Chuẩn Hoá Quy Trình Định Lượng Malondialdehyde Nhằm Đánh Giá Tình Trạng Stress Oxy Hoá Trên Mẫu Mô Cơ Và Máu.pdf

- Phân tích ảnh hưởng của một số yếu tô lý hóa tới quy trình tạo MDA và định lượng MDA từ chất chuẩn và trong mô cơ và máu bằng phản ứng TBARS.. Các sản phẩm thứ cấp của quá trình peroxi

MO CO VA MAU

Khóa luận tốt nghiệp đại học hệ chính quy

Ngành Sinh học (Chương trình dao tạo chuẩn)

Hà Nội - 2020

CHUẨN HOÁ QUY TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG

MALONDIALDEHYDE NHAM DANH GIA TINH TRANG STRESS OXY HOA TREN MAU MO CO VA

LOI CAM ON Tôi xin được bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc nhất tới TS Đỗ Minh Hà, người thầy đã tận tình chỉ bảo, hướng dẫn tôi trong suốt quá trình học tập, nghiên cứu và thực hiện khóa luận này Tôi vô cùng trân trọng những đam mê, tính kiên trì và cẩn thận, phương pháp tư duy, trách nhiệm cùng tình yêu khoa học mà thầy muốn gửi gắm cho thế hệ của chúng tôi!

Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành đến PGS.TS Trịnh Hồng Thái đã luôn giúp đỡ, tạo điều kiện về vật chất cũng như tinh thần trong suốt thời gian tôi học tập và làm việc tại phòng thí nghiệm

Tôi cũng xin trân trọng cảm ơn các thầy giáo, cô giáo trong khoa Sinh Học,trường Đại học Khoa học tự nhiên, đặc biệt là các thầy cô giáo trong bộ môn Sinh lý học Sinh học người đã tận tình giảng dạy và dìu dắt tôi trong suốt thời gian học tập tại trường!

Trong quá trình học tập và làm việc tại phòng Proteomics và Sinh học cấu trúc thuộc Phòng thí nghiệm Trọng điểm Công nghệ Enzyme và Protein, trường Đại học Khoa học tự nhiên, tôi đã nhận được sự chỉ bảo tận tình, chia sẻ kinh nghiệm làm việc của TS Nguyễn Thị Tú Linh, ThS Lê Lan Phương, TS Bùi Phương Thảo cùng

các anh, các chị và các bạn sinh viên cùng khóa Tôi xin chân thành cảm Ơn!

Tôi cũng xm gửi lời cảm ơn đến Trung tâm Khoa học sự sông - Khoa Sinh học và Trung tâm khoa học vật liệu - Khoa Vật Lý, trường Đại học Khoa học Tự nhiên, ĐHQG

HN vì đã tạo điều kiện cho tôi sử dụng các thiết bị nghiên cứu, giúp đỡ, hỗ trợ tôi rất nhiều trong quá trình học tập, làm việc và thực hiện khoa luận tốt nghiệp

Tôi cũng xin bày tỏ lòng cảm ơn tới Phòng thí nghiệm Trọng điểm Công nghệ

Enzym và Protein, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên đã tạo điều kiện giúp đỡ tôi trong quá trình làm khóa luận này Cuối cùng, tôi vô cùng biết ơn gia đình và bạn bè

đã khích lệ, động viên và luôn bên tôi trong suốt thời gian qua

Hà Nội, tháng 6 năm 2020

Sinh viên

Nguyén Thu Ha

DANH MUC VIET TAT

AA Axit Arachidonic (Arachidonic acid)

DANH MUC BANG

Bang 1 Cac gia tri hang số hấp thụ phân tử [26]

Bảng 2 Danh sách các hóa chất dùng trong nghiên cứu

Bảng 3.Các thiết bị sử dụng trong nghiên cứu

DANH MUC HiNH

Hình I1 Giá tri OD của TBARS tại các pH và nhiệt độ ủ khác nhau với thời gian ủ là 60 phút

Hình 12 Biéu dé so sánh giá trị độ hap thụ trung bình tại các điểm pH, nhiệt độ khác nhau

Hình 13 Gia trị độ hấp thụ trung bình của TBARS khi có mặt của Hemoglobim - ««- «+ Hình 14 Giá trị OD trung bình của TBARS với MDA tạo ra từ TMP khi có mặt của MSU ws

Hình 15 Gia tri trung bình độ hấp thy cua TBARS voi MDA tao ra từ TMP khi có mặt của Sucrose 32

Hình 16 Giá trị OD trung bình của TBARS với MDA tạo ra từ TMP khi có mặt của Glucose 33

Hình I7 Giá trị trung bình của độ hấp thụ khi ủ các mẫu máu vào các dung dich PBS, MSU 200 mM,

MSU 800mM, Glucose 75 mg/L, Glucose | ŠÖ rmg/L - 5 5 <6 6 <1 11311 1 HH nh nh, 34

Hình 18 Giá trị độ hấp thụ khi cho các mẫu gan chuột vào trong môi trường PBS, MSU, Glucose 3ó

Hình 19 Giá trị độ hấp thụ khi ủ các mẫu cơ đùi trong môi trường PBS, MSU,Glucose - - 37

MO DAU

Stress oxy hóa được ghi nhận là một đặc điểm nỗi bật của nhiều bệnh lý cấp và mãn tính cũng như các bệnh gây ra do quá trình lão hóa ở người như bệnh tim mạch, ung

thư, rối loạn thần kinh, đái tháo đường Trạng thái stress oxy hóa của cơ thê có thể được

đánh giá thông qua việc định lượng các biomarker chính của quá trình Peroxit hóa lipid như: MDA, HNE, Acrolem, F2-IsoProstane, Pentane, Ethane Trong đó, MDA là một trong sô các biomarker được nghiên cứu nhiều nhất trong các trạng thái sinh lý và bệnh lý

cả trên mô hình động vật và trên người

Có rất nhiều phương pháp định lượng MDA khác nhau, trong đó phương pháp phản ứng TBAR là một trong những phương pháp đơn giản, và thông dụng nhất Ưu điểm của phương pháp phán ứng TBARS là dễ thực hiện, năng suất cao, không đòi hỏi các trang

thiết bị hiện đại và có thể định lượng bằng phương pháp quang phổ Tuy nhiên, kết quả

phản ứng TBARS chịu nhiều ảnh hưởng bởi các hóa chất, quy trình cũng như các sản phẩm phụ gây nhiễu đến kết quả Đề khắc phục một phần các nhược điểm của phương pháp phản ứng TBARS truyền thống, các thiết bị phân tích hiện đại như sắc ký lỏng hiệu

năng cao (HPLC), Sắc ký khí (GC), Khối phố (MS) đã được áp dụng đề cải tiễn phản ứng

TBARS Nhưng trên thực tế, không phải phòng thí nghiệm nào cũng được trang bị các thiết bị phân tích hiện đại này

Trên cơ sở các vấn đề trên, chúng tôi tiến hành đề tài: "Chuẩn hóa quy trình định lượng Malondialdehyde nhằm đánh giá tình trạng stress oxy hóa trên mẫu mô cơ và

máu” với mục đích:

- Chuân hóa và kiểm soát quy trình phản ứng TBARS để có một phương pháp định

lượng sơ bộ Malondialdehyde tốt nhất

- Phân tích ảnh hưởng của một số yếu tô lý hóa tới quy trình tạo MDA và định lượng MDA từ chất chuẩn và trong mô cơ và máu bằng phản ứng TBARS

Đề tài được tiến hành tại phòng Proteomics và Sinh học cầu trúc thuộc Phòng thí nghiệm Trọng điểm Công nghệ Enzyme và Protem, trường Đại học Khoa học tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội

CHUONG I: TONG QUAN

1.1 Stress oxy hóa

Stress oxy hóa là một thuật ngữ chỉ trạng thái mất cân bằng giữa sự sản xuất, hoạt động của các "goc tự do có nguôn gốc oxy” hay còn được gọi là các "hình thái oxy hóa hoạt động” (Reactive oxygen species - ROS) va kha năng của cơ thê sông trong việc khử các hop chat trung gian hoạt tính cao, cũng như sửa chữa hư hại do những chât này gây

nên Ngày nay, stress oxy hóa được ghi nhận là một đặc diém noi bat cua nhiêu bệnh ly

cấp và mãn tính, cũng như các bệnh gây ra do quá trình lão hóa như bệnh tim mạch, ung thư, rôi loạn thân kinh, đái tháo đường [L7, 41]

Gốc tự do có thể được định nghĩa là các phân tử hoặc mảnh vỡ phân tử có chứa một

hoặc nhiều electron độc thân trong orbital nguyên tử hoặc phân tử Các gốc tự do ROS là một trong các “gốc hình thái hoạt động” quan trọng nhất trong cơ thê sông [4l] ROS có

thể được tạo thành từ nguồn gốc ngoại sinh hoặc nội sinh Nguồn gốc ngoại sinh như tia

UV, tia X, tia y hoặc do các chất ô nhiễm trong khí quyên Nguồn gốc nội sinh như: là sản phẩm phụ của chuỗi truyền điện tử trong ty thê; hay được sản xuất bởi bạch cầu trung tính, đại thực bào trong viêm; hoặc là sản phẩm của các phản ứng được xúc tác bởi kim loại hay các enzymeví dụ NADPH oxidases (NOXs), xanthine oxidase (XO) [42] 1.2 Peroxit hóa lipid

Một trong các tác động phá hủy của ROS lên các đại phân tử sinh học đặc biệt phải chú ý đến là sự peroxit hóa lipid (Lipid peroxidation - LPO) Sự peroxit hóa

lipid màng gây thay đổi các đặc tính sinh học của màng, làm bất hoạt các thụ thể

liên kết màng hay các enzyme dẫn đến làm giảm chức năng của các tế bào bình thường và tăng tính thấm của màng Hơn nữa, sự peroxit hóa lipid còn có thỂ gây ra

và “khuếch đại” các tốn thương tế bào do tạo ra các sản phẩm oxi hóa thứ cấp [43] Khác với các gốc tự do có thời gian tồn tại ngắn, các sản phẩm thứ cấp của quá trình peroxit hóa lipid có thời gian bán hủy dài hơn và có khả năng khuếch tán qua màng tế bào, tấn công tới các đích ởxa nơi chúng được hình thành Các sản phẩm thứ cấp của quá trình peroxit hóa lipid là các aldehyde như malonaldehyde (MDA),

hexanal, 4-hydroxynonenal (HNE) hay acrolein đã được chứng minh có thể phản

ứng với các đại phân tử sinh học như ADN, Protein và Phospholipid [17, 23].

Hiện nay, peroxit hóa lipid được xem là nguyên nhân chính liên quan đến

việc oxy hóa, phá vỡ cấu trúc màng và tạo ra các chất độc có thể làm tổn hại hay gây chết tế bào Peroxit hóa lipid là một quá trình phức tạp xảy ra ở cả thực vật và động vật Nó liên quan đến sự hình thành và phát tán các gốc lipid dư thừa điện tử; sự sắp xếp lại các liên kết đôi trong chất béo không bão hòa (PUFA) dẫn đến phá hủy màng lipid, cũng như sản xuất một loạt các sản phẩm phụ gây độc, trong có các gốc rượu, xeton, andehyde và ete [13]

Sự peroxit hóa các lipid chứa gốc acid béo có thể dẫn đến một chuỗi các “phản ứng dây chuyền phân nhánh” tạo ra thêm gốc tự do mới Sở dĩ như vậy bởi vì từ một gốc tự do kích thích ban đầu (R°) có thể dẫn đến sự hình thành của rất nhiều

các gốc tự do bên cạnh lipid hydroperoxyde (LOOH) như là: LO°, °0H va LOO® [18] Các gốc LOO° 8 LO° được gọi là các “sản phẩm sơ cấp” của quá trình peroxit hóa

lipid, chúng có thể phân hủy theo nhiều cơ chế khác nhau tạo ra vô số các sản phẩm thứ cấp ổn định hơn và gây độc cho tế bào Sự peroxit hóa của các PUEAs là rất phức tạp vì có rất nhiều các loại axit béo có mặt trong cơ thể của động vật có

vú Ngoài ra sự phức tạp này còn do vị trí của các gốc peroxyl Esterbauer ước

tình rằng có khoảng 120-150 sản phẩm có thể tạo ra từ quá trình peroxit hóa lipid, chẳng hạn như các gốc lipid alkoxyl (LO°) tiếp theo có thể phân cắt beta tạo ra các sản phẩm ngắn hơn (từC2 đến C12 với một dải các nhóm chức khác nhau) hoặc bị biến đổi phần carboxylic của nó (phân cắt tạo HNE); các gốc lipid peroxyl (LOO°)

có thể tạo sản phẩm trung gian bicyclic endoperoxide rồi từ đó tạo ra MDA [23,

42

Các “sản phẩm thứ cấp” của quá trình peroxit hóa lipid có thể là aldehyde, alkane, isoprostane, alkene, ketone, alcohol va furane du6i cac diéu kiện phản ứng

khác nhau Các sản phẩm aldehyde đặc biệt được chú ý bởi chúng là các sản phẩm

hoạt động và có độc tính với tế bào Trong các aldehyde thì MDA được xem như chỉ thị sinh học của sự peroxit hóa các axit béo omega-3, omega-6 và được sử dụng

nhiều nhất để đánh giá mức độ peroxit hóa lipid [18, 23]

1.3 Malondialdehyde

1.3.1 Đặc điểm, tính chất của MDA

Malondialdehyde (MDA) là một trong những sản phẩm cuối của quá trình peroxit hóa lipid đang được quan tâm hàng đầu hiện nay MDA là chỉ thị của mức độ tốn thương

oxy hóa ở các tế bào và mô MDA cũng được sử dụng như một chỉ thị của tốn thương màng tế bào MDA có thể được tìm thấy trong hầu hết các mẫu sinh học bao gồm huyết tương, huyết thanh, mô và nước tiểu

MDA có bản chất hóa học một hợp chất hữu cơ có khối lượng phân tử thấp (M=72,04 g/mol), có công thức cấu tạo là C;H4O;, với hai nhóm aldehyde ở vị trí C1 và C3 và có tính axit yêu, pKa=4.46

MDA là một chất dễ bay hơi, ôn định dưới điều kiện trung tính Trong dung dịch và

pha khí, MDA bị enol hóa hoàn toàn và nhanh chóng giữa các dạng liên kết Hidro nội phân tử không đối xứng (Hình 1b và đ) với một hàng rào thấp đề biến đối lẫn nhau thông qua cầu trúc cộng hưởng liên kết Hidro đôi xứng (Hình I.c)

H.nh 1 Các dạng cấu hình của MDA [27]

Trong các dung môi hữu cơ, MDA tổn tại ở dạng cấu hình cis (Hình I.b và d) Tuy nhiên trong nước, MDA tổn tại ở dạng cấu hình trans, đưới dạng bazo liên hợp (Hình 1.a

và e) MDA hấp thụ bước sóng ở vùng tử ngoại với dung môi là nước có tính axit, chúng hấp thụ cực đại ở bước sóng 245 nm với hằng số hấp thy dién tir ¢ = 13.103(cm-1 M-1) (Hình 2)[27]

MDA duoc xem la san pham có khả năng đột biến cao [3] MDA có độ ồn định hóa học cao và khả năng thắm qua màng tốt hơn các gốc tự do chứa oxy (ROS) khác, đồng thời MDA cũng không độc như 4-HNE và methyl glyoxal (MG) [20] Một số nghiên cứu

cũng đã ghi nhận MDA có thê hoạt động như một phân tử tín hiệu và điều hòa biểu hiện

gen:

() Nhiều nghiên cửu đã chỉ ra MDA hoạt động như một phân tử tín hiệu và điều

hòa hoạt động tiét insulin khi có kích thích của glucose (GSIS) thông qua con đường Wnt, đây là tập hợp các con đường dẫn truyền tín hiệu tế bào khởi đầu bằng loại protein Wnt và sẽ kết thúc khi protein Wnt này được tiếp nhận bởi

thụ thể bề mặt tế bào Ở nồng độ cao (5-10uM), MDA làm thay đổi tỉ lệ

ATP/ADP và lượng Ca? nội bào, và ảnh hưởng tới biểu hiện gen, gây ra các

thay đổi trong hoạt động của GSIS [43]

(i) — Ở các tế bào sao ở gan, MDA kích thích biểu hiện gen collagen thông qua tang cudng hoat déng cua gen Spl (specificity protein-1), khiến lượng protein Sp3 va Spl tang cao [22] Ca Spl va Sp3 co thé tuong tac véi cac protein trong hệ thông kiêm soát phiên mã của gene, các enzyme kiêm soát histone va các phức hệ cấu trúc nhiễm sắc thê, các ảnh hưởng này minh chứng cho việc Spl va Sp3 là các yếu tô phiên mã quan trọng, tham gia tái cầu trúc lại nhiễm sắc thê và điều hòa biểu hiện gen [28]

Vi MDA là một aldehyde ưa điện tử, độ hoạt động của MDA phụ thuộc nhiều vào

pH Ở pH sinh lí, MDA tồn tại ở dạng ion enolate và có hoạt độ thấp Khi pH giảm,

MDA tổn tại ở dang beta-hydroxyacrolein và hoạt độ của nó tăng lên Hoạt độ của MDA

cao chủ yếu dựa vào tính điện, dẫn đến MDA có xu hướng phản ứng mạnh mẽ với các nucleophile [3] MDA có thê hoạt động nhu mét nucleophile hoac electrophile va tao thành các sản phẩm đa sac [11, 31]

Aldehyde nói chung có khá năng phản ứng hình thành các sản phẩm cộng và phức hợp trong hệ thống sinh học và MDA cũng không ngoại lệ, mặc dù, ở pH sinh lý MDA

có độ hoạt động thấp Rất nhiều nghiên cứu đã chứng minh MDA đóng vai trò quan trọng trong nhiều phản ứng sinh học Các thống kê gần đây cho thấy có tới 33 protein bị biến doi bởi MDA, trong đó có cả các enzyme, protein vận chuyển, protein khung xương tế bào, các protein của ty thê và protein chống oxy hóa [20] Những thay đối DNA do MDA gây ra có thê là nguyên nhân đáng kê cho bệnh ung thư và các bệnh lý liên quan đến di

truyền khác [3].

1.3.2 Nguồn gốc phát sinh MDA

1.3.2.1 Nguồn gốc nội sinh

MDA la san pham cuối của quá trinh peroxit hoa arachidonic va cac phan tir PUFA lớn [20] thông qua các con đường có enzyme hoặc không có enzyme (Hình 2)

Cwcizatlen

H.nh 2 Quá trình hình thành và chuyển hóa MDA

(Chú thích: MDA duoc tao ra theo con đường có enzyme (màu xanh nước biển), MIDA được tạo ra theo con đường không có enzyme (màu cam Cac enzyme chinh lién quan dén suo hinh thanh MDA: cyclooxygenase (1), prostacyclin hydroperoxidase (2), thromboxanesynthase (3))

i) Sản xuất MDA theo con đường có enzyme

Trong điều kiện # vivo, MDA có thể được sinh ra theo con đường có enzyme trong quá trình tổng hợp thromboxane A; (TXA;) [25, 36, 39] TXA; là một

chất chuyển hóa có hoạt tính sinh học của axit arachidomc (AA) được hình

thành từ prostaglandin endoperoxide hoặc prostaglandin H2 (PGH2) dưới sự

xuc tac cua thromboxane A2 synthase [5, 19], trong đó PGH2 được hình thành từ AA khi cd xuc tac cua cyclooxygenase [5, 7]

ii) San xuat MDA theo con đường không có enzyme

Lipid hydroperoxide được hình thành trong quá trình peroxit hóa lipid Gốc peroxyl của hydroperoxide có một liên kết đôi có thể kết hợp với một gốc

nữa, tại vị trí liên kết đôi để tạo ra một gốc tự do mới Các gốc tự do trung

gian được hình thành sau khi đóng vòng, có thể tiếp tục đóng vòng nữa đề tao thành endoperoxide bi-cycle, có cầu trúc tương tự như prostaglandin, và tạo ra MDA Ở con đường không có enzyme, quá trình hình thành MDA sẽ phụ thuộc gốc tự do oxy gen AA là tiền chất quan trọng của endoperoxide bicycle, từ chất này, theo nhiều phản ứng không có enzyme nữa sẽ tạo ra MDA (Hinh 2) [20] Tuy nhiên, eicosanoid cting dugc tao ra theo con đường này và có thể là tiền chất của endoperoxide bicycle va MDA [21, 44] Cac nghiên cứu gần đây cũng ghi nhận, trong một số điều kiện cụ thể, MDA cũng được hình thành theo con đường không có enzyme [32]

1.3.2.2 Nguồn gốc ngoại sinh

Ảnh hưởng của bức xạ ion hóa hoặc không ion hóa, ô nhiễm không khí và khí độc tự

nhiên như ozone, hóa chất và các chất độc hại như các chất khử trùng hóa học, sẽ trực

tiếp hoặc gián tiếp gây ra stress oxy hóa Ché độ ăn không đủ chất dinh dưỡng cũng gián tiếp dẫn đến stress oxy hóa bằng cách làm suy yếu cơ chế bảo vệ tế bào Các đại phân tử

tế bào, đặc biệt là lipid, protein và DNA là mục tiêu tự nhiên của quá trình oxy hóa Chất oxy hóa có khả năng bắt đầu quá trình oxy hóa lipid bằng cách lấy một proton allylic từ

một PUFA Quá trình này qua nhiều giai đoạn dẫn đến sự hình thành lipid hydroperoxide

từ đó dẫn đến tạo ra MDA [29]

1.3.2.3 Phương pháp hóa học tổng hợp MDA

Có thể tạo ra MDA theo phương pháp hóa học bằng cach thay phan 1,1,3,3- tetraethoxypropane (TEP) hoặc 1,1,3,3-tetramethoxypropane (TMP) trong môi trường

axit

Do MDA không ổn định và không thể lưu trữ ở dang tinh khiét nén dung dịch của

MDA thường được sử dụng ngay khi làm phản ứng thủy phân axIt TEP hay TMP Đã có nhiều báo cáo công bồ cho rằng sự thủy phân các hợp chất này ổi kèm với việc tạo ra các

sản phâm phụ được cho là polyme của MDA Do đó, đề tránh được sự hình thành của các

polyme này, người ta đã sử dụng dung dịch TEP hay TMP tất loãng để thực hiện phản ứng thủy phân [4]

1.4 Các phương pháp định lượng MDA

MDA được xem như một chỉ số chính để đánh giá mức độ peroxit hóa lipid Đề định

lượng MDA có thê sử dụng các phương pháp định lượng trực tiếp hoặc định lượng gián tiếp thông qua các dẫn xuất của MDA với các chất khác

1.4.1 Định lượng trực tiếp

Các phương pháp phân tích định lượng MDA trực tiếp đều dựa trên nguyên lí kết hợp HPLC với đo quang phô tử ngoại, ngoài ra có thể sử dụng thêm các phương pháp làm

sạch mẫu trước khi chạy sắc ký như: lọc gel, siêu lọc và chưng cat

© Uu diém cia phuong phap

Phương pháp định lượng trực tiếp cho độ đặc hiệu cao

® Nhược điểm của phương pháp

Phương pháp đòi hỏi các thiết bị HPLC với detector có độ nhạy cao, thời gian chạy sắc ký để thôi MDA cùng các thành phần khác của mẫu lớn, tùy thuộc vào mỗi loại mẫu,

thời gian có thể rất khác nhau Thêm vào đó, MDA cũng có thể liên kết với các thành

phần của mẫu, khi đó cần phái thủy phân các liên kết này trước khi chạy HPLC đồng thời phải phân tích xem lượng MDA liên kết là bao nhiêu để có thể định lượng đúng giữa

MDA tông số và MDA tự do [46]

1.4.2 Định lượng gián tiếp thông qua dẫn xuất

Các phương pháp định lượng MDA gián tiếp thông qua dẫn xuất cho phép định lượng gián tiếp MDA bằng cách định lượng các dẫn xuất có khả năng phát huỳnh quang các dẫn xuất màu, các dẫn xuất hấp thụ tia tử ngoại hay các sản phẩm khí

a Ưu điểm

Ưu điểm của phương pháp này là dễ thực hiện, năng suất lớn, có thể xử lí đồng thời được nhiều mẫu với tốc độ nhanh chóng, có thể định lượng bằng phương pháp quang phô

b Nhược điểm

Các phản ứng tạo dẫn xuất của MDA đòi hỏi phải thực hiện trong các điều kiện

“khắc nghiệt” (môi trường axit, nhiệt độ cao, có các dung môi hữu cơ), điều này khiến cho mẫu có thê tiếp tục bị oxy hóa hay phân hủy tạo ra các dẫn xuất phụ hoặc các sản phâm không mong muốn gây nhiễu đến việc định lượng So với phương pháp định lượng trực tiếp, các phương pháp định lượng thông qua dẫn xuất có thé dan đến các đánh

giá sai lệch về chỉ số peroxit hóa lipid nhiều hơn

Để giảm thiểu các ảnh hưởng của các dẫn xuất phụ đến kết quả, HPLC thường được kết hợp dé phân tách các hỗn hợp dẫn xuất Ngoài ra, việc tiễn hành phản ứng trong điều kiện kị khí kết hợp với bô sung các chất chống oxy hóa đề giảm thiểu quá trình tự oxy hóa hay phân hủy của mẫu trong quá trình tạo dẫn xuất Tuy nhiên có rất ít các nghiên cứu trực tiếp chứng minh sự hiệu quả của biện pháp phòng ngừa trên [27]

các sản phẩm oxy hóa của axit béo không bão hòa và TBA Phan img TBARS sau đó đã

được phát triển trở thành một test nghiệm thực nghiệm về tự oxy hóa lipid và đã được sử

dụng rộng rãi với các vật liệu sinh học như mô và thực phẩm [6]

Phản ứng TBARS xảy ra dựa trên sở phản ứng của phân tử MDA và hai phân tử MDA (nhóm monoenolic của MDA tấn công vào nhóm methylene của hai phân tử TBA) tạo ra một dẫn xuất màu TBARS (H.nh 5)

TBARS có cực đại của phổ hấp thụ ở vùng ánh sáng khả kiến (530-535nm) và

đỉnh hấp thụ thứ hai ở vùng bước sóng tử ngoại (245-305 nm) [26, 27]

5 aN

0

ACID (HEAT)

H.nh 5 Phản ứng tạo dẫn xuất màu TBARS của hai phân tử TBA với MDA [27]

Ưu điểm của phương pháp phân tích TBARS là chất phản ứng chính MDA, TBA là

chất hòa tan trong nước, sản phâm TBARS được hình thành hoặc giải phóng khi đung nóng mẫu trong môi trường axit và cường độ màu của phức hợp hình thành trong phản ứng là rất lớn nên phương pháp này có độ nhạy cao trong việc phát hiện và định lượng

peroxit hoa lipid [40] Tuy nhiên, phương pháp này còn có một số nhược điềm như không đặc hiệu, kết quả đo có thể bị nhiễu bởi 4 lí do chính:

Quá trình phân hủy của các lipid peroxide có thể tiếp tục xảy ra trong quá

trỉnh thực hiện phản ứng TBARS làm sai lệch kết quả MDA thực tế lúc ban

đầu có trong mẫu

Các ion kim loại chuyên tiếp có ảnh hưởng đến quá trình peroxit hóa lipid gây

Ta bởi gốc tự do, sự có mặt của các 1on kim loại gây ảnh hưởng nhiều đến độ

tin cậy của kết quả

Khi tiễn hành phản ứng TBARS déi với các mẫu ở người và động vật, MDA

trong mẫu có thê hình thành từ các nguồn khac (nhu glycoprotein, sắc tổ mật)

mà không phải do quá trình peroxit hóa lipid, dẫn đến kết quả không chính xác [17, 24]

Dé khắc phục các nhược điểm của phản ứng TBARS, ngày nay các nghiên cứu

thường kết hợp phản ứng TBARS với HPLC đề phân tách sản phẩm TBARS từ hỗn hợp

các dẫn xuất nhằm tăng độ đặc hiệu [L7] Bên cạnh đó, việc bảo quản mẫu trong nito long

và thêm vào các chất chống oxi hóa cũng được chú ý trong nhiều nghiên cứu Ngoài ra,

có các tác giá cho rằng, độ hấp thụ ở bước sóng 532 - 535 nm của các dẫn xuất phụ khác

so với dẫn xuất của MDA nhỏ hơn khoảng 1000 lần [26] Vì vậy chúng tôi chọn bước sóng 535 nm để đo độ hấp thụ của sản phẩm phản ứng TBARS

Ngày nay có bốn quy trình Phản ứng TBA chính, bao gồm:

Phản ứng TBARS với mẫu nguyên vẹn

Phản ứng TRARS với dịch chiết nước hoặc axit của mẫu

Phản ứng TBARS với dịch sản phẩm trưng cất của mẫu

Phản ứng TBARS với lipid chiết từ mẫu

Trong bốn quy trình phản ứng TBARS này thì quy trình Phản ứng TBA với mẫu nguyên vẹn là dễ thực hiện nhất Trong quy trình này, mẫu nguyên vẹn được nghiền đồng thể và cho phản ứng với dung dịch TBA dưới điều kiện pH

thấp (pH từ 2-3), nhiệt độ cao (95-100°C), dẫn xuất màu tạo thành sau dó được

chiết bằng n-butanol và đo độ hấp thụ bước song cực đại ở 530-535 nm Từ kết quả độ hấp thụ, thông qua hằng số hấp thụ phân tử tính được lượng MDA trong mẫu, lượng MDA trong mẫu thường được tính theo lượng mg MDA/ kg mẫu Bảng 1 liệt kê các giá trị hằng số hấp thụ phân tử của các tác giả khác nhau [26, 34]

Brng 1 Cac gia tri hang s6 hap thy phan tir [34]

Bước sóng (nm) Hang so hap thu phân tử Theo tac gia

(litre/mol.cm)

Kim & LaBella (1987); Vincent et al (1988); Kosugi et al (1989)

1.6 Tình hình nghiên cứu trên thế giới và tại Việt Nam

1.6.1 Tình hình nghiên cứu trên thế giới

Phan ứng TBARS là một chủ đề nghiên cứu được rất nhiều quan tâm trên thể giới Do

đây là một phản ứng được thực hiện nhằm định lượng MDA có trong mẫu, từ đó đánh giá được mức độ stress oxy hóa

Phan ung TBARS lần đầu được đề xuất bé Kohn và Liversedge vao nam 1944, dựa

trên cơ sở phản ứng của phân tử MDA với hai phân tử TBA tạo ra dẫn xuất màu hấp thụ

cực đại ở vùng ánh sáng khả kiến (530-535 nm) và đỉnh hấp thụ thứ hai ở vùng bước

sóng tử ngoại (245-305 nm) [27]

Yu và Sinnhuber (1964) đã công bố rằng sự phân hủy của hydroperoxit hoặc các dẫn

xuất và tiền chất của MDA bằng TBA có thê làm tăng MDA tự do [45]

Nghiên cứu của Manoharan và cs [52] trên huyết tương và hồng cầu bệnh nhân ung thư tế bào biểu mô miệng cho thấy mức TBARS màng hồng cầu tăng lên dần qua các giai đoạn ung thư (giai đoạn khỏe mạnh, II, II, IV).Trong nghiên cứu về mức độ MDA và chất chống oxi hóa được tìm thấy là có liên quan với các giai đoạn khối u của bệnh nhân [30]

Turner va cs (1954) [40] va Baumgartner va cs (1975) [12] da chimg minh Sucrose tạo thành phức màu vàng khi phản ứng với TBA, gây nhiễu cho phan ing TBARS do

đỉnh ở (450-460 nm) va có chân phố hấp thụ chồng lên một phần đính hấp thụ của TBARS ở bước sóng vùng màu hồng (530-537 nm)

Đã có nhiều nghiên cứu công bồ nhiều chất gây nhiễu đến phản ứng TBARS như proten cua Chio va Tappel (1969) [15], Buttkus va Bose (1972) [14], diép lục của Shamberger va cs (1977) [35] va forrmaldehyde cua Almandos va cs (1988) [9]

1.6.2 Tình hình nghiên cứu tại Việt Nam

Hiện nay, ở Việt Nam chưa có các nghiên cứu sâu về cơ chế của phản ứng TBARS cũng như các yêu tố ảnh hưởng đến phản ứng này Nhưng có một số bài báo và nghiên cứu có đề cập đến việc dung phản ứng TBARS nhằm bán định lượng quá trình stress oxi hoá ở bệnh nhân ung thư đại trực tràng như luận an TS cua tác giả Phạm Mạnh Cường " Nghiên cứu sự thay đối hàm lượng Malondialdehyde ở bệnh nhân ung thư đại trực tràng

trước và sau phẫu thuật triệt căn" [I|, hay công trỉnh khoa học "Mức độ peroxit hóa lipid trên một số nhóm TĐƯỜI CÓ mắc độ vận động khác nhau” của Lê Thị Mai và cs (2016)

trên tạp chí Sinh lí học Việt Nam [2] Và cũng đã có một số nghiên cứu đánh giá ảnh

hưởng của điều kiện pH, nhiệt độ ủ mẫu, thời gian ủ mẫu đến phản ứng TBA Tuy nhiên,

chưa có nhiều nghiên cứu về ảnh hưởng của một số nhân tô như MSU, Glucose, Sucrose hay Hemoglobin đến phản ứng TBARS dé kiém tra liệu chúng có ảnh hưởng đến kết quả nghiên cứu hay không

2.1 Vật liệu

2.1.1 Đối tượng nghiên cứu

¢ 1,1,3,3-tetramethoxyproane (TMP) duoc sử dụng làm tiền chat dé tao chất chuẩn

MDA

se Mẫu mô nghiên cứu được lấy từ chuột duc Swiss trang co can nang tir 17-19g,

2 CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

được cung cấp bở Viện Vệ sinh Dịch Tế Trung Ương từ tháng I1-12/2019

® Mâu máu phục vụ cho nghiên cứu này được lây của các tỉnh nguyện viên là các

sinh viên khoẻ mạnh

8 Thiobarbituric acid (TBA) Alfa Aesar (MY), Merk (Buc)

9 Trichloroacetic acid (TCA) Gaoshen (Trung Quéc)

2.1.3 Thiét bi

Quá trình thực hiện nghiên cứu sử dụng các dụng cụ và trang thiết bị của phòng Proteomics và Sinh học cấu trúc thuộc Phòng Thí nghiệm Trọng điểm Công nghệ

Enzyme va Protein, va Trung Tam Khoa học Vật liệu - Khoa Vật Lý cũng như Trung tâm

Khoa học Sự sống - Khoa Sinh học Các thiết bị chính sử dụng trong nghiên cứu này

được liệt kê ở Brng 5

Bảng 3.Các thiết bị sử dụng trong nghiên cứu

STT Tên máy, thiết bị Hãng sản xuất

3 May ly tam Sigma 3K Thermo Scientific (My)

8 May đo quang phổ toàn dải UV - VIS Shimadzu (Nhật Bản)

độ phân giải cao

2.2.1 Tạo chất chuẩn MDA từ tiền chất TMP

Sau khi tham khảo một số bài báo về phản ứng tạo MDA từ TMP [62,63], chúng tôi

thực hiện phản ứng theo các quy trình: Thêm I,2u1 TMP vào 600 ul nước.Bồ sung thêm 1,2 nl HCI Phản ứng tạo MDA được thử ở các pH khác nhau của đệm: 1;1,5;2;2,5;3;4 Lần lượt ủ ở các nhiệt độ: nhiệt độ phòng, 30°C, 40°C, 50°C,60°C, 90°C trong thời gian

30 và 60 phút Sau thời gian ủ, làm mát về 25°C rồi bô sung đến thê tích I,2ml bằng

nước Đề không làm thay đổi giá trị hấp thụ của dung dịch chuẩn, dung dịch được bảo

quản tối, ở 2 - 4°C trong tối đa một tuần

222 Ảnh hưởng cua MSU, Glucose, Sucrose va Hemoglobin dén phan ting TBARS

2.2.2.1 Thí nghiệm xét các tác động của MSU, Glucose, Sucrose, Hemoglobin dén Phản ứng TBARS của quy trình đối với màng tế bào hồng cầu từ máu

Cho 50 ul mẫu bao gồm MDA được tạo ra từ TMP và một trong bốn yếu to dang xét

(MSU, Glucose, Sucrose hoic Hemoglobin) theo tỉ lệ 1:1 vào hỗn hợp dung dich phan img gém: 200 pl dém Phosphate (pH 7,4) va 500 wl TBA 0,375% (pha trong HCl 0,3 N

va TCA 3%) U hén hop trong bé 6n nhiét 6 98°C trong 30 phut Lam mát hỗn hợp sau khi ủ rồi mang di ly tâm 1000 xg trong 10 phút Thu dịch nổi và tiễn hành đo độ hấp thụ