Đánh giá tác dụng cải thiện hành vi của cao chiết nước từ Rau má trên mô hình ruồi giấm chuyển gen hAPP mang kiểu hình bệnh Alzheimer .... Kết quả đánh giá tác dụng của cao chiết nước Ra
TỔNG QUAN
Tổng quan về dược liệu
• Tên khoa học: Centella asiatica (L.) Urb.[4]
• Tên nước ngoài: Phanok (Vientian), trachiek ktranh (Campuchia), Gotu Kola (Anh), Centelle, Bévillacque (Pháp), Brahmi (Ấn Độ) [24]
• Tên tiếng việt: Rau má, Tích tuyết thảo, Liên tiền thảo [2], [4]
Bộ: Ngũ gia bì (Araliales)
Rau má là một lại cây thân thảo, cao 7-10 cm, tuy nhiên một số cây có thể cao lên tới 25cm [13] Thân mảnh, mọc bò, hơi có lông khi còn non, bén rễ ở các mấu Thân phân nhánh nhiều trên mặt đất, thân gầy, nhẵn
Lá mọc xen kẽ nhau thành cụm ở đốt thân, nhẵn hai mặt, hình mắt chim, khía tai bèo, rộng 2-4cm, cuống dài 2-4cm trong những nhánh mang hoa và dài 10-12cm trong những nhánh thường [4], [13]
Cụm hoa hình tán đơn mọc ở kẽ lá gồm 1-5 hoa nhỏ không cuống màu trắng hoặc phớt đỏ Hoa giữa không có cuống, tổng bao có 2 hoặc 3 mảnh hình trái xoan lõm, dạng màng, cánh hoa hình tam giác hoặc trái xoan; nhị có chỉ nhị ngắn, bao phấn hình mắt chim; bầu hình cầu [4]
Quả dẹt, rộng 3-5 cm có sống hơi rõ, màu nâu đen, đỉnh lõm, có 7-9 cạnh lồi, nhẵn hoặc có lông nhỏ, có vân mạng
Toàn cây khi tươi có vị đắng, hăng hơi khó chịu, khi khô thì chỉ còn mùi cỏ khô Sinh thái: Cây mọc thành đám trên các bãi hoang, bờ ruộng, ven đường, dọc đường sắt, nơi ẩm mát, mùa ra quả kéo dài từ tháng 4 đến tháng 6
Hình 1 1 Cây Rau má Centella asiatica (L.) Urb [4], [13]
Rau má nguồn gốc từ các nước như vùng nhiệt đới: Ấn Độ, Sri Lanka, Trung Quốc, Indonesia và Malaysia, Nam Phi và Madagascar [24] Tại Việt Nam, cây Rau má mọc hoang hoặc được trồng phổ biến khắp nơi từ Bắc vào Nam Cây thường được tìm thấy tại những chỗ ẩm mát, gần kênh mương [4]
Có rất nhiều nghiên cứu về thành phần hóa học của Rau má, tuy nhiên, chưa có sự thống nhất giữa kết quả nghiên cứu này Thành phần hóa học và tỉ lệ phần trăm các hợp chất trong Rau má sẽ tùy theo điều kiện tự nhiên của khu vực hay mùa thu hái mà có sự thay đổi Một số hợp chất phổ biến được biết đến như: saponin, alkaloid, flavonoid, tinh dầu, các hợp chất polyacetylen saccharid, beta caroten, sterol, tanin, oligosaccharid (centelose) [50] Ngoài ra còn có chứa một lượng nhỏ vitamin bao gồm: B, C, K, E; một số khoáng chất: sắt, calci, kali, magie [6], [13]
Phần trên mặt đất của cây Rau má có các saponin triterpen 5 vòng và các sapogenin của chúng, chủ yếu thuộc nhóm ursan Một số ít thuộc nhóm oleanan và lupan Các hợp chất triterpenoid thuộc nhóm ursan được xem là hoạt chất chính trong Rau má [6] Cho đến nay đã có hơn 20 chất đã được phân lập với hơn nửa trong số đó là các saponosid Các saponin quan trọng trong Rau má là: asiaticosid, madecassosid Ngoài ra còn có một số saponin có cấu trúc uran khác với hàm lượng thấp như: thankunisid, isothankunisid [36] Các acid trong Rau má là acid asiatic, acid brahmic, acid
4 isobrahmic Theo Tổ chức Y tế Thế giới (WHO), dược liệu Rau má không được chứa dưới 2% triterpene ester glycosid asiaticoside và madecassosid [24]
Acid asiatic H CH2OH H Acid madecassic OH CH2OH H Acid madasiatic OH CH3 H Asiaticoid H CH2OH Glu-Glu-Rham Madecassosid OH CH2OH Glu-Glu-Rham
Hình 1 2 Cấu trúc các saponin triterpennoid trong Rau má
Trong rau má có các flavonoid là: kaempferol, quercetin, catechin, epicatechin, rutin, apigenin và naringin, 3-glucosyl quercetin, 3-glucosyl kaempferol [36]
Phần trên mặt đất của cây Rau má mọc ở Nam Phi có 11 hydrocacbon monoterpenoid (20,20%), 9 monoterpenoid oxy hóa (5,46%), 14 hydrocacbon sesquiterpenoid (68,80%), 5 sesquiterpenoid oxy hóa (3,90%) và một sesquiterpenoid sulfua (0,76%), α-humulen (21,06%), β-caryophyllene (19,08%), bicyclogermacren
Rau má có chứ 14 hợp chất polyacetylen, trong đó có 5 hợp chất đã được xác định: pentadeca-2,9-dien-4, 6-diyn-1-ol acetat; 3,8-diacetoxypentadeca-1,9-dien-4,6-diyn; 3- hydroxy-8-acetoxy pentadeca-19-dien-4,6-diyn; 3-hydroxy-10-acetoxy-pentadeca-18- dien-4 và pentadeca-1,8-dien-4,6-diyn-3,10-diol [5]
1.1.6 Tác dụng dược lý của Rau má
1.1.6.1 Tác dụng bảo vệ da làm, lành vết thương
Rau má và acid asiatic được chứng minh có tác dụng làm lành vết thương thông qua nhiều giai đoạn của quá trình làm lành da Một trong những cơ chế được kể đến là: tăng tổng hợp collagen I và fibronectin, duy trì kiên kết, tăng sinh nguyên bào sợi Năm
1996, Suguna và cộng sự chứng minh rằng việc sử dụng chiết xuất ethanolcủa Rau má bằng đường uống giúp thúc đẩy việc giảm diện tích vết thương và chữa lành nhanh hơn [6], [16], [49]
1.1.6.2 Tác dụng điều hòa miễn dịch, chống ung thư
Các thử nghiệm dược lý cho thấy các sản phẩm thoái giáng của pectin SA3 trong Rau má có tác dụng kích thích miễn dịch [6] Acid asiatic trong Rau má hoạt động như một một tác nhân trị liệu miễn dịch chống khối u, nhờ tác dụng cảm ứng lên Smad7 kết hợp với naringenin [56]
Trong nghiên cứu của Michał Wiciński và cộng sự năm 2024, acid asiatic trong Rau má tham gia ức chế quá trình phosphoryl hóa, gây chết tế bào và giảm sự phát triển và di căn của khối u bằng cách tác động đến các con đường truyền tín hiệu quan trọng trong tế bào ung thư như PI3K, Akt, mTOR, p70S6K và STAT3 [56]
1.1.6.3 Tác dụng bảo vệ gan
Theo nghiên cứu của Irmak Ferah Okkay và cộng sự, Rau má được chứng minh có tác dụng bảo vệ chống nhiễm độc gan do cisplatin gây ra thông qua việc giảm các enzym AST, ALT và ALP và giảm căng thẳng oxy hóa (giảm MDA và ROS, đồng thời tăng SOD, CAT và GSH) Rau má cũng làm giảm tổn thương do viêm bằng cách ức chế các chất gây viêm: TNF-α, IL-1β và NF-κB [17]
1.1.6.4 Tác dụng lên tim mạch
Rau má chứa lượng lớn các chất có tác dụng chống tăng lipid máu, chống oxy hóa tiềm năng, giúp ngăn ngừa mắc các bệnh lý về tim mạch Đồng thời, hoạt chất bracosid
A chiết xuất từ Rau má có tác dụng kích thích bài tiết oxit nitric (NO) của mô Từ đó giúp làm giãn nở vi động mạch, hỗ trợ máu lưu thông qua mô tốt hơn, giảm nhanh cơn đau tim Song song quá trình đó, chất độc tích tụ trong cơ thể được đào thải ra ngoài dễ dàng hơn [5]
Tổng quan về bệnh Alzheimer
1.2.1 Lịch sử phát hiện bệnh Alzheimer
Vào năm 1901, bác sĩ tâm thần học người Đức, Alois Alzheimer đã quan sát một bệnh nhân 51 tuổi sống tại Viện an dưỡng vùng Frankfurt là Bà Auguste D Người phụ nữ này mắc một rối loạn trí nhớ ngắn hạn cùng với các triệu chứng rối loạn hành vi khác như: trí nhớ suy giảm, khó khăn trong việc làm việc nhà và nấu ăn đơn giản, ghen tuông quá mức, tưởng tượng có ai đó muốn giết mình Sau năm năm, khi bệnh nhân tử vong, bác sĩ Alzheimer đã gửi não và bệnh án của bà đến phòng thí nghiệm của Bác sĩ Emil Kraeplin tại Munich Sau khi phân tích mẫu giải phẫu bệnh của bệnh nhân, ông đã xác định các mảng amyloid và các đám rối sợi thần kinh Vào ngày 3/11/1906, bác sĩ Alzheimer lần đầu tiên đã công bố lần đầu tiên các triệu chứng lâm sàng và bệnh học của bệnh, khi đó bệnh được gọi là “sa sút trí tuệ tiền lão” (presenile dementia) [47], [55]
Trong vòng 15-20 năm sau, các hiểu biết về di truyền thần kinh và sinh lý bệnh học của bệnh Alzheimer đã được phát hiện: bốn gien liên quan chắc chắn đến bệnh được phát hiện Cơ chế chuyển hóa của các protein tau và amyloid, cơ chế viêm, cơ chế oxy- hóa và những thay đổi về nội tiết có thể gây ra những thoái hóa tế bào thần kinh trong bệnh Alzheimer cũng được làm rõ [1]
1.2.2 Dịch tễ dược về bệnh Alzheimer
Ca bệnh Alzheimer đầu tiên được mô tả vào năm 1906 Từ đó đến nay, số lượng bệnh Alzheimer được báo cáo ngày càng gia tăng, đặc biệt khi tuổi thọ của con người ngày càng gia tăng, tỷ lệ mắc ở phụ nữ giống như nam giới (một phần vì phụ nữ có tuổi thọ dài hơn) Theo số liệu thống kê năm 2015 của The World Alzheimer Report 2015, số ca bệnh sa sút trí tuệ mới là 3 ca/giây [63] Trên toàn thế giới có khoảng 50 triệu người mắc bệnh Alzheimer và con số này được dự đoán sẽ tăng lên 152 triệu vào năm
2050, trong đó có khoảng 2/3 số người mắc bệnh ở các nước thu nhập thấp và thu nhập trung bình [33]
7 Ở Mỹ, bệnh Alzheimer chính thức được liệt kê là nguyên nhân gây tử vong đứng thứ sáu vào năm 2019 và là nguyên nhân gây tử vong đứng thứ bảy vào năm 2020 và
2021 [58] Theo báo cáo năm 2024 của Alzheimer’s Association ước tính có 6,9 triệu người trưởng thành > 65 tuổi ở Mỹ hiện đang sống chung với bệnh Alzheimer và hơn 200.000 người < 65 tuổi mắc bệnh Alzheimer khởi phát ở độ tuổi trẻ hơn [52] Tỷ lệ người mắc bệnh Alzheimer tăng theo độ tuổi [62]:
Tại Việt Nam, theo Bộ Y Tế, tỉ lệ mắc bệnh Alzheimer khoảng 5% dân số trên 60 tuổi và tăng dần theo độ tuổi [63] Năm 2015, số người mắc sa sút trí tuệ là 660.000 người Tỷ lệ gánh nặng bệnh tật của bệnh Alzheimer và sa sút trí tuệ lên đến 52% trên tổng gánh nặng bệnh tật do bệnh thần kinh và tâm thần ở người cao tuổi tại Việt Nam [60]
1.2.3 Nguyên nhân, cơ chế bệnh sinh và các yêu tố nguy cơ
Theo Hội thần Kinh học Việt Nam, Alzheimer được là một bệnh đa chức năng và đa nhân tố, bao gồm các cơ chế sinh bệnh khác nhau Một số giả thuyết đưa ra giả thuyết về cơ chế bệnh sinh của Alzheimer: giả thuyết Aβ-amyloid, giả thuyết Aβ-amyloid oligome, giả thuyết presenilin, giả thuyết rối loạn điều hòa Ca 2+ , giả thuyết lysosome, giả thuyết tau, [29]
Tuy hiện nay chưa có giả thuyết nào được công nhận để giải thích cơ chế bệnh sinh của Alzheimer nhưng có một số giả thuyết đươc được đưa ra như nguyên nhân chính gồm:
Thứ nhất: giả thuyết amyloid
Giả thuyết amyloid cho rằng việc tích tụ dần beta-amyloid (βA) trong não (bao gồm các mảng amyloid) sẽ dẫn đến chết tế bào thần kinh, mất các khớp thần kinh và thiếu hụt dần dần các chất dẫn truyền thần kinh Tất cả những ảnh hưởng này góp phần gây ra các triệu chứng lâm sàng của sa sút trí tuệ
Mảng amyloid là sự phân giải (amyloid precursor protein – APP) một glycoprotein xuyên màng APP gồm 770 acid amin, biểu hiện trong nhiều mô đặc biệt trong các khớp thần kinh cuả các neuron APP bị phân cắt bởi 3 enzym : α, β và γ secretase Trước hết APP bị cắt bởi α và β secretase Nhiều nghiên cứu cho thấy stress oxy hóa làm giảm hoạt tính của α-secretase, làm tăng cường biểu hiện và kích hoạt β-secretase Con đường
8 α-secretase tạo ra sAPPα , các sAPPα hòa tan này liên quan đến sự dẫn truyền thần kinh bình thường ở synap và C83 Con đường β-secretase sinh ra sAPPβ và C99 Các sản phẩm C83 và C99 này bị cắt một lần nữa nhờ γ secretase (γ secretase là một phức hợp đa enzyme có chứa presenilin 1,2 Đột biến presenilin được tìm thấy ở bệnh nhân Alzheimer sớm có tính chất di truyền) Riêng với C99 dưới tác dụng của γ secretase sẽ tạo thành hai phân đoạn không hòa tan β Amyloid 40 (Aβ40) và β Amyloid 42 (Aβ42) Aᵦ42 có tính chất độc hơn và nhiều hơn Aᵦ40 Những monomer này sau đó kết hợp lại thành các oligomer (là dimer hoặc trimer), chúng dường như là các chất độc thần kinh, không hòa tan xung quanh các tế bào thần kinh và dần dần thành các mảng beta-amyloid [61]
Dựa trên tỷ lệ mắc AD khởi phát sớm ngày càng tăng ở những bệnh nhân mắc hội chứng Down có ba bản sao của gen APP và ở những người có APP tăng đột biến chức năng làm tăng tích tụ βA, βA được cho là nguyên nhân chính gây ra AD [26]
Hình 1 3 Sơ đồ phân tầng APP [29]
Thứ hai: giả thuyết Tau
Sự phosphoryl hóa Tau cũng được đề xuất là một yếu tố góp phần tiềm năng vào việc hình thành các đám rối sợi thần kinh trong AD Ở những bệnh nhân mắc AD, sự tăng phospho của một số acid amin nhất định trong protein tau khiến protein này tách ra khỏi vi ống, làm rối loạn cấu trúc vận chuyển và dẫn đến tình trạng thiếu tế bào thần kinh và cuối cùng là chết tế bào [29]
Con đường Amyloidogenic Con đường không Amyloidogenic
Hình 1 4 Mô phỏng sự phosphoryl hóa Tau [29]
Ngoài ra, protein TAU bị phosphoryl hóa quá mức sẽ không còn gắn kết bền vững với các tubulin Chúng sẽ tách rời khỏi các vi ống trùng hợp thành oligomer (khoảng 2 hoặc 3 monomer) tạo thành kẹp đôi soắn ốc (PHFs), PHFs kết hợp với các sợi thẳng tạo thành đám rối sợi thần kinh NFTs Cơ cấu này phá hoại các chức năng của tế bào chất và cản trở vận chuyển của sợi trục Những thay đổi này cuối cùng dẫn đến sự phá hủy của bộ khung tế bào, mất khả năng sống của tế bào dẫn đến sự chết của tế bào [61]
Alzheimer cũng được đặc trưng bởi sự thiếu hụt cholinergic Các tế bào thần kinh giải phóng acetylcholin, đặc biệt là ở các thân tế bào nằm trong não trước bị thoái hóa trong bệnh Alzheimer, ảnh hưởng đến các chức năng nhận thức và trí nhớ vì những tế bào thần kinh này rất quan trọng trong hoạt động bình thường của vỏ não và các cấu trúc liên quan Trong bệnh Alzheimer có sự biến đổi và thay đổi tính đa hình của acetylcholinesterase (AChE) trong não Mức độ AChE tăng lên xung quanh các mảng
Aβ và NFTs là đặc điểm thường được báo cáo trong bệnh Alzheimer
Tổng quan về ruồi giấm
1.3.1 Đặc điểm hình thái của ruồi giấm
Ruồi giấm là một loài ruồi trong họ Drosophilidae, có tên khoa học là Drosophila melanogaster, phân bố ở khắp các châu lục Ruồi giấm có màu vàng nâu với các vòng đen ngang bụng Con cái trưởng thành có kích thước dài khoảng 2.5 mm, con đực nhỏ hơn với phần bụng sẫm màu Dễ dàng phân biệt được con đực và con cái nhờ sự khác nhau về màu sắc với mảng đen rõ rệt ở bụng
1.3.2 Hệ gen của ruồi giấm
Hệ gen ruồi giấm chứa khoảng 132 triệu cặp base gồm 15500 gen nằm trên 4 cặp nhiễm sắc thể, trong đó có 3 cặp nhiễm sắc thể thường và 1 cặp nhiễm sắc thể giới tính, trong khi ở người có tới 23 cặp nhiễm sắc thể Cho đến nay, so sánh dữ liệu bộ gen người và ruồi giấm cho thấy có khoảng 75% gen liên quan đến bệnh ở người có gen tương đồng và bảo tồn ở ruồi giấm [51] Chính vì có sự tương đồng về di truyền giữa người và ruồi giấm nên ruồi giấm được sử dụng để nghiên cứu các cơ chế phân tử của một số bệnh ở người và phát triển thành các mô hình để nghiên cứu sàng lọc thuốc và không gặp phải vấn đề nào về đạo đức trong nghiên cứu
1.3.3 Chu kỳ vòng đời của ruồi giấm
Với ưu thế vòng đời ngắn, tuổi thọ trung bình của ruồi giấm khi nuôi ở 29ºC khoảng 30-40 ngày chu kỳ phát triển của ruồi giấm trải qua 4 giai đoạn: trứng, ấu trùng, nhộng và ruồi trưởng thành Ruồi cái có thể tạo ra khoảng 750 -1500 trứng trong suốt vòng đời của nó Trứng sau khi thụ tinh sẽ phát triển thành phôi trong vòng 24h Các phôi sau đó trải qua ba giai đoạn ấu trùng (larva) khác nhau (ấu trùng bậc một, ấu trùn hai tương đương với 1, 2 ngày tuổi ; đời sống ấu trùng bậc ba bắt đầu được tính từ 3 ngày tuổi và kéo dài đến sáu ngày tuổi Ấu trùng bậc ba chuyển qua giai đoạn nhộng (pupa) ; tài liệu cho rằng còn qua giai đoạn tiền nhộng (prepupa) cuối cùng trưởng thành thành một con ruồi giấm trưởng thành Sự phát triển của một con ruồi trưởng thành khoảng 9 đến 10 ngày rưỡi kể từ khi thụ tinh
Hình 1 5 Chu kỳ vòng đời của ruồi giấm
KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
Đánh giá tác dụng cải thiện hành vi của cao chiết nước từ Rau má trên mô hình ruồi giấm chuyển gen hAPP mang kiểu hình bệnh Alzheimer
hình ruồi giấm chuyển gen hAPP mang kiểu hình bệnh Alzheimer
3.1.1 Kết quả đánh giá khả năng học tập và ghi nhớ mùi của ấu trùng ruồi giấm chuyển gen hAPP mang kiểu hình bệnh Alzheimer của cao chiết nước Rau má
Bệnh lý Alzheimer là một bệnh lý sa sút trí tuệ có biểu hiện giảm khả năng nhận thức, ghi nhớ và suy giảm khứu giác Do vậy, chúng tôi thực hiện thử nghiệm đánh giá khả năng ghi nhớ mùi của ấu trùng bậc ba của thế hệ F1 ruồi giấm mang gen bệnh Alzheimer để đánh giá tác dụng của cao chiết Rau má Đánh giá khả năng học tập và ghi nhớ của ấu trùng ruồi giấm thông qua chỉ số học tập LI Kết quả được xử lý và thể hiện trong Hình 3.1
Chỉ số học tập LI
Hình 3 1 Kết quả đánh giá khả năng ghi nhớ ngắn hạn của ấu trùng ruồi giấm
(n = 144, One-way ANOVA test với *** p < 0,001 so với lô bệnh lý (Elav-hAPP))
Ghi chú: Elav-Gal4: lô sinh lý; Elav-hAPP: lô bệnh lý; RM2, RM4: lô thử là ruồi giấm chuyển gen mang bệnh Alzheimer được điều trị bằng cao chiết nước Rau má ở các nồng độ tương ứng 2 mg/ml và 4 mg/ml
3.1.2 Kết quả đánh giá tác dụng của cao chiết nước Rau má đối với hành vi di chuyển của ấu trùng ruồi giấm chuyển gen hAPP mang kiểu hình bệnh Alzheimer
Suy giảm khả năng vận động, rối loạn định hướng là những biểu hiện liên quan đến vận động ở bệnh nhân Alzheimer Trong thử nghiệm này, tiến hành đánh giá tác dụng cải thiện khả năng vận động của ấu trùng bậc ba ruồi giấm mang gen bệnh Alzheimer của cao chiết nước Rau má thông qua chỉ tiêu đánh giá là vận tốc trung bình và hình dạng đường đi của ấu trùng Kết quả được xử lý và thể hiện trong Hình 3.2
Tốcđộ trung bình cm/s Elav - Gal4 Elav - hAPP
Hình 3.2 Kết quả đánh giá khả năng di chuyển của ấu trùng ruồi giấm bậc 3
27 (A) Kết quả phân tích tốc độ di chuyển trung bình của ấu trùng ruồi giấm bậc 3 trong
45s; (B) Hình ảnh đường đi của ấu trùng ruồi giấm
(n = 38-51; test , One-way ANOVA với *** p < 0,001 so sánh với lô bệnh lý (Elav- hAPP))
Ghi chú: Elav-Gal4: lô sinh lý; Elav-hAPP: lô bệnh lý; RM2, RM4: lô thử là ruồi giấm chuyển gen mang kiểu hình bệnh Alzheimer được điều trị bằng cao chiết nước
Rau má ở các nồng độ tương ứng 2 mg/ml và 4 mg/ml
Kết quả hình 3.2 cho thấy ấu trùng ruồi giấm lô bệnh lý (Elav-hAPP) có tốc độ di chuyển thấp hơn lô sinh lý (Elav-Gal4) với p < 0,001 Lô ấu trùng ruồi giấm dùng cao chiết RM nồng độ 2 và 4 mg/ml đều có tốc độ bò trung bình cao hơn so với lô bệnh lý (p < 0,001) Ngoài ra, khi ghi lại quỹ đạo di chuyển của ấu trùng ruồi giấm bậc 3 ở các nhóm trong khoảng thời gian 45 giây, chúng tôi nhận thấy ấu trùng ở ô bệnh di chuyển không có định hướng và quỹ đạo không rõ ràng Ruồi giấm ở lô sinh lý và lô mẫu di chuyển về một hướng xác định, theo xu hướng đường thẳng hơn
3.1.3 Kết quả đánh giá tác dụng của cao chiết nước Rau má đối với hành vi leo trèo của ruồi giấm trưởng thành chuyển gen hAPP mang kiểu hình bệnh Alzheimer
Sự suy giảm khả năng phối hợp vận động là một dấu hiệu quan trọng trong các rối loạn thoái hóa thần kinh khác nhau bao gồm với bệnh Alzheimer [57] Để nghiên cứu khả năng bảo vệ thần kinh của Rau má, mô hình đánh giá khả năng leo trèo của ruồi giấm trưởng thành chuyển gen hAPP mang kiểu hình bệnh Alzheimer được thực hiện Đánh giá khả năng vận động của ruồi giấm trưởng thành thông qua số điểm trung bình mà ruồi đạt được Kết quả được xử lý và thể hiện trong Hình 3.3
Elav-Gla4 Elav-hAPP RM2 RM4
Hình 3 3 Kết quả đánh giá khả năng vận động của ruồi giấm trưởng thành bằng thử nghiệm leo trèo ở các thời điểm 7, 14, 21 ngày tuổi
(n = 160; test , One-way ANOVA với * p < 0,05, ** p < 0,01 so sánh với lô bệnh lý
Ghi chú: Elav-Gal4: lô sinh lý; Elav-hAPP: lô bệnh lý; RM2, RM4: lô thử là ruồi giấm chuyển gen mang bệnh Alzheimer được điều trị bằng cao chiết nước Rau má ở các nồng độ tương ứng 2 mg/ml và 4 mg/ml
Kết quả Hình 3.3 cho khả năng leo trèo của ruồi giấm trưởng thành có sự thay đổi theo thời gian
- Khả năng leo của lô chứng sinh lý Elav so với nhóm ruồi giấm chuyển gen hAPP mang kiểu hình bệnh Alzheimer thể hiện sự khác biệt ở cả 3 ngày 7, 14 và 21 đều có ý nghĩa thống kê với giá trị p được chỉ trong hình 3.3
- Điều trị bằng cao chiết RM liều 2 mg/ml có xu hướng làm tăng khả năng leo trèo của ruồi giấm chuyển gen hAPP ở các ngày 7 và 21, và mức độ tăng ở ngày thứ 14 đạt ý nghĩa thống kê (p < 0,05)
- Điều trị bằng cao chiết RM liều 4 mg/ml có tác dùng làm tăng đáng kể khả năng leo trèo của ruồi giấm ở ngày 7 và ngày 14 (p < 0,01) Sang ngày 21, cả 2 lô ruồi bệnh điều trị bằng cao chiết RM đều không cho thấy sự khác biệt có ý nghĩa thống kê (p > 0,05).
Kết quả đánh giá tác dụng chống oxy hóa ex vivo của cao chiết nước Rau má trên mô hình ruồi giấm chuyển gen hAPP mang kiểu hình bệnh Alzheimer
trên mô hình ruồi giấm chuyển gen hAPP mang kiểu hình bệnh Alzheimer
29 MDA là một sản phẩm của quá trình peroxy hóa lipid Việc xác định nồng độ MDA trong đầu ruồi giúp đánh giá khả năng chống oxy hóa ex vivo của cao chiết nước từ RM trên mô hình ruồi giấm chuyển gen mang bệnh Alzheimer Nếu lượng MDA ít chứng tỏ mẫu RM có khả năng làm giảm quá trình peroxy hóa lipid Tiến hành phản ứng và so sánh nồng độ MDA giữa các lô ruồi Kết quả được xử lý và thể hiện ở Hình 3.4
Hình 3 4 Kết quả đánh giá tác dụng chống oxy hóa ex vivo của cao chiết nước từ RM trên mô hình ruồi giấm chuyển gen mang bệnh Alzheimer
(n = 3, One-Way ANOVA test với * p < 0,05, ** p < 0,01 so với lô bệnh lý (Elav- hAPP))
Ghi chú: Elav-Gal4: lô sinh lý; Elav-hAPP: lô bệnh lý; RM2, RM4: lô thử là ruồi giấm chuyển gen mang bệnh Alzheimer được điều trị bằng cao chiết nước Rau má ở các nồng độ tương ứng 2 mg/ml và 4 mg/ml
Kết quả Hình 3.4 cho thấy nồng độ MDA định lượng được trong đầu ruồi giấm ở lô bệnh lý cao hơn đáng kể so với lô sinh lý, đạt ý nghĩa thống kê với p < 0,05 Ruồi giấm chuyển gen hAPP được điều trị bằng cao chiết RM nồng độ 2 mg/kl cho thấy giá trị MDA thấp hơn đáng kể so với lô chứng bệnh lý, đạt ý nghĩa thống kê với giá trị p < 0,01 Tuy nhiên, cao chiết RM ở nồng độ 4 mg/ml không thể sự thay đổi về giá trị MDA so với lô chứng bệnh lý
BÀN LUẬN
Về mô hình nghiên cứu
4.1.1 Về việc lựa chọn mô hình ruồi giấm mang bệnh Alzheimer
Ruồi giấm (Drosophila melanogaster) đã từ lâu được xem như đối tượng nghiên cứu cho các bệnh thoái hóa thần kinh với ưu điểm là có khả năng di truyền ngắn: thời gian sinh sản nhanh khoảng 10 ngày và vòng đời ngắn chỉ 60-80 ngày Điều này làm cho nó trở thành một mô hình hấp dẫn, phù hợp để nghiên cứu về các bệnh liên quan đến tuổi tác, lão hóa [35]
Xét về mặt di truyền, sinh hóa: ruồi giấm có chứa một hệ thần kinh đầy đủ chức năng với cấu trúc chuyên biệt như thị giác, khứu giác, học tập và trí nhớ tương tự như hệ thần kinh của động vật có vú [20] Ngoài ra, nhiều đặc điểm bệnh lý của Alzheimer có thể được bảo tồn trong các mô hình ruồi biến đổi gen gồm nhiễm độc thần kinh, thoái hóa thần kinh tiến triển, bất thường về hành vi và tử vong sớm [25], [53]
Xét về mặt đạo đức: ruồi giấm là động vật bậc thấp nên hạn chế được những vấn đề về đạo đức trong việc sử dụng động vật làm mô hình thí nghiệm nghiên cứu y sinh học hơn là thử nghiệm trên các động vật bậc cao như chuột, chó, thỏ, khỉ…
Xét về mặt kinh phí: ruồi giấm phát triển sinh sản nhanh và nhiều, kích thức nhỏ nên nhu cầu về thức ăn và diện tích môi trường không quá nhiều, thức ăn cho ruồi cũng dễ kiếm, rẻ tiền
Vì tất cả những lý do trên, chúng tôi quyết định lựa chọn mô hình ruồi giấm chuyển gen hAPP mang bệnh Alzheimer để đánh giá tác dụng của cao chiết nước từ RM trên bệnh Alzheimer
4.1.2 Về việc lựa chọn dược liệu nghiên cứu
Rau má (Centella asiatica (L.) Urb.) – dược liệu thuộc chi Centella theo nền y học cổ truyền Trung Quốc và Ấn Độ từ lâu đã được miêu tả có tác dụng trên hệ thần kinh, chống lão hóa Hiên nay, trên thế giới cũng đã có nhiều nghiên cứu thực nghiệm trên động vật chỉ ra đặc tính chống oxy hóa và khả năng tăng cường nhận thức của các hoạt chất khác nhau được lập từ Rau má như: madecassosid, asiaticosid, [21], [30] Trong đó có acid asiatic được chứng minh có tác dụng chống lại độc tính trên thần kinh do quá mức βA , bảo vệ thần kinh thông qua cơ chế ức chế đáng kể quá trình tăng phospho tau của pTau-S396 và pTau-T23, làm giảm nồng độ IL-1β, TNF-α và malondialdehyd (MDA) [14], [22], [27]
31 Ở Việt Nam, Rau má rất phổ biến, mọc hoang khắp nơi trên nước ta Rau má dễ trồng và phát triển nhanh Vì vậy nhóm nghiên cứu chúng tôi chọn dược liệu Rau má để đánh giá tác dụng trên ruồi giấm chuyển gen mang bệnh Alzheimer
4.1.3 Về việc lựa chọn mức liều sử dụng
Dựa vào kết quả sàng lọc số lượng lớn mẫu trên ruồi giấm thuộc dự án First được Ngân hàng thế giới tài trợ (2017-2019), do PGS.TS Phạm Thị Nguyệt Hằng, Viện Dược liệu làm chủ nhiệm Việc tiến hành sàng lọc trên một dải nồng độ 1, 2, 4, 6, 10 mg/ml, dựa vào tỷ lệ sống sót của ruồi trưởng thành và sự cải thiện hành vi với các mức liều Chúng tôi nhận thấy nồng độ 2 mg/ml và 4 mg/ml là phù hợp để sử dụng trong nghiên cứu.
Về các kết quả nghiên cứu
4.2.1 Kết quả đánh giá khả năng học tập và ghi nhớ mùi của ấu trùng ruồi giấm chuyển gen hAPP mang kiểu hình bệnh Alzheimer của cao chiết nước Rau má
Mất trí nhớ, sa sút trí tuệ là biểu hiện đặc trưng đầu tiên của bệnh Alzheimer Sự tích tụ độc tố β-amyloid trong các tế bào thần kinh gây ra sự thoái hóa hay phá hủy các neuron làm suy giảm chức năng suy nghĩ, học tập và ghi nhớ ở người bệnh [62] Biểu hiện này đã được mô phỏng lại bằng thí nghiệm đánh giá khả năng học hỏi và ghi nhớ của ấu trùng ruồi giấm trong nghiên cứu của chúng tôi
Cùng được trải qua tập luyện như nhau nhưng khả năng học hỏi và ghi nhớ ở nhóm bệnh kém hơn so với nhóm chứng Kết quả thực nghiệm cho thấy, khả năng ghi nhớ (mùi) ngắn hạn ở lô bệnh lý (Elav-hAPP) kém hơn so với lô sinh lý (Elav-Gal4), chỉ số học tập LI của lô sinh lý cao hơn lô bệnh lý với sự khác biệt có ý nghĩa thống kê (p < 0,001) Kết quả này tương đồng với nghiên cứu của tác giả Opeyemi B và cộng sự năm
2022 [39], cho thấy mô hình hoàn toàn phù hợp để đánh giá tác dụng của cao chiết RM trên việc cải thiện hành vi học tập – ghi nhớ của ấu trùng ruồi giấm chuyển gen hAPP Điều trị bằng các cao chiết nước RM ở cả 2 nồng độ 2 mg/ml và 4 mg/ml có tác dụng phục hồi suy giảm trí nhớ ngắn hạn trên ấu trùng bậc ba ruồi giấm chuyển gen mang kiểu hình bệnh Alzheimer, được thể hiện thông qua chỉ số học tập LI ở các lô điều trị đều cao hơn đáng kể so với lô bệnh lý (p < 0.001) Những kết quả này đã cho thấy, cao chiết nước bộ phận trên mặt đất của RM đều tham gia vào tác dụng cải thiện suy giảm trí nhớ ngắn hạn trên ruồi giấm chuyển gen mang bệnh Alzheimer
4.2.2 Kết quả đánh giá tác dụng của cao chiết nước Rau má đối với hành vi di chuyển của ấu trùng ruồi giấm chuyển gen hAPP mang kiểu hình bệnh Alzheimer
Kết quả thực nghiệm cho thấy ấu trùng ruồi giấm ở lô bệnh lý (Elav-hAPP) có khả năng di chuyển giảm so với lô sinh lý (Elav-Gal4), biểu hiện qua việc giảm tốc độ di chuyển (p < 0,001) Hình ảnh quỹ đạo chuyển động cho thấy khả năng vận động của ấu trùng ruồi giấm ở lô bệnh lý di chuyển theo một quỹ đạo không có định hướng Ấu trùng ruồi giấm ở lô sinh lý bò về một hướng xác định, quỹ đạo di chuyển theo xu hướng đường thẳng hơn Tốc độ di chuyển của lô bệnh lý thấp hơn so với lô sinh lý với sự khác biệt có ý nghĩa thống kê (giá trị p < 0,001) cho thấy mô hình này phù hợp để đánh giá tác dụng của cao chiết RM
Sử dụng cao chiết RM làm cải thiện tốc độ di chuyển của ấu trùng ruồi giấm thông qua việc dùng cao chiết nước RM ở nồng độ 2 mg/ml và 4 mg/ml trên nhóm ruồi bệnh lý làm tăng tốc độ di chuyển trung bình, với sự khác biệt có ý nghĩa thống kê so với lô bệnh lý (với giá trị p < 0,01)
Trong bệnh Alzheimer, các tế bào thần kinh giải phóng acetylcholine, đặc biệt là ở các thân tế bào nằm trong não trước bị thoái hóa dẫn đến sự thiếu hụt cholinergic trong não [39] Cholinergic là một chất dẫn truyền thần kinh quan trọng cho quá trình định hướng, ghi nhớ, do đó những người mắc bệnh Alzheimer có sự suy giảm đặc trưng các chức năng này Sử dụng cao chiết RM nồng độ 2 và 4 mg/ml cải thiện khả năng vận động của ruồi giấm chuyển gen hAPP mang bệnh Alzheimer Do đó, cao chiết RM có thể tác động lên việc giảm thoái hóa các tế bào thần kinh cholinergic, tuy nhiên vẫn cần nghiên cứu sâu hơn để khẳng định chính xác
4.2.3 Kết quả đánh giá tác dụng của cao chiết nước Rau má đối với hành vi leo trèo của ruồi giấm trưởng thành chuyển gen hAPP mang kiểu hình bệnh Alzheimer
Kết quả của thử nghiệm leo trèo cho thấy sự suy giảm khả năng vận động có ý nghĩa thống kê ở thí nghiệm cả 3 ngày 7, 14 và 21 của ruồi biểu hiện protein APP so với dòng đối chứng Kết quả thực nghiệm này phù hợp với nghiên cứu của tác giả F., Zhao, Y., Huang và cộng sự (2015) [42] Nghiên cứu đó đã chỉ ra việc biểu hiện protein gen APP trên não làm suy giảm và rối loạn vận động của ruồi giấm trưởng thành Tốc độ di chuyển của lô bệnh lý thấp hơn so với lô sinh lý với khác biệt có ý nghĩa thống kê (giá trị p < 0,001) cho thấy mô hình này phù hợp để đánh giá tác dụng của cao chiết RM trên mô hình ruồi giấm chuyển gen hAPP
33 Ngày 7, lô ruồi điều trị cao chiết RM ở mức liều 4 mg/ml thể hiện khả năng cải thiện hành vi leo trèo của ruồi giấm chuyển gen hAPP (p