nguyễn thị giang nghiên cứu một số phương pháp tinh chế pazopanib hydroclorid

HÀ NỘI – 2024

BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

Người hướng dẫn:

1 GS.TS Nguyễn Đình Luyện 2 NCS Bùi Thị Thanh Châm

LỜI CẢM ƠN

Lời đầu tiên, tôi xin được bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc và gửi lời cảm ơn chân

thành nhất đến thầy PGS.TS Nguyễn Văn Hải và chị NCS Bùi Thị Thanh Châm,

những người đã dìu dắt hướng dẫn tôi từ những ngày đầu, luôn quan tâm, động viên tôi vượt qua những giây phút nản lòng, tận tình chỉ dẫn và tạo mọi điều kiện tốt nhất giúp tôi hoàn thành khóa luận này

Tôi vô cùng biết ơn thầy GS.TS Nguyễn Đình Luyện, thầy TS Nguyễn Văn Giang, cô TS Đào Nguyệt Sương Huyền đã nhiệt tình chỉ bảo, chia sẻ cho tôi những

kinh nghiệm quý báu và cổ vũ tôi vượt qua những khó khăn trong qua trình thực hiện khóa luận này

Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn đến Ban giám hiệu cùng toàn thể các giảng viên của Trường Đại học Dược Hà Nội, các thầy cô của bộ môn Hóa Dược - trường Đại học Y dược Thái Nguyên đã tạo điều kiện cho tôi hoàn thành khóa luận này

Chân thành cảm ơn các anh chị, các bạn K74, các em đã cùng tôi thực hiện khóa

luận tại phòng thí nghiệm Tổng hợp Hóa dược, khoa Công nghệ Hóa dược, bộ môn Kỹ thuật Hóa dược & Chiết xuất đã đồng hành cùng tôi trên con đường nghiên cứu

Đặc biệt, tôi xin dành sự biết ơn sâu sắc nhất dành cho gia đình thân yêu của tôi vì đã sát cánh bên tôi, yêu thương, chăm sóc và tạo điều kiện cho tôi thực hiện khóa

luận Cảm ơn bạn Hoàng Thị Lan Hương kiên nhẫn hướng dẫn tôi những kỹ năng cần

thiết để có thể hoàn thành khóa luận này

Mặc dù đã cố gắng hết sức và được tạo mọi điều kiện thuận lợi nhưng do thời gian nghiên cứu chưa nhiều đồng thời kiến thức của bản thân còn hạn chế nên khóa luận này không tránh khỏi những thiếu sót Rất mong nhận được sự góp ý từ các thầy cô và các bạn để khóa luận này được hoàn thiện hơn

Tôi xin chân thành cảm ơn!

Hà Nội, ngày 03 tháng 06 năm 2024

Sinh viên

Nguyễn Thị Giang

MỤC LỤC DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT, KÝ HIỆUDANH MỤC CÁC BẢNG

DANH MỤC CÁC HÌNH

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

CHƯƠNG 1 Tổng quan 2

1.1 Tổng quan về pazopanib hydroclorid 2

1.1.1 Đặc điểm cấu trúc, danh pháp 2

1.2.1 Tổng quan về các phương pháp tinh chế 6

1.2.2 Kỹ thuật tinh chế bằng kết tinh 6

1.3 Các phương pháp tinh chế pazopanib hydroclorid 9

1.3.1 Kết tinh bằng phương pháp làm lạnh 9

1.3.2 Kết tinh bằng phương pháp thêm đối dung môi 12

1.4 Định hướng lựa chọn phương pháp tinh chế pazopanib hydroclorid 13

1.4.1 Lựa chọn phương pháp định lượng pazopanib hydroclorid 13

1.4.2 Lựa chọn phương pháp tinh chế pazopanib hydroclorid 14

CHƯƠNG 2 Đối tượng và phương pháp nghiên cứu 15

2.1 Nguyên vật liệu và thiết bị 15

2.2 Nội dung nghiên cứu 16

2.3 Phương pháp nghiên cứu 16

2.3.1 Xây dựng phương pháp định lượng pazopanib hydroclorid 16

2.3.2 Khảo sát một số phương pháp tinh chế pazopanib hydroclorid 17

CHƯƠNG 3 Thực nghiệm, kết quả và bàn luận 18

3.1 Kết quả thực nghiệm 18

3.1.1 Xây dựng phương pháp định lượng pazopanib hydroclorid 18

3.1.2 Đánh giá chất lượng mẫu chuẩn và mẫu chưa tinh chế 27

3.1.3 Khảo sát một số phương pháp tinh chế pazopanib hydroclorid 27

3.1.4 Khảo sát các yếu tố nâng cao hiệu suất tinh chế 33

3.2 Bàn luận 35

3.2.1 Bàn luận về phương pháp định lượng pazopanib hydroclorid 35

3.2.2 Bàn luận về các phương pháp tinh chế pazopanib hydroclorid 35

KẾT LUẬN, KIẾN NGHỊ 37TÀI LIỆU THAM KHẢO

PHỤ LỤC

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT, KÝ HIỆU

AR Hóa chất phân tích đvC Đơn vị Carbon EA Ethyl acetat EtOH Ethanol FGFR Thụ thể của yếu tố tăng trưởng nguyên bào sợi

(Fibroblast growth factor receptor)

HPLC Sắc ký lỏng hiệu năng cao

(High Performance Liquid Chromatography)

KQ Kết quả m Khối lượng MeOH Methanol nl Nguyên liệu RSD Độ lệch tương đối S pic diện tích pic trên sắc ký đồ SD Độ lệch chuẩn

TB Giá trị trung bình TLTK Tài liệu tham khảo tºnc Nhiệt độ nóng chảy tR Thời gian lưu mẫu

VEGFR Thụ thể của yếu tố tăng trưởng nội mô mạch máu

(Vascular Endothelial Growth Factor Receptor)

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 1.1 Phần trăm khối lượng các nguyên tố trong phân tử pazopanib hydroclorid 2

Bảng 1.2 Một số tạp chất sinh ra trong quá trình tổng hợp pazopanib hydroclorid 4

Bảng 1.3 Tóm tắt một số quy trình tinh chế theo Chava và cộng sự 10

Bảng 1.4 Tóm tắt một số quy trình tinh chế theo Reddy và cộng sự 11

Bảng 1.5 tóm tắt một số quy trình kết tinh sử dụng đối dung môi theo Rendell 13

Bảng 1.6 Các chỉ tiêu cần đánh giá trong quy trình thẩm định 14

Bảng 2.1 Danh mục nguyên liệu, hóa chất sử dụng 15

Bảng 2.2 Danh mục các thiết bị sử dụng trong nghiên cứu 15

Bảng 3.1 Các điều kiện sắc ký 19

Bảng 3.2 Kết quả thử tính thích hợp của hệ thống với dung dịch chuẩn 1 20

Bảng 3.3 Kết quả thử tính thích hợp của hệ thống với dung dịch chuẩn 2 21

Bảng 3.4 Kết quả khảo sát độ lặp lại 22

Bảng 3.5 Kết quả thử tính thích hợp của hệ thống 2 23

Bảng 3.6 Kết quả thử tính thích hợp của hệ thống 2 24

Bảng 3.7 Kết quả khảo sát độ tuyến tính 25

Bảng 3.8.Kết quả khảo sát độ đúng 26

Bảng 3.9 Kết quả phân tích mẫu chuẩn và mẫu chưa tinh chế 27

Bảng 3.10 Hiệu suất tinh chế pazopanib hydroclorid trong đơn dung môi 27

Bảng 3.21 Kết quả khảo sát tỷ lệ dung môi- nước đến hiệu suất kết tinh 34

Bảng 3.22 Kết quả khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ và thời gian đến hiệu suất kết tinh 34

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 1.1 Công thức cấu tạo của pazopanib hydroclorid 2

Hình 1.2 Các hợp phần của pazopanib 3

Hình 1.3 Các phương pháp tổng hợp pazopanib hydroclorid 3

Hình 3.1 Phổ UV của dung dịch pazopanib hydroclorid chuẩn 18

Hình 3.2 Đồ thị biểu diễn tính tuyến tính dung dịch chuẩn pazopanib hydroclorid 25

ĐẶT VẤN ĐỀ

Ung thư biểu mô tế bào thận (RCC) là bệnh ác tính phổ biến thứ 12 trên toàn thế giới, chiếm khoảng 2,4% trong tổng số các ca ung thư ác tính ở người lớn, hơn 400 000 trường hợp mới được chuẩn đoán và khoảng 180.000 ca tử vong trên toàn thế giới vào năm 2020 theo dữ liệu của GLOBOCAN Hiện nay việc phát hiện sớm các tổn thương RCC ngày càng tăng do việc sử dụng rộng rãi chụp cắt lớp vi tính (CT) và chụp cộng hưởng từ (MRI), tuy nhiên tỷ lệ sống sót sau 5 năm chỉ có 12% với bệnh nhân có RCC di căn và ít nhất một nửa trong số họ cần điều trị bằng thuốc [19] Ban đầu liệu pháp miễn dịch đầu tiên với cytokin là phương pháp điều trị tiêu chuẩn nhưng cho hiệu quả kém Sự ra đời của các chất ức chế tyrosin kinase, chủ yếu là chất ức chế thụ thể yếu tố tăng trưởng nội mô mạch máu (VEGF) đã góp phần cải thiện tiên lượng của các ca RCC di căn [13], [19]

Pazopanib hydroclorid là một chất ức chế đa tyrosin kinase đã được Cục Quản lý Thực phẩm và Dược phẩm Hoa Kỳ phê duyệt vào tháng 10 năm 2009 và Cơ quan Dược phẩm Châu Âu phê duyệt vào tháng 6 năm 2010 để điều trị RCC di căn [20] Theo dự kiến, bằng sáng chế của pazopanib tại Châu Âu sẽ hết hạn vào tháng 6 năm 2025 [28], vì vậy, cần nghiên cứu và cải tiến các phương pháp tổng hợp pazopanib để đưa thuốc ra thị trường khi hết hạn độc quyền

Tinh chế là một bước quan trọng để đảm bảo độ tinh khiết của chế phẩm Do đó, tinh chế pazopanib hydroclorid là một bước không thể thiếu sau mỗi quá trình tổng hợp Tuy nhiên, trên thế giới, việc tinh chế pazopanib hydroclorid chỉ được đề cập một cách sơ sài, chưa đầy đủ đồng thời quy trình định lượng pazopanib hydroclorid chưa được

công bố trong các chuyên luận dược điển Do đó, chúng tôi đã thực hiện đề tài “Nghiên cứu một số phương pháp tinh chế pazopanib hydroclorid” với mục tiêu:

- Xây dựng được phương pháp định lượng pazopanib hydroclorid để đánh giá

chất lượng sản phẩm trước và sau tinh chế

- Lựa chọn được phương pháp tinh chế pazopanib hydroclorid từ một số phương

pháp đã khảo sát

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan về pazopanib hydroclorid

1.1.1 Đặc điểm cấu trúc, danh pháp

• Công thức cấu tạo (Hình 1.1):

Hình 1.1 Công thức cấu tạo của pazopanib hydroclorid

• Tên khoa học:

5-((4-((2,3-dimethyl-2H-indazol-6-yl)(methyl)amino)pyrimidin-2-yl)amino)-2-methylbenzensulfonamid hydroclorid [26] • Biệt dược: Votrient

• Công thức phân tử: C21H14ClN7O2S [26] • Phân tử khối: 473,99 đvC [26]

• Thành phần khối lượng các nguyên tố (Bảng 1.1)

Bảng 1.1 Phần trăm khối lượng các nguyên tố trong phân tử pazopanib hydroclorid

VEGFR-2, VEGFR-3 và 2 PDGFR là PDGFR-α và PDGFR-β, do đó làm giảm tăng sinh

tế bào, ức chế các còn đường truyền tín hiệu của tế bào ung thư và ức chế sự hình thành mạch máu nuôi dưỡng tế bào ung thư [9], [17], [20] Bản chất của quá trình ức chế cạnh tranh này là do cấu trúc phân tử pazopanib có phần indazol tương tự với phần adenin

của ATP nên có khả năng tạo liên kết hydro với các thụ thể tyrosin kinase, ngăn ATP gắn vào thụ thể làm ức chế kých hoạt chuỗi phản ứng nội bào do ATP gây ra [17]

1.1.4 Chỉ định

Pazopanib hydroclorid được chỉ định để điều trị ung thư biểu mô tế bào thận tiến triền và sarcoma mô mềm tiến triển đã dùng hóa trị để điều trị di căn trước đó [17], [20], [25]

1.1.5 Các phương pháp tổng hợp pazopanib hydroclorid

Theo các phượng pháp đã được công bố, pazopanib hydroclorid đều được tổng hợp từ 3 hợp phần vòng thơm (indazol, pyrimidin, benzensulfonamid) và 1 hợp phần

methyl được mô tả như Hình 1.2.Trong đó pyrimidin là hợp phần cầu nối với 3 hợp

phần còn lại [2]

Hình 1.2 Các hợp phần của pazopanib

Theo cách gắn vòng thơm, có 2 cách chính để tổng hợp pazopanib hydroclorid

được thể hiện qua Hình 1.3:

Hình 1.3 Các phương pháp tổng hợp pazopanib hydroclorid

• Cách 1: Gắn hợp phần indazol vào hợp phần pyrimidin trước, sau đó cho sản

phẩm phản ứng tiếp với hợp phần sulfonamid Có 3 quy trình thực hiện tổng hợp pazopanib theo phương pháp này, đó là quy trình của Boloor, của Mei và của Liu

Haidong Hợp phần pyrimidin trong phương pháp của Boloor và Mei có nguồn gốc từ 2,4-dicloropyrimidin, còn của Liu Haidong có nguồn gốc từ 2,4-dicloro-

5-nitropyrimidin [5-8]

• Cách 2: Gắn hợp phần sulfonamid vào hợp phần pyrimidin trước, sau đó gắn

thêm hợp phần indazol Hiện nay mới chỉ có quy trình của Reddy và cộng sự thực hiện tổng hợp pazopanib theo phương pháp này, trong đó hợp phần pyrimidin có

nguồn gốc từ 2,4-dicloropyrimidin [21]

1.1.6 Tạp chất

Một số nghiên cứu về pazopanib đã chỉ ra, nhiều tạp chất xuất hiện là do tính chọn lọc trong quy trình tổng hợp Trong đó, hầu hết phương pháp tổng hợp pazopanib hydroclorid đã công bố được thực hiện bằng cách gắn hợp phần indazol và hợp phần sulfonamid vào 2,4-dicloropyrimidin hoặc 2,4-dicloro-5-nitropyrimidin Tuy nhiên việc định hướng phản ứng thế vào vị trí số 2 hay vị trí số 4 của vòng pyrimidin là không chọn lọc, thể hiện ở 2 phương pháp của Boloor và Reddy Boloor thực hiện phản ứng thế hợp phần indazol vào vị trí số 4, còn Reddy lại thực hiện thế hợp phần sulfonamid vào vị trí số 2 [5-8], [21], [22] Vì vậy, các tạp chất có thể sinh ra do sự không chọn lọc trong quá

trình phản ứng (Bảng 1.2)

Bảng 1.2 Một số tạp chất sinh ra trong quá trình tổng hợp pazopanib hydroclorid

Tài liệu tham khảo

4-yl)-N4

-(2,3-dimethyl-2H-indazol-5-yl)-N2

-

(2,3-dimethyl-2H-indazol-6-yl)-N4methylpyrimidin-2,4-

-diamin

[23]

5-((2,3-dimethyl-2H-indazol-6-yl) (methyl) amino) pyrimidin-4-yl)

methylbenzensulfonami

amino)-2-d

[29]

N2, N4

-bis(2,3-dimethyl-2H-indazol-6-yl)-N2, N4dimethylpyrimidin-2,4-

N-(2-cloro-4-methyl-1H-indazol-6-yl)

methylbenzensulfonami

2-d

[11]

5-((4-((1,3-dimethyl-1H-indazol-6-yl) (methyl) amino) pyrimidin-2-yl)

methylbenzensulfonami

amino)-2-d

[11]

1.2 Các phương pháp tinh chế 1.2.1 Tổng quan về các phương pháp tinh chế

Tinh chế là quá trình kĩ thuật làm sạch, loại các tạp chất khỏi một hợp chất nào đó để thu được một chất dưới dạng tinh khiết cao Sau quá trình tổng hợp hóa học thì thường thu được hỗn hợp gồm nhiều chất khác nhau bên cạnh chất chính như dung môi, các nguyên liệu ban đầu, các xúc tác còn dư, các sản phẩm phụ sinh ra trong quá trình phản ứng Vì vậy, quá trình tinh chế để thu được sản phẩm chính có độ tinh khiết cao là yêu cầu bắt buộc trong quá trình tổng hợp một chất hóa học Các phương pháp tinh chế hay dùng với chất hữu cơ là chưng cất, chiết, kết tinh và sắc ký [1]

• Phương pháp chưng cất: phương pháp này sử dụng sự chênh lệch trong

nhiệt độ sôi của các thành phần trong hỗn hợp để tách chúng ra khỏi nhau

• Phương pháp chiết: là phương pháp dùng một dung môi thích hợp hòa tan

chất cần tách thành pha lỏng (gọi là dịch chiết) để phân tách khỏi pha lỏng hoặc pha rắn chứa hỗn hợp các chất còn lại Dung môi thường dùng là ete, benzen, hexan…

• Phương pháp kết tinh: Nguyên lý của quá trình kết tinh là tạo ra dung dịch

quá bão hòa ở nhiệt độ cao hơn sau đó làm lạnh, thành phần nào đạt được nồng độ bão hòa trước thì kết tinh được còn thành phần nào chưa đạt tới nồng độ bão hòa thì không thể kết tinh và nằm trong dung dịch

• Phương pháp sắc ký: cơ sở của phương pháp này là dựa trên sự khác biệt

về tốc độ di chuyển của các chất trong pha động khi tiếp xúc với pha tĩnh Một số kiểu sắc ký phổ biến như sắc ký cột, sắc ký lớp mỏng, sắc ký khí…

1.2.2 Kỹ thuật tinh chế bằng kết tinh

1.2.2.1 Chọn dung môi kết tinh

Đây là việc quan trọng nhất khi chuẩn bị kết tinh Các tiêu chí lựa chọn dung môi bao gồm [3]:

• Dung môi cần phải hòa tan tốt chất cần kết tinh ở nhiệt độ cao và tủa ra từ dung dịch khi giảm nhiệt độ

• Dung môi dùng kết tinh không làm phân hủy thành phần chất đem kết tinh, không làm biến đổi về mặt hóa học chất kết tinh

• Nếu có nhiều dung môi đáp ứng yêu cầu trên thì ưu tiên chọn dung môi dễ thao tác, ít độc, không gây cháy nổ và rẻ tiền Hạn chế tối đa sử dụng ether trong kết tinh vì dễ cháy và rất dễ bay hơi ngay cả điều kiện thường

1.2.2.2 Quy trình kết tinh

Sau khi chọn được dung môi kết tinh, thực hiện quy trình kết tinh thông thường

gồm các bước được thể hiện qua Sơ đồ 1.1 [3]

Sơ đồ 1.1 Các bước trong quy trình kết tinh

thể sẽ hình thành Quy trình của phương pháp này được mô tả đơn giản qua Sơ đồ 1.2

Sơ đồ 1.2 Kết tinh bằng phương pháp làm lạnh

• Kết tinh bằng phương pháp cô đặc dung dịch

Nguyên lý của phương pháp này là dựa trên sự bay hơi dung môi, làm nồng độ của chất cần tinh chế vượt quá điểm bão hòa, do đó tinh thể sẽ được hình thành Quy trình

của phương pháp này được mô tả như Sơ đồ 1.3

Sơ đồ 1.3 Kết tinh bằng phương pháp cô đặc dung dịch

• Kết tinh bằng phương pháp thêm đối dung môi

Nguyên lý của phương pháp là sử dụng một đối dung môi làm giảm độ tan của sản phẩm trong dung môi ban đầu, làm nồng độ của sản phẩm vượt quá nồng độ bão hòa, từ đó hình thành tinh thể Đối dung môi sử dụng cần lựa chọn hợp lý, dựa trên 2 tiêu chí: độ tan của sản phẩm trong hỗn hợp dung môi – đối dung môi thấp và 2 dung môi phải trộn lẫn được với nhau Quy trình của phương pháp được mô tả đơn giản bằng

Sơ đồ 1.4

Sơ đồ 1.4 Kết tinh bằng phương pháp thêm đối dung môi

Chất rắn Dung môi

Hòa tan tạo dung dịch Nhiệt độ

Cô đặc dung dịch Bay hơi tự nhiên

Cô áp suất g ggiảm

Dung môi Lọc chất kết tinh

Sấy thu sản phẩm

Chất rắn Dung môi

Nhiệt độ

Hòa tan tạo dung dịch

Thêm đối dung môi

Lọc chất kết tinh

Sấy thu sản phẩm

1.3 Các phương pháp tinh chế pazopanib hydroclorid 1.3.1 Kết tinh bằng phương pháp làm lạnh

Có 3 hướng tinh chế pazopazib hydroclorid theo phương pháp kết tinh làm lạnh,

đó là quy trình của Chava, của Reddy và của Rendell • Quy trình của Chava và cộng sự

Một số quy trình tinh chế pazopanib hydroclorid được Chava và cộng sự công bố

bao gồm [10]:

✓ Hòa tan 1g pazopanib hydroclorid trong 60 mL methanol ở 25 - 30°C, đun nóng khối phản ứng đến 60 - 65°C và khuấy trong 2h thu được dung dịch trong suốt Lọc dung dịch thu được và làm nguội đến nhiệt độ phòng Bổ sung 10 mL methanol đã làm lạnh ở -15°C đến -10°C vào dịch lọc Lọc chất rắn thu được, rửa bằng methanol (5 mL), hút kiệt và sấy khô trong chân không ở 4h thu được 0,76g pazopanib hydroclorid có độ tinh khiết HPLC 99,99%

✓ Hòa tan 1g pazopanib hydroclorid trong hỗn hợp diclomethan và methanol (1:1,35 mL) ở khoảng 60 - 65°C, khối phản ứng được khuấy trong 2h thu được dung dịch trong suốt Để nguội dung dịch thu được đên -15°C và khuấy trong 2-3h Lọc chất rắn thu được, rửa bằng methanol (5 mL), hút khô và sấy khô trong chân không ở 40- 45°C trong 4h thu được 0,16g pazopanib hydroclorid có độ tinh khiết HPLC 99,97%

✓ Hòa tan 1g pazopanib hydroclorid vào 300 mL nước ở 95 - 100°C, khuấy trong 2h thu được dung dịch trong suốt Để nguội dung dịch thu được đến 25 - 30°C và khuấy trong 2-3h Lọc chất rắn thu được, rửa bằng 5 mL methanol, hút khô và sấy khô trong chân không 4h thu được 0,38g pazopanib hydroclorid có độ tinh khiết HPLC 99,8%

✓ Hòa tan 1g pazopanib hydroclorid trong 400 mL ethanol ở 75 - 80°C, khuấy trong 2h thu được dung dịch trong suốt Bổ sung 10 mL ethanol đã làm lạnh ở -15°C đến -10°C vào dung dịch thu được Lọc chất rắn thu được, rửa bằng 5 mL ethanol, hút khô và sấy khô trong chân không trong 4h thu được 0,5g pazopanib hydroclorid có độ tinh khiết 99,97%

✓ Hòa tan 1g pazopanib hydroclorid trong 400 mL n-propanol ở 95 - 100°C,

khuấy trong 2h thu được dung dịch trong suốt Bổ sung 10 mL n-propanol

đã làm lạnh ở -15°C đến -10°C vào dung dịch thu được Lọc chất rắn thu

được, rửa bằng 5 mL n-propanol, hút khô và sấy khô trong chân không trong

4h thu được 0,6g pazopanib hydroclorid có độ tinh khiết 99,96%

Kết quả của một vài quy trình trên đã được tóm tắt trong Bảng 1.3:

Bảng 1.3 Tóm tắt một số quy trình tinh chế theo Chava và cộng sự

Stt Dung

môi

mnl (g)

Thể tích hòa tan

(mL)

Nhiệt độ hòa tan

(ᵒC)

Nhiệt độ làm lạnh

(ᵒC)

Hiệu suất (%)

Độ tinh khiết HPLC

(%)

1 MeOH 1,0 60 60 - 65 -15 → -10 76,0 99,99 2 DCM:

MeOH

1,0 35 60 - 65 -15 16,0 99,97 3 H2O 1,0 300 95 - 100 25 - 30 38,0 99,80 4 EtOH 1,0 400 75 - 80 -15 → -10 50,0 99,97 5 n-

Tuy nhiên, các phương pháp này có một vài nhược điểm, đó là sử dụng tỷ lệ dung môi lớn, gây tốn kém và có thể gây ảnh hưởng đến môi trường Đồng thời, hiệu suất tinh chế không đồng đều giữa các loại dung môi và điều kiện làm lạnh khó khăn nên khó áp dụng ở quy mô lớn

• Quy trình của Reddy và cộng sự

Reddy và cộng sự đã đề xuất một vài quy trình tinh chế pazopanib hydroclorid

như sau [22]:

✓ Hòa tan 5g pazopanib hydroclorid (độ tinh khiết 97,50%) trong hỗn hợp gồm methanol (100 mL) và nước (10 mL) ở nhiệt độ phòng và sau đó đun nóng đến hồi lưu Khuấy khối phản ứng 30 phút khi hồi lưu và lọc Dịch lọc được làm nguội về nhiệt độ phòng và duy trì trong 2h Chất rắn được lọc và sấy khô để thu được 3,5g pazopanib hydroclorid có độ tinh khiết HPLC 99,90%

✓ Pazopanib hydroclorid (22g, độ tinh khiết HPLC 98,00%) được hòa tan trong hỗn hợp methanol (528 mL), nước (55 mL) và acid hydroclorid đặc (0,2 mL) ở nhiệt độ phòng Đun nóng hồi lưu và duy trì trong 30 phút sau đó lọc lấy dịch lọc Cất bớt dung môi trong chân không sau đó được làm nguội khối dịch còn lại đến nhiệt độ trong phòng và khuấy trong 30 phút ở

lọc Chất rắn thu được được sấy khô để thu 19g pazopanib hydroclorid có độ tinh khiết HPLC 99,85%

✓ Pazopanib hydroclorid (10g, độ tinh khiết HPLC 96%), methanol (250 mL), nước (25 mL) và acid hydroclorid đặc (0,1 mL) ở nhiệt độ phòng Đun nóng để hồi lưu và duy trì trong 30 phút và lọc Sau đó, dịch lọc được làm nguội về nhiệt độ phòng và khuấy tiếp 30 phút Làm nguội đến 0 đến 10°C và khuấy trong 1h Chất rắn tách được lọc và sấy khô để thu được 6,6g pazopanib hydroclorid có độ tinh khiết HPLC 99,80%

✓ Pazopanib hydroclorid (22g, độ tinh khiết HPLC 97,00%) được hòa tan trong hỗn hợp gồm isopropanol (132 mL) và nước (20 mL) ở nhiệt độ phòng rồi đun nóng đến hồi lưu Khối lượng phản ứng được hồi lưu trong 1h và sau đó làm nguội đến nhiệt độ phòng Tiếp tục khuấy trong 1h và được lọc Chất rắn thu được được sấy khô để tạo thành 18g pazopanib hydroclorid độ tinh khiết HPLC 99,80%

Bảng 1.4 Tóm tắt một số quy trình tinh chế theo Reddy và cộng sự

Dung môi mnl

(g)

Lượng dung môi (mL)

Hàm lượng ban

đầu (%)

Thời gian hồi lưu

(h)

Hiệu suất (%)

Hàm lượng sau (%)

MeOH: H2O 5,0 100:10 97,50 0,5 70,0 99,90 MeOH: H2O: HCl 22,0 528: 55: 0,2 98,00 0,5 86,4 99,85 MeOH: H2O: HCl 10,0 250: 25: 0,1 96,00 0,5 66,0 99,80 IPA: H2O 22,0 132: 20 97,00 1,0 81,8 99,80

Nhận xét:

So sánh với các quy trình của Chava và cộng sự thì có thể thấy Reddy và cộng

sự đã đưa ra vài điểm mới như thực hiện trong điều kiện hồi lưu để giảm bớt thời gian

hòa tan đồng thời điều kiện làm lạnh cũng đơn giản, dễ thực hiện hơn Một ưu điểm khác dễ nhận ra là hiệu suất của quá trình đã được cải thiện đồng thời sản phẩm thu được vẫn đạt được độ tinh khiết cao

Tuy nhiên, nhược điểm của các quy trình này là lượng dung môi sử dụng vẫn tương đối nhiều, do đó cần phải quan tâm đến vấn đề này trước khi thực hiện ở quy mô lớn

• Quy trình của Rendell và cộng sự So với công trình nghiên cứu của 2 tác giả trên thì Rendell và cộng sự có sự khác

biệt nổi bật về loại dung môi sử dụng, cụ thể một số quy trình tinh chế được trình bày dưới đây [23]:

✓ Bình cầu 100 mL được nạp pazopanib hydroclorid(1,97g, độ tinh khiết 98,6%) và DMF (35V, 1V= 1 mL/g) Hỗn hợp này được khuấy và đun nóng

đến 125°C trong 10 phút để hòa tan Sau đó, dung dịch này được làm nguội đến nhiệt độ môi trường phòng trong 50 phút và tiếp tục khuấy trong 60 phút thấy có kết tủa Chất rắn được lọc và sấy khô trong chân không ở 70°C trong 66 giờ để thu được 1,69g pazopanib HC1 có độ tinh khiết HPLC >99,9%

✓ Pazopanib HCl thô (1,04g, độ tinh khiết 98,6%) được trộn với acid acetic băng (2 mL, 2V) ở nhiệt độ phòng và sau đó đun nóng hồi lưu (117- 118°C) trong khi khuấy Thêm từng giọt acid acetic băng khác (4V) vào để hòa tan hoàn toàn Dung dịch thu được được làm nguội đến nhiệt độ phòng trong 1,5h và khuấy trong 1 giờ thu được kết tủa Chất rắn được tách ra bằng cách lọc chân không và rửa bằng acid acetic băng (0,5 mL, 0,5V) Sấy khô chân không ở 60°C trong 17 giờ để thu được pazopanib HCI ở dạng chất rắn màu trắng với hiệu suất 98% và độ tinh khiết >99,9%

Nhận xét:

Ưu điểm của các quy trình này là lượng dung môi sử dụng ít, dung dịch chỉ cần đưa về nhiệt độ phòng đã thu được kết tủa, đồng thời hiệu suất và độ tinh khiết của sản phẩm thu được đều cao

Nhược điểm lớn nhất của nghiên cứu này là dung môi không thân thiện với môi trường và thời gian sấy khô sản phẩm quá lâu

1.3.2 Kết tinh bằng phương pháp thêm đối dung môi

Rendell và cộng sự đã đề xuất một số quy trình tinh chế pazopanib HCl bằng cách

thêm đối dung môi vào dung dịch chứa chất tan Dưới đây là một vài quy trình đã được tác giả công bố [23]:

✓ Một bình cầu 20 mL được nạp pazopanib HCl (333 mg, độ tinh khiết 98,6%) và DMSO (3,2 mL) Hỗn hợp này được khuấy ở nhiệt độ phòng trong 10 phút để hòa tan Thêm từng giọt acetonitril (10,4 mL) vào dung dịch trong 5 phút thu được đến kết tủa Tiếp tục khuấy ở nhiệt độ phòng trong 17 giờ Chất rắn được lọc, rửa bằng acetonitril (2 x 3 mL) và sấy khô trong chân không ở 60°C trong 24h để thu được pazopanib HCl với hiệu suất 93%, độ tinh khiết > 99,9%

✓ Một lọ 20 mL được nạp pazopanib HCl (171 mg, độ tinh khiết 98,6%) và DMSO (1,7 mL) Hỗn hợp được khuấy nhiệt độ phòng trong 10 phút thu được dung dịch Thêm từng giọt ethyl acetat (5,6 mL) vào dung dịch này trong 5 phút dẫn đến kết tủa Tiếp tục khuấy ở nhiệt độ phòng trong 17 giờ Chất rắn được lọc, rửa bằng ethyl acetat (2 x 1,7 mL) và sấy khô trong chân không ở 60°C trong 24h để thu được pazopanib HCI với hiệu suất 86%, độ tinh khiết > 99,9%

✓ Một bình cầu 20 mL được nạp pazopanib HCl (171 mg; độ tinh khiết 98,6%) và DMSO (2 mL) Hỗn hợp này được khuấy ở nhiệt độ phòng trong khoảng 10 phút để hòa tan Thêm từng giọt aceton (4,8 mL) vào dung dịch trong 5 phút thu được kết tủa Khuấy được tiếp tục ở nhiệt độ phòng trong 17 giờ Chất rắn được lọc, rửa bằng aceton (2 x 1,7 mL) và sấy khô trong chân khôn ở 60°C trong 24 giờ để thu được pazopanib HCl hiệu suất 46%, độ tinh khiết > 99,9%

Bảng 1.5 tóm tắt một số quy trình kết tinh sử dụng đối dung môi theo Rendell

(%)

Độ tinh khiết (%)

1 DMSO Acetonitril 93 99,9 2 DMSO Ehtyl acetat 86 99,9

Nhận xét:

Các quy trình được đề xuất đều thu được sản phẩm có độ tinh khiết cao đồng thời hiệu suất tinh chế cao (trừ trường hợp sử dụng aceton) Tuy nhiên các dung môi sử dụng đều không thận thiện với môi trường nên cần chú ý nếu muốn nâng quy mô

1.4 Định hướng lựa chọn phương pháp nghiên cứu 1.4.1 Lựa chọn phương pháp định lượng pazopanib hydroclorid

Do pazopanib hydroclorid chưa có trong chuyên luận các dược điển, vì vậy chúng tôi dự kiến xây dựng phương pháp định lượng pazopanib hydroclorid bằng HPLC dựa theo các tài liệu tham khảo có uy tín đồng thời dựa trên khảo sát thực tế trên thiết bị Waters Acquity Arc Các điều kiện sắc ký khảo sát bao gồm: cột, pha động, bước sóng phát hiện, tốc độ dòng, thể tích tiêm mẫu và dung môi pha mẫu [4], [14], [15], [27]

Để khẳng định tính đúng đắn của phương pháp sắc ký HPLC mới xây dựng, chúng tôi tiến hành thẩm định phương pháp dựa theo Hướng dẫn của ASEAN về thẩm định quy trình phân tích Căn cứ vào Bảng hướng dẫn của ASEAN về các chỉ tiêu cần

thẩm định (Bảng 1.6), chúng tôi lựa chọn các chỉ tiêu thẩm định bao gồm: Độ đúng, độ

chính xác (độ lặp lại, độ chính xác trung gian), tính đặc hiệu, tính tuyến tính và khoảng xác định

Bảng 1.6 Các chỉ tiêu cần đánh giá trong quy trình thẩm định

Loại quy trình phân tích

Các chỉ tiêu

Định tính

Xác định tạp chất

Định lượng: - Độ hoà tan - Hàm lượng/

hoạt lực Định

lượng

Thử giới hạn

- Độ đúng - Độ chính xác

+ Độ lặp lại + Độ chính xác trung gian - Tính đặc hiệu (2)

- Giới hạn phát hiện (LOD)

- Giới hạn định lượng (LOQ)

- Tính tuyến tính - Khoảng xác định

- - - + - - - -

+ + +(1)

+ - (3)

+ + +

- - - + + - - -

+ + +(1)

+ - - + + Dấu - nhằm chỉ các chỉ tiêu này thông thường không cần phải đánh giá Dấu + nhằm chỉ các chỉ tiêu này cần phải đánh giá

(1) trong tường hợp đã tiến hành kiểm tra độ tái lặp thì độ chính xác trung gian không cần phải xem xét

(2) một quy trình phân tích kém đặc hiệu có thể được bổ trợ bằng một hay nhiều quy trình phân tích hỗ trợ khác

(3) có thể cần trong một số trường hợp

1.4.2 Lựa chọn phương pháp tinh chế pazopanib hydroclorid

Qua các phương pháp tinh chế đã đề cập ở trên, có thể thấy rằng có thể sử dụng nhiều loại dung môi khác nhau trong các phương pháp khác nhau Căn cứ vào khả năng hòa tan hoạt chất cũng như giá cả, độ thân thiện với môi trường của mỗi dung môi, trong khóa luận này, tôi dự kiến sử dụng 3 dung môi phổ biến trong phòng thí nghiệm là methanol, ethanol và isopropanol Kết hợp với các phương pháp kết tinh đã được các tác giả sử dụng thì đề tài này tôi dự định sẽ sử dụng phương pháp kết tinh làm lạnh và sử dụng đối dung môi Chất lượng mẫu pazopanib thu được sau tinh chế được đánh giá qua chỉ tiêu hàm lượng bằng phương pháp HPLC Nội dung chi tiết sẽ đươc trình bày và bàn luận ở các phần sau của khóa luận này

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Nguyên vật liệu và thiết bị

Các hóa chất, dung môi và các thiết bị sử dụng trong nghiên cứu được liệt kê trong

Bảng 2.1 và Bảng 2.2

Bảng 2.1 Danh mục nguyên liệu, hóa chất sử dụng

2 Acetonitril 99,9% HPLC Hàn quốc 3 Acid hydroclorid 37,0% AR Trung Quốc 4 Acid phosphoric ≥ 85% AR Trung Quốc

6 Ethyl acetat 99,5% AR Trung Quốc 7 Isopropanol 99,5% AR Trung Quốc 8 Methanol 99% AR Trung Quốc 9 Methanol 99,9% HPLC Merch, Đức 10 Natri hydroxyd 1M AR Trung Quốc

12 Nước cất 2 lần DĐVN V Việt Nam 13 Pazopanib hydroclorid chuẩn (Số lô: 1-KJK-151-1) HPLC TRC, Canada 14 Pazopanib mẫu chưa tinh chế tᵒnc = 300-303,5°C Lab THHD

Bảng 2.2 Danh mục các thiết bị sử dụng trong nghiên cứu

1 Bếp khuấy từ DaiHan, model: MSH – 20D Hàn Quốc 2 Bình cầu 1 cổ 100 mL, 250mL Đức 3 Bộ lọc chân không Trung Quốc 4 Bơm chân không tuần hoàn SHZ - DIII Trung Quốc 5 Cân kỹ thuật điện tử AND EK – 410i 400g Nhật Bản 6 Cân phân tích Sartorius TE241S Sartorius, Đức 7 Cốc có mỏ 50 mL, 100 mL, 250 mL, 500 mL Đức

11 Máy cô quay chân không, Model: 10 Digital Đức 12 Máy đo nhiệt độ nóng chảy EZ-Melt Hoa Kỳ 13 Máy sắc ký lỏng hiệu năng cao Waters Acquity Arc Mỹ 14 Tủ hút Unilab, model: B1200 Malaysia

2.2 Nội dung nghiên cứu

Để đạt được mục tiêu, nghiên cứu này đã tiến hành một số nội dung sau: - Xây dựng phương pháp xác định hàm lượng pazopanib hydroclorid - Khảo sát các phương pháp tinh chế pazopanib hydroclorid dựa trên các tài liệu

đã tham khảo - Khảo sát các yếu tố giúp nâng cao hiệu suất tinh chế của phương pháp đã lựa

• Điều kiện sắc ký: Pha tĩnh là cột C18 (250mm x 4,6mm, 5µm), nhiệt độ cột 30ᵒC

Pha động là dung dịch acid phosphoric 0,1% – acetonitril (55: 45) Tốc độ dòng

pha động là 1,0 mL/phút Thể tích tiêm 10 µL Bước sóng phát hiện 269nm

• Chuẩn bị mẫu định lượng

- Dung dịch chuẩn: Hòa tan chính xác khoảng 25mg pazopanib hydroclorid

chuẩn trong dung môi pha mẫu và pha loãng thành 50,0 mL với cùng dung môi

Lọc qua màng lọc 0,45 µm - Dung dịch thử: Hòa tan chính xác khoảng 25mg chế phẩm trong dung môi pha

mẫu và pha loãng thành 50,0 mL với cùng dung môi Lọc qua màng lọc 0,45

µm

• Tính toán kết quả định lượng

Hàm lượng pazopanib hydroclorid trong mẫu thử được tính toán theo công thức:

P (%) = S(t)

S(C)X

m(C)m(t)X

hàm lượng chuẩn(1 − hàm ẩm thử)X100

2.3.2 Khảo sát một số phương pháp tinh chế pazopanib hydroclorid

Dựa trên dung môi có sẵn có của phòng thí nghiệm Kỹ thuật Hóa dược và Chiết xuất và tính an toàn, giá cả của dung môi, nhóm nghiên cứu đã lựa chọn 3 dung môi để khảo sát phương pháp tinh chế là: methanol, ethanol 96° và isopropanol

Sau khi tham khảo một số tài liệu [10], [22], [23], nghiên cứu sẽ sử dụng các phương pháp dưới đây để thực hiện tinh chế pazopanib hydroclorid:

• Phương pháp kết tinh làm lạnh

Quy trình sẽ được tiến hành như sau: Hòa tan một lượng pazopanib hydroclorid thô vào một thể tích xác định dung môi (methanol, ethanol 96°, isopropanol hoặc hỗn hợp dung môi - nước) Nhiệt độ khối phản ứng có thể dao động từ nhiệt độ phòng đến nhiệt độ sôi của dung môi Sau một thời gian duy trì, đem cô dung dịch bay hơi dung môi còn một thể tích nhất định Làm lạnh dung dịch sau cô trong tủ đá (nhiệt độ dưới 0ºC) trong 12 giờ, cọ thành bình để kých thích hình thành mầm tinh thể Lọc sản phẩm kết tinh bằng phễu lọc Buchner, rửa bằng nước lạnh, sau đó sấy khô ở 40ºC trong 4-5h Quan sát cảm quan sản phẩm, đo nhiệt độ nóng chảy của sản phẩm thu được

• Phương pháp kết tinh sử dụng đối dung môi

Quy trình tiến hành của phương pháp này tiến hành như sau: Hòa tan một lượng pazopanib hydroclorid trong một thể tích xác định dung môi (methanol, ethanol 96° hoặc isopropanol) Nhiệt phản ứng có thể dao động từ nhiệt độ phòng đến nhiệt độ sôi của dung môi Sau một thời gian duy trì, đem dung dịch thu được cô bay hơi dung môi đến còn một thể tích nhất định Thêm một thể tích xác định đối dung môi vào dung dịch sau cô, khuấy đều tạo dung dịch đồng nhất Làm lạnh dung dịch sau khi thêm đối dung môi trong tủ đá (nhiệt độ dưới 0ºC) trong 12 giờ, cọ thành bình để kích thích hình thành mầm tinh thể Lọc sản phẩm kết tinh bằng phễu lọc Buchner, rửa bằng nước lạnh, sau đó sấy khô ở 40ºC trong 4-5h Quan sát cảm quan sản phẩm, đo nhiệt độ nóng chảy của sản phẩm thu được

CHƯƠNG 3 THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 3.1 Kết quả thực nghiệm

3.1.1 Xây dựng phương pháp định lượng pazopanib hydroclorid

3.1.1.1 Xây dựng phương pháp định lượng pazopanib hydroclorid

Pazopanib hydroclorid hiện chưa có chuyên luận riêng trong các dược điển Từ các tài liệu tham khảo chúng tôi nhận thấy hầu hết các tác giả sử dụng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao để xác định hàm lượng pazopanib hydroclorid trước và sau tinh chế Phương pháp cho kết quả đáng tin cậy và có độ chính xác cao nên được chúng tôi lựa chọn Dựa theo một số điều kiện sắc ký được công bố trong các TLTK [14], [15], chúng tôi đã tiến hành thực nghiệm trên thiết bị Waters Acquity Arc (Mỹ) và đã lựa chọn được một số điều kiện sắc ký như sau:

- Về cột sắc ký: Chúng tôi lựa chọn cột C18 (250 mm x 4,6 mm; 5µm) vì đây là

loại cột thông dụng, tách được nhiều hợp chất và cho hiệu lực tốt với pazopanib hydroclorid Nhiệt độ cột duy trì 30ᵒC cho áp suất và tR ổn định

- Về dung môi pha mẫu: do pazopanib hydroclorid tan trong hỗn hợp acetonitril: nước (50:50) ở điều kiện pha mẫu và đây là các dung môi thường dùng trong sắc ký lỏng hiệu năng cao nên chúng tôi lựa chọn hệ dung môi này

- Về pha động: Chúng tôi thử chạy sắc ký pazopanib hydroclorid chuẩn với pha

động như TLTK (acid ortho-phosphoric 0,1%: acetonitril) (55:45) cho kết quả pic

pazopanib hydroclorid xuất hiện tại vị trí có thời gian lưu vừa phải (tR~7,0), số đĩa lý thuyết 11196, hệ số kéo đuôi 1,11 Hệ dung môi phù hợp với mục tiêu định lượng Dung dịch acid ortho phosphoric 0,1 % được điều chỉnh đến pH 8 bằng dung dịch natri hydroxyd (pH thấp hơn cho thời gian lưu ngắn hơn nên không lựa chọn)

- Về bước sóng định lượng: Phổ UV trong dải bước sóng từ 210nm-400nm có hình

dạng như Hình 3.1 Tại bước sóng 269 ± 1 nm, độ hấp thụ đạt cực đại và đáp ứng tốt

nên chúng tôi lựa chọn bước sóng 269 nm Kết quả phù hợp với TLTK [14], [15]

Hình 3.1 Phổ UV của dung dịch pazopanib hydroclorid chuẩn

- Tốc độ dòng 1 mL/phút, thể tích tiêm mẫu 10L cũng phù hợp với điều kiện sắc ký thực tế và giống TLTK [14]

Từ các phân tích trên, chúng tôi đã lựa chọn các điều kiện sắc ký như Bảng 3.1

Dung môi pha mẫu Hỗn hợp acetonitril - nước (1: 1) Dung dịch acid phosphoric 0,1%: Hòa tan 1ml acid phosphoric trong 1000 ml nước, điều chỉnh pH 8 bằng dung dịch NaOH 1M

• Cách tiến hành

- Dung dịch chuẩn: Hòa tan chính xác khoảng 25 mg pazopanib hydroclorid chuẩn

trong dung môi pha mẫu và pha loãng thành 50,0 mL với cùng dung môi Lọc qua màng

lọc 0,45 µm Tiến hành sắc ký

- Dung dịch thử: Hòa tan chính xác khoảng 25 mg chế phẩm trong dung môi pha

mẫu và pha loãng thành 50,0 mL với cùng dung môi Lọc qua màng lọc 0,45 µm Tiến

hành sắc ký

- Kiểm tra khả năng thích hợp của hệ thống sắc ký: Tiêm 6 lần dung dịch chuẩn,

số đĩa lý thuyết tính trên pic pazopanib hydroclorid không được nhỏ hơn 2000, hệ số đối xứng của pic pazopanib không được lớn hơn 2,0 và độ lệch chuẩn tương đối của diện tích pic pazopanib không được lớn hơn 1,0 %

Tiến hành sắc ký lần lượt dung dịch chuẩn và dung dịch thử, ghi lại các sắc ký đồ Tính hàm lượng của pazopanib hydroclorid dựa vào diện tích pic thu được trên sắc ký đồ của dung dịch chuẩn, dung dịch thử; khối lượng cân; hàm lượng chuẩn; hệ số pha loãng và hàm lượng pazopanib hydroclorid chuẩn

3.1.1.2 Thẩm định quy trình định lượng pazopanib hydroclorid bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao

• Tính thích hợp của hệ thống

Tiến hành:

Chuẩn bị dung dịch chuẩn 1 và dung dịch chuẩn 2 (chuẩn kiểm tra) theo quy trình

ghi ở mục 3.1.1.1 (Hòa tan chính xác khoảng 25 mg pazopanib hydroclorid chuẩn trong

dung môi pha mẫu và pha loãng thành 50,0 mL với cùng dung môi Lọc qua màng lọc

0,45 µm) Khối lượng chuẩn 1 (m(C1)) = 0,0257g; khối lượng chuẩn 2 (m(C2)) =

0,0256g

Dung dịch chuẩn 1: Tiến hành sắc ký, tiêm lặp lại 06 lần, ghi lại các sắc ký đồ và các giá trị thời gian lưu (tR), diện tích pic (S), số đĩa lý thuyết (N), hệ số bất đối xứng của pic pazopanib hydroclorid Tính giá trị trung bình và RSD của các lần tiêm lặp lại

Dung dịch chuẩn 2: Tiến hành sắc ký, tiêm lặp lại 03 lần, ghi lại các sắc ký đồ Tính giá trị trung bình của các lần tiêm lặp lại của diện tích pic pazopanib hydroclorid

Tính hệ số tương đồng (RF) theo công thức sau:

RF = S(C2)S(C1)X

m(C2)m(C1)

Trong đó: S(C1) là diện tích pic pazopanib hydroclorid của dung dịch chuẩn 1

S(C2) là diện tích pic pazopanib hydroclorid của dung dịch chuẩn 2 m(C1) là khối lượng cân chuẩn pazopanib hydroclorid pha dung dịch chuẩn 1 m(C2) là khối lượng cân chuẩn pazopanib hydroclorid pha dung dịch chuẩn 2

Yêu cầu:

Giá trị RSD của thời gian lưu ≤ 1,0 % RSD của diện tích pic pazopanib hydroclorid ≤ 1,0 % (Đánh giá trên 6 lần tiêm của dung dịch chuẩn 1)

Số đĩa lý thuyết (N) tính trên pic pazopanib hydroclorid ≥ 2000 Hệ số đối xứng(Tf) của pic pazopanib hydroclorid ≤ 2,0

Bảng 3.3 Kết quả thử tính thích hợp của hệ thống với dung dịch chuẩn 2

1 6,981 21848420

RF =S(C2)S(C1)X

m(C2)m(C1) = 21816591

21732944X

0,02560,0257

Dung dịch thử: Chuẩn bị theo quy trình phân tích (Sử dụng dung dịch thử trong phần thẩm định độ lặp lại) (m thử = 0,0246g; hàm ẩm mẫu thử = 0,2 %) (01 lần tiêm)

Ghi lại sắc ký đồ, thời gian lưu của pazopanib hydroclorid trong sắc ký đồ dung dịch thử và dung dịch chuẩn

Kết quả:

Sắc ký đồ của dung môi pha mẫu không xuất hiện pic ở trong khoảng thời gian lưu

tương ứng với thời gian lưu của pic pazopanib hydroclorid (Phụ lục 10)

Thời gian lưu của pic pazopanib hydroclorid trên sắc ký đồ của dung dịch chuẩn và dung dịch thử giống nhau tR chuẩn = 6,982 phút, tR thử = 6,970 phút (Phụ lục 11)

Độ tinh khiết của pic pazopanib hydroclorid trên sắc ký đồ của dung dịch thử là 100 %

Nhận xét: Độ đặc hiệu đạt yêu cầu

• Độ chính xác ✓ Độ lặp lại

Tiến hành:

Tiến hành định lượng mẫu thử, thực nghiệm với 06 thử độc lập (mỗi thử tiêm 01 lần) Xác định hàm lượng hoạt chất có trong mẫu thử (sử dụng dung dịch chuẩn 1 ở mục tính thích hợp của hệ thống

Độ lặp lại của phương pháp được xác định bằng giá trị RSD (%) của các kết quả xác định hàm lượng pazopanib hydroclorid thu được từ mẫu thử

Yêu cầu: Giá trị RSD (%) của các kết quả định lượng mẫu thử phải ≤ 2 %

Kết quả: Kết quả khảo sát độ lặp lại được trình bày trên Bảng 3.4:

Bảng 3.4 Kết quả khảo sát độ lặp lại

STT m (mg) S (μV.sec) KQ định lượng (%) Phụ lục

1 24,9 20953615 99,71 Sắc ký đồ 12 2 25,2 21199882 99,68 Sắc ký đồ 13 3 25,1 21084329 99,53 Sắc ký đồ 14 4 24,6 20703507 99,72 Sắc ký đồ 15 5 24,9 20921896 99,56 Sắc ký đồ 16 6 24,8 20833728 99,54 Sắc ký đồ 17

Dung dịch chuẩn 1: m(ch1) = 25,8mg pha trong bình định mức 50 mL bằng dung

môi pha mẫu Lọc qua màng lọc 0,45 μm và tiến hành sắc ký

Dung dịch chuẩn 2: m(ch2) = 25,7mg pha trong bình định mức 50 mL bằng dung

môi pha mẫu Lọc qua màng lọc 0,45 μm và tiến hành sắc ký

Dung dịch thử: Hòa tan chính xác khoảng 25,0mg chế phẩm trong dung môi pha

mẫu và pha loãng thành 50,0 mL với cùng dung môi Lọc qua màng lọc 0,45 µm và tiến

hành sắc ký Hàm lượng pazopanib hydroclorid trong chế phẩm được tính dựa vào lượng cân chuẩn, hàm lượng chuẩn, diện tích pic pazopanib hydroclorid của dung dịch chuẩn 1 và dung dịch thử, hệ số pha loãng của dung dịch chuẩn và dung dịch thử

Yêu cầu:

Giá trị RSD (%) kết quả định lượng của mỗi kiểm nghiệm viên thử nghiệm (n = 6) phải ≤ 2 % và của cả 2 kiểm nghiệm viên thử nghiệm (n = 12) phải ≤ 2 %

Kết quả: Kết quả thu được từ các lần tiêm lặp lại của dung dịch chuẩn 1 (ch1) và dung dịch

chuẩn 2 (ch2) được trình bày trên Bảng 3.5

m(ch2)m(ch1)=

2183183421845005X

0,02570,0258 = 1,003

Bảng 3.6 Kết quả thử tính thích hợp của hệ thống 2

STT m (mg) S pic (μV.sec) Hàm lượng (%) Phụ lục

1 24,7 20794380 99,63 Sắc ký đồ 27 2 24,7 20764338 99,49 Sắc ký đồ 28 3 24,4 20551877 99,68 Sắc ký đồ 29 4 24,6 20733126 99,74 Sắc ký đồ 30 5 24,7 20756652 99,45 Sắc ký đồ 31 6 24,4 20510009 99,47 Sắc ký đồ 32

Trung bình 99,58

Kết quả định lượng của 2 người thực hiện: Bảng 3.4 và Bảng 3.6

Trung bình kết quả định lượng của 2 người thực hiện (n = 12) là 99,60 % RSD của các kết quả định lượng của 2 người thực hiện (n = 12) là 0,105 (< 2 %)

Chuẩn bị 05 dung dịch chuẩn pazopanib hydroclorid theo cách pha dung dịch chuẩn trong tiêu chuẩn với nồng độ 50%, 80%, 100%, 120%, 150% so với nồng độ định lượng ghi trong tiêu chuẩn

Tiến hành sắc ký các dung dịch chuẩn (mỗi dung dịch tiêm 01 lần), ghi lại các sắc ký đồ và xác định đáp ứng của pic

Xác định phương trình hồi quy tuyến tính, hệ số tương quan tuyến tính giữa diện

tích pic và nồng độ dung dịch pazopanib hydroclorid chuẩn gốc theo Bảng 3.7 có trong

các dung dịch chuẩn và đáp ứng của pic thu được trên sắc ký đồ bằng phương pháp bình phương tối thiểu Thiết lập phương trình hồi quy tuyến tính y = ax + b và hệ số tương quan tuyến tính R2

Kết quả: Kết quả khảo sát độ tuyến tính chuẩn pazopanib hydroclorid được thể hiện trên

Bảng 3.7

Bảng 3.7 Kết quả khảo sát độ tuyến tính

STT

% nồng độ định lượng

V chuẩn gốc (mL)

Bình định mức (mL)

C

(μg/mL) S (μV.sec)

Phụ lục

1 50 2,5 25 256,20 10787788 Sắc ký đồ 33 2 80 4 25 409,92 17412124 Sắc ký đồ 34

Hình 3.2 Đồ thị biểu diễn tính tuyến tính dung dịch chuẩn pazopanib hydroclorid

Nhận xét:

Từ kết quả thu được ở Bảng 3.7 và Hình 3.2, chúng tôi kết luận quy trình thử đạt

yêu cầu về độ tuyến tính

• Độ đúng

Tiến hành:

Chuẩn bị các dung dịch khảo sát: Cân chính xác một lượng pazopanib hydroclorid chuẩn khoảng 20 mg, 25 mg và 30 mg (tương ứng với mẫu tự tạo chứa 80 %, 100 % và 120 % lượng pazopanib hydroclorid so với nồng độ định lượng vào bình định mức 50 ml, hòa tan và pha loãng vừa đủ thể tích bằng dung môi pha mẫu Lọc qua màng lọc 0,45 μm và tiến hành đo HPLC

R² = 0,998S = 39744 C + 956806

05000000100000001500000020000000250000003000000035000000

Phân tích mẫu theo quy trình định lượng (mỗi mẫu tiêm 01 lần) Xác định hàm lượng pazopanib hydroclorid trong các mẫu tự tạo (lượng hoạt chất tìm thấy), sử dụng dung dịch chuẩn 1 ở mục xác định tính thích hợp của hệ thống

Xác định độ đúng của phương pháp theo công thức:

Độ đúng = Lượng hoạt chất tìm thấy

Lượng hoạt chất thêm vàox 100 =m tìm lại

m thực x 100 = Si

STBx

m (C)m cânx 100 Trong đó

Si là diện tic của pic ở các mẫu đo, m cân là khối lượng các mẫu cân STB là diện tích pic trung bình, m (C) là khối lượng cân của dung dịch chuẩn 1 ở mục xác định tính thích hợp của hệ thống

(STB = 21732944 μV.sec), m(C) = 25,7 mg; hàm lượng chuẩn 100 %)

m cân (mg)

m thực (mg)

S pic

(μV.sec)

m tìm lại (mg)

% thu hồi

1 80 20,4 20,4 17025388 20,13 98,69 2 80 20,5 20,5 17043021 20,15 98,31 3 80 20,6 20,6 17080205 20,20 98,05

4 100 25,8 25,8 21608678 25,55 99,04 5 100 25,9 25,9 21632649 25,58 98,77 6 100 25,8 25,8 21607641 25,55 99,04

7 120 30,2 30,2 25025989 29,59 97,99 8 120 30,1 30,1 24965048 29,52 98,08 9 120 30,1 30,1 24997718 29,56 98,21

• Khoảng xác định

Khoảng xác định được suy ra từ kết quả thẩm định độ tuyến tính và độ đúng Giới hạn chấp nhận tối thiểu là 90 % - 110 % nồng độ dung dịch định lượng Khoảng xác định là 80 % - 120 % nồng độ dung dịch định lượng

3.1.2 Đánh giá chất lượng mẫu chuẩn và mẫu chưa tinh chế

Pazopanib hydroclorid mẫu chưa tinh chế có màu trắng ngà, dạng tinh thể, nhiệt độ nóng chảy 300,0- 303,5°C

Định lượng hàm lượng pazopanib hydroclorid trong mẫu chuẩn và mẫu chưa tinh chế bằng phương pháp HPLC thu được kết quả như sau:

Bảng 3.9 Kết quả phân tích mẫu chuẩn và mẫu chưa tinh chế

(mg)

tR (phút)

S pic (μV.sec)

Hàm lượng

3.1.3 Khảo sát một số phương pháp tinh chế pazopanib hydroclorid

3.1.3.1 Tiến hành tinh chế theo phương pháp kết tinh làm lạnh

• Phương pháp tinh chế sử dụng đơn dung môi

Cách tiến hành

Hòa tan 2,0g pazopanib hydroclorid vào bình cầu 1 cổ trong một thể tích nhất định dung môi (MeOH hoặc EtOH hoặc IPA) Đun hồi lưu khối phản ứng trong 1h ở nhiệt độ 60-70°C Cô bay hơi một phần dung môi dưới áp suất giảm ở 50°C đến khi còn lại khoảng 1/4 lượng dịch ban đầu Làm lạnh dung dịch sau cô trong tủ đá 12h, cọ thành bình để kích thích hình thành mầm tinh thể Lọc sản phẩm rắn qua phễu lọc Buchner, rửa bằng nước lạnh hoặc aceton, sau đó sấy trong tủ sấy chân không ở 40ºC trong 5h

Thể tích dung môi (mL)

msp (g)

Hiệu suất

1 MeOH 2,0045 150 1,2780 63,76 301,2- 305,0 3 IPA 2,0003 210 1,1868 59,33 301,4- 304,1 2 EtOH 2,0106 180 1,0039 49,93 293,1- 296,0

Bảng 3.11 Kết quả định lượng 1

ẩm

m (mg)

tR (phút)

S pic

(μV.sec)

Hàm lượng

(%)

Phụ lục

1 MeOH 0,008

24,1 7,044 19169834 95,94 Sắc ký đồ 50

2 MeOH 7,039 19284852 96,52 Sắc ký đồ 51

TB 19227343 96,23

RSD (%) 0,42 3 IPA

0,008 24,1 7,033 19309737 96,64 Sắc ký đồ 52 4 IPA 7,024 19307107 96,63 Sắc ký đồ 53

TB 19308422 96,64

RSD (%) 0,01 5 EtOH

Kết quả

Pazopanib hydroclorid sau tinh chế có màu trắng, dạng bột mịn Khảo sát hiệu suất và hàm lượng pazopanib hydroclorid sau tinh chế được trình

bày qua Bảng 3.12 và Bảng 3.13:

Bảng 3.12 Hiệu suất tinh chế trong hệ dung môi hữu cơ - nước

STT Hệ dung môi mnl

(g)

Thể tích dung môi

(mL)

msp (g) Hiệu

suất (%) t

1 MeOH - H2O 2,0090 110 1,2903 64,23 301,3-303,5 2 IPA - H2O 2,0035 165 1,3007 64,92 300,5-302,4 3 EtOH - H2O 2,0008 132 1,2548 62,71 300,1-303,2

Bảng 3.13 Kết quả định lượng 2

(mg)

tR (phút)

S pic (μV.sec)

Hàm lượng (%) Phụ lục

Trong 3 hệ dung môi đã khảo sát, phương pháp cho hiệu quả tinh chế tốt với methanol và isopropanol

• Phương pháp tinh chế sử dụng hệ dung môi hữu cơ – acid hydrocloric

Cách tiến hành

Trong bình cầu 1 cổ, hòa tan 2,0 g pazopanib hydroclorid trong một thể tích nhất định dung môi methanol, thêm từ từ acid hydrocloric đặc (0,2 mL) Đun hồi lưu khối phản ứng trong 1h ở 60 - 70°C Cô bay hơi một phần dung môi dưới áp suất giảm ở 50°C đến còn khoảng 1/4 thể tích ban đầu Làm lạnh dung dịch sau cô trong tủ đá 12h, cọ thành bình để kích thích hình thành mầm tinh thể Lọc chất rắn qua phễu lọc Buchner, rửa bằng nước lạnh hoặc aceton, sấy khô chân không ở 40°C trong 5h Tiến hành tương tự với dung môi ethanol và isopropanol

Kết quả

Pazopanib hydroclorid thu được dạng bột, có màu trắng hơn nguyên liệu ban đầu

Bảng 3.14 Hiệu suất tinh chế sử dụng hệ dung môi hữu cơ – acid hydroclorid

STT Dung môi mnl

(g)

Thể tích dung môi (mL)

msp (g)

Hiệu suất

1 MeOH-HCl 2,0005 60 1,3650 68,23 300,8-305,5 2 IPA- HCl 2,0007 100 1,2276 61,36 299,8-306,0 3 EtOH-HCl 2,0024 90 1,4012 66,98 298,7-303,4

Bảng 3.15 Kết quả định lượng 3

(mg)

tR (phút)

S pic

(μV.sec)

Hàm lượng

Từ kết quả được trình bày ở Bảng 3.14 và Bảng 3.15, phương pháp sử dụng 1

dung môi hữu cơ và acid hydroclorid làm giảm lượng dung môi để hòa tan nguyên liệu nhưng khoảng nhiệt độ nóng chảy đã bị tăng lên và hàm lượng pazopanib bị giảm

• Phương pháp tinh chế sử dụng hệ dung môi hữu cơ – nước – acid hydrocloric

Cách tiến hành

Trong bình cầu 1 cổ, hòa tan 2,0g pazopanib hydroclorid trong hệ dung môi methanol – nước (10:1) và thêm từ từ acid hydrocloric đặc (0,2 mL) Đun hồi lưu khối phản ứng trong 1h ở 60- 70°C Cô bay hơi một phần dung môi dưới áp suất giảm ở 50°C đến còn khoảng 1/4 thể tích ban đầu Làm lạnh dung dịch sau cô trong tủ đá 12h, cọ thành bình để kích thích hình thành mầm tinh thể Lọc chất rắn qua phễu lọc Buchner,

rửa bằng nước lạnh hoặc aceton, sấy khô chân không ở 40°C trong 5h Tiến hành tương tự với hệ dung môi ethanol – nước và isopropanol – nước

Kết quả

Sản phẩm thu được có dạng bột, màu trắng hơn so với nguyên liệu

Bảng 3.16 Hiệu suất tinh chế sử dụng hệ dung môi hữu cơ- nước- acid hydrocloric

(g)

Thể tích dung môi (mL)

msp (g)

Hiệu suất (%) t

1 MeOH - H2O - HCl 2,0010 44 1,2645 63,19 301,7-304,8 2 IPA - H2O - HCl 2,0006 66 1,0274 51,35 300,8-304,5 3 EtOH- H2O - HCl 2,0014 49,5 1,3005 64,50 300,7-305,9

Bảng 3.17 Kết quả định lượng 4

ẩm

m (mg)

tR (phút)

Từ kết quả ở Bảng 3.16 và Bảng 3.17, phương pháp tinh chế sử dụng hệ dung môi

hữu cơ - nước đồng thời cho thêm acid hydrocloric không làm hiệu suất có sự thay đổi đáng kể so với phương pháp khác nhưng lại làm hàm lượng pazopanib hydroclorid bị giảm đáng kể

3.1.3.2 Tiến hành tinh chế theo phương pháp kết tinh làm lạnh sử dụng đối dung môi Cách tiến hành

Nạp 2,0g pazopanib hydroclorid vào bình cầu 1 cổ, thêm từ từ dung môi đến khi thu được dung dịch đồng nhất Đun hồi lưu khối phản ứng trong 1h ở 60 - 70°C thu được dung dịch trong suốt Cô bay hơi một phần dung môi dưới áp suất giảm ở 50°C đến còn 1/4 thể tích ban đầu Thêm ethyl acetat vào dung dịch sau cô với lượng ethyl acetat gấp đôi lượng dịch còn lại Làm lạnh dung dịch trong tủ đá 12h, cọ thành bình để kích thích

hình thành mầm Lọc chất rắn qua phễu lọc Buchner, rửa bằng nước lạnh hoặc aceton, sấy khô chân không ở 40°C trong 5h Tiến hành tương tự với dung môi ethanol và isopropanol

Kết quả

Sản phẩm sau khi lọc sấy có dạng bột mịn, màu trắng hơn nguyên liệu

Bảng 3.18 Hiệu suất tinh chế theo phương pháp kết tinh sử dụng đối dung môi

STT Dung môi Đối dung

môi

mnl (g)

msp (g)

m (mg)

tR (phút)

S pic

(μV.sec)

Hàm lượng (%)

Nhận xét chung

- Việc sử dụng HCl trong tinh chế làm giảm chất lượng sản phẩm

- Việc sử dụng EtOH trong tinh chế pazopanib hydroclorid ở các điều kiện khác nhau (kết hợp với nước, với ethylacetat, với acid hydrocloric) làm giảm chất lượng mẫu

cả về hàm lượng và độ tinh khiết

- Việc sử dụng hệ dung môi hữu cơ – ethyl acetat trong tinh chế không làm tăng

chất lượng sản phẩm nhiều nên cũng cần cân nhắc khi lựa chọn phương pháp này

- Phương pháp tinh chế sử dụng hỗn hợp 1 dung môi hữu cơ với nước cho sản phẩm tinh khiết hơn Hiệu quả sử dụng isopropanol và methanol tương tự như nhau Do hiệu suất tinh chế còn chưa cao nên chúng tôi sẽ khảo sát một số yếu tố để nâng cao hiệu

suất

3.1.4 Khảo sát các yếu tố nâng cao hiệu suất tinh chế

Qua quá trình khảo sát các phương pháp tinh chế với các dung môi khác nhau thì hiệu quả sử dụng isopropanol và methanol khác biệt không đáng kể Tuy nhiên methanol - một dung môi không được khuyến khích sử dụng trong công nghiệp nên chúng tôi sẽ sử dụng dung môi isopropanol để khảo sát các yếu tố nhằm nâng cao hiệu suất tinh chế Bên cạnh đó, qua việc khảo sát 2 phương pháp tinh chế thì việc thêm đối dung môi không cải thiện được chất lượng của sản phẩm nên chúng tôi sẽ lựa chọn phương pháp kết tinh làm lạnh để tiến hành khảo sát nâng cao hiệu suất tinh chế

3.1.4.1 Khảo sát ảnh hưởng của tỷ lệ chất tan/ dung môi đến quá trình kết tinh Cách tiến hành

Cân 1,0g pazopanib hydroclorid cho vào bình cầu đáy tròn 1 cổ, thêm một lượng isopropanol thích hợp vào bình cầu Sau đó tiến hành đun nóng đến 70℃ để hoà tan hết nguyên liệu Cô bay hơi 1 phần dung môi đến khi còn khoảng 1/4 dịch ban đầu Dung dịch đã cô đưa về nhiệt độ phòng, sau đó được làm lạnh trong tủ đá qua đêm Sản phẩm kết tinh được lọc, rửa bằng nước lạnh, sấy chân không ở 40℃ trong 5h Cân, tính hiệu suất Đánh giá quá trình kết tinh của pazopanib bằng dung môi IPA được đưa ra theo

Bảng 3.20 Bảng 3.20 Kết quả khảo sát tỉ lệ pazopanib hydroclorid/ IPA đến hiệu suất quá

trình kết tinh

STT Tỷ lệ chất tan: dung môi

(g/mL) Hiệu suất kết tinh tonc (oC)