệ E/S khác nhau 37Hình 3 3 Hàm lượng protein hịa tan của dịch gluten sau thủy phân ở các nồng độenzyme khác nhau theo thời Qian - - << 1101320000101 ng vn 38Hình 3 4 Hàm lượng protein hịa tan sau 120 phút với các nồng độ enzyme khác nhau

Hình 3 5 Đồ thị biểu diễn mức độ thủy phân theo thời gian ở các nhiệt độ khác nhau41

Hình 3 6 Mức độ thủy phân sau 120 phút ở các nhiệt độ khác nhau 42Hình 3 7 Đồ thị biéu diễn hàm lượng protein hòa tan theo thời gian ở các nhiệt độ41a: 07 43Hình 3 8 Hàm lượng protein hòa tan sau 120 phút ở các gia tri nhiệt độ khác nhau 4⁄4Hình 3 9 Đồ thị biểu diễn mức độ thủy phân theo thời gian ở các giá trị pH khác nhau

¬- 45Hình 3 10 Mức độ thủy phân tại các pH khác nhau - «55555 << keeseesss 46Hình 3 11 Đồ thị biểu diễn hàm lượng protein hòa tan ở các pH khác nhau theo thời20 ố 47Hình 3 12 Ham lượng protein hòa tan ở các pH khác nhau - «5555 <<+ 46Hình 3 13 Đồ thị biéu diễn mức độ thủy phân theo thời gian - - - 5: 49Hình 3 15 Đồ thị biéu diễn ảnh hưởng của tỷ lệ E/S đến ham lượng aa theo thời gian52Hình 3 16 Hàm lượng aa sau 180 phút theo các nồng độ enzyme khác nhau 53Hình 3 17 Đồ thị biéu diễn ảnh hưởng của tỷ lệ E/S đến DH owen 54Hình 3 18 Mức độ thủy phân sau 180 phút theo các nồng độ enzyme khác nhau 54Hình 3 19 Đồ thị biéu diễn ảnh hưởng của nhiệt độ đến hàm lượng aa theo thời gian57Hình 3 20 Hàm lượng aa sau 180 phút theo các nhiệt độ khác nhau 58Hình 3 21 Đồ thị biéu diễn ảnh hưởng của nhiệt độ đến DH eee 59Hình 3 22 Mức độ thủy phansau 180 phút tại các nhiệt độ khác nhau 60Hình 3 23 Đồ thị biéu diễn ảnh hưởng của pH đến hàm lượng aa theo thời gian 61Hình 3 24 Hàm lượng aa sau 180 phút tại các giá tri pH khác nhau - 62Hình 3 25 Đồ thị biéu diễn ảnh hưởng của pH đến DH - 2 255552252: 62Hình 3 26 Mức độ thủy phan sau 180 phút tại các pH khác nhau - 63Hình 3 27 Đồ thị biéu diễn ảnh hưởng của thời gian đến hàm lượng aa 64Hình 3 28 Đồ thị biéu diễn ảnh hưởng của thời gian lên mức độ thủy phân 66Hình 3 29 Khối lượng phân tử của gluten (NL), dịch thủy phân Alcalase 2h, dịch thủyphân với Alcalase 3h, dịch thủy phân với Alcalase và Flavourzyme(A-L) 68

xi

DANH MỤC TU VIET TAT

WGH: Wheat gluten hydrolysates : dịch thủy phan gluten lúa miWG: Wheat gluten: gluten lúa mì

DH: Degree hydrolysis: mức độ thủy phanaa: Acid amin

EAI: Emulsification activity index: chỉ số tao nhũE/S: Enzyme/substract : ty lệ enzyme/co chatACE: Angiotensin-converting enzyme : chat ức chế men chuyểnUF: Ultrafiltration — Siêu lọc

AU: Anson unit: đơn vi AnsonADG: acetic deamide gluten: deamide gluten bang acid aceticHDG: acid clohydric deamide gluten: deamide gluten bằng acid HCIAla: Alanine

Arg : ArginineAsp: Aspartic acidCys: CysteinGlu: GlutamicGln: GlutamineHis: HistidineIle: Iso-leucineLeu: LeucineLys: LysineMet: MethioninePhe: PhenylalaninePro: Proline

Ser: SerineThr: ThreonineTyr: TyrosineVal: ValineTry: Tryptophan

xili

GIỚI THIỆU

Gluten là protein lúa mì được tách ra trong quá trình sản xuất bột mì Hiện nay,gluten lúa mì được sử dụng chủ yếu dé làm tăng độ dai, đàn hồi của khối bột nhào khisản xuất bánh mì và giúp tao cau trúc cho các sản phẩm thực phâm như xúc xích, thứcăn cho vật nuôi Tuy nhiên, một số người không thé sử dụng được các sản phẩm cóchứa gluten bởi vi gluten gây ra triệu chứng dị ứng gọi là bệnh Celiac, hệ đề khángtrong cơ thé người bệnh sé chống lại chất đạm trong lúa mì và các loại ngũ cốc khác.Gluten chứa day đủ các acid amin trong đó có cả các acid amin không thay thế, ngoàira trong gluten còn chứa lượng lớn acid glutamic, một acid amin góp phan tạo nên viumami cho dịch đạm Là một nguồn thực phẩm tốt, có giá trị dinh dưỡng cao, nhưngứng dụng của gluten lúa mì bị hạn chế bởi khả năng hòa tan kém của nó

Nhiều nghiên cứu tập trung vào các phương pháp hóa học hoặc enzyme để thủyphân gluten lúa mì nhằm tăng cường độ hòa tan, tạo bọt và tăng tính chất nhũ hóa Cóthé thủy phân gluten bằng xúc tác vô cơ, nhưng nhược điểm là tạo nhiều sản phẩmkhông có lợi cho sức khỏe Khi thủy phân bằng HCI không điều khiển được quá trìnhthủy phân, HCI kết hợp với chất béo trong nguyên liệu tạo thành hợp chất tiền ung thư:mono-dichloropropanols, monocholoropropanols (Nagodawithana, 1994) Quá trìnhthủy phân bằng NaOH phá hủy một số acid amin thiết yếu như tryptophan, serine,cysteine (Hall, 1992) Phương pháp thủy phân bằng enzyme thé hiện nhiều ưu điểmhơn so với thủy phân băng phương pháp hóa học: quá trình thủy phân không đòi hỏicác điều kiện nhiệt độ và áp suất cao như thủy phân bằng phương pháp hóa học, sảnphẩm thủy phân chứa nhiều acid amin cần thiết cho cơ thể Ngoai ra, phản ứng thủyphân bang enzyme có tính đặc hiệu cao, sản phẩm thu được có độ tinh khiết cao Tuynhiên, quá trình thủy phân bằng enzyme cần thời gian kéo dài hơn so với quá trình thủyphân bằng phương pháp hóa học

Dịch thủy phân có nhiều ứng dụng khác nhau: b6 sung vao thực phẩm, làm phụgia, làm gia vị Hiện nay, natriglutamate được sử dụng như chất tạo vị bằng con đườnglên men, tuy nhiên người tiêu dùng mong muôn sử dụng sản phâm gia vi có nguôn gôc

tự nhiên Ở Nhật nhiều sản phẩm thủy phân có nguồn gốc tự nhiên như: dịch thủy phântừ thực vật, cá, chất chiết nam men đã được nghiên cứu (Ueda Y, 1997) Hedwig vàAmado (2002) cũng cho rằng các peptide từ protein thực vật như: lúa mì, bắp, đậunành khi thủy phân bang enzyme chứa nhiều acid glutamic và acid pyroglutamic tạo vịumami cho sản phẩm Chất lượng dịch thủy phân được cải thiện là do thành phânamino acid, các peptide nhỏ, muôi và các hợp chât hữu cơ dê bay hơi.

Thông qua các tài liệu tham khảo thì Alcalase là enzyme cho hiệu quả thủy phâncao nhất Tuy nhiên Alcalase khi thủy phân tạo ra các peptide mạch ngăn trong đó cónhiều peptide ky nước tạo vị đắng cho sản phẩm Một phương pháp nhằm giảm vị đắngnay là sử dụng kết hợp exo-peptidase Trong số các exo-peptidase thì Flavourzyme làenzyme thủy phan các peptide tai vi trí N-, tao ra các acid amin tự do va peptide machngăn hơn, tăng chất lượng dich thủy phân va cơ thé dé hấp thu hơn Vi vay trong luậnvăn này chúng tôi tập trung nghiên cứu thủy phân gluten lúa mì bằng enzyme Alcalasevà Flavourzyme với các nội dung như sau:

e Khảo sát quá trình thủy phân gluten lúa mì bằng enzyme Alcalasee Khảo sát quá trình thủy phân gluten lúa mì bang enzyme Flavourzyme

sau khi xử lý với enzyme Alcalase.Chúng tôi hy vọng kết quả nghiên cứu sẽ thu hút nhiều sự quan tâm, dịch thủyphân thu được có nhiều ứng dụng nhằm nâng cao giá trị sử dụng của gluten

CHUONG 1 TONG QUAN

1.1 Thanh phan gluten lúa mì

1.1.1 Giới thiệu chung về gluten lúa mìProtein của lúa mì được chia làm bốn loại: albumin, globulin, gliadin, vàglutenin Trong đó albumin va globulin chiếm khoảng 20%, gliadin va glutenin chiếmkhoảng 80% (ty lệ của hai loại protein nay xấp xi nhau) Thành phan chất khô củagluten lúa mì dao động từ 60-85% protein, 5-10% lipid, phần còn lại là tinh bột và cáccarbohydrates khác Gluten lúa mì chứa khoảng 20 loại acid amin, các acid amin khôngthay thế đều có trong thành phần lúa mì, đặc biệt nỗi bật với hàm lượng acid glutamic,glutamine va proline cao, ham lượng các acid amin chứa nhóm tích điện thap.

Ở pH = 7.0 các protein của gluten ít tích điện Ham lượng glutamine cao hìnhthành nhiều liên kết hydro giữa các chuỗi peptide với nhau hoặc với phân tử nước dođó tạo cho gluten có tính nhớt cao Hàm lượng các acid amin ưa béo tham gia vào cautrúc bậc 4 của glutenin và liên kết với lipid Hàm lượng prolin rất cao (10-15%) đặcbiệt là gliadin cũng ảnh hưởng đến cấu trúc bậc 2 của protein gồm xoắn a và xếp B, cácgốc cystine vượt xa các gốc cystein chứng tỏ có liên kết disulfua trong liên kếtprotein.Trong gluten lúa mì có khoảng 20 aa trong đó các aa không thay thế đều cótrong thành phần gluten lúa mi (Clodualdo và cộng su, 1994)

Khi tiến hành thủy phân gluten lúa mì và các phân đoạn protein Glutenin vàGliadin bang HCI 6M trong 24h ở 110°C, sau đó cô đặc dịch thu được và tiến hànhphân tích HPAEC-IPAD thu được thành phần acid amin như sau:

Bảng 1 1 Thành phan amino acid trong gluten lúa mì khi thủy phân bằng HCI 6M

trong 24h ở 110°C (Ine Rombouts, 2009)

Gluten Glutenin Gliadin(mol %) (umol/g) (mol %) (umol/g) (mol %) (umol/g)Ala 3.5 270 4.1 315 3.0 225

Arg 3.2 245 3.1 240 2.9 215Asx 2.8 215 3.2 250 2.3 170

Cys 2.2 170 1.9 150 24 180

Glx 31.9 2450 28.1 2180 33.8 2510

Gly 534 420 72 560 2.9 215

His 1.7 130 1.7 135 1.7 125Ile 4.1 315 4.0 305 4.7 345

Leu 72 550 71 550 78 580Lys 1.4 110 2.0 155 0.6 45Met 1.3 100 1.4 105 1.2 90

Phe 44 335 4.0 310 5.1 380Pro 14.1 1080 124 965 17.1 1270

Ser 5.7 440 8.0 620 4.3 320

Thr 2.8 215 3.3 255 2.3 170Tyr 2.8 220 3.1 235 2.6 195Val 534 415 5.5 425 3.3 395

Gliadin1.1.2 Thanh phan protein trong lúa mi

a- gliadin là tên gọi riêng của prolamin lúa mi Trong lúa mì có 2 prolamin chính:- Gliadin ơ,B, y có phân tử lượng 30000-45000 Da

- Gliadin œ có phân tử lượng nam giữa 60000-80000 Da- Cac gliadin của lúa mì có tính đa hình lớn, ở dạng đơn chuỗi Dựa vào sự phân

bô các acid amin ở dau tận cùng N- của các gliadin a, B, y thì 30 acid amin daucủa chúng rất giống nhau trong đó có 20 acid amin dau tiên tạo thành peptide có

tín hiệu ưa béo Peptide này có gốc lysine ở gan cuối N, tiếp đó là các acid aminưa béo và cuối cùng là gốc alanine nối với protein Các gliadin œ có hàm lượngglutamine và prolin rất cao Phan lớn các gốc glutamine đều dưới dạng amide.Gliadin œ có chứa hoặc không chứa các acid amin có S do đó trong phân tửkhông có cầu disulfua Các gliadin a, B, y còn có một số câu disufua trong phântử do đó làm cho cấu trúc bậc 3 chặt và bên.

e GluteninCác glutenin có xu hướng tự liên kết với nhau bang các tương tác ưa béo, bang liênkết hydro và câu disulfua lớn hơn so với gliadin Các glutenin còn có tính đa hìnhmạnh mẽ Khi phá hủy cau disulfua giữa các phân tử người ta thu được 25 tiểu donvị glutenin Chia thành 3 kiểu:

- _ Tiểu đơn vị kiểu A : không hoàn tan trong etanol, có khối lượng phân tử thấp(10000-70000 Da) và rất giàu các acid amin có tính bazo

- _ Tiểu đơn vị kiểu B không hoàn tan trong ethanol nhưng có khối lượng phân tửcao (60000-1400000 Da) giàu glycine, proline và glutamine, nghèo cystine ty lệxoăn ơ trong phân tử thấp

- Tiểu đơn vị kiểu C hoàn tan trong ethanol có phân tử 35000-45000.Các tiêu đơn vi liên hợp với nhau bang câu hydro, tương tác ưa béo, disulfua Khi

các tiêu đơn vị liên hợp lại tạo thành các sợi O trạng thái ngậm nước, các glutenin

tạo ra một khuôn hoặc màng mỏng chac, đàn hôi, có tính cô kêt cao, chịu kéo căng.(J.A.Bietz va cộng sự, 1970) (J.H.Woychik và cộng sự, 1961).

Hình 1 1 Kích thước hạt protein trong mang gluten ở trang thái tự do (a) và kéo căng

(b) (J.H.Woychik và cộng sự, 1961)1.2 Tinh chất dịch gluten lúa mì sau thủy phân và ứng dụng trong thực phẩm

1.2.1 Tinh chất dich gluten lúa mì sau thủy phânKha năng hoa tan trong HƯỚC

Alder Nissen (1986) cho rang sự gia tang độ tan cua dịch thủy phân so vớiprotein ban đầu là do việc giảm cấu trúc bậc hai và do enzyme giải phóng polypeptidengăn hơn từ protein Chobert và cộng sự (1988) cho răng khi thủy phân protein có bathay đối cơ bản: tăng số lượng nhóm phân cực, làm tăng tinh ưa nước sản phẩm, giảmkhối lượng phân tử, và thay đối cấu tao phân tử Sau khi thủy phân, mối liên kết thứcấp trong protein gluten lúa mì bị phá hủy làm suy yếu sự gắn kết và sức bám dính củamang gluten làm tăng khả năng hòa tan.

Jinshui Wang và cộng sự (2006) tiễn hành thủy phân gluten (DH = 2.8%) sau đótiến hành lọc UF phân tách các phân đoạn peptide với khối lượng phân tử khác nhau:100, 50, 20 kDa Các phân đoạn thủy phân có độ hòa tan cao hơn so với gluten lúa mivà dịch thủy phân ban đầu tại tất cả các giá trị pH

Kha năng tạo nhũ

Theo Jinshui wang và cộng sự (2006) thì khả năng tạo nhũ (EAI) của các phânđoạn peptide phụ thuộc vào giá trị pH EAT của gluten lúa mì giảm trong môi trườngpH trung tính, nhưng tăng trong môi trường có tính acid và kiểm Theo Chiai và cộngsự (1982) EAI thấp nhất có thé tương ứng với điểm đăng điện của protein Ngoài rakhả năng 6n định nhũ tương của dịch thủy phân gluten lúa mì và các phan phân đoạnpeptide tại các giá trị pH acid và kiềm cao hơn so với khi ở pH 7.0 (Yves Popineau,Blandine Huchel, 2002).

Khả năng tạo bọt

Protein là những tác nhân tạo bọt tốt, chúng nhanh chóng khuếch tán đến bề mặt

không khí-nước Sự tạo bọt tương ứng với số lượng amino acid ky nước tiếp xúc trênbề mặt của phân tử protein (Damodaran, 1990) Sự phân tán protein làm giảm sức căngbề mặt tại bề mặt nước/không khí, do đó tạo ra khả năng tạo bọt (Turgeon và cộng sự,

1992).

XiangZhen Kong (2007) cho răng khi thủy phân có giới hạn làm tăng số lượngcác mach polypeptide giúp tăng hoạt động bề mặt, giúp nhiều khí được giữ lại hơn, khảnăng tạo bọt tăng Khi mức độ thủy phân tăng lên (DH 10% và 15%), khả năng tạo botgiảm, điều đó được giải thích do sự tạo thành các mạch peptide ngắn làm giảm hoạtđộng bề mat

Tinh chất chong oxy hóa

Gluten lúa mì có ái lực mạnh với dầu và các chất không phân cực khác, glutenthủy phân sẽ có tác dụng chống lại sự oxy hóa của acid béo Kunio Stuetsuna và cộngsự (2002) phân tách các peptide thu được khi thủy phan gluten với enzyme trích ly từdạ dày heo với cột Saphadex G25, kết quả là phân đoạn có M = 5400-8000 Da có khảnăng chồng oxy hóa mạnh hon tocopherol với thời giam cảm ứng 7.5 ngày

Theo Kexue Zhu và cộng sự (2006), dịch thủy phân gluten bằng Alcalase cómột số peptide có khả năng chống oxy hóa Các peptide này gồm 5-16 amino acid, baogôm cả các acid amin ky nước, Val hoặc Leu, tại các vi trí N-, và Pro, Tyr va His.

Chen và cộng sự (1998) cho rằng histidine N- có khả năng chống oxy hóa cao hơn cácpeptide Ngoài ra, các acid amin, chắng hạn như Tyr, Met, His, Lys, và Trp, thườngđược xem như là chất chống oxy hóa.

Tạo vị cho umami cho dich thủy phan

Noguch và cộng sự (1975) cho răng protein thực vật thủy phân được sử dụnglàm gia vi cho thực phẩm vì sản phẩm thủy phan tạo hương vị "umami" giống nhưglutamate Hedwig Schlichtherle-Cenny và Renato Amado (2002) tiễn hành thủy phângluten lúa mì băng 3 phương pháp khác nhau: WGH-1 được thủy phân chi sử dungprotease Flavourzyme WGH-2 bồ sung glutaminase để xúc tác cho sự chuyển đổiglutamine sinh ra thành acid glutamic tự do WGH-3 được xử ly HCI trước khi thủyphân dé chuyển đổi protein- glutamine thành axit glutamic- protein Kết quả thu được,WGH-1 chứa nỗng độ cao của glutamine tự do 5.7% và chỉ có rất ít acid glutamic tự do0.8% Mặt khác, WGH-2 glutamine tự do 0.6%, acid glutamic tự do 7.6% Nong doacid glutamine va glutamic trong WGH-3 la 3.5 va 2.5% Theo cac tac gia nay, dichWGH-3 là ít đắng nhất và cho vị giống umami nhất Trong dịch thủy phân ngoai acidglutamic, thì các acid hữu co cũng góp phan tạo hương vị cho dịch thủy phân Bốnpeptide pyroglutamyl được xác định: pGlu-Pro-Ser, pGlu-Pro, pGlu-Pro-Glu, và pGlu-Pro-Gln cho vị giỗng như umami

Seung Hyun Koo và cộng sự (2011) tiến hành thủy phân gluten với 3 loạienzyme khác nhau: Alcalase, Flavourzyme, Protamex Tiến hành đánh giá cảm quanthì dịch thủy phân với Alcalase đắng nhất Còn Flavourzyme và Protamex khi tăngmức độ thủy phân thì tăng vị dang va vị umami không bị ảnh hưởng Ngoài ra dichthủy phân bằng Alcalase sau 24h còn có hoạt tính chống oxy hóa cao

Hoạt tinh opioid

Peptide có hoạt tinh opioid (an thần, giảm dau) bắt nguồn từ các protein thựcvật Ngoài protein sữa, gluten lúa mì là nguồn giàu các peptide opioid (exorphins).Theo Anne Pihlanto và cộng sự (2003) các enzyme như Pepsin, Trypsin, Chymotrypsin

thủy phan gluten cho ra các peptide như: Gly-Pro-Thr (exorphin A5), Gly-Gly-Trp-Leu (Exorphin B5) và Tyr-Pro-Ile-Ser-Leu (exorphin C).

Tyr-Xiang và cộng sự (2008) tiến hành thủy phân gluten bằng các enzyme khácnhau: Alcalase, Pancreatin, Pepsin, Protamex, Neutrase, Flavourzyme Các dịch thủyphân thu được với Protamex và Neutrase không có hoạt tính opioid WGHs thu đượcvới Alcalase và Pepsin cho thấy hoạt tính opioid tăng khi tăng thời gian thủy phân, đặcbiệt là Alcalase thủy phan 6h va pepsin thủy phan 24h với giá trị [C59 là 1.21 + 0.25 và1.57 + 0.21 mg protein/mL Các tác giả cũng lọc tách các phân đoạn trong dịch thủyphân băng màng UF và xác định được hoạt tính opioid tập trung ở các peptide có phântử lượng < 3 kDa.

1.2.2 Ung dụng dịch đạm thủy phânHiện nay ứng dung gluten lúa mì rất hạn chế như làm phụ gia trong quá trìnhsản xuất xúc xích, bánh mì Gluten lúa mì thủy phân cho các hỗn hợp peptide có khảnăng hòa tan cao va thay đôi kha năng tạo bot và nhũ hóa Các tính chất này phụ thuộcđặc điểm, tùy thuộc vào mức độ thủy phân Ngoài mục đích thủy phân gluten lúa mìnhằm cải thiện các tính chất chức năng mà protein lúa mì không có thì một số nghiên

cứu còn hướng đến việc tạo ra peptide phân tử thấp Theo Gonzalez-Tello (1994)

peptide này có lợi thé là được hap thụ trong ruột và có tác dụng gây dị ứng thấp

Theo các nghiên cứu thì dịch thủy phân có những tính chất công nghệ như tạobọt, tạo nhũ có thể dùng làm phụ gia tạo bọt Ngoài ra, dịch thủy phân với hàm lượngđạm cao và các peptide mạch ngăn có thê được sử dụng làm gia vi, làm nước cham.

Trong dịch thủy phân chứa các peptide có khả năng chống oxy hóa chất béo Dođó có thé sử dụng dich hydrolysates gluten lúa mì làm chất chống oxy hóa tự nhiênthay thé cho các chất chống oxy hóa tổng hợp như BHA, BHT Các peptide trongdịch thủy phân còn có hoạt tính sinh học như: an thần, giảm đau, ức chế ACE

13 Các phương pháp thuy phan protein

1.3.1 Phương phap sinh họcXiang va cộng sự (2007) tiễn hành thủy phan gluten lúa mì với sáu loại enzymekhác nhau Tốc độ thủy phân gluten lúa mì với Alcalase, Trypsin, Pancreatin, Neutrasevà Protamex tăng nhanh trong 30 phút đầu tiên và sau đó tăng chậm Alcalase cho DHcao nhât và hiệu quả hơn so với những enzyme khác.

Hiệu suất thủy phân protein bằng các enzym khác nhau đã được đưa ra trongbảng 1.2 Mặc dù có nhiều yếu tố ảnh hưởng đến hiệu suất thủy phân, loại enzymeđược sử dụng có ảnh hưởng đáng kế đến hiệu suất và tinh chất của sản phẩm cudicùng.

Bảng 1 2 Hàm lượng protein và hàm lượng protein hòa tan khi thủy phân bằng các

enzyme khác nhau (Xiang và cộng sự, 2007)

Dịch thủy phan gluten | Hàm lượng protein (3%) Hàm lượng on hỏa tan

Alcalase 2.4L 79.7 +0.73 $1.3+0.13PTN 6.0S 80.9 + 0.28 42.5 + 0.68

Hình 1 2 Mic độ thủy phân cua gluten theo thời gian với các enzyme khác nhau

(Xiang và cộng sự, 2007)Các tác giả cho rằng sự gia tăng độ tan của dịch thủy phân so với protein bandau là do việc giảm cau trúc thứ cấp và cũng do enzyme thủy phân protein tạo thànhpolypeptide ngắn hon Dịch thủy phân với với Alcalase tạo thành polypeptide có phântử lượng dưới 10 kDa.

1.3.2 Phương pháp kết hợp1.3.2.1 Kết hợp xử lý nhiệt và thủy phân bằng enzyme

Theo Zhang (2012) đã tiễn hành say gluten ở 120°C trong 30 phút, sau đó glutenđược đem thủy phân bằng Alcalase ở 55°C, pH 8.0 Mức độ thủy phân của gluten lúamì đã được cải thiện đáng kế bởi tiền xử lý nhiệt DH đạt 30% sau 1h thủy phân và chothay tăng 10% so với gluten lúa mì không qua xử lý Lượng các peptide có M < 1000Da tăng từ 17.6% lên 30.7% so với với gluten không qua xử lý nhiệt.

Tốc độ thủy phân gluten lúa mì băng Alcalase có thé được tăng tốc bang tiền xửlý nhiệt khô, sản phẩm thu được có nhiễu peptide có phân tử lượng thấp (M < 5000Da) So sánh cau trúc thứ cấp của gluten nguyên liệu va gluten xử lý nhiệt kết qua thuđược số lượng gap nếp j tăng từ 41.5 đến 51.2% và tăng xoắn a từ 24.5 đến 26% và sựbiến mat của các cấu trúc mở rộng Cau trúc mở rộng là những cấu trúc thứ cấp phdbiến như xoắn polyproline và gấp nếp a Tỷ lệ xoăn ơ và gấp nếp B giảm trong glutenqua xử lý nhiệt và chứng tỏ sự biên đôi của câu trúc bậc 2.

Tính ky nước bề mặt (H,) của øluten lúa mì tăng từ 56.7 đến 74.5% sau khi xửlý nhiệt khô Khi protein được gia nhiệt trong dung dịch nước H, giảm chủ yếu là do sựtương tác của nhiệt tiếp xúc với nhóm ky nước trong protein Cùng với sự thay đối cấutrúc thứ cấp, và phá vỡ liên kết disulfua giúp enzym có thé tiếp cận cơ chat

1.3.2.2 Kết hợp xử lý bằng acid và thủy phân bang enzymeYoung Shick Hong và cộng sự (2011) tiễn hành thủy phân gluten lúa mì vớinông độ 6% (w/w) có tiền xử lý acid HCl 0.1N 6 95°C trong 1 giờ và kết hợp vớienzyme Alcalase thủy phân trong 3 giờ Khối lượng phân tử của các phân tử peptidetrong dịch thủy phan lúa mì đã được xác định phù hợp với thời gian xử lý trong quátrình thủy phân Sau 24 giờ thủy phân thì dịch thủy phân chứa polypeptide,oligopeptide và các acid amin tự do với các kích thước khác nhau.

1.4 Giới thiệu về enzyme protease Alcalase và Flavourzyme

1.4.1 Enzyme AlcalaseGiới thiệu

Enzyme Alcalase là loại endo-peptidase thủy phân protein, thuộc loại enzymemột câu tử, được thu nhận băng quá trình lên men bê sâu của loài vi khuân BacillusLicheniformis.

Thanh phan chính trong san phẩm thương mai enzyme Alcalase là SubtilisinCarlsberg (alkaline protease A), một serin protease Trong hệ thống danh pháp phânloại protease, Subtilisin (EC.3.4.21.62) thuộc phân nhánh SB của nhóm serine protease(EC.3.4.21.-) với điểm đặc trưng là chứa đơn phân serine nằm trong trung tâm xúc tácphản ứng của enzyme Subtilisin Carlsberg là một chuỗi polypeptide chứa 274 acidamin, khối lượng phân tử 27300 Da Subtilisin Carlsberg là một enzyme chịu nhiệt, vớinhiệt độ hoạt động tối ưu từ 55°C đến 65°C, hoạt động tốt trong vùng pH kiềm tính từ 7đền 8.5.

Trung tâm hoạt dongTrung tâm hoạt động của Subtilisin Carlsberg bao gồm bộ ba acid amin: serine ởvị trí 221, histidine ở vi trí 64, và aspartic acid ở vi trí 32.

Protease có cấu trúc gấp nếp để các amino acid này có thể tương tác với nhautheo một cách nhất định nhằm thủy phân nhiều cơ chất khác nhau Histidine đóng vaitrò như chất nhận proton, hay một bazơ, nhận nguyên tử H từ nhóm OH cua serine

12

Serine mat đi một proton, sẽ hình thành liên kết mới với nguyên tử C trong nhómcarbonyl của liên kết peptide trong cơ chất Nhóm carboxylic acid trong aspartic acidtích điện âm, giúp ôn định chuỗi điện tích dương cua histidine.

Cơ chế phản ứng thủy phânCơ chế thủy phân protein của Subtilisin Carlsberg được chia thành hai bước:e Bước 1: Phan ứng acyl hóa (là phản ứng thay thế nguyên tử H trong nhóm -OH bang nhóm R-CO-)

Khi một polypeptide di chuyển đến trung tâm hoạt động, nhóm imidazole trongphân tử histidine sẽ lấy đi nguyên tử H trong nhóm -OH của serine, ngay lập tức O7“của serine hình thành liên kết mới với nguyên tử C trong liên kết peptide của cơ chất,dẫn đến liên kết peptide giữa C-N bị phá vỡ Sự phá vỡ liên kết peptide này làm choserine bi acyl hóa bởi nhóm carbonyl của amino acid Nhóm -NH trong liên kết peptideliên kết với nguyên tử H của histidine (nguyên tử H histidine lấy từ serine), hình thànhmột peptide mới.

e Bước 2: Khu acyl hóaKhi có mặt phân tử HO, nguyên tử O trong nhóm -OH của H;O sẽ tan công vàonguyên tử C trong nhóm carbonyl trên ester serine, liên kết giữa C và O của serine bịphá vỡ, hình thành một peptide độc lập Nguyên tử H còn lại của HO sẽ hình thànhliên kết với O của serine, giúp trung tâm hoạt động của enzyme được phục hồi.(DonLon, 2007)

(]Enzyme-Ser Substrate Telrahedral Iransilion slate Acyl-enzyme intermediate

R :

-Ẻ RA Seem peptide Rp

E~EH=0, + Rp- E-CH;-0 E-CHEO Rp-NếH ed_ — i

% |

Base Base Buse

(His) (His) (His)

Các ion Pb*, Cu” và Fe” có tác dụng ức chế enzyme làm giảm hoạt tínhenzyme Flavourzyme, trong khi đó ion Zn” có tác dụng hoạt hóa làm tăng hoạt tínhenzyme lên 84% so với ban dau, các ion Mg””, Ca”*, Mn** không ảnh hưởng đến hoạttinh enzyme (Shie-Jea Lin, 2010)

15 Một số nghiên cứu trong và ngoài nước về quá trình thủy phan gluten

Jin-Shui Wang (2007) thủy phan gluten lúa mì với enzyme papain trong 6h ở

50°C pH 6.5 tỷ lệ E/S là 6000 U/g Dịch thủy phân được vô hoạt sau đó làm lạnh và

tiến hành phân tách protein băng phương pháp siêu lọc với mang UF có kích thước

14

5KDa Kết quả cho thấy dịch thủy phân và phân đoạn UF có chứa một số chất có khảnăng nhường electron và có thé phản ứng với các gốc tự do chuyển đổi chúng sang sảnphẩm 6n định hơn và cham dứt chuỗi phan ứng Theo kết quả nghiên cứu quá trình oxyhóa acid linoleic bị ức chế bởi việc bố sung các sản phẩm thủy phân Trong số ba phânđoạn, phân đoạn trong dòng permeat có khả năng kháng oxy hóa cao nhất gần bằng vớitocopherol Khả năng chống oxy hóa của các peptide phân lập từ protein thủy phân phụthuộc vào trình tự acid amin của mạch peptide trong dịch thủy phân.

Lan Liao và cộng sự (2010) tiến hành thủy phân gluten lúa mì bằng enzymePancreatin với một số biện pháp hỗ trợ Mẫu đối chứng thủy phân băng Pancreatintrong 24h, mẫu ADG tiến hành deamide bằng acid acetic 121°C trong 10 phút, sau đóthủy phân bằng enzyme trong 24h Mẫu HDG tiến hành deamide bằng HCI 121°Ctrong 10 phút sau đó thủy phân bằng enzyme trong 24h Kết quả khảo sát cho thay mẫuđối chứng cho vi đăng mạnh, ít vị umami, có vị mặn Mẫu HDG thì ngọt hơn vẫn có vịmặn, đăng và có hương vị nước sốt thơm, trong khi đó ADG có vị umami mạnh hơn,nhưng chua hơn so với HDG Gluten lúa mì được coi là một nguồn nghèo protein hơncác nguồn động vật va đậu tương vi chứa it acid amin thiết yếu lysine (Lys) Tuy nhiênsau quá trình thủy phân thì hàm lượng này tăng lên Tác giả nhận thấy so với mẫu đốichứng thi hàm lượng lys trong HDG tăng từ 51.96 mg/100g lên 97.47 mg/100g, vớimẫu ADG thì tăng từ 51.96 mg/100g lên 75.88 mg/100g Phân tích khối lượng phân tửtrong dịch thu được thì mẫu đối chứng chứa chủ chủ yếu các peptide có M > 10 KDa,mẫu ADG có M <3 KDa, mau HDG có M <5 kDa

Một nghiên cứu khác của Mondher Mejri và cộng sự (2005) tiễn hành thủy phangluten băng enzyme Neutrase kết hợp với việc bố sung NaCl 0.2%, KCI 0.2%, cysteine0.2% Những anh hưởng của KCI, NaCl va cysteine đến khả năng hòa tan trong nướccủa dịch thủy phân đã được nghiên cứu tại các giá trị pH khác nhau Theo kết quảnghiên cứu tính tan cải thiện 28-30% khi b6 sung KCI và cysteine, trong khi đó NaCl íthiệu qua hơn Kết quả phân tích cau trúc cho thay sự gia tăng tỷ lệ gấp nếp B, giảm cautrúc xoăn a Tác giả giải thích tinh hòa tan cua gluten được cải thiện là nhờ có sự tăng

cường liên kết nước - protein và giảm tương tác protein - protein Thay đôi câu trúcdân dén khả năng tiép xúc tot hơn của các phân tử nước và protein.

Ahmad Asoodeh va cộng sự (2014) tién hanh nghiên cứu các peptide có hoạttính sinh học thu được từ dịch thủy phân gluten Trong nghiên cứu này, profeasetrypsin đã được sử dụng dé thủy phân gluten Hoạt tính ức chế ACE của peptide đượcđo và so sánh với mẫu đối chứng là captopril Kết qua cho thay tất cả các peptide tinhkhiết có hoạt tính ức chế ACE ở các cấp độ khác nhau thay đổi từ 24% đến 94% Haipeptide, IPALLKR (P4) và AQQLAAQLPAMCR (P6), có khả năng ức chế ACE cao.Peptide P4 và P6 tương ứng với các acid amin 102-108 va 791-803 trong trình tự củagluten.

Hoạt tính ức chế ACE ảnh hưởng mạnh mẽ bởi acid amin, thành phân của chuỗipeptide Tripeptide với tryptophan, tyrosine, phenylalanine, proline và acid amin kynước ở vị tri C-terminal cho thay su ức chế ACE cao nhất (Kim và cộng sự, 2012) P4và Pó không chứa dư lượng tryptophan, tyrosine, phenylalanine tuy nhiên, proline vàacid amin ky nước có mặt trong cả hai peptide P4 liên kết với các vị trí ACE tự do,trong khi P6 liên kết với cơ chất và enzyme tự do Ngoài ra, nghiên cứu cho thay mứcđộ hấp thụ của các peptide cao hơn ba lần so với captopril

Từ các tài liệu tham khảo, có thể thấy sản phẩm thủy phân gluten có nhiều ưuđiểm hon gluten, có thé ứng dụng rộng hơn trong thực phẩm Dé thu nhận gluten thủyphân, phương pháp sử dụng enzyme là phương pháp tiên tiến, an toàn Tuy nhiên, cònmột số hạn chế đòi hỏi phải khắc phục để áp dụng quy trình vào thực tế Nhiều nghiêncứu tập trung vào việc cải thiện tính chất chức năng của dịch thủy phân và thu cácpeptide có hoạt tính sinh học, tuy nhiên các nghiên cứu nhằm thu dịch thủy phân giauđạm để bồ sung vào thực phẩm còn hạn chế Vì vay, trong luận văn nay chúng tôi tậptrung nghiên cứu thủy phân gluten lúa mì bằng cách kết hợp hai enzyme Alcalase vàFlavourzyme.

l6

CHƯƠNG 2 NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

NGHIÊN CỨU

2.1 Nguyên vật liệu và hóa chất

2.1.1 Gluten lia mìGluten lúa mì của hãng Roquette (Pháp) được cung cấp bởi Công ty TNHHĐịnh Hướng Mới Sản phẩm được đóng gói 1kg/goi với thành phần nha sản xuất cungcấp được trình bày trong bảng 2.1 Sản phẩm được bảo quản nhiệt độ thường, nơi khôthoáng.

Bảng 2 1 Thành phan gluten lúa mì do nhà sản xuất cung cap

Am (%) 6.5Protein (%/khối lượng chất khô) 85.8

Tro (%) 0.9Khả nang hap thụ nước (%) 165

Melamine < 0.05 mg/kg

Tong vi sinh vat hiéu khi < 50000

Nắm men < 5002.1.2 Enzyme Alcalase va Flavourzyme

Enzyme Alcalase và Flavourzyme của hang Novorzyme được cung cấp bởicông ty TNHH Phương Trâm.

Enzmye Alcalase được sản xuất bằng phương pháp lên men vi khuân Bacilluslicheniformis

Flavourzyme được sản xuât từ nam moc Aspergillus oryzae thuộc loại aminopeptidase.

phẩm

Bảng 2 2 Các đặc tính của enzyme Alcalase do nhà sản xuất cung cấp

Màu sắc Dạng lỏng, màu nâu

Khối lượng phân tử 27300

Bang 2 3 Các đặc tính của enzyme Flavourzyme do nhà sản xuất cung cap

Màu sắc Dạng răn, màu nâu

Hoạt tính 300 LAPU/g

pH hoạt động 5.5 - 7.0

Nhiệt độ hoạt động 40°C - 55°CBao quan 4-8°C

18

Enzyme được bao quản lạnh va sử dụng trong vòng 6 tháng từ ngày mở san

2.1.3 Hóa chấtCác hóa chất sử dụng để nghiên cứu:- Hoa chất phan tich: NaOH, Ethanol, Albumin huyét thanh bo, Casein, Tyrosin,

Kali Natri tartrat, - _ Thuốc thử: Folin, Nihydrin, chất chi thị mau phenolphatalein 2.2 Dụng cu và thiết bị

e Đề điều nhiệt có lắc, cân 4 số, máy hút chân không, tủ say, tu lanh, may sayâm hồng ngoại, máy cất đạm Kjeldalh

e Thiết bị ly tâm lạnh (Certomate BS-1, Sigma, Hoa Kỳ).e Thiết bị đo quang phố (CT 2300 Spectrophotometer, Dai Loan).e Một số thiết bị khác

2.3 Nội dung và phương pháp nghiên cứu

2.3.1 Noi dung nghién cứuNội dung nghiên cứu

nghệ đên quá trình

thủy phân gluten lúa pH ~) Hàm lượng protein

mì băng enzyme | hòa tan

Alcalase Thời gian |—

Khảo sát ảnh hưởng Tỷ lệ E/S

của các thông số công

nghệ đến quá trình Nhiệt độ Í_ Mức độ thủy phân

thủy phân gluten lua [-»

mi bang enzyme pH Ham lượng aa

Flavourzyme sau khi

xử lý với Alcalase Thời gian |—

Hình 2 1 Nội dung nghiên cứu

20

2.3.2 Bồ trí thí nghiệm2.3.2.1 Nghiên cứu các thông số công nghệ ảnh hưởng đến quá trình thủy phân bằngenzyme Alcalase

Các bước tiến hành quá trình thủy phan gluten lúa mì bang enzyme Alcalaseđược trình bày trong hình 2.2

Thuyết minh sơ dé

Cho gluten và nước theo tỷ lệ thí nghiệm 15% (w/w) Dùng dung dịch NaOH1N để chỉnh pH của hỗn hợp về giá trị pH khảo sát Tiến hành gia nhiệt hỗn hợp trongbể điều nhiệt có lắc đến nhiệt độ cần khảo sát trong 15 phút Sau đó, cho enzymeAlcalase vào mẫu thủy phân Sau thời gian thủy phân xác định, tiễn hành vô hoạtenzyme ở 90°C trong 10 phút rồi làm nguội đến nhiệt độ thường bang nước lạnh, lytâm thu dịch thủy phân và xác định các thông số cần đo

% Thí nghiệm 1: Khảo sát ảnh hưởng của tỷ lệ enzyme/co chất đến quá trình thủyphân bằng Alcalase

Mục đích thí nghiệm tìm tý lệ E/S phù hợp Sơ đồ khảo sát được trình bày nhưhình 2.3

22

Cre 4 Hoa tanVv

Gluten 15%(w/w)

Vv

Chinh pH 8.0Gia nhiét

t = 120 phút0.029AU/g 0.058A U/g 0.087AU/g 0.116AU/g 0.145AU/g 0.174AU/g

Vô hoạt enzyme

Ỷ

Làm nguộiLy tâm v = 5000¢

t = 30 phútDich

thủy phan

hoa tan-Xac dinh DH

Hình 2 3 Sơ đồ khảo sát anh hưởng ty lệ E/S đến quá trình thủy phân bang Alcalases%* Thí nghiệm 2: Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ đến qua trình thủy phân bang

Alcalase