VIỆN CHĂN NUÔI - Tạp chí Khoahọc Công nghệ Chăn nuôi - Số 21-Tháng 12-2009 48 ẢNHHƯỞNGCỦATUỔIBÒĐẾNSỐLƯỢNGVÀCHẤT LƯ ỢNG TẾBÀOTRỨNGCHỌCHÚTBẰNGSIÊUÂM Phan Lê Sơn 1 , Nguyễn Thị Thoa 2 , Lưu Công Khánh 1 , Chu Thị Yến 1 , Nguyễn Thị Hương 1 , Phạm Khánh Vân 2 và Lưu Thị Ngọc Anh 2 1 Bộ môn Sinh lý Sinh hóa và Tập tính vật nuôi 2 Phòng thí nghiệm trong điểm Tếbào động vật *Tác giả liên hệ: Phan Lê Sơn - Bộ môn Sinh lý Sinh hóa và Tập tính vật nuôi Viện Chăn nuôi - Thụy Phương - Từ Liêm - Hà Nội Tel: (04) 38.385.940 /0914551149 ; Email: sonphanle@yahoo.com ABSTRACT Effect of cow ages on oocyte quantity and quality Phan Le Son*, Nguyen Thi Thoa, Luu Cong Khanh, Chu Thi Yen, Nguyen Thi Huong, Pham Khanh Van and Lưu Thi Ngoc Anh The aim of this study was examin the possible effect of age of doner cows on oocytes quantity and quality. Two groups of Holstein Friese cows of 3 and six years were used . For this study ovum pick up was conducted twice a weeks .It was found that number of follicles with diameter of 2 to ≥ 9mm obtained from 3 year old cows was higher than that from 6 year old cows (10.35 vs 9.63) p<0.05. Similarly, number of oocyte/ovary otained from 3 year old cows was higher than that from 6 year old cows (7.2 vs 6.78) (p< 0.05). The number of oocytes qualified as A,B Grade, Which can be use for maturation , fertiliration and culturewas higher in cows of 3 year old (5.39 vs 5.12) than that in cows of 6 year old. It was conluded that the younger the cows were, the greater the quantity and quality of oocytes were. Key word: occyte, ovum pick up, follicle ĐĂT VẤN ĐỀ Số lượng, chất lượng, nguồn gốc tếbàotrứng đóng một vai trò hết sức quan trọng trong việc phát triển các công nghệ sinh sản như sản xuất phôi in-vitro, vi tiêm, cloning, chuyển gen, thành lập ngân hàng tếbào trứng,…Trước đây tếbàotrứng để phục vụ nghiên cứu và sản suất phôi bò ở nước ta được lấy từ lò mổ nên chấtlượng di truyền của phôi rất thấp, khả năng triển khai vào sản xuất rất hạn chế do ở Việt Nam bò được giết thịt ở các lò mỏ chủ yếu là bò vàng, bò lai sind có khả năng di truyền vàchấtlượngtếbàotrứng rất kém. Hiện nay kỹ thuật siêuâmhúttếbàotrứng từ bò sống đã thành công, cho phép chúng ta có được sốlượngvàchấtlượngtếbàotrứng tốt củabò cho. Tếbàotrứng có giá trị di truyền cao, chủ động được thời gian, do vậy chấtlượng phôi tốt, dễ triển khai sản suất, thu được sản phẩm có chấtlượng cao, khai thác tối đa tiềm năng sinh sản. Theo Hansel (2003) siêuâmhúttếbàotrứngvà thu được 10,4 tếbào trứng/bò cho tếbào trứng, với 40% phôi dâu và phôi nang thu được sau khi nuôi chín và thụ tinh ống nghiệm thu được 4 phôi/tuần hay có ít nhất 200 phôi/bò/năm. Kết quả này cao hơn nhiều khi thu phôi in vivo bằng phương pháp gây rụng trứng nhiều 5,9 phôi/lần hay 35 phôi/bò/năm (Thibier, 2001). Siêuâmhúttếbàotrứng chịu ảnhhưởngcủa rất nhiều yếu tố trong đó tuổibò cho tếbàotrứng đóng vai trò hết sức quan trọng, liên quan mật thiết đến sinh lý sinh sản cũng như khả năng cho tếbào trứng. Nhằm xác định được mức độ ảnh hưởngcủatuổibò đến sốlượngvàchấtlượngtếbàotrứng thu được. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Vật liệu nghiên cứu 4 bò sữa HF thuần, có độ tuổi từ 3 (n=2) tuổivà từ 6 tuổi (n=2), có năng suất sữa ≥ 5000 lít sữa/chu kỳ. Được nuôi dưỡng và chăm sóc trong cùng một điều kiện chăn nuôi, cho ăn 50 kg cỏ tươivà 4 kg thức ăn tinh mỗi ngày. PHAN LÊ SƠN – Ảnhhưởngcủatuổibò 49 Nội dung nghiên cứu Xác định ảnhhưởngcủatuổibò lên sốlượng nang trứng. Xác định ảnhhưởngcủatuổibò lên sốlượngtếbàotrứng thu được. Xác định ảnhhưởngcủatuổibò lên chấtlượngtếbàotrứng thu được Phương pháp nghiên cứu Chuẩn bị bò: Sau khi lắp đặt xong hệ thống máy siêuâmvà nhiệt độ của môi trường húttếbàotrứng (trong bình ổn nhiệt) được làm ấm lên 37 o C. Bò cho tếbàotrứng được cố định, gây tê cục bộbằng cách tiêm 4 - 6 ml lidocain 2% vào khấu đuôi, lấy hết phân, rửa sạch và sát khuẩn khu âm đạo và khu vực xung quanh bằng cồn 70 o . Xác định sốlượngvà kích thước nang trứng Cho đầu giò siêuâm vào trực tràng, cố định buồng trứng, đưa buồng trứng về phía mặt quét của đầu giò siêu âm. Nhẹ nhàng xoay, đếm và đo kích thước nang trứng có mặt trên buồng trứng qua màn hình của máy siêu âm. Quá trình đo, đếm cần thực hiện tỉ mỉ, chính xác và ghi chép cẩn thận. HúttếbàotrứngSiêuâmhúttếbàotrứng được thực hiện sử dụng kim 18 G dài 55 cm, áp suất 120 mmHg và tần suất 2 lần/tuần. Môi trường húttếbàotrứng (mDPBS của Sigma) có bổ sung 2% heparin và 5% huyết thanh bê và kháng sinh (100.000iu penicilin/ml + 100l streptomycin/ml) duy trì ở nhiệt độ 37 o C bằng máy ổn nhiệt. Nhẹ nhàng cho đầu dò siêuâm có gắn hệ thống dẫn kim vào âm đạo, cho tay qua trực tràng cố định buồng trứng, đưa các nang trứng về vị trí mũi kim, quan sát các nang trứng trên màn hình máy siêuâmvàchọchút dịch nang trứng. Trong quá trình hút hệ thống kim và ống dẫn luôn luôn chứa đầy môi trường húttếbào trứng. Sau khi chọchút 2 - 4 nang trứng, rút kim ra, hút dung dịch thu tếbàotrứng để tếbàotrứng chảy vào ống falcon (giữ ấm trong bình ổn nhiêt 37 o C), tiến hành hút lặp lại đến khi không còn nhìn thấy nang trứng nào trên buồng trứng thì chuyển qua buồng trứng đối diện. Lọc, soi tìm tếbàotrứng Sau khi hút xong một buồng trứng, đưa ngay về phòng thí nghiệm, lọc bằng cốc lọc Emcon có đường kính lỗ lọc 20m, khoảng 10ml dung dịch còn lại được chuyển vào đĩa petri vô trùng có đường kính 90mm để soi tìm, đánh giá, phân loại tếbàotrứng dưới kính hiển vi soi nổi. Đánh giá chấtlượngtếbàotrứngTếbàotrứng thu được được đánh giá phân loại theo phương pháp của Goodhand và cs. (1999). Dựa vào hình dạng, sự đồng nhất củatếbàochấtvà đặc biệt là màng cumulus. Loại A có ≥ 4 lớp màng cumulus, phân bố rõ ràng, liên kết chặt chẽ vàtếbàochất đồng nhất. Loại B có ≥ 1 lớp màng tếbào cumulus, liên kết chặt chẽ vàtếbàochất đồng nhất. Loại C một số phần vỏ ngoài tếbàotrứng bị lột trần, tếbàochất co lại không đều. Loại D tếbàotrứng hoàn toàn bị lột trần vàtếbàochất co lại không đều. Xử lý số liệu Số liệu được xử lý theo phương pháp thống kê sinh học có sử dụng phần mềm Excel . VIỆN CHĂN NUÔI - Tạp chí Khoahọc Công nghệ Chăn nuôi - Số 21-Tháng 12-2009 50 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN Ảnh hưởngcủatuổibò lên sốlượng nang trứng Nang trứng có mặt trên buồng trứng 114 lượt buồng trứng được siêuâm ở 2 nhóm bò thí nghiệm với 1137 nang trứng có mặt trên buồng trứng. Trong đó nang trứng có kích thước 2 – 8 mm và ≥ 9mm củabò 3 tuổi tương ứng 482 và 77 nang trứng, bình quân nang trứng/buồng trứng tương ứng 8,93 và 1,43 nang. Ở nhóm bò 6 tuổi nang trứng có kích thước 2 – 8 mm và ≥ 9m tương ứng 466 và 112 nang, nang trứng/buồng trứng tương ứng 7,77 và 1,87 nang. Bảng 1. Sốlượng nang trứng/buồng trứngvàsốlượng nang trứng có kích thước 2 – 8 mm, ≥ 9 mm/buồng trứngcủa 2 nhóm bò. Nang trứng 2 – 8mm Nang trứng ≥ 9 mm Tuổibò cho tếbàotrứng Nang trứng/buồng trứng n. Nangtrứng /buồng trứng n Nang trứng /buồng trứng Mean ± SE Mean ± SE Mean ± SE 3 tuổi 10,35 ± 0,22 a 482 8,93 ± 0,16 a 77 1,43 ± 0,11 a 6 tuổi 9,63 ± 0,29 b 466 7,77 ± 0,22 b 112 1,87 ± 0,17 b Chung 9,99 ± 0,36 948 8,31 ± 0,15 189 1,66 ± 0,10 Các chữ cái a, b trong cùng cột có giá trị sai khác (p<0,05) Bảng 1 cho thấy, bò 3 tuổi có sốlượng nang trứng/buồng trứng ở kích thước 2 – 8 mm cao hơn nhóm bò 6 tuổi. Song ở nang trứng có kích thước ≥ 9mm nhóm bò 6 tuổi có phần cao hơn. Số nang trứng bình quân thu được của chúng tôi không sai khác nhiều so với số nang trứngtrung bình/buồng trứngcủa Rizos và cs. (2005) ở bò hậu bị vàbò cái sinh sản tương ứng 10,4 và 7,8 nang trứng/buồng trứng. Song lại cao hơn Ramos và cs. (2009) khi tiến hành siêuâmhúttếbàotrứng 2 lần/tuần và 1 lần/tuần sử dụng hormon để kích thích thu được tương ứng 7,05, 7,95 và 8,75 nang trứng/buồng trứng. Nang trứng được hútBảng 2. Tổng số nang trứng được chọc hút, nang trứng đư ợc chọc hút/buồng trứng ở 2 nhóm bò. Tuổibò cho tếbàotrứng Tổng số nang (2 - > 9 mm) Nang trứng được hút Nang trứng được hút/buồng trứng Tỉ lệ hút (Mean ± SE) 3 559 454 8,41 ± 0,22 a 81,21 6 578 472 8,00 ± 0,24 b 81,66 Chung 1137 926 8,20 ± 1,64 81,43 Các chữ cái a, b trong cùng cột có giá trị sai khác (p <0,05) Bảng 2 cho thấy, tổng số nang trứng được chọchút là 926 nang/ tổng số 1137 nang quan sát được chiếm tỉ lệ 81,43 %. Sốlượng nang trứng được chọc hút/buồng trứng ở cả 2 nhóm bò là 8,20 nang. Không có sự khác nhau của 2 nhóm bò về tỉ lệ nang trứng được chọc hút/nang trứng quan sát được ở nhóm bò 3 tuổivà 6 tuổi, tương ứng 81,2 và 81,66 %. Sốlượng nang trứng được chọc hút/buồng trứngcủa chúng tôi cao hơn so với kết quả của Manik và cs. (2003) đã nghiên cứu siêuâmhúttếbàotrứng ở bò Ấn có sốlượng nang trứng được chọc hút/buồng trứng 4,25 nang trứng. Goodhand và cs, (2000) chọchút được 6,65 nang trứng/buồng trứng. PHAN LÊ SƠN – Ảnh hưởngcủatuổibò 51 Ảnh hưởngcủatuổibò lên sốlượngtếbàotrứng thu được Sau 114 lượt buồng trứng được siêuâmhúttếbàotrứng có 796 tếbàotrứng được thu, bình quân tếbào trứng/buồng trứng 6,98 tếbào trứng. Tỉ lệ thu được chiếm 85,95 %/ tổng số nang trứng được chọc hút. Có sự khác nhau về tếbào trứng/ buồng trứng thu được giữa 2 nhóm bò, ở nhóm bò 3 tuổi thu được 7,20 tếbàocao hơn nhóm bò 6 tuổi 6,78 tế bào. Không có sự khác nhau về tỉ lệ tếbàotrứng thu được/nang trứng được chọchút giữa hai nhóm bò. Bảng 3. Tổng sốtếbàotrứng thu được, tếbào trứng/buồng trứngTuổibò cho tếbàotrứng Buồng trứng được hútTếbàotrứng thu được Tếbào trứng/buồng trứngTếbàotrứng thu được/nang trứng được hút (%) (Mean ± SE) 3 54 389 7,20 ± 0,23 a 85,68 6 60 407 6,78 ± 0,13 b 86,22 Chung 114 796 6,98 ± 0,13 85,95 Các chữ cái a, b trong cùng cột có giá trị sai khác (p <0,05) Nghiên cứu để nâng caosốlượngtếbàotrứng được rất nhiều nhà khoahọc quan tâm nghiên cứu để thu được tối đa tếbàotrứng có chất lượng. Manik và cs, (2003) thu được 4,5 tế bào/buồng trứng. De Roover và cs, (2005) thu đuợc bình quân 5,6 tếbào trứng/buồng trứng khi tiến hành siêuâmhúttếbàotrứng từ bò sống. Kết quả của chúng tôi cũng phù hợp với Viana và cs, (2004) đã thu được bình quân sốtếbàotrứng 7,0 tếbào trứng, Ramos và cs, (2009) thu được 7,05 tếbào trứng/buồng trứng. Ảnh hưởngcủatuổibò lên chấtlượngtếbàotrứng thu được Chấtlượngtếbàoảnhhưởng rất lớn đến khả năng phát triển sau khi nuôi chín, thụ tinh, phân chia và phát triển đến giai đoạn phôi dâu và phôi nang. Sau khi chọchút xong, dịch hút nang trứngtếbàotrứng được đưa ngay về phòng thí nghiệm để lọc, soi tìm và đánh giá chấtlượng theo 4 mức độ khác nhau (A, B, C và D). Chỉ có tếbàotrứng loại A và B mới đủ tiêu chuẩn nuôi cấy, thụ tinh và tạo phôi. Bảng 4. Tếbàotrứng loại A, B, C và D của 2 nhóm bòTếbàotrứng loại A, B Tếbàotrứng loại C, D Tuổibò cho tếbàotrứng N Tế bào/buồng trứng n Tế bào/buồng trứng 3 291 5,39 98 1,81 6 307 5,12 100 1,67 Chung 598 5,25 198 1,74 Bảng 4 cho thấy, tổng sốtếbàotrứng loại A, B là 598 tế bào. Tếbàotrứng bình quân thu được/buồng trứngcủa nhóm bò 3 tuổi 5,39 tế bào, cao hơn nhóm bò 6 tuổi 5,12 tế bào. Tếbàotrứng loại C, D không có sự khác nhau nhiều, tương ứng 1,81 và 1,67 tế bào. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ Tuổibò có ảnhhưởngđếnsốlượngvàchấtlượngtếbàotrứng thu được. Nhóm bò cho tếbàotrứng có độ tuổi 3 tuổi cho sốlượngvàchấtlượngtếbàotrứng tốt hơn nhóm bò 6 tuổi. VIỆN CHĂN NUÔI - Tạp chí Khoahọc Công nghệ Chăn nuôi - Số 21-Tháng 12-2009 52 TÀI LIỆU THAM KHẢO De Roover, R., Genicot, G., Leonard, S., Bols, P and Dessy, F (2005). Ovum pick up and in vitro embryo production in cows superstimulated with an individually adapted superstimulation protocol. Animal .Reproduction Science. 2005; 86: p.13-25. Dimitrios Rizos, Lisa Burke, Patrick Duffy, Mary Wade, John F. Mee, Kevin J.O’Farrell, Mairtin MacSiurtain, Maurice P. Boland and Patrick Lonergan, (2005). Comparisons between nulliparous heifers and cows as oocyte doners for embryo production in vitro. Theriogenology 2005; 63: p.939-949. Hasler J.F., Hasler W.B. Henderson, P.J. Hurtgen, Z.Q. Jin, A.D. McCauley, S.A Mower, B. Neely, L.S. Shuey, J.E. Stockes and S.A. Trimmer, (1995) Production, freezing and transfer of bovine IVF embryos and Halsel, B.M. Magunath, J.P. Ravinada, P.S.P. Gupta, M. Devaraj and S.Nandi(2003). Effect of breeding season on in vivo oocyte recovery and embryo production in non – descriptive indian river buffaloes. Animal Reproduction Science 2: 376-383. K.L. Goodhand, M.E. Staines, J.S.M. Hutchinson and P.J. Broadbent, (2000). In vivo oocyte recovery and in vitro embryo production from bovine oocyte doner treated with progestagen, oestradiol. Animal reproduction 2000; 63; p.145-185 K.L. Goodhand, M.E. Staines, J.S.M. Hutchinson and P.J. Broadbent (1999). In vivo oocyte recovery and in vitro embryo production from doner aspirated at different frequencies or following FSH treatment. Theriogenology 1999; 51, p. 951-961 Manik, F.li, X.chen, W. pi, C. Lin and Z. Shi (2003). Collection oocytes through transvaginal Ovum pick-up for invitro embryo production in Nanyang yellow cattle. Reproduction in Domestic Animal 42: 666-670 Ramos, R. Rupt, J.U. Camara, M. R. Mollo, I . Pivato, A. P. Marques and Satori. Effect of follicular wave sunchronzation on invitro embryo production in heifers. Animal Reproduction Science 3: 201-207. Rizos, D., Burke, L., Duffy, P., Wade, M., Mee, J.F., O'Farrell, K.J., MarSiurtain, M., Boland, M.P and Lonergan, P, (2005). Comparisons between nulliparous heifers and cows as oocyte donors for embryo production in vitrro. Theriogenology 2005; 63: p.939-949. Thibier.M, (2001). A constrated year for the world activity of the animal embryo transfer industry. Newslett. 20, p.13-19. Viana, JHM. Camargo, LSA and Ferreira, A.M, (2004). Short intervals between ultrasonographically guided follicle aspiration improve oocyte quality but do not prevent establishment of dominant follicle in the Gir breed of cattle. Animal Reproduction Science 84: p.1-12 *Người phản biện: TS. Phan Văn Kiểm; TS. Đào Đức Thà . và 1,67 tế bào. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ Tuổi bò có ảnh hưởng đến số lượng và chất lượng tế bào trứng thu được. Nhóm bò cho tế bào trứng có độ tuổi 3 tuổi cho số lượng và chất lượng tế bào trứng. trứng/ buồng trứng. PHAN LÊ SƠN – Ảnh hưởng của tuổi bò 51 Ảnh hưởng của tuổi bò lên số lượng tế bào trứng thu được Sau 114 lượt buồng trứng được siêu âm hút tế bào trứng có 796 tế bào trứng. – Ảnh hưởng của tuổi bò 49 Nội dung nghiên cứu Xác định ảnh hưởng của tuổi bò lên số lượng nang trứng. Xác định ảnh hưởng của tuổi bò lên số lượng tế bào trứng thu được. Xác định ảnh