đinh thị thêu đánh giá tác dụng trên ruồi giấm chuyển gen happ mang kiểu hình bệnh alzheimer của phần trên mặt đất rau má centella asiatica l urb

Đánh giá tác dụng cải thiện hành vi của cao chiết nước từ Rau má trên mô hình ruồi giấm chuyển gen hAPP mang kiểu hình bệnh Alzheimer .... Kết quả đánh giá tác dụng của cao chiết nước Ra

BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

- -

ĐINH THỊ THÊU Mã sinh viên: 1901659

ĐÁNH GIÁ TÁC DỤNG TRÊN RUỒI GIẤM CHUYỂN GEN hAPP MANG KIỂU

Tiếp đến, em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến PGS.TS Nguyễn Hoàng Tuấn,

khoa Dược liệu – Dược học cổ truyền, Trường Đại học Dược Hà Nội Thầy đã cho em cơ hội nghiên cứu khoa học trong một môi trường chuyên nghiệp, luôn giúp đỡ, quan tâm sát sao và cho em những lời khuyên quý báu trong quá trình thực hiện khóa luận của mình Em xin chân thành cảm ơn !

Em cũng xin được gửi lời cảm ơn chân thành đến anh Nguyễn Văn Hiệp, chị Đinh Thị Minh, anh Lều Khánh Duy cùng các anh chị và các cô tại khoa Dược lý –

Sinh hóa, Viện Dược liệu đã giúp đỡ, hướng dẫn kỹ thuật và tạo điều kiện tốt nhất cho em trong suốt thời gian em tham gia nghiên cứu thực nghiệm tại khoa

Em xin cảm ơn các bạn bè của mình đã luôn đồng hành cùng em trong suốt những

năm tháng học tập tại trường Xin cảm ơn bạn Lê Thị Mai Linh và các bạn cùng thực

hiện khóa luận tại khoa Dược lý – Sinh hóa, Viện Dược liệu đã luôn gắn bó, động viên, giúp đỡ, sẻ chia cùng nhau suốt quãng đường vừa qua

Cuối cùng, em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến bố mẹ và tất cả những người thân trong gia đình em, những người đã luôn yêu thương, ủng hộ để em có được ngày hôm nay

Do thời gian làm thực nghiệm cũng như kiến thức của bản thân còn hạn chế, nên khóa luận không tránh khỏi thiếu sót Em rất mong nhận được sự góp ý của các thầy cô, bạn bè để khóa luận được hoàn thiện hơn Em xin chân thành cảm ơn!

Hà Nội, ngày 02 tháng 06 năm 2024

Sinh viên

Đinh Thị Thêu

1.2.5 Một số mô hình nghiên cứu gây bệnh Alzheimer trên ruồi giấm 11

1.3 Tổng quan về ruồi giấm 11

1.3.1 Đặc điểm hình thái của ruồi giấm 11

1.3.2 Hệ gen của ruồi giấm 11

1.3.3 Chu kỳ vòng đời của ruồi giấm 12

CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 13

2.1 Nguyên vật liệu, thiết bị 13

2.1.1 Đối tượng nghiên cứu 13

2.1.2 Chủng ruồi nghiên cứu 13

2.1.3 Dụng cụ, hóa chất, thiết bị 14

2.2 Phương pháp nghiên cứu 15

2.2.1 Chuẩn bị ruồi phục vụ nghiên cứu 15

2.2.2 Phương pháp nghiên cứu tác dụng cải thiện hành vi 17

2.2.4 Phương pháp xử lý số liệu 24

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 25

3.1 Đánh giá tác dụng cải thiện hành vi của cao chiết nước từ Rau má trên mô hình ruồi giấm chuyển gen hAPP mang kiểu hình bệnh Alzheimer 25

3.1.1 Kết quả đánh giá khả năng học tập và ghi nhớ mùi của ấu trùng ruồi giấm chuyển gen hAPP mang kiểu hình bệnh Alzheimer của cao chiết nước Rau má 25 3.1.2 Kết quả đánh giá tác dụng của cao chiết nước Rau má đối với hành vi di chuyển của ấu trùng ruồi giấm chuyển gen hAPP mang kiểu hình bệnh Alzheimer 26

3.1.3 Kết quả đánh giá tác dụng của cao chiết nước Rau má đối với hành vi leo trèo của ruồi giấm trưởng thành chuyển gen hAPP mang kiểu hình bệnh Alzheimer 27

3.2 Kết quả đánh giá tác dụng chống oxy hóa ex vivo của cao chiết nước Rau má trên mô hình ruồi giấm chuyển gen hAPP mang kiểu hình bệnh Alzheimer 28

CHƯƠNG 4: BÀN LUẬN 30

4.1 Về mô hình nghiên cứu 30

4.1.1 Về việc lựa chọn mô hình ruồi giấm mang bệnh Alzheimer 30

4.1.2 Về việc lựa chọn dược liệu nghiên cứu 30

4.1.3 Về việc lựa chọn mức liều sử dụng 31

4.2 Về các kết quả nghiên cứu 31

4.2.1 Kết quả đánh giá khả năng học tập và ghi nhớ mùi của ấu trùng ruồi giấm chuyển gen hAPP mang kiểu hình bệnh Alzheimer của cao chiết nước Rau má 31

4.2.2 Kết quả đánh giá tác dụng của cao chiết nước Rau má đối với hành vi di chuyển của ấu trùng ruồi giấm chuyển gen hAPP mang kiểu hình bệnh Alzheimer 32

4.2.3 Kết quả đánh giá tác dụng của cao chiết nước Rau má đối với hành vi leo trèo của ruồi giấm trưởng thành chuyển gen hAPP mang kiểu hình bệnh Alzheimer 32

4.2.4 Kết quả đánh giá tác dụng chống oxy hóa ex vivo của cao chiết nước Rau má trên mô hình ruồi giấm chuyển gen hAPP mang kiểu hình bệnh Alzheimer 33

KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 35

TÀI LIỆU THAM KHẢO 1

PHỤ LỤC 6

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT

Viết tắt Viết đầy đủ theo Tiếng Anh Viết đầy đủ theo Tiếng Việt AChE Acetylcholinesterase Acetylcholinesterase

AD Alzheimer’s disease Bệnh Alzheimer ALT Alanine transaminase Enzyme alanine transaminase AM n – Amyl acetate n – Amyl acetate

APP amyloid precursor protein Gen APP AST Aspartate transaminase Enzyme aspartat transaminase

GWAS Genome-wide association

HPLC High Performance Liquid

Chromatography Sắc ký lỏng hiệu năng cao MAPK Mitogen activated protein

NTF Neurofibrillary tangles Đám rối sợi thần kinh

PBS Phosphate-buffered saline Đệm phosphat PI3K Phosphatidylinositol 3-kinase Phosphatidylinositol 3-kinase

SOD Superoxide dismutase Enzym superoxid dismutase TBA Thiobarbituric acid Acid thiobarbituric

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 2 1 Hóa chất, thuốc thử 14 Bảng 2 2 Dụng cụ, thiết bị 14

Bảng 2 3 Nồng độ hệ dung môi pha động chạy HPLC theo thời gian Error! Bookmark not defined

Bảng 2 4 Thành phần thức ăn ruồi giấm 16

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, SƠ ĐỒ, ĐỒ THỊ

Hình 1 1 Cây Rau má Centella asiatica (L.) Urb [4], [13] 3

Hình 1 2 Cấu trúc các saponin triterpennoid trong Rau má 4

Hình 1 4 Sơ đồ phân tầng APP [29] 8

Hình 1 5 Mô phỏng sự phosphoryl hóa Tau [29] 9

Hình 1 6 Chu kỳ vòng đời của ruồi giấm 12

Hình 2 1 Sơ đồ chiết xuất cao chiết nước Rau má 13

Hình 2 2 Sơ đồ phương pháp nghiên cứu 15

Hình 2 3 Thí nghiệm đánh giá khả năng hành vi leo trèo của ruồi giấm trưởng thành 18

Hình 2 4 Thí nghiệm đánh giá khả năng vận động của ấu trùng ruồi giấm 20

Hình 2 5 thí nghiệm đánh giá khả năng hành vi leo trèo của ruồi giấm trưởng thành 21

Hình 2 6 Phản ứng giữa MDA và TBA 23

Hình 3 1 Kết quả đánh giá khả năng ghi nhớ ngắn hạn của ấu trùng ruồi giấm 25

Hình 3 2 Kết quả đánh giá khả năng di chuyển của ấu trùng ruồi giấm bậc 3 26 Hình 3 3 Kết quả đánh giá khả năng vận động của ruồi giấm trưởng thành bằng thử nghiệm leo trèo ở các thời điểm 7, 14, 21 ngày tuổi 28

Hình 3 4 Kết quả đánh giá tác dụng chống oxy hóa ex vivo của cao chiết nước từ RM trên mô hình ruồi giấm chuyển gen mang bệnh Alzheimer 29

ĐẶT VẤN ĐỀ

Alzheimer (AD) là một bệnh lý nhận thức thần kinh tiến triển chậm bao gồm những thay đổi về nhận thức, tính cách, hành vi và là nguyên nhân phổ biến nhất của sa sút trí tuệ, chiếm tới 60 – 80% nguyên nhân sa sút trí tuệ ở người cao tuổi [53], [62] Các triệu chứng của bệnh bao gồm: Mất trí nhớ, khó khăn thực hiện các công việc quen thuộc, gặp vấn đề về ngôn ngữ, rối loạn định hướng, giảm khả năng đánh giá nhận xét, tư duy Do đó gây ảnh hưởng nghiêm trọng đến khả năng hoạt động hằng ngày và chất lượng cuộc sống của bệnh nhân cũng như người nhà Alzheimer tạo ra gánh nặng về bệnh tật và chi phí y tế vô cùng to lớn, ước tính lên tới 345 tỷ đô la vào năm 2023 cho nhóm bệnh nhân từ 65 tuổi trở lên, chi phí cho mỗi người gấp 3 lần so với một người già không mắc bệnh Alzheimer [58] Tuy nhiên việc sử dụng các nhóm thuốc trong điều trị như nhóm thuốc chống loạn thần, thuốc ức chế cholinesterase, donepezil, memantine đều cho thấy kém hiệu quả và ngày càng có nhiều lo ngại về khả năng xảy ra các tác dụng phụ bao gồm đột quỵ và tử vong [45], [15] Vì vậy, các nghiên cứu phát triển thuốc mới có nguồn gốc từ dược liệu với hy vọng an toàn, vượt trội hơn so với các nhóm thuốc trước đây được đang được quan tâm và kỳ vọng

Rau má (RM) có tên khoa học Centella asiatica (L.) Urb thuộc chi Centella Ở

một số nước trên thế giới, Rau má được biết đến như một thảo dược tiềm năng bảo vệ thần kinh [23], [9] Trong đó, ở Ấn Độ chiết xuất Rau má từ lâu đã được sử dụng để giúp cải thiện khả năng học tâp và trí nhớ [11], nhiều nghiên cứu hiện nay phát hiện có tác dụng bảo vệ chống lại sự suy giảm khả năng vận động, lão hóa tế bào thần kinh dopamin trong bệnh lý thần kinh như Parkinson, Alzheimer [43], [42], [19] Ở Việt Nam, đã có báo cáo chứng minh tác dụng chống oxy hóa của cao chiết ethanol Rau má [7] Tuy nhiên, nghiên cứu về tác dụng của Rau má nhằm hỗ trợ điều trị bệnh Alzheimer vẫn

còn rất hạn chế Do đó, chúng tôi thực hiện đề tài “Đánh giá tác dụng trên ruồi giấm chuyển gen hAPP mang kiểu hình bệnh Alzheimer của phần trên mặt đất Rau má

(Centella asiatica (L.) Urb.)” với 2 mục tiêu cụ thể như sau:

1 Đánh giá tác dụng cải thiện hành vi của cao chiết nước từ Rau má trên mô hình ruồi giấm chuyển gen hAPP mang kiểu hình bệnh Alzheimer

2 Đánh giá tác dụng chống oxy hóa ex vivo của cao chiết nước từ Rau má trên mô

hình ruồi giấm chuyển gen hAPP mang kiểu hình bệnh Alzheimer

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan về dược liệu

1.1.1 Tên gọi

• Tên khoa học: Centella asiatica (L.) Urb.[4]

• Tên nước ngoài: Phanok (Vientian), trachiek ktranh (Campuchia), Gotu Kola (Anh), Centelle, Bévillacque (Pháp), Brahmi (Ấn Độ) [24]

• Tên tiếng việt: Rau má, Tích tuyết thảo, Liên tiền thảo [2], [4]

Lá mọc xen kẽ nhau thành cụm ở đốt thân, nhẵn hai mặt, hình mắt chim, khía tai bèo, rộng 2-4cm, cuống dài 2-4cm trong những nhánh mang hoa và dài 10-12cm trong những nhánh thường [4], [13]

Cụm hoa hình tán đơn mọc ở kẽ lá gồm 1-5 hoa nhỏ không cuống màu trắng hoặc phớt đỏ Hoa giữa không có cuống, tổng bao có 2 hoặc 3 mảnh hình trái xoan lõm, dạng màng, cánh hoa hình tam giác hoặc trái xoan; nhị có chỉ nhị ngắn, bao phấn hình mắt chim; bầu hình cầu [4]

Quả dẹt, rộng 3-5 cm có sống hơi rõ, màu nâu đen, đỉnh lõm, có 7-9 cạnh lồi, nhẵn hoặc có lông nhỏ, có vân mạng

Toàn cây khi tươi có vị đắng, hăng hơi khó chịu, khi khô thì chỉ còn mùi cỏ khô Sinh thái: Cây mọc thành đám trên các bãi hoang, bờ ruộng, ven đường, dọc đường sắt, nơi ẩm mát, mùa ra quả kéo dài từ tháng 4 đến tháng 6

Hình 1 1 Cây Rau má Centella asiatica (L.) Urb [4], [13]

1.1.4 Phân bố

Rau má nguồn gốc từ các nước như vùng nhiệt đới: Ấn Độ, Sri Lanka, Trung Quốc, Indonesia và Malaysia, Nam Phi và Madagascar [24] Tại Việt Nam, cây Rau má mọc hoang hoặc được trồng phổ biến khắp nơi từ Bắc vào Nam Cây thường được tìm thấy tại những chỗ ẩm mát, gần kênh mương [4]

1.1.5 Thành phần hóa học

Có rất nhiều nghiên cứu về thành phần hóa học của Rau má, tuy nhiên, chưa có sự thống nhất giữa kết quả nghiên cứu này Thành phần hóa học và tỉ lệ phần trăm các hợp chất trong Rau má sẽ tùy theo điều kiện tự nhiên của khu vực hay mùa thu hái mà có sự thay đổi Một số hợp chất phổ biến được biết đến như: saponin, alkaloid, flavonoid, tinh dầu, các hợp chất polyacetylen saccharid, beta caroten, sterol, tanin, oligosaccharid (centelose) [50] Ngoài ra còn có chứa một lượng nhỏ vitamin bao gồm: B, C, K, E;

một số khoáng chất: sắt, calci, kali, magie [6], [13] - Saponin

Phần trên mặt đất của cây Rau má có các saponin triterpen 5 vòng và các sapogenin của chúng, chủ yếu thuộc nhóm ursan Một số ít thuộc nhóm oleanan và lupan Các hợp chất triterpenoid thuộc nhóm ursan được xem là hoạt chất chính trong Rau má [6] Cho đến nay đã có hơn 20 chất đã được phân lập với hơn nửa trong số đó là các saponosid Các saponin quan trọng trong Rau má là: asiaticosid, madecassosid Ngoài ra còn có một số saponin có cấu trúc uran khác với hàm lượng thấp như: thankunisid, isothankunisid [36] Các acid trong Rau má là acid asiatic, acid brahmic, acid

isobrahmic Theo Tổ chức Y tế Thế giới (WHO), dược liệu Rau má không được chứa dưới 2% triterpene ester glycosid asiaticoside và madecassosid [24]

Acid asiatic H CH2OH H Acid madecassic OH CH2OH H Acid madasiatic OH CH3 HAsiaticoid H CH2OH Glu-Glu-Rham Madecassosid OH CH2OH Glu-Glu-Rham

Hình 1 2 Cấu trúc các saponin triterpennoid trong Rau má - Flavonoid

Trong rau má có các flavonoid là: kaempferol, quercetin, catechin, epicatechin, rutin, apigenin và naringin, 3-glucosyl quercetin, 3-glucosyl kaempferol [36]

- Tinh dầu

Phần trên mặt đất của cây Rau má mọc ở Nam Phi có 11 hydrocacbon monoterpenoid (20,20%), 9 monoterpenoid oxy hóa (5,46%), 14 hydrocacbon sesquiterpenoid (68,80%), 5 sesquiterpenoid oxy hóa (3,90%) và một sesquiterpenoid

sulfua (0,76%), α-humulen (21,06%), β-caryophyllene (19,08%), bicyclogermacren

(11,22%), germanacren B (6,29%) và myrcen (6,55%) [40]

- Các hợp chất polyacetylen

Rau má có chứ 14 hợp chất polyacetylen, trong đó có 5 hợp chất đã được xác định: pentadeca-2,9-dien-4, 6-diyn-1-ol acetat; 3,8-diacetoxypentadeca-1,9-dien-4,6-diyn; 3-hydroxy-8-acetoxy pentadeca-19-dien-4,6-diyn; 3-hydroxy-10-acetoxy-pentadeca-18-dien-4 và pentadeca-1,8-dien-4,6-diyn-3,10-diol [5]

1.1.6 Tác dụng dược lý của Rau má 1.1.6.1 Tác dụng bảo vệ da làm, lành vết thương

Rau má và acid asiatic được chứng minh có tác dụng làm lành vết thương thông qua nhiều giai đoạn của quá trình làm lành da Một trong những cơ chế được kể đến là: tăng tổng hợp collagen I và fibronectin, duy trì kiên kết, tăng sinh nguyên bào sợi Năm 1996, Suguna và cộng sự chứng minh rằng việc sử dụng chiết xuất ethanolcủa Rau má bằng đường uống giúp thúc đẩy việc giảm diện tích vết thương và chữa lành nhanh hơn [6], [16], [49]

1.1.6.2 Tác dụng điều hòa miễn dịch, chống ung thư

Các thử nghiệm dược lý cho thấy các sản phẩm thoái giáng của pectin SA3 trong Rau má có tác dụng kích thích miễn dịch [6] Acid asiatic trong Rau má hoạt động như một một tác nhân trị liệu miễn dịch chống khối u, nhờ tác dụng cảm ứng lên Smad7 kết hợp với naringenin [56]

Trong nghiên cứu của Michał Wiciński và cộng sự năm 2024, acid asiatic trong Rau má tham gia ức chế quá trình phosphoryl hóa, gây chết tế bào và giảm sự phát triển và di căn của khối u bằng cách tác động đến các con đường truyền tín hiệu quan trọng trong tế bào ung thư như PI3K, Akt, mTOR, p70S6K và STAT3 [56]

1.1.6.3 Tác dụng bảo vệ gan

Theo nghiên cứu của Irmak Ferah Okkay và cộng sự, Rau má được chứng minh có tác dụng bảo vệ chống nhiễm độc gan do cisplatin gây ra thông qua việc giảm các enzym AST, ALT và ALP và giảm căng thẳng oxy hóa (giảm MDA và ROS, đồng thời tăng SOD, CAT và GSH) Rau má cũng làm giảm tổn thương do viêm bằng cách ức chế

các chất gây viêm: TNF-α, IL-1β và NF-κB [17]

1.1.6.4 Tác dụng lên tim mạch

Rau má chứa lượng lớn các chất có tác dụng chống tăng lipid máu, chống oxy hóa tiềm năng, giúp ngăn ngừa mắc các bệnh lý về tim mạch Đồng thời, hoạt chất bracosid A chiết xuất từ Rau má có tác dụng kích thích bài tiết oxit nitric (NO) của mô Từ đó giúp làm giãn nở vi động mạch, hỗ trợ máu lưu thông qua mô tốt hơn, giảm nhanh cơn đau tim Song song quá trình đó, chất độc tích tụ trong cơ thể được đào thải ra ngoài dễ dàng hơn [5]

Theo một nghiên cứu của Nyuk Jet Chong và Zoriah Aziz và cộng sự, Rau má có thể có lợi cho việc cải thiện các dấu hiệu và triệu chứng của suy giãn tĩnh mạch mạn tính [44]

1.1.6.5 Tác dụng lên thần kinh trung ương

Nhiều nghiên cứu in vitro và in vivo đã cho thấy Rau má và các thành phần trong

dịch chiết của nó có tác dụng bảo vệ thần kinh theo các cơ chế khác nhau Rau má đã được chứng minh là cải thiện hình thái tế bào thần kinh và hiệu suất học tập cũng như tăng cường khả năng duy trì trí nhớ ở mô hình động vật [44] Một số cơ chế hoạt động của RM đã được chứng minh là giúp tăng cường chức năng nhận thức, như cơ chế ức chế hoạt động của acetylcholinesterase [37], giảm hoạt động của phospholipase A2 (PLA2 ) [8], bảo vệ chống lại sự hình thành β-amyloid (Aβ) [48] Rau

má cũng cho thấy đặc tính chống căng thẳng, chống trầm cảm, giải lo âu và chống động kinh trong các nghiên cứu tiền lâm sàng [44]

Asiaticosid và asiatic acid là hai dẫn xuất triterpenoid tự nhiên có trong RM được chứng minh có thể giảm thiểu rối loạn chức năng nhận thức và làm giảm tình trạng viêm thần kinh bằng cách ức chế sự kích hoạt của microglia và các yếu tố tiền viêm ở chuột

gây bệnh AD do Aβ1-42 gây ra và có thể cải thiện tình trạng suy giảm nhận thức bằng cách ức chế kích hoạt con đường MAPK p38 và thúc đẩy quá trình sửa chữa khớp thần kinh [28], [32]

1.2 Tổng quan về bệnh Alzheimer 1.2.1 Lịch sử phát hiện bệnh Alzheimer

Vào năm 1901, bác sĩ tâm thần học người Đức, Alois Alzheimer đã quan sát một bệnh nhân 51 tuổi sống tại Viện an dưỡng vùng Frankfurt là Bà Auguste D Người phụ nữ này mắc một rối loạn trí nhớ ngắn hạn cùng với các triệu chứng rối loạn hành vi khác như: trí nhớ suy giảm, khó khăn trong việc làm việc nhà và nấu ăn đơn giản, ghen tuông quá mức, tưởng tượng có ai đó muốn giết mình Sau năm năm, khi bệnh nhân tử vong, bác sĩ Alzheimer đã gửi não và bệnh án của bà đến phòng thí nghiệm của Bác sĩ Emil Kraeplin tại Munich Sau khi phân tích mẫu giải phẫu bệnh của bệnh nhân, ông đã xác định các mảng amyloid và các đám rối sợi thần kinh Vào ngày 3/11/1906, bác sĩ Alzheimer lần đầu tiên đã công bố lần đầu tiên các triệu chứng lâm sàng và bệnh học của bệnh, khi đó bệnh được gọi là “sa sút trí tuệ tiền lão” (presenile dementia) [47], [55] Trong vòng 15-20 năm sau, các hiểu biết về di truyền thần kinh và sinh lý bệnh học của bệnh Alzheimer đã được phát hiện: bốn gien liên quan chắc chắn đến bệnh được phát hiện Cơ chế chuyển hóa của các protein tau và amyloid, cơ chế viêm, cơ chế oxy-hóa và những thay đổi về nội tiết có thể gây ra những thoái hóa tế bào thần kinh trong bệnh Alzheimer cũng được làm rõ [1]

1.2.2 Dịch tễ dược về bệnh Alzheimer

Ca bệnh Alzheimer đầu tiên được mô tả vào năm 1906 Từ đó đến nay, số lượng bệnh Alzheimer được báo cáo ngày càng gia tăng, đặc biệt khi tuổi thọ của con người ngày càng gia tăng, tỷ lệ mắc ở phụ nữ giống như nam giới (một phần vì phụ nữ có tuổi thọ dài hơn) Theo số liệu thống kê năm 2015 của The World Alzheimer Report 2015, số ca bệnh sa sút trí tuệ mới là 3 ca/giây [63] Trên toàn thế giới có khoảng 50 triệu người mắc bệnh Alzheimer và con số này được dự đoán sẽ tăng lên 152 triệu vào năm 2050, trong đó có khoảng 2/3 số người mắc bệnh ở các nước thu nhập thấp và thu nhập trung bình [33]

Ở Mỹ, bệnh Alzheimer chính thức được liệt kê là nguyên nhân gây tử vong đứng thứ sáu vào năm 2019 và là nguyên nhân gây tử vong đứng thứ bảy vào năm 2020 và 2021 [58] Theo báo cáo năm 2024 của Alzheimer’s Association ước tính có 6,9 triệu người trưởng thành > 65 tuổi ở Mỹ hiện đang sống chung với bệnh Alzheimer và hơn 200.000 người < 65 tuổi mắc bệnh Alzheimer khởi phát ở độ tuổi trẻ hơn [52] Tỷ lệ người mắc bệnh Alzheimer tăng theo độ tuổi [62]:

• Tuổi từ 65 đến 74: 3% • Tuổi từ 75 đến 84: 17% • Tuổi ≥ 85: 32%

Tại Việt Nam, theo Bộ Y Tế, tỉ lệ mắc bệnh Alzheimer khoảng 5% dân số trên 60 tuổi và tăng dần theo độ tuổi [63] Năm 2015, số người mắc sa sút trí tuệ là 660.000 người Tỷ lệ gánh nặng bệnh tật của bệnh Alzheimer và sa sút trí tuệ lên đến 52% trên tổng gánh nặng bệnh tật do bệnh thần kinh và tâm thần ở người cao tuổi tại Việt Nam

[60] 1.2.3 Nguyên nhân, cơ chế bệnh sinh và các yêu tố nguy cơ

Theo Hội thần Kinh học Việt Nam, Alzheimer được là một bệnh đa chức năng và đa nhân tố, bao gồm các cơ chế sinh bệnh khác nhau Một số giả thuyết đưa ra giả thuyết

về cơ chế bệnh sinh của Alzheimer: giả thuyết Aβ-amyloid, giả thuyết Aβ-amyloid

oligome, giả thuyết presenilin, giả thuyết rối loạn điều hòa Ca2+, giả thuyết lysosome, giả thuyết tau, [29]

Tuy hiện nay chưa có giả thuyết nào được công nhận để giải thích cơ chế bệnh sinh của Alzheimer nhưng có một số giả thuyết đươc được đưa ra như nguyên nhân chính gồm:

Thứ nhất: giả thuyết amyloid

Giả thuyết amyloid cho rằng việc tích tụ dần beta-amyloid (βA) trong não (bao gồm các mảng amyloid) sẽ dẫn đến chết tế bào thần kinh, mất các khớp thần kinh và thiếu hụt dần dần các chất dẫn truyền thần kinh Tất cả những ảnh hưởng này góp phần gây ra các triệu chứng lâm sàng của sa sút trí tuệ

Mảng amyloid là sự phân giải (amyloid precursor protein – APP) một glycoprotein xuyên màng APP gồm 770 acid amin, biểu hiện trong nhiều mô đặc biệt trong các khớp thần kinh cuả các neuron APP bị phân cắt bởi 3 enzym : α, β và γ secretase Trước hết APP bị cắt bởi α và β secretase Nhiều nghiên cứu cho thấy stress oxy hóa làm giảm hoạt tính của α-secretase, làm tăng cường biểu hiện và kích hoạt β-secretase Con đường

α-secretase tạo ra sAPPα , các sAPPα hòa tan này liên quan đến sự dẫn truyền thần kinh bình thường ở synap và C83 Con đường β-secretase sinh ra sAPPβ và C99 Các sản phẩm C83 và C99 này bị cắt một lần nữa nhờ γ secretase (γ secretase là một phức hợp đa enzyme có chứa presenilin 1,2 Đột biến presenilin được tìm thấy ở bệnh nhân Alzheimer sớm có tính chất di truyền) Riêng với C99 dưới tác dụng của γ secretase sẽ tạo thành hai phân đoạn không hòa tan β Amyloid 40 (Aβ40) và β Amyloid 42 (Aβ42) Aᵦ42 có tính chất độc hơn và nhiều hơn Aᵦ40 Những monomer này sau đó kết hợp lại thành các oligomer (là dimer hoặc trimer), chúng dường như là các chất độc thần kinh, không hòa tan xung quanh các tế bào thần kinh và dần dần thành các mảng beta-amyloid [61]

Dựa trên tỷ lệ mắc AD khởi phát sớm ngày càng tăng ở những bệnh nhân mắc hội chứng Down có ba bản sao của gen APP và ở những người có APP tăng đột biến chức năng làm tăng tích tụ βA, βA được cho là nguyên nhân chính gây ra AD [26]

Hình 1 3 Sơ đồ phân tầng APP [29]

Thứ hai: giả thuyết Tau

Sự phosphoryl hóa Tau cũng được đề xuất là một yếu tố góp phần tiềm năng vào việc hình thành các đám rối sợi thần kinh trong AD Ở những bệnh nhân mắc AD, sự tăng phospho của một số acid amin nhất định trong protein tau khiến protein này tách ra khỏi vi ống, làm rối loạn cấu trúc vận chuyển và dẫn đến tình trạng thiếu tế bào thần kinh và cuối cùng là chết tế bào [29]

Con đường Amyloidogenic Con đường không Amyloidogenic

Hình 1 4 Mô phỏng sự phosphoryl hóa Tau [29]

Ngoài ra, protein TAU bị phosphoryl hóa quá mức sẽ không còn gắn kết bền vững với các tubulin Chúng sẽ tách rời khỏi các vi ống trùng hợp thành oligomer (khoảng 2 hoặc 3 monomer) tạo thành kẹp đôi soắn ốc (PHFs), PHFs kết hợp với các sợi thẳng tạo thành đám rối sợi thần kinh NFTs Cơ cấu này phá hoại các chức năng của tế bào chất và cản trở vận chuyển của sợi trục Những thay đổi này cuối cùng dẫn đến sự phá hủy của bộ khung tế bào, mất khả năng sống của tế bào dẫn đến sự chết của tế bào [61]

Thứ 3: Giả thuyết Cholinergic

Alzheimer cũng được đặc trưng bởi sự thiếu hụt cholinergic Các tế bào thần kinh giải phóng acetylcholin, đặc biệt là ở các thân tế bào nằm trong não trước bị thoái hóa trong bệnh Alzheimer, ảnh hưởng đến các chức năng nhận thức và trí nhớ vì những tế bào thần kinh này rất quan trọng trong hoạt động bình thường của vỏ não và các cấu trúc liên quan Trong bệnh Alzheimer có sự biến đổi và thay đổi tính đa hình của acetylcholinesterase (AChE) trong não Mức độ AChE tăng lên xung quanh các mảng Aβ và NFTs là đặc điểm thường được báo cáo trong bệnh Alzheimer

Mặc dù nguyên nhân, cơ chế bệnh sinh chưa thực sự được xác định, nhưng hiện nay đã xác định được các yêu tố nguy cơ làm tăng khả năng tiến triển của bệnh Alzheimer gồm [62]:

• Tuổi tác : Yếu tố nguy cơ được biết đến nhiều nhất của bệnh Alzheimer là sự gia tăng tuổi tác Cứ 8 người Mỹ trong độ tuổi từ 65 trở lên thì có 1 người mắc bệnh Alzheimer’s, và gần một nửa số người từ 85 tuổi trở lên mắc bệnh này

Não bệnh lý Alzheimer Não bình thường

• Tiền sử gia đình: Nghiên cứu cho thấy những người có bố/mẹ hoặc anh/chị/em mắc bệnh Alzheimer sẽ có nguy cơ bị bệnh cao hơn Nguy cơ sẽ gia tăng nếu có nhiều hơn một thành viên trong gia đình mắc bệnh

• Một số bệnh lý tim mạch: như tăng huyết áp, tiểu đường, rối loạn lipid máu và hút thuốc, có thể làm tăng nguy cơ mắc bệnh Alzheimer

1.2.4 Phương pháp điều trị bệnh

Cho đến nay chưa có cách điều trị bệnh Alzheimer và không làm thay đổi tiến triển của bệnh Những liệu pháp điều trị dùng thuốc hay không dùng thuốc nhằm mục đích cải thiện triệu chứng nhận thức và triệu chứng hành vi trên bệnh nhân [59]

Điều trị các triệu chứng liên quan đến nhận thức:

Triệu chứng liên quan đến nhận thức gồm: ảnh hưởng đến trí nhớ, khả năng nhận biết, ngôn ngữ, óc phán đoán và tư duy logic Hiệp hội Quản lý Thuốc và Thực phẩm Hoa Kỳ (FDA) đã phê chuẩn lưu hành hai loại thuốc dùng để điều trị các triệu chứng liên quan đến nhận thức của bệnh Alzheimer [59]

Loại 1: Chất ức chế cholinesterase giúp ngăn ngừa sự giảm hàm lượng acetylcholine

(một chất dẫn truyền thần kinh quan trọng cho quá trình ghi nhớ và học hỏi) bằng cách giữ cho hàm lượng acetylcholine ở mức cao, những loại thuốc này sẽ hỗ trợ cho quá trình truyền tín hiệu giữa các tế bào thần kinh Ba loại chất ức chế cholinesterase thường được kê trong đơn thuốc là:

• Donepezil (Aricept): được cấp phép dùng để điều trị trong tất cả các giai đoạn của bệnh Alzheimer

• Rivastigmine (Exelon): được cấp phép dùng để điều trị bệnh Alzheimer trong giai đoạn nhẹ và vừa

• Galantamine (Razadyne): được cấp phép dùng để điều trị bệnh Alzheimer trong giai đoạn nhẹ và vừa

Loại 2: Memantine (Namenda) giúp điều hòa hoạt động của glutamat, một loại chất dẫn

truyền thần kinh liên quan đến quá trình ghi nhớ và học hỏi Loại thuốc này được cấp phép dùng để điều trị bệnh Alzheimer trong giai đoạn vừa và nặng

Điều trị các triệu chứng liên quan đến hành vi:

Các rối loạn liên quan đến hành vi bao gồm: bối rối, lo âu, gây hấn và rối loạn giấc ngủ Nguyên nhân cơ bản nhất gây nên các triệu chứng về mặt tâm thần và hành vi này là do các tế bào não bị tổn thương không ngừng, do tác dụng phụ của thuốc, tình trạng nền sức khỏe hay tác động từ môi trường Việc xử trí được khuyến cáo nên bắt đầu bằng

liệu pháp không dùng thuốc (giáo dục, luyện tập, xoa bóp dầu thơm trị liệu, kích thích cảm giác, âm nhạc theo từng người) vì các triệu chứng có thể thoái lui một cách tự nhiên trong một khoảng thời gian ngắn Ngoài ra, một số nhóm thuốc được dùng là [59], [63]:

• Chống trầm cảm • Giải lo âu

• Điều trị triệu chứng Parkinson • Chẹn beta giao cảm

• Chống động kinh • Thuốc an thần kinh

1.2.5 Một số mô hình nghiên cứu gây bệnh Alzheimer trên ruồi giấm

Các mô hình AD ở Drosophila được phân chia dựa vào các đột biến trong chỉnh

hình Ruồi giấm của gen bệnh ở người, các cấu trúc chuyển gen mang các alen của gen gây bệnh ở người và các mô hình được sử dụng để nghiên cứu tác động của các yếu tố

gây stress môi trường đối với độc tính Aβ Các gen người mà mô hình Drosophila đã

được tạo ra bao gồm APP, BACE1, BACE2, PS1, PS2, APP, MEGF10, CD2AP, SNRPN, PTPRD, XYLT1, FERMT2, CELF, MAST4, ITGAM và ITGA9 Các cấu trúc chuyển gen đã được sử dụng để nhằm mục tiêu sản xuất và độc tính Aβ; chúng cũng đã được sử dụng để nghiên cứu vai trò của Tau trong bệnh lý của AD Trong một nghiên

cứu khác về 87 gen Drosophila, mỗi gen có một gen tương đồng với con người được

xác định trong GWAS là một gen liên quan đến AD, 9 gen được phát hiện là có ảnh hưởng mạnh đến độc tính của Tau [34]

Các yếu tố môi trường cũng là yếu tố nguy cơ gia tăng tiến triển AD và độc tính βA bao gồm: chế độ ăn uống, lối sống, tiếp xúc với hóa chất: sắt, đồng, kẽm, Vì vậy đã có nhiều nghiên cứu trên mô hình ruồi giấm phơi nhiễm với các yếu tố môi trường trên đã được áp dụng để đánh giá trên bệnh AD [10]

1.3 Tổng quan về ruồi giấm 1.3.1 Đặc điểm hình thái của ruồi giấm

Ruồi giấm là một loài ruồi trong họ Drosophilidae, có tên khoa học là Drosophila

melanogaster, phân bố ở khắp các châu lục Ruồi giấm có màu vàng nâu với các vòng

đen ngang bụng Con cái trưởng thành có kích thước dài khoảng 2.5 mm, con đực nhỏ hơn với phần bụng sẫm màu Dễ dàng phân biệt được con đực và con cái nhờ sự khác nhau về màu sắc với mảng đen rõ rệt ở bụng

1.3.2 Hệ gen của ruồi giấm

Hệ gen ruồi giấm chứa khoảng 132 triệu cặp base gồm 15500 gen nằm trên 4 cặp nhiễm sắc thể, trong đó có 3 cặp nhiễm sắc thể thường và 1 cặp nhiễm sắc thể giới tính, trong khi ở người có tới 23 cặp nhiễm sắc thể Cho đến nay, so sánh dữ liệu bộ gen người và ruồi giấm cho thấy có khoảng 75% gen liên quan đến bệnh ở người có gen tương đồng và bảo tồn ở ruồi giấm [51] Chính vì có sự tương đồng về di truyền giữa người và ruồi giấm nên ruồi giấm được sử dụng để nghiên cứu các cơ chế phân tử của một số bệnh ở người và phát triển thành các mô hình để nghiên cứu sàng lọc thuốc và không gặp phải vấn đề nào về đạo đức trong nghiên cứu

1.3.3 Chu kỳ vòng đời của ruồi giấm

Với ưu thế vòng đời ngắn, tuổi thọ trung bình của ruồi giấm khi nuôi ở 29ºC khoảng 30-40 ngày chu kỳ phát triển của ruồi giấm trải qua 4 giai đoạn: trứng, ấu trùng, nhộng và ruồi trưởng thành Ruồi cái có thể tạo ra khoảng 750 -1500 trứng trong suốt vòng đời của nó Trứng sau khi thụ tinh sẽ phát triển thành phôi trong vòng 24h Các phôi sau đó trải qua ba giai đoạn ấu trùng (larva) khác nhau (ấu trùng bậc một, ấu trùn hai tương đương với 1, 2 ngày tuổi ; đời sống ấu trùng bậc ba bắt đầu được tính từ 3 ngày tuổi và kéo dài đến sáu ngày tuổi Ấu trùng bậc ba chuyển qua giai đoạn nhộng (pupa) ; tài liệu cho rằng còn qua giai đoạn tiền nhộng (prepupa) cuối cùng trưởng thành thành một con ruồi giấm trưởng thành Sự phát triển của một con ruồi trưởng thành khoảng 9 đến 10 ngày rưỡi kể từ khi thụ tinh

Hình 1 5 Chu kỳ vòng đời của ruồi giấm

CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Nguyên vật liệu, thiết bị

2.1.1 Đối tượng nghiên cứu

Đối tượng nghiên cứu là cao chiết nước Rau má Rau má được thu hái ở Hải Phòng

vào tháng 4/2023, được giám cos tên khoa học là Centella asiatica (L.) Urban bởi Trung

tâm Tài nguyên, Viện Dược liệu Dược liệu thu hái toàn cây được phơi khô, sau đó nghiền thành bột thô để chiết cao phục vụ cho nghiên cứu

Quy trình chiết cao chiết nước Rau má được tiến hành tại Khoa Chiết xuất, Viện Dược liệu Quy trình chiết xuất được mô tả tóm tắt như Hình 2.1: Thu được 29,5g cao với hàm ẩm: 4,75%, hiệu suất 26,17%

Hình 2 1 Sơ đồ chiết xuất cao chiết nước Rau má

2.1.2 Chủng ruồi nghiên cứu

Chúng tôi sử dụng 2 dòng ruồi giấm sau: ruồi giấm hAPP 64358 và ruồi Elav-Gal4 được cung cấp bởi GS Masamitsu Yamaguchi, Viện Công nghệ Kyoto, Nhật Bản

- Dòng Driver sinh lý: chủng ruồi hoang dại Elav-Gal4 mang gen GAL4 ở nhiễm sắc thể thứ 3 biểu hiện kiểu hình mắt đỏ có tập tính sinh hoạt cũng như các đặc điểm sinh học tương tự ruồi bình thường (có mã số #7680)

- Dòng mang gen bệnh: Chủng ruồi hAPP 64385 mang gen hAPP ở nhiễm sắc thể số 2 (có mã số FBst0064385)

Ruồi được nuôi trong điều kiện nhiệt độ 25oC, thời gian chiếu sáng chu kỳ 12 giờ sáng - 12 giờ tối

2.1.3 Dụng cụ, hóa chất, thiết bị 2.1.3.1 Hóa chất, thuốc thử

STT Tên hóa chất Nguồn gốc STT Tên hóa chất Nguồn gốc

6 Dầu parafin Trung Quốc 15 Đường sucrose Trung Quốc

8 Natri benzoat Trung Quốc 17 H2SO4 Trung Quốc 9 Sữa bột Việt Nam 18 Một số hóa chất khác

Bảng 2 1 Hóa chất, thuốc thử 2.1.3.2 Dụng cụ, thiết bị

2 Chai, ống thủy tinh để đựng thức ăn, nuôi ấu trùng Việt Nam

2.2 Phương pháp nghiên cứu

Hình 2 2 Sơ đồ phương pháp nghiên cứu 2.2.1 Chuẩn bị ruồi phục vụ nghiên cứu

2.2.1.1 Chuẩn bị thức ăn cho ruồi giấm a Quy trình chuẩn bị thức ăn

- Cân 2g natri benzoat vào ống falcon thêm 10 ml nước, dùng máy vortex hoà tan đến khi dung dịch đồng nhất

- Cân 15g sữa bột vào cốc thuỷ tinh hoà thêm một ít nước nguội (khoảng 50 ml) và đánh đều

- Cân 5g agar vào trong bát sắt Bổ sung khoảng 200 ml H2O đun nóng đến khi dung dịch trong

- Bổ sung đường và nấm men vào trong bát sắt thêm khoảng 100 ml H2O chứa agar đun sủi lăn tăn trong 10 phút

- Đổ dung dịch ra cốc dung tích 1 lít để nguội về 60oC phối hợp sữa vào khuấy đều Bổ sung thêm nước nóng đủ 500 ml khuấy đều

- Bổ sung acid propionic và natri benzoat tiếp tục khuấy đều - Chia vào ống nuôi khoảng 2 ml Bảo quản ở 4oC đến khi sử dụng (tối đa sử dụng

trong 1 tháng)

b Thành phần thức ăn (cho 500ml)

Bảng 2 3 Thành phần thức ăn ruồi giấm 2.2.1.2 Quy trình nhân dòng ruồi giấm chuyển gen hAPP mang bệnh Alzheimer

Trong nghiên cứu này, chúng tôi tiến hành biểu hiện protein hAPP trên mô não của ruồi giấm được sử dụng làm mô hình có kiểu hình mang bệnh Alzheimer thông qua các bước:

Bước 1: Chuẩn bị chủng hAPP 64385 mang gen hAPP ở nhiễm sắc thể thứ 2 và chủng

Elav – Gal4 mang GAL4 ở nhiễm sắc thể thứ 3

Bước 2: Tách riêng biệt các con đực, cái và ruồi cái chưa qua giao phối của 2 chủng

- Bắt ruồi cái chưa qua giao phối (Virgin female) của chủng Elav: Gây mê ruồi trong ống chứa ether Ruồi được bắt từ 3-6h sau khi nở kén (9-10h sáng hoặc 2-3h chiều) - Bắt ruồi đực của chủng hAPP 64385

Bước 3: Cho lai với tỷ lệ 20 con đực hAPP 64385 và 20 con cái chưa qua giao phối

Elav Đây là đời P

Bước 4: Ống chứa P sẽ được nuôi trong 3-4 ngày để có ấu trùng F1 Sau đó chuyển ruồi

P sang ống mới để tránh lẫn giữa P và F1

Bước 5: Cho lai tạo đời F1 từ đời P như bước 3 để tạo chủng ruồi Elav-hAPP mang gen

bệnh Azheimer

2.2.1.3 Chia lô nghiên cứu

Nghiên cứu được tiến hành với 4 lô sau: - Lô 1: nhóm sinh lý sử dụng dòng ELAV–Gal4 nuôi trong ống thức ăn chuẩn