Định nghĩa Xúc tác sinh học là một thuật ngữ dùng để mô tả việc sử dụng các chất xúc tác sinh học ở dạng toàn bộ tế bào hoặc các enzym phân lập ở trạng thái tự nhiên hoặc enzym tái tổ h
TỔNG QUAN
Xúc tác sinh học
Xúc tác sinh học là một thuật ngữ dùng để mô tả việc sử dụng các chất xúc tác sinh học (ở dạng toàn bộ tế bào hoặc các enzym phân lập ở trạng thái tự nhiên hoặc enzym tái tổ hợp) nhằm làm tăng tốc độ phản ứng tổng hợp các hợp chất hữu cơ [9]
Xúc tác sinh học là một trong những trụ cột chính của công nghệ sinh học ứng dụng, được Liên đoàn Công nghệ sinh học châu Âu xác định vai trò là “sự tích hợp của khoa học tự nhiên và khoa học kỹ thuật nhằm đạt được ứng dụng của sinh vật, tế bào, các bộ phận của chúng và các chất tương tự phân tử cho các sản phẩm và dịch vụ” [10]
Tự nhiên đã tạo ra những chất xúc tác sinh học trong quá trình tiến hóa qua hàng triệu năm Chúng chủ yếu là protein nhưng cũng có axit nucleic mang đặc tính xúc tác tương tự như đặc tính của enzym được phát hiện vào đầu những năm
80 Tuy nhiên, cho đến nay, trong số các chất xúc tác tự nhiên này, chỉ có enzym được sử dụng trong xúc tác sinh học ứng dụng
1.1.2 Ưu điểm và nhược điểm
Xúc tác sinh học ngày càng được ứng dụng rộng rãi và thay thế dần xúc tác hóa học trong các ngành công nghiệp bởi những ưu điểm mang tính đặc trưng của chúng Tuy nhiên, việc sử dụng các chất xúc tác sinh học trong công nghiệp cũng còn hạn chế do các chất xúc tác sinh học cũng có những nhược điểm nhất định Dưới đây là bảng tóm tắt ưu, nhược điểm của chất xúc tác sinh học mà cụ thể là enzym (Bảng 1.1)
Bảng 1.1 Những ưu điểm và nhược điểm chính của các chất xúc tác sinh học Ưu điểm Nhược điểm
✓ Xúc tác rất hiệu quả đối với hầu hết phản ứng hóa học và chuyển hóa đã biết
✓ Điều kiện phản ứng dễ thiết lập, đơn giản, ít tốn kém
✓ Sản phẩm phụ tạo ra ít, thân thiện với môi trường
✓ Có khả năng phân hủy sinh học
✓ Có thể chuẩn bị trên quy mô lớn thông qua quá trình lên men
✓ Có thể tái sử dụng
✓ Có thể được thiết kế đáp ứng nhu cầu
✓ Tính an toàn cao, không độc hại nếu được tuân thủ đúng quy trình
✓ Các chất xúc tác có bản chất là protein kém ổn định trong môi trường nước
✓ Nhiều enzym phụ thuộc vào cofactor
✓ Enzym có thể bị bất hoạt bởi nhiều yếu tố: Nhiệt độ cao, giá trị pH, nồng độ muối cao, bọt khí, ion kim loại trong nước, …
1.1.3 Vai trò của xúc tác sinh học trong nghiên cứu và phát triển thuốc mới
Thuốc là thành quả của hàng loạt các công trình nghiên cứu, thử nghiệm và đánh giá Trước đây, thời gian trung bình để phát triển một loại thuốc mới từ giai đoạn phát hiện cho tới khi đưa vào điều trị cho người bệnh là 10 – 15 năm Chi phí trung bình cho việc nghiên cứu và phát triển thành công một thuốc vào khoảng
800 triệu đô la cho tới 1 tỷ đô la Quá trình này gồm nhiều giai đoạn được tóm tắt trong Hình 1.1 [11]
Hình 1.1 Quá trình nghiên cứu và phát triển thuốc mới
Với thế mạnh như đã nói ở trên (mục 1.1.2), việc sử dụng xúc tác sinh học trong những thập niên gần đây đã giúp quá trình nghiên cứu và phát triển thuốc mới được rút ngắn và chi phí được giảm một cách rõ rệt [11]
Các cấu trúc tiềm năng được xác định ban đầu thường không được tối ưu hóa về hiệu quả điều trị kèm biểu hiện các tác dụng không mong muốn Do đó, cấu trúc này cần được sửa đổi bởi các chất xúc tác sinh học bằng cách thêm vào một số nhóm chức năng nhất định (oxy hóa, glycosyl hóa, halogen hóa, v.v.) hoặc chuyển đổi các nhóm chức năng hiện có (loại bỏ, oxy hóa hoặc cắt giảm, thay thế) [12] Xúc tác sinh học giúp quá trình nghiên cứu chủ động sửa đổi cấu trúc, nhanh chóng hoàn thiện cấu trúc hoạt chất tiềm năng giúp nâng cao hiệu quả điều trị và giảm thiểu tác dụng không mong muốn Khoảng 15 năm trước, ngành công nghiệp dược phẩm phần lớn đã chuyển từ xúc tác sinh học toàn bộ tế bào sang tập trung vào các quy trình dựa trên enzym được phân lập Các chất xúc tác sinh học là enzym được phân lập bảo quản trong tủ lạnh phòng thí nghiệm, luôn sẵn sàng tham gia vào một vài giai đoạn của quá trình nghiên cứu và phát triển thuốc [13] Một trong những ví dụ thành công và được công bố rộng rãi nhất về quá trình nghiên cứu, phát triển thuốc mới ứng dụng xúc tác sinh học là quá trình tổng hợp sitagliptin - dược chất của sản phẩm thương mại Januvia được sử dụng trong điều trị đái tháo đường type II Quá trình phát triển này đã ứng dụng xúc tác sinh học
6 thông qua tác dụng xúc tác của enzym transaminase Thông thường, sitagliptin được điều chế bằng cách sử dụng rhodium, một kim loại nặng làm chất xúc tác Tuy nhiên, so với phương pháp sử dụng xúc tác hóa học, phương pháp ứng dụng xúc tác sinh học cho thấy giảm đáng kể chất thải, tiết kiệm chi phí cũng như loại bỏ việc sử dụng kim loại nặng Bên cạnh đó, sản lượng và năng suất tổng thể đã tăng lên 10 và 53%, giảm tổng lượng chất thải được tạo ra 19% [10] Ngoài ra, việc sử dụng chất xúc tác sinh học giúp rút ngắn thời gian nghiên cứu và tạo ra hoạt chất sitagliptin xuống còn một năm [13] so với phương pháp tổng hợp hóa học trước đây
Trong số các enzym là chất xúc tác sinh học, CYP là chất xúc tác sinh học được ứng dụng nhiều nhất trong nghiên cứu phát triển thuốc mới, do enzym này có tính linh hoạt xúc tác với đa dạng cơ chất [11].
Cytochrom P450
1.2.1 Định nghĩa và danh pháp
Cytochrom P450 (CYP) có bản chất là hemoprotein, là một siêu họ enzym monoxygenase xúc tác cho các phản ứng chuyển hóa các hợp chất ngoại sinh, nội sinh và tổng hợp các hợp chất [2], [14] Tên gọi “cytochrom P450” có nguồn gốc do một số đặc điểm của chúng: Liên kết với màng tế bào (cyto), chứa nhân hem (chrom và P), đặc biệt là khi liên kết với carbon monoxide (CO), các protein này có độ hấp thụ cực đại ở bước sóng xấp xỉ 450 nm [2]
Hình 1.2 Mô hình hệ thống cytochrom P450 ở ty thể
7 Các cytochrom P450 được đặt tên theo Hệ thống danh pháp Quốc tế như sau: CYP, tiếp theo là một số chỉ họ (với hơn 40% độ tương đồng về trình tự acid amin) (VD:CYP1, CYP2, CYP3), tiếp sau là một chữ cái viết hoa biểu thị phân họ (với hơn 55% độ tương đồng về trình tự acid amin) (VD: CYP1A), và một chữ số biểu thị gen/isoenzym/isozym/isoform đơn lẻ; VD: CYP3A4 là enzym thuộc họ 3, phân họ A, protein thứ 4 [15]
Có nhiều tiêu chuẩn khác nhau để phân loại các CYP như dựa theo nguồn gốc, theo cấu trúc, theo trình tự…v.v Cách phân loại phổ biến nhất là theo các kiểu protein vận chuyển điện tử (redox partner) tham gia vào chuỗi truyền điện tử [16, 17] Theo tiêu chí này, CYP được chia làm 5 nhóm CYP chính (Bảng 1.2):
Bảng 1.2 Phân loại các CYP
Nhóm Protein vận chuyển điện tử Sinh vật
Trong ty thể của vi khuẩn và sinh vật nhân chuẩn
Reductase) có chứa FAD/FMN
Phổ biến ở sinh vật nhân chuẩn, tồn tại và gắn với màng lưới nội chất ER
Tồn tại trong tế bào chất của một số vi khuẩn, nấm: Bacillus megaterium
4 FMN/Fe2S2 Tồn tại trong tế bào chất của
Rhdococcus sp NCIMB 9784, Burkholderia.sp.,Ralstonia metallidurans
5 Không có protein vận chuyển điện tử, CYP tự vận chuyển điện tử
Tồn tại trong tế bào chất của Fusarium oxysporum Rất hiếm trong tự nhiên Đa số các CYP sử dụng nguồn điện tử từ cofactor NAD(P)H thông qua các thành viên của chuỗi truyền điện tử [18], gồm có một hoặc một vài protein vận chuyển điện tử
CYP được coi là chất xúc tác sinh học linh hoạt nhất trong tự nhiên Enzym này tham gia vào hơn 20 loại phản ứng oxy hóa khác nhau, bao gồm hydroxyl hóa, epoxy hóa, decarboxyl hóa, N- và O -dealkyl hóa, nitrat hóa, và ghép nối hoặc phân tách liên kết C–C, …[2] Phản ứng phổ biến nhất được xúc tác bởi CYP là phản ứng monooxygenase, hoạt hóa một phân tử O 2 , sau đó chuyển một nguyên tử oxy đã được hoạt hóa vào cơ chất, nguyên tử oxy còn lại bị khử thành nước
Cơ chế này được cụ thể hóa bằng phản ứng [19]:
Chu trình xúc tác của CYP được thực hiện thông qua một loạt các phản ứng riêng lẻ (Hình 1.3):
Hình 1.3 Chu trình xúc tác của CYP
(Redox partners: protein vận chuyển điện tử) Ở trạng thái nghỉ của CYP (A), ion sắt (Fe III ) ở trạng thái spin thấp liên kết theo trục bởi cystein - thiolat và phân tử H2O [20] Cơ chất (RH) chiếm chỗ phân tử H2O này vị trí hoạt động nhưng không liên kết trực tiếp với ion sắt (Fe III ) Ion sắt (Fe III ) của nhân hem liên kết cơ chất, chuyển sang trạng thái spin cao (B) sau đó được khử thành (Fe II ) (C) bởi một electron, được chuyển qua một protein vận chuyển điện tử lấy từ NAD(P)H [18] Tiếp theo, liên kết của O2 với Fe II tạo thành phức hợp [Fe II O2] (D) Phức hợp D bị khử bởi electron thứ hai để tạo thành phức hợp E, phức hợp này sử dụng một proton từ dung môi để tạo ra một loại hydroperoxo sắt [Fe III –OOH] (F), được gọi là hợp chất 0 (Cpd 0) Liên kết O–O của Cpd 0 bị phân cắt khi thêm proton thứ hai và giải phóng một phân tử nước để tạo ra sắt hóa trị bốn cation gốc porphyrin π hóa trị cao [Fe IV =O] (hợp chất I (Cpd I; G)) Phức hợp này tách một nguyên tử
10 hydro khỏi chất nền, dẫn đến sự hình thành hợp chất ferl-hydroxo II (Cpd II; H) Sau đó, sản phẩm hydroxyl hóa (R-OH) được hình thành do phản ứng của gốc cơ chất với nhóm hydroxyl của Cpd II và được giải phóng khỏi vị trí hoạt động của phức hợp I Cuối cùng, một phân tử nước trở lại phối trí với Fe III , phục hồi trạng thái nghỉ A của CYP Chu trình xúc tác tương tự được bắt đầu lặp đi lặp lại khi các phân tử cơ chất liên kết với vị trí hoạt động tập trung vào hem của CYP [19, 20]
Một số CYP, ví dụ như phân họ CYP152 có khả năng sử dụng trực tiếp
H2O2 làm chất cho electron và 1 proton để tạo thành Cpd 0 và thực hiện xúc tác thông qua con đường chuyển hóa peroxide (Hình 1.3, mũi tên nét đứt) Tuy nhiên, con đường này bị hạn chế rất nhiều do hiệu quả thấp và khả năng dung nạp H 2 O 2 thấp của hầu hết các CYP, ngoại trừ CYP peroxygenase.
Cytochrom P450 từ Streptomyces
Nếu như nhiều sinh vật nhân sơ chỉ có một vài CYP được mã hóa trong bộ gen của chúng; hay thậm chí như Escherichia coli và Salmonella typhimurium còn không có gen mã hóa tạo CYP [5], thì ngược lại Streptomyces lại có khả năng tạo ra lượng lớn CYP thuộc nhiều họ khác nhau Điều này góp phần lý giải tính ưu việt của các loài Streptomyces trong việc tạo ra các chất chuyển hóa thứ cấp Minh chứng là hai phần ba số kháng sinh được sử dụng trên thế giới hiện nay đến từ các loài này [21] Lý do bởi vì: bộ gen của Streptomyces rất đặc biệt khi mang một số lượng lớn gen mã hóa CYP Bộ gen được sắp xếp đầy đủ của các loài
Streptomyces cho thấy S coelcolor A3(2) có 18 gen mã hóa CYP, S avermitilis có 33 gen; S scabies có 25; S peucetius có 21 gen ; S hygroscopicus có 7 gen; và Saccharopolyspora erythraea có 22 gen [4]
Phần lớn CYP tham gia vào con đường sinh tổng hợp sản phẩm tự nhiên xúc tác quá trình hydroxyl hóa, biến đổi xenobiotic Hơn hai phần ba các CYP đặc
11 trưng từ Streptomyces xúc tác cho quá trình hydroxyl hóa Sự thêm vào bộ khung carbon của 1 hợp chất một hoặc một vài nhóm hydroxyl làm thay đổi đáng kể các tính chất như khả năng hòa tan hay hoạt tính sinh học của hợp chất đó Ví dụ như quá trình sinh tổng hợp sesquiterpene albaflavenone có hoạt tính kháng sinh được thực hiện bởi CYP170A1 qua hai bước hydroxyl hóa hợp chất epi-isozizaene [22]
Ngoài quá trình hydroxyl hóa, CYP cũng thường chuyển đổi liên kết đôi C–C thành epoxit với khả năng duy trì cấu hình [5] Các loại phản ứng mà CYP từ Streptomyces có thể xúc tác được tóm tắt trong Hình 1.4 và Bảng 1.3
Hình 1.4 Sự đa dạng về chức năng xúc tác của CYP trong Streptomyces
Bảng 1.3 Phản ứng xúc tác bởi CYP từ các loài Streptomyces [4]
Loài Streptomyces CYP Phản ứng xúc tác
158A1 Nối 2 vòng aryl (C-C, flaviolin) 158A2 Nối 2 vòng aryl (C-C, flaviolin)
Narbomycin) 170A1 Hydroxyl hóa, oxy hóa (Albaflavenone)
1.3.2 Ứng dụng trong ngành Dược
Với sự đa dạng về số lượng và chức năng của các CYP, chi Streptomyces đặc biệt được quan tâm trong 2 lĩnh vực của ngành Dược, đó là: Tổng hợp hóa dược và nghiên cứu chuyển hóa thuốc [5, 23]
Trong lĩnh vực tổng hợp hóa dược, các CYP từ Streptomyces đã và đang được ứng dụng để sinh tổng hợp các hợp chất có hoạt tính sinh học, đặc biệt trong
S avermitilis 171A1 Tạo vòng furan (Avermectin)
Narbomycin) 105P1 Hydroxyl hóa (Filipin) 105D7 Hydroxyl hóa
S hygroscopicus 105U1 Giải bão hòa (Geldanamycin) fkbD Hydroxyl hóa (Ascomycin)
Saccharopolyspora erythraea 147F1 Hydroxyl hóa (acid béo)
107A1 Hydroxyl hóa (Erythromycin A) 113A1 Hydroxyl hóa (Erythromycin A)
13 các quá trình cần hydroxyl hóa chọn lọc, tham gia vào quá trình nghiên cứu và phát triển thuốc mới Những thành tựu về ứng dụng các CYP từ Streptomyces vào ngành dược phẩm rất đa dạng, trong đó có tổng hợp kháng sinh macrolid, thuốc kháng nấm, chống ký sinh trùng, chống khối u Một số nghiên cứu ứng dụng đáng chú ý được tổng hợp lại trong Bảng 1.4
Bảng 1.4 Một số ứng dụng đáng chú ý trong ngành dược của CYP từ Streptomyces
Loài Streptomyces CYP Ứng dụng
S griseus 105A1 Xúc tác biến đổi vitamin D3 thành dạng hoạt động 1α, 25 – dihydroxyvitamin D3 [24], [25]
105D1 Xúc tác cho phản ứng N – demethyl hóa của verapamil để tạo Norverapamil giảm kháng thuốc và ít tác dụng phụ hơn [26]
Xúc tác phản ứng O – và N – dealkyl hóa của thuốc diệt cỏ coumarin và sulfonylurea [27], [28]
Xúc tác phản ứng hydroxyl hóa và epoxy hóa các acid từ nhựa cây có gốc diterpenoid [29]
S coelcolor 105N1 Tổng hợp coelibactin siderophore
170A1 sinh tổng hợp albaflavenone, một loại kháng sinh sesquiterpene ba vòng [30]
S avermitilis 171A1 Sản xuất avermectin, một dẫn xuất lacton macrocyclic có đặc tính diệt giun và diệt côn trùng mạnh
Xúc tác phản ứng cyclase vòng C6–C8α của avermectin, một dẫn xuất lacton macrocyclic có đặc tính diệt giun và diệt côn trùng mạnh
14 107W1 Hydroxyl hóa chọn lọc lại C12 của oligomycin
105D7 Xúc tác phản ứng 4′-hydroxyl hóa của thuốc chống viêm diclofenac và phản ứng 3′- hydroxyl hóa của isoflavone daidzein [32]
Xúc tác quá trình oxy hóa C8 của 8- deoxyamphotericin B thành kháng sinh polyene macrolide, amphotericin B [33]
S venezuelae 107L1 Sinh tổng hợp kháng sinh macrolide như narbomycin, pikromycin, methymycin, jadomycin và neomethymycin [34]
CYP duy nhất ở Streptomyces tham gia vào quá trình sinh tổng hợp của nhiều kháng sinh macrolide khác nhau, sử dụng vòng 12 cạnh YC17 hoặc vòng 14 cạnh narbomycin làm cơ chất [35]
Xúc tác các phản ứng oxy hóa C27 và C9 của pre-rapamycin [36]
Sinh vật duy nhất sản xuất rapamycin, một chất ức chế miễn dịch macrolide, để ngăn ngừa thải ghép nội tạng, đặc biệt hữu ích trong ghép thận và được sử dụng để phủ stent mạch vành [37]
Xúc tác phản ứng oxy hóa, O -methyl hóa và hydroxyl hóa ở C9 và C27 của tiền rapamycin [38], [39], sinh tổng hợp rapamycin
Xúc tác cho phản ứng khử bão hòa trong con đường sinh tổng hợp geldanamycin - một polyketide macrocyclic có tác dụng chống ung thư [5]
S peucetius DoxA Xúc tác tổng hợp daunorubicin từ 13- deoxydaunorubicin và tiếp tục oxy hóa daunorubicin để tạo ra doxorubicin Chúng là những tác nhân hóa trị liệu anthracycline trong điều trị ung thư, được sử dụng rộng rãi [4], [40, 41]
109A2 Xúc tác phản ứng oxy hóa trong quá trình sản xuất doxorubicin, xúc tác phản ứng hydroxyl hóa tạo resveratrol và piceatannol là những chất có hoạt tính chống ký sinh trùng, chống ung thư, chống oxy hóa, giãn mạch và chống viêm, ngăn ngừa tăng cholesterol máu, rối loạn nhịp tim, xơ vữa động mạch [42]
S platensis 107L Xúc tác quá trình hydroxyl hóa nhóm t-butyl của terfenadine, từ đó tổng hợp Fexofenadine, một loại thuốc kháng histamine được sử dụng trong điều trị viêm mũi dị ứng [43]
Xúc tác phản ứng hydroxyl hóa trong quá trình tổng hợp erythromycin A [24]
Ngoài ứng dụng trong sinh tổng hợp nhiều thuốc và các hợp chất có hoạt tính sinh học, các CYP từ Streptomyces còn được ứng dụng trong nghiên cứu về
16 chuyển hóa thuốc [44] Tính tới hiện tại, việc tách chiết và tinh sạch các enzym CYP tham gia chuyển hóa thuốc từ cơ thể người, với số lượng đủ để phục vụ cho nghiên cứu dược lý và độc tính vẫn còn bị giới hạn bởi độ ổn định của enzym phân lập từ cơ thể người, và sự hiểu biết còn hạn chế về mối liên hệ giữa nhiều CYP khác nhau trong bộ gen người Do đó, CYP từ Streptomyces là một lựa chọn thay thế cho các mô hình động vật và CYP tách chiết từ người trong nghiên cứu về chuyển hóa thuốc [45], bởi khả năng sinh tổng hợp nhiều hợp chất và phân giải nhiều chất ngoại sinh từ môi trường, giúp tiết kiệm chi phí và thời gian nghiên cứu Ví dụ như nghiên cứu về thuốc kháng khối u - acronycin, bình thường trong cơ thể được chuyển hóa thông qua phản ứng hydroxyl hóa tại vị trí 3 – methyl, C – 9, C – 11, và phản ứng 6 – demethyl hóa Nhưng khi ủ acronycin với môi trường nuôi cấy S spectabilis, sẽ thu được chất chuyển hóa là sản phẩm của phản ứng hydroxyl hóa ở 3 – methyl và C – 11 [46] CYP107L sản xuất từ S platensis có khả năng chuyển hóa amodiaquine, ritonavir, amitriptyline và thioridazine tương tự như khả năng chuyển hóa bởi các CYP ở người (CYP 3A4, 2C8, 2C19 và 2D6) [47]
Các chất chuyển hóa như vậy rất khó được tạo ra bằng phương pháp tổng hợp hóa học truyền thống, vì vậy chuyển hóa thông qua vi sinh vật nói chung và
Streptomyces nói riêng là một lựa chọn thích hợp và hiệu quả để nghiên cứu về độc tính của thuốc và các chất chuyển hóa từ thuốc
Với đặc điểm không có các gen mã hóa ra CYP, nên E.coli trở thành hệ biểu hiện lý tưởng của các CYP từ Streptomyces [48] Ví dụ, CYP102D1 từ
Streptomyces avermitilis được nghiên cứu biểu hiện thành công trong tế bào E.coli
BL21 (DE3) và được tinh sạch bằng phương pháp sắc ký ái lực ion [49]
1.3.3 Hệ thống CYP từ chủng S cavourensis YBQ59
ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Nguyên vật liệu và thiết bị
Chủng E.coli C43(DE3), chủng E.coli BL21(DE3) từ Invitrogen, plasmid biểu hiện pET17b-CYP154A, pET32b-CYP154A mang gen mã hóa CYP154A, plasmid pGro mang gen mã hóa chaperon GroES/GroEL, plasmid pET17-YkuN mang gen mã hóa YkuN và plasmid pET17- Fdr mang gen mã hóa Fdr được cung cấp bởi phòng Sinh hóa thực vật, viện Công nghệ Sinh học
Các thiết bị được sử dụng làm thí nghiệm được liệt kê ở Bảng 2.1
Bảng 2.1 Các thiết bị sử dụng
Tên thiết bị Xuất xứ
Bể ổn nhiệt VS-1205CW Vision (Hàn Quốc)
Box cấy vi sinh vật clean bench TTCG Công nghệ (Việt Nam)
Máy đo pH-827 Metrohm (Thụy Sỹ)
Máy lắc rung ổn nhiệt ProvocellTM Esco (Mỹ)
Máy lắc rung Inka (Đức)
Máy li tâm lạnh Thermo Fisher (Mỹ)
Máy khuấy từ Metrohm (Thụy Sỹ)
Hệ thống điện di đứng Thermo Fisher (Mỹ)
Máy quang phổ hai chùm tia UV-6300 Chincan (Trung Quốc)
Máy quang phổ UV 2500 Labomed (Mỹ)
Nồi khử trùng ES-315 Tomy (Nhật)
- Các ống eppendorf 2,0ml; 1,5ml
- Các ống falcon 15ml; 50ml
- Micropipet và đầu cụn phự hợp với cỏc thể tớch: 0,5 - 10 àl; 10 - 100 àl;
- Dụng cụ thủy tinh: đĩa petri, cốc có mỏ, đũa thủy tinh, pipet thủy tinh, ống đong, bình nón, bình đựng hóa chất
- Dụng cụ nhựa khác: Hộp đựng mẫu, giá để ống
- Hệ thống bình tạo khí CO tự thiết kế
- Các dụng cụ đều đạt chuẩn phân tích
Các hóa chất sử dụng đều đạt tiêu chuẩn phân tích được liệt kê ở Bảng 2.2 Các dung dịch và đệm sử dụng được pha theo hướng dẫn của các bài thí nghiệm chuẩn, có thành phần, nồng độ được tóm tắt trong Bảng 2.3
Bảng 2.2 Các hóa chất sử dụng
Hóa chất Hãng sản xuất
(quốc gia) Hóa chất Hãng sản xuất
Bảng 2.3 Công thức pha dung dịch
Dung dịch Thành phần Đệm phá tế bào Đệm KPP (10 mM, pH 7,4; NaCl 300 mM chứa
Glycerol 10%); PMSF 0,1 mM Đệm cân bằng 10 mM Đệm KPP (10 mM, pH 7,4, chứa Glycerol 10%) nồng độ 1% (v/v); Imidazol 10 mM Đệm rửa 20 mM Đệm KPP (10 mM, pH 7,4, chứa Glycerol 10%) nồng độ 1% (v/v); Imidazol 20 mM Đệm rửa giải 300 mM Đệm KPP (10 mM, pH 7,4, chứa Glycerol 10%) nồng độ 1% (v/v); Imidazol 300 mM Đệm biến tính protein 4X 0,05% (m/v) Bromophenol blue; 20% (v/v)
Glycerol; 4% (m/v) SDS; 10% β- Mercaptoethanol (v/v) pha trong đệm 125 mM Tris-HCl, pH 6,8
Dung dịch Acrylamid 40% 39% (m/v) Acrylamid; 1% (m/v) bis-Acrylamid Dung dịch APS 30% (m/v) Amoni persulfat Đệm điện di protein 10X 0,25 M Tris base; 1,92 M Glycin; 1% (m/v) SDS Dung dịch nhuộm PAGE 28,5% (v/v) Ethanol; 10% (v/v) Acid acetic băng;
22 Dung dịch tẩy PAGE 50% (v/v) Ethanol; 16,7% (v/v) Acid acetic băng Đệm KPP 10 mM 7 mM K2HPO4; 3 mM KH2PO4; pH 7,4 Đệm KPP 50mM 35 mM K2HPO4; 35 mM KH2PO4; pH 7,4 Đệm Tris 1.5 M, pH 8,8 Tris base 1,5 M; 1,6% (v/v) HCl; pH 8,8 Đệm Tris 1 M, pH 6,8 Đệm Tris 1 M; 7,2% (v/v) HCl; pH 6,8
Các môi trường sử dụng có thành phần, nồng độ được tóm tắt trong Bảng 2.4
Bảng 2.4 Môi trường nuôi cấy E.coli
LB 1% (m/v) Trypton; 1% (m/v) NaCl; 0,5% (m/v) Cao nấm men
TB 2,4% (m/v) Cao nấm men; 1,2% (m/v) Trypton; 0,5% (v/v)
Glycerol; 17 mM KH2PO4; 73 mM K2HPO4
NA 0,5% (m/v) Pepton; 0,3% (m/v) Cao nấm men; 1,5% (m/v)
Nội dung nghiên cứu
Để đạt được các mục tiêu của đề tài, chúng tôi thực hiện triển khai các nội dung như sau:
- Mục tiêu 1: Biểu hiện được enzym CYP154A từ S cavourensis YBQ59, bao gồm nội dung:
+ Biến nạp plasmid mang gen mã hóa CYP154A vào vi khuẩn E.coli, nuôi cấy E.coli tái tổ hợp và cảm ứng biểu hiện gen, thu tế bào
+ Đánh giá khả năng biểu hiện bằng điện di đồ SDS – PAGE
- Mục tiêu 2: Tinh sạch được enzym CYP154A từ S cavourensis YBQ59, với nội dung:
23 + Tinh sạch CYP154A bằng phương pháp sắc ký ái lực ion kim loại
+ Đánh giá khả năng, mức độ tinh sạch bằng điện di đồ SDS – PAGE
+ Xác định hàm lượng enzym CYP154A bằng phương pháp phổ hấp thụ cực đại
- Mục tiêu 3: Xác định tính chất của CYP154A tái tổ hợp tinh sạch được, với nội dung:
+ Xác định sự ảnh hưởng của pH, nhiệt độ và điều kiện bảo quản đến khả năng hoạt động của enzym
+ Đánh giá khả năng tương tác enzym - cơ chất
+ Chuyển hóa cơ chất in vitro và đánh giá sản phẩm chuyển hóa bằng phương pháp GC-MS
Nội dung của nghiên cứu được mô tả tóm tắt trên Hình 2.1
Hình 2.1 Sơ đồ nội dung nghiên cứu
Phương pháp nghiên cứu
2.3.1.1 Chuẩn bị tế bào khả biến
Tế bào khả biến E.coli C43 (DE3) và BL21 (DE3) được tạo theo quy trình của Nicholas Renzette, Alexandrine Froger và James E Hall [57], [58]
Nguyên lý: Màng tế bào vi khuẩn E.coli có thể trở nên khả biến khi được xử lý với ion Ca 2+ Ion Ca 2+ bao bọc lại các điện tích âm trên phân tử DNA và tăng cường khả năng xuyên qua màng tế bào của chúng
- Khuẩn lạc E.coli được cấy chuyển vào 3 ml môi trường LB lỏng, lắc 200 vòng/phút ở 37℃ qua đêm
- Tiếp giống 1% dịch tế bào nuôi cấy qua đêm vào môi trường LB lỏng mới, nuôi ở 37℃, lắc 200 vòng/phút
- Khi mật độ quang của dịch nuôi OD600nm đạt 0,4 – 0,7, đặt dịch nuôi trong đá lạnh 1 giờ, rồi ly tâm 4000 vòng/phút ở 4℃ trong 5 phút để thu tế bào
- Rửa tế bào lần 1 trong dung dịch CaCl2 100 mM lạnh và vô trùng, ủ đá lạnh 15 phút, sau đó ly tâm 4000 vòng/phút ở 4℃ trong 5 phút để thu tế bào
- Rửa tế bào lần 2 trong dung dịch CaCl2 100 mM lạnh và vô trùng, ủ đá lạnh 1 giờ, sau đó ly tâm 4000 vòng/phút ở 4℃ trong 5 phút để thu tế bào
- Hòa tế bào đã qua xử lý trong dung dịch CaCl2 100 mM lạnh và vô trùng có chứa glycerol 15%
- Chia nhỏ dịch hỗn hợp tế bào và glycerol vào cỏc ống eppendorf (50àl/ống), dùng biến nạp ngay, hoặc bảo quản ở -80℃ sử dụng trong 1 – 3 tháng
2.3.1.2 Tạo tế bào E.coli tái tổ hợp mang gen mã hóa enzym CYP154A
Plasmid mang gen quy định mã hóa CYP154A được biến nạp vào tế bào
E.coli C43(DE3), BL21 (DE3) bằng phương pháp sốc nhiệt [59]
25 Nguyên lý: E.coli sau khi được xử lý bằng CaCl2 giúp plasmid dễ dàng bám dính vào màng tế bào, khi sốc nhiệt, sử dụng sự thay đổi đột ngột về nhiệt độ để tác động lên cấu trúc thành thế bào, tạo điều kiện cho plasmid ngoại lai đi vào trong tế bào
- Lấy tế bào khả biến tươi hoặc từ -80℃ được rã đông từ từ trong đá khoảng 30 phút
- Bổ sung 1 μl plasmid tỏi tổ hợp vào cỏc ống eppendorf chứa 50 àl dịch tế bào khả biến, đảo nhẹ nhàng, ủ trong đá 30 phút
- Sốc nhiệt hỗn hợp ở 42℃ trong 45 giây, sau đó lấy mẫu ra và đặt ngay vào trong đá lạnh khoảng 10 phút
- Bổ sung 250 μl LB lỏng, nuôi lắc 200 vòng/phút ở 37℃ trong 1 giờ
- Cấy trải 100 àl dịch biến nạp trờn đĩa thạch LB cú bổ sung 100 μg/ml ampicillin, ủ ở 37℃
Ghi chú: Trường hợp tạo tế bào mang 2 vector tái tổ hợp khác nhau thì tiến hành làm tế bào khả biến với tế bào đã chứa sẵn 1 vector theo quy trình trên rồi biến nạp vector thứ hai theo quy trình tương tự Hai vector này phải mang gen kháng kháng sinh khác nhau Vì vậy môi trường nuôi cấy sẽ được bổ sung 2 kháng sinh tương ứng với nồng độ thích hợp cho sự phát triển của E.coli
2.3.1.3 Nuôi cấy tế bào E.coli tái tổ hợp mang gen mã hóa enzym CYP154A và biểu hiện gen
Tế bào E.coli sau khi được biến nạp, tiếp tục được nuôi cấy và tiến hành cảm ứng biểu hiện gen mã hóa CYP154A [57], [58]
- Một khuẩn lạc đơn E.coli mang plasmid tái tổ hợp được cấy vào môi trường LB lỏng chứa 100 àg/ml ampicillin, nuụi lắc 200 vũng/phỳt ở 37℃ qua đờm
- Cấy chuyển tế bào sang môi trường TB với tỷ lệ 1%, tiếp tục nuôi lắc 200 vòng/phút ở 37℃
- Khi mật độ quang của môi trường OD600nm đạt giá trị từ 0,8 – 1 thì bổ sung 1 mM β – D – 1 thiogalactopyranoside (IPTG) để cảm ứng biểu hiện gen, 0,5 mM Delta-Aminolevulinic acid (δ – Ala) để hỗ trợ tổng hợp nhân hem của CYP154A
- Tiếp tục nuôi lắc 200 vòng/phút ở 30℃ trong 24 giờ
- Ly tâm 4000 vòng/phút trong 15 phút để thu tế bào
- Bảo quản tế bào ở 0℃ hoặc phá tế bào để thực hiện tinh sạch protein
Ghi chú: Đối với trường hợp đồng biểu hiện gen mã hóa CYP154A với plasmid pGro: môi trường nuôi cấy tế bào E.coli BL21(DE3) được bổ sung
Kanamycin với nồng độ 30 àg/ml; cảm ứng biểu hiện gen bằng Arabinose với nồng độ 4 mg/ml môi trường nuôi cấy
2.3.2 Phương pháp điện di SDS – PAGE
Các protein được phân tách khỏi nhau bằng phương pháp điện di trên gel polyacrylamide natri dodecyl-sulfate (SDS-PAGE) của Laemmli U.K [60]
Trong môi trường có SDS (Sodium Dodecyl Sulfat), các phân tử protein được duỗi thẳng và tích điện âm, chúng sẽ di chuyển về cực dương trong điện trường với tốc độ phụ thuộc vào khối lượng phân tử: Protein nhỏ nhất sẽ di chuyển xa nhất và protein lớn nhất sẽ di chuyển quãng đường ngắn nhất
Bước 1: Đổ bản gel Đổ bản gel gồm 2 lớp: gel tách và gel cô bằng thiết bị SureCast™ Gel Handcast Đổ gel tách, chờ đông hoàn toàn trong 40 phút, đổ tiếp lớp gel cô phía trên, cài lược tạo giếng, để gel đông hoàn toàn trong 40 phút Thành phần gel được trình bày trong Bảng 2.5
Bảng 2.5 Thành phần gel cô và gel tách
Thành phần Gel tách (12%) Gel cô
DDI H2O 2,8 ml 1,95 ml Đệm Tris 1.5M, pH 8.8 2,6 ml 0 ml Đệm Tris 1.0M, pH 6.8 0 ml 250 μl
- Xử lý mẫu bằng đệm Sample 4X theo công thức:
+ V protein tinh sạch: V H2O: V Sample buffer 4X = 1:2:1
- Biến tính nhiệt: 100℃ trong 10 phút, sau đó để ở tủ 0℃ trong 1 phút
- Lắp bản gel vào hệ điện di SureCast™ Gel Handcast
- Cài điện thế 100V cho lớp gel cô, 140V cho lớp gel tách đến khi hàng mẫu chạy xuống đáy bản gel
- Nhuộm gel bằng dung dịch nhuộm PAGE trong 30 phút
- Tẩy màu gel bằng dung dịch tẩy PAGE trong khoảng 2 giờ đến khi nền gel trở nên trong suốt
2.3.3.1 Phá tế bào, thu protein
Tế bào E.coli được phá vỡ bằng phương pháp siêu âm, sử dụng máy siêu âm VCX 130/Sonics [61]
28 Nguyên lý: Đầu máy siêu âm được nhúng vào hỗn dịch tế bào, phát ra các sóng cao tần
20 kHz - 10 MHz Năng lượng của sóng siêu âm được truyền vào hỗn dịch gây ra sự thay đổi áp suất tăng giảm theo chu kì Khi áp suất âm giảm xuống dưới áp suất hơi của pha lỏng, các bọt khí được hình thành và khi phát triển đến kích thước nhất định, chúng bị phá vỡ khi áp suất pha lỏng tăng, dẫn đến giải phóng lượng lớn năng lượng, nhiệt, áp suất và các gốc tự do gây phá vỡ thành tế bào vi khuẩn
- Phân tán tế bào thu được từ bước nuôi cấy vào dung dịch Lysis buffer, phá vỡ tế vào bằng máy siêu âm, chế độ: siêu âm 10 giây, nghỉ 30 giây, tổng thời gian 30 phút Đặt hỗn dịch trong đá lạnh để tránh quá nhiệt gây biến tính protein
- Ly tâm thu dịch nổi, chế độ ly tâm: 10.000 vòng/phút x 15 phút; 4℃
2.3.3.2 Tinh sạch protein tái tổ hợp
CYP154A có trong dịch nổi siêu âm phá tế bào E.coli được tinh sạch bằng phương pháp sắc ký ái lực ion, sử dụng cột sắc ký chứa các hạt chất mang His- select® cobalt affinity gel: hạt Agarose gắn nitrilotriacetic acid – NTA tạo phức chelat với Co 2+ [62]
CYP154A được gắn thêm đuôi His gồm 6 phân tử Histidin xếp cạnh nhau Vòng imidazol của Histidin có ái lực với Co 2+ , do đó những protein gắn đuôi His sẽ gắn chọn lọc với pha tĩnh của cột sắc ký, protein tái tổ hợp sau đó sẽ được rửa giải bằng dung dịch imidazol nồng độ cao
- Cột His-select® cobalt affinity gel được rửa 2 lần với nước khử ion và đệm cân bằng (Equilibration buffer)
- Cho dịch nổi thu được sau siêu âm phá tế bào qua cột
- Rửa cột 4 lần với đệm rửa (Wash buffer)
- Rửa giải protein tái tổ hợp bằng đệm rửa giải (Elution buffer), gộp các phân đoạn dịch rửa giải đậm đặc nhất đem ly tâm loại imidazole và cô đặc bằng ống milipore 30kDa với dịch rửa giải cột CYP154A
2.3.3.3 Xác định độ tinh sạch enzym bằng phần mềm ImageJ
Sau khi đã trừ tín hiệu nền (cường độ tích hợp (Integrated density) của giếng không có protein), độ tinh sạch được tính theo tỷ lệ phần trăm cường độ tích hợp của băng protein quan tâm trong tổng số cường độ tích hợp của protein ở giếng dịch rửa giải
2.3.4 Xác định hàm lượng CYP154A
Hàm lượng CYP154A được xác định theo phương pháp quang phổ của Omura và Sato (1964) [63]
Hàm lượng CYP154A được xác định dựa vào quang phổ hấp thụ đặc trưng của CYP, khi bị khử bởi dithionite và ở dạng kết hợp với CO thì enzym này có đỉnh hấp thụ cực đại ở bước sóng 450 nm
Hình 2.2 Phổ hấp thụ UV-VIS của CYP trong điều kiện không (Fe 3+ ) và có
(Fe 2+ ) tạo phức với CO
30 Ở dạng hoạt động: Nhân hem của CYP có khả năng nhận điện tử, từ đó có khả năng tạo phức với CO và cho đỉnh hấp thụ ở bước sóng đặc trưng ở 450 nm
- Lấy vào ống eppendorf 2 ml dung dịch enzym đã được pha loãng trong dung dịch đệm KPP 10 mM, pH 7,4 tới nồng độ thích hợp để đo quang
- Thêm vào dung dịch enzym khoảng 1 – 3 mg/ml dithionite
- Chia dung dịch enzym vào 2 cuvet, tương ứng với mẫu thử và mẫu chứng, dùng máy quang phổ 2 chùm tia để ghi lại đường nền trong khoảng bước sóng 400 –
- Sục khí CO vào cuvet chứa mẫu thử trong khoảng 1 phút
- Đo phổ hấp thụ trong khoảng bước sóng 400 – 500 nm, và hiệu độ hấp thụ giữa hai bước sóng 450 nm, 490 nm
- Công thức tính nồng độ CYP154A: CYP154A = (ΔA450-490×fd)/(ε×d)
CP154A: Nồng độ CYP ở dạng hoạt động (mM) ΔA450-490: Chênh lệch độ hấp thụ ở bước sóng 450 nm và 490 nm fd: Hệ số pha loãng ε: Hệ số hấp thụ ở bước sóng 450 nm (= 91 mM -1 x cm -1 ) d: bề dày của cuvet (cm)
2.3.5 Xác định ảnh hưởng của một số yếu tố tới khả năng hoạt động của CYP154A
2.3.5.1 Xác định ảnh hưởng của pH tới khả năng hoạt động của CYP154A
KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
Biểu hiện và tinh sạch enzym CYP154A
3.1.1 Biểu hiện CYP154A tái tổ hợp trong E.coli Để có enzym phục vụ cho nghiên cứu, ban đầu plasmid tái tổ hợp pET17b- CYP154A được biến nạp vào tế bào E.coli C43(DE3) Nuôi cấy tế bào và cảm ứng biểu hiện gen CYP154A như mô tả ở mục 2.3.1 Tuy nhiên khi phá tế bào và ly tâm thu dịch nổi thì chúng tôi quan sát thấy màu đỏ (màu đặc trưng của enzyme P450) nhạt, trong khi cặn tế bào có màu đỏ đậm hơn Điều này chứng tỏ enzyme CYP154A có được biểu hiện nhưng một lượng khá lớn nằm ở thể vùi
Vì vậy, để tối ưu mức độ biểu hiện của CYP154A, chúng tôi đã thiết kế thêm vector biểu hiện CYP154A trên vector pET32b tái tổ hợp trong chủng E.coli C43(DE3), đồng thời chúng tôi tiến hành đồng biểu hiện CYP154A trên plasmid pET17b với chaperon GroES/GroEL trong chủng E.coli BL21(DE3) Qúa trình tạo tế bào E.coli tái tổ hợp được miêu tả ở mục 2.3.1.2 Tiến hành nuôi cấy tế bào
E.coli tái tổ hợp và cảm ứng biểu hiện gen CYP154A như mô tả ở điều kiện
2.3.1.3 Mẫu đối chứng âm là chủng E.coli mang plasmid pET17b không chứa gen mã hóa enzym CYP154A Sau 24 giờ, ly tâm thu tế bào và xử lý mẫu tế bào có trong 125 μl dịch môi trường nuôi cấy để điện di kiểm tra biểu hiện của CYP bằng phương pháp điện SDS-PAGE như đã mô tả mục 2.3.5 Kết quả được thể hiện trong Hình 3.1
Hình 3.1 Điện di đồ SDS – PAGE tế bào E.coli tái tổ hợp biểu hiện CYP154A với các điều kiện biểu hiện khác nhau
(1: Tế bào không mang plasmid pET17b (đối chứng âm); 2: Tế bào E.coli C43(DE3) mang plasmid pET32b-CYP154A; 3: Marker protein; 4: Tế bào E.coli C43(DE3) mang plasmid pET17b-CYP154A; 5: Tế bào E.coli BL21(DE3) mang plasmid pET17b- CYP154A và plasmid pGro biểu hiện chaperon GroES/GroEL )
Kết quả điện di cho thấy so với mẫu đối chứng âm ở giếng thứ nhất, mẫu ở giếng thứ 2 xuất hiện một băng protein đậm, tương ứng với vị trí khối lượng phân tử khoảng 63 kDa ở giếng marker protein, đúng với khối lượng phân tử của CYP154A dự kiến theo tính toán của chúng tôi Mẫu ở giếng thứ 4 xuất hiện 1 băng protein rất đậm so với mẫu đối chứng âm và ở vị trí tương ứng với vị trí khối lượng phân tử 48 kDa, dự kiến của CYP154A Trường hợp đồng biểu hiện với chaperon GroES/GroEL: chúng tôi cũng quan sát thấy ở giếng 5 có 2 băng kích thước đậm hơn so với đối chứng là băng 48 kDa tương ứng kích thước của CYP154A và băng 58 kDa tương ứng với kích thước của chaperon GroES/GroEL Điều này chứng tỏ CYP154A có khả năng đã được biểu hiện trên cả 2 plasmid là pET17b và pET32b và khi đồng biểu hiện với chaperon GroES/GroEL
3.1.2 Tinh sạch CYP154A tái tổ hợp trong E.coli Để khẳng định chắc chắn CYP154A đã được biểu hiện thành công trên
E.coli C43(DE3) và E.coli BL21(DE3) cũng như xác định được mức độ biểu hiện enzym ở cả 3 trường hợp: sử dụng vector pET17b, vector pET32b và đồng biểu hiện với chaperon như đã mô tả ở trên, chúng tôi tiến hành tách chiết, tinh sạch, và kiểm tra khả năng biểu hiện thông qua điện di đồ SDS – PAGE và phổ hấp thụ đặc trưng của CYP
Sau khi phá tế bào bằng phương pháp siêu âm được mô tả ở mục 2.3.3.1, tiến hành li tâm thu dịch nổi ở chế độ 10.000 vòng/phút trong 15 phút ở 4℃ Cho dịch nổi chảy qua cột His-select® cobalt affinity gel đã được cân bằng pH và lực ion bằng đệm cân bằng 10 mM trước đó Loại các protein bám không đặc hiệu bằng đệm rửa 20 mM Enzym bám cột được rửa giải bằng đệm rửa giải 300 mM, thu phân đoạn đặc nhất Gộp các phân đoạn 300 mM, sau đó tiến hành cô đặc enzym, loại Imidazol và NaCl bằng màng lọc millipore 30 kDa Mẫu sau ly tâm được mang đi kiểm tra nồng độ bằng phương pháp phổ hấp thụ đặc trưng và bổ sung glycerol để bảo quản enzym dùng cho những thí nghiệm tiếp theo
Trên hình 3.2 cho thấy khi qua cột His-select® cobalt affinity gel, protein dần bám cột từ trên xuống dưới theo chiều dịch chuyển của dịch nổi và khối hạt resin chuyển từ màu xanh sang màu đỏ Đỏ là màu đặc trưng của enzym CYP, điều này góp phần khẳng định tế bào E.coli đã biểu hiện, enzym được giải phóng thành công, CYP154A đã được biểu hiện trong tế bào ở dạng hòa tan và có thể tinh sạch được bằng cột His-select® cobalt affinity gel
Hình 3.2 Dịch nổi sau khi phá tế bào biểu hiện CYP154A
(A Dịch nổi sau siêu âm phá tế bào; B.1 Hình ảnh cột His-select® cobalt affinity geltrước khi cho dịch nổi lên cột; B.2 Hình ảnh cột His-select® cobalt affinity gelsau khi cho dịch nổi lên cột) Để góp phần khẳng định CYP154A được biểu hiện trong E.coli cũng như đánh giá mức độ tinh sạch của enzym, chúng tôi tiến hành chạy điện di SDS – PAGE một lần nữa với mẫu enzym tinh sạch, so sánh với mẫu tế bào E.coli biểu hiện CYP154A trước đó, kết quả được thể hiện trên Hình 3.3
Hình 3.3 Điện di đồ SDS – PAGE của CYP154A trước và sau tinh sạch
1: Mẫu tế bào BL21(DE3) mang gen mã hóa CYP154A và chaperon sau biểu hiện; 2 Mẫu enzyme tinh sạch; 3 Marker
Kết quả điện di cho thấy, mẫu enzym tinh sạch có 1 băng đậm (giếng 2) tương ứng với băng đậm nhất ở mẫu tế bào biểu hiện mang gen CYP154A (giếng 1), có kích thước khoảng 48 kDa trên marker (giếng 3), đúng bằng kích thước dự đoán của enzym CYP thông qua trình tự gen, chứng tỏ enzym này đã được tách chiết và tinh sạch Điều này góp phần chứng tỏ, CYP154A đã biểu hiện và tinh sạch thành công Độ tinh sạch enzym tính theo phần mềm ImageJ là 90,7 %
40 Để khẳng định chắc chắn protein tinh sạch được là CYP154A, chúng tôi tiến hành xác định phổ hấp thụ của dung dịch protein tinh sạch theo phương pháp của Omura và Sato đã mô tả ở mục 2.3.4 Kết quả được thể hiện ở Hình 3.4
Hình 3.4 Phổ hấp thụ UV-VIS của CYP154A ở trạng thái khử gắn CO sau tinh sạch
Sau khi khử enzym bởi dithionite và sục khí CO, hình ảnh thu được khi quét độ hấp thụ trên dải bước sóng 400 – 500 nm cho thấy enzym có độ hấp thụ cực đại ở 450 nm (Hình 3.4), đây là tính chất đặc trưng chỉ có ở CYP
Sau tinh sạch, mức độ biểu hiện ở 3 trường hợp sử dụng vector pET17b, sử dụng vector pET32b và đồng biểu hiện với chaperon GroES/GroEL, lần lượt là: 198,5 nmol/L, 120 nmol/L, 399,8 nmol/L môi trường nuôi cấy
Các kết quả thu được chứng minh rằng enzym CYP154A tái tổ hợp đã được biểu hiện thành công trong E coli Enzym biểu hiện ở thể tan tốt nhất trong trường hợp được đồng biểu hiện với chaperon GroES/GroEL trong chủng E.coli
BL21(DE3) với hàm lượng đạt khoảng 400 nmol/L
Xác định một số yếu tố làm ảnh hưởng khả năng hoạt động của enzym 41 1 pH
Sau khi biểu hiện và tinh sạch được CYP154A, trước tiên cần nghiên cứu những yếu tố ảnh hưởng đến khả năng hoạt động của enzym nhằm tìm ra điều kiện tối ưu để enzym chuyển hóa cơ chất tốt nhất Do đó, chúng tôi tiến hành khảo sát ảnh hưởng của một số yếu tố tới nồng độ ở dạng hoạt động của CYP154A tái tổ hợp từ E.coli
3.2.1 pH Để tìm ra khoảng pH tối thích cho hoạt động của enzym CYP154A tái tổ hợp tinh sạch từ vi khuẩn E.coli, dung dịch enzym được chuẩn bị có nồng độ ban đầu là 65 μM được ủ ở 25℃, trong đệm KPP 40 mM có pH từ 6,0 – 8,0 Sau 1 giờ ủ, tiến hành xác định nồng độ CYP ở dạng hoạt động theo phương pháp Omura và Sato như mô tả ở mục 2.3.4 Kết quả được trình bày trong Bảng 3.1 và Hình 3.5
Bảng 3.1 Ảnh hưởng của pH đến khả năng hoạt động của CYP154A pH Nồng độ trung bình dạng CYP hoạt động (àM)
Hình 3.5 Ảnh hưởng của pH đến khả năng hoạt động của
Kết quả cho thấy enzym CYP154A khá bền ở dải pH 6,0 – 8,0 sau 1 giờ ủ ở 25℃ Trong dải pH này, nồng độ enzym ở trạng thái hoạt động đạt cao nhất tại pH 7,4
Khả năng hoạt động của enzym CYP154A được khảo sát ở hai nhiệt độ khác nhau là 30℃ và 37℃, đây là hai nhiệt độ thường được sử dụng để chuyển hóa cơ chất trong các nghiên cứu về CYP CYP154A tinh sạch được ủ trong đệm KPP 40 mM pH 7,4 chứa Glycerol 10%, ở nhiệt độ 30℃ và 37℃ trong các khoảng thời gian 0, 2, 4, 6 giờ, sau đó được mang đi xác định nồng độ ở dạng hoạt động theo phương pháp Omura và Sato như mô tả ở mục 2.3.4, kết quả được ghi lại ở Bảng 3.2 và Hình 3.6
Bảng 3.2 Ảnh hưởng của nhiệt độ đến khả năng hoạt động của
Nồng độ trung bình dạng CYP hoạt động
Hình 3.6 Ảnh hưởng của nhiệt độ đến khả năng hoạt động của
44 Kết quả trên cho thấy nồng độ ở dạng hoạt động của CYP154A tái tổ hợp giảm dần khi enzym được ủ ở 30°C và 37 độ℃, trong những khoảng thời gian 0,
2, 4, 6 giờ Cụ thể, sau 6 giờ, nồng độ ở dạng hoạt động của CYP tái tổ hợp giảm 20,22% khi ủ ở 30℃ và giảm 27,29% khi ủ ở 37℃ so với ban đầu
Vì quá trình tách chiết và tinh sạch CYP154A tái tổ hợp từ vi khuẩn E.coli thường tốn nhiều thời gian, nên enzym sau khi tinh sạch cần được bảo quản trước khi tiến hành các nghiên cứu tiếp theo Do đó, để tìm ra một điều kiện bảo quản thích hợp nhằm giữ được độ ổn định và khả năng hoạt động của enzym, chúng tôi tiến hành khảo sát hai điều kiện sau:
- Điều kiện 1: Bảo quản ở 4℃ trong đệm KPP 40 mM ở pH 7,4 có chứa Glycerol 10%
- Điều kiện 2: Bảo quản ở -20℃ trong đệm KPP 40 mM ở pH 7,4 có chứa Glycerol 50%
Dung dịch enzym có nồng độ 65 μM Sau những khoảng thời gian 5, 8, 11, và 15 ngày kể từ khi bảo quản, tiến hành đo nồng độ enzym CYP154A ở dạng hoạt động theo phương pháp Omura và Sato (mô tả ở mục 2.3.4) Kết quả được thể hiện ở Bảng 3.3, 3.4 và Hình 3.7
Bảng 3.3 Ảnh hưởng của điều kiện bảo quản 1 đến khả năng hoạt động theo thời gian của CYP154A
Ngày Nồng độ trung bình dạng CYP hoạt động (àM)
Bảng 3.4 Ảnh hưởng của điều kiện bảo quản 2 đến khả năng hoạt động theo thời gian của CYP154A
Ngày Nồng độ trung bình dạng CYP hoạt động (àM)
Hình 3.7 Ảnh hưởng của điều kiện bảo quản đến khả năng hoạt động theo thời gian của CYP154A
Kết quả trên cho thấy:
- Sau thời gian bảo quản là 15 ngày, ở cả hai điều kiện bảo quản, khả năng hoạt động của CYP154A từ S cavourensis YBQ59 tái tổ hợp trong E.coli đều giảm so với ban đầu
- Khi bảo quản ở điều kiện 1, sau 5 ngày bảo quản nồng độ CYP154A giảm 9,47% so với nồng độ ban đầu và giảm 35,0% sau 15 ngày bảo quản
- Khi bảo quản ở điều kiện 2, sau 5 ngày bảo quản nồng độ CYP154A giảm 2,89% so với nồng độ ban đầu và giảm 12,5% sau 15 ngày bảo quản
- Tại cùng một thời điểm đo, nồng độ ở dạng hoạt động của CYP154A khi bảo quản ở điều kiện 2 luôn cho kết quả lớn hơn khi bảo quản ở điều kiện
Xác định khả năng liên kết của CYP154A với các hợp chất khác nhau
Một trong những đặc tính cơ bản và quan trọng của các CYP là tính chọn lọc cơ chất Để 1 hợp chất là cơ chất của CYP thì chất đó phải có khả năng liên kết, thay thế vị trí của phối tử nước trong trung tâm hoạt động của enzym, dẫn tới sự thay đổi trạng thái spin của sắt ở nhân hem từ thấp lên cao, tương ứng với sự thay đổi phổ hấp thụ typ I của P450 với cực đại hấp thụ rất điển hình ở 390 nm và cực tiểu hấp thụ ở 420 nm Dựa vào tính chất này, chúng tôi tiến hành sàng lọc cơ chất trên 1 thư viện gồm hơn 50 chất thuộc các nhóm hợp chất khác nhau (Phụ lục I) Kết quả là có 11 chất làm thay đổi phổ hấp thụ sang Typ I shift được trình bày trong Bảng 3.5
Bảng 3.5 Các hợp chất sàng lọc cơ chất cho CYP154A
Tên hợp chất Cấu trúc hóa học Khối lượng phân tử (g/mol)
Phân loại theo cấu trúc hóa học
Trong các hợp chất được khảo sát, sự thay đổi phổ typ I được quan sát thấy rõ ràng ở các hợp chất: Octanol-1; Decanol-1; Decanol-2; Geraniol; Nerol (Hình 3.8a và 3.8b) Vì vậy, Geraniol; Octanol-1; Decanol-1; Nerol; Decanol-2 có khả năng gắn với CYP154A
Hình 3.8a: Phổ UV-VIS của CYP154A khi thêm các hợp chất khảo sát vào dung dịch enzym Hình 3.8b: Phổ UV-VIS của CYP154A ở trạng thái gắn Octanol-1; Decanol-1; Decanol-2; Geraniol; Nerol
3.3.2 Xác định hằng số phân ly của phản ứng gắn enzym – cơ chất
Khi enzym CYP gắn với cơ chất, phổ hấp thụ của dung dịch thay đổi theo kiểu I và phổ hấp thụ phụ thuộc vào nồng độ cơ chất cũng như nồng độ của enzym
Do đó, hằng số phân ly Kd của phản ứng enzym – cơ chất có thể được xác định dựa trên tính chất này, theo phương pháp đã mô tả ở mục 2.3.5.2 Cơ chất được thờm dần dần vào dung dịch enzym CYP nồng độ 0,26 àM tới khi enzym bóo hũa
Sự phụ thuộc của độ chênh lệch giữa cực đại và cực tiểu hấp thụ vào nồng độ cơ chất được biểu diễn theo phương trình Michaelis Menten sử dụng phần mềm GraphPad Prism 10 Kết quả xác định Kd của phản ứng giữa CYP154A và 5 cơ chất được thể hiện ở bảng 3.6 và Hình 3.10, 3.11, 3.12, 3.13, 3.14
Bảng 3.6 Sự thay đổi phổ hấp thụ của enzym CYP154A tái tổ hợp khi thêm các cơ chất ở những nồng độ khác nhau vào dung dịch enzym
Hình 3.9 Sự phụ thuộc chênh lệch độ hấp thụ cực đại và cực tiểu với nồng độ Geraniol trong dung dịch enzym CYP154A
Hình 3.10 Sự phụ thuộc chênh lệch độ hấp thụ cực đại và cực tiểu với nồng độ Octanol-1 trong dung dịch enzym CYP154A
Hình 3.11 Sự phụ thuộc chênh lệch độ hấp thụ cực đại và cực tiểu với nồng độ Decanol-1 trong dung dịch enzym CYP154A
Hình 3.12 Sự phụ thuộc chênh lệch độ hấp thụ cực đại và cực tiểu với nồng độ Nerol trong dung dịch enzym CYP154A
Hình 3.13 Sự phụ thuộc chênh lệch độ hấp thụ cực đại và cực tiểu với nồng độ Decanol-2 trong dung dịch enzym CYP154A
Chuyển hóa cơ chất in vitro và đánh giá sản phẩm chuyển hóa bằng phương pháp GC-MS
Sau khi tiến hành sàng lọc cơ chất, để xác định chính xác cơ chất của CYP154A, chúng tôi tiến hành phản ứng chuyển hóa in vitro như đã mô tả ở mục 2.3.9.1 Chúng tôi tiến hành chuyển hóa in vitro với 5 cơ chất tiềm năng sau khi đã sàng lọc ở trên Mẫu đối chứng được tiến hành ở cùng điều kiện, thành phần tương tự mẫu thử nhưng không chứa CYP154A Các chất sau phản ứng được chiết bằng dụng dung môi ethyl acetat Mẫu thử và mẫu đối chứng sau khi bay hơi dung môi dưới áp suất giảm xuống thể tích khoảng 100 μl được đem đi phân tích bằng phương pháp sắc ký khí ghép khối phổ (Gas Chromatography-Mass Spectrometry – GC-MS) như đã mô tả trong mục 2.3.9.3, kết quả sẽ được thể hiện qua Hình 3.14 - 3.25
So sánh sắc ký đồ GC, mẫu đối chứng và mẫu chuyển hóa của các chất thử nghiệm cho thấy sự xuất hiện của một số đỉnh hấp thụ mới với thời gian lưu Rt khác biệt với Rt của mẫu đối chứng
Hình 3.14 Sắc ký đồ GC-MS của Geraniol tinh khiết
Hình 3.15 Sắc ký đồ GC-MS của sản phẩm chuyển hóa Geraniol
- Kết quả cho thấy, Geraniol có thời gian lưu là 3,8 phút (Hình 3.14) Chuyển hóa Geraniol in vitro bằng CYP154A cho sản phẩm duy nhất có thời gian lưu là 6,8 phút (Hình 3.15)
Hình 3.16 Phổ khối (MS) của sản phẩm chuyển hóa Geraniol và cấu trúc dự đoán
Kết quả cho thấy: Sản phẩm chuyển hóa Geraniol có độ tinh sạch cao (Hình 3.15) Khi so sánh với thư viện phổ khối NIST 2.0 (National Institute of Standards and Technology), sản phẩm này có độ tương đồng cao nhất với chất có công thức phân tử là C10H18O2, và có tên là 8-hydroxylgeraniol (cấu trúc phân tử minh họa như trên Hình 3.16)
Hình 3.17 Sắc ký đồ Sắc ký đồ GC-MS của Nerol tinh khiết
Hình 3.18 Sắc ký đồ Sắc ký đồ GC-MS sản phẩm chuyển hóa của Nerol
- Kết quả cho thấy, Nerol có thời gian lưu là 3,8 phút (Hình 3.17) Chuyển hóa Nerol in vitro bằng CYP154A cho sản phẩm duy nhất có thời gian lưu là 7,2 phút (Hình 3.18)
Hình 3.19 Phổ khối (MS) của sản phẩm chuyển hóa Nerol và cấu trúc dự đoán
- Kết quả cho thấy: Sản phẩm chuyển hóa Nerol có độ tinh sạch cao (Hình 3.18) Khi so sánh với thư viện phổ khối NIST 2.0 (National Institute of Standards and Technology), sản phẩm này có độ tương đồng cao nhất với chất có công thức phân tử là C10H18O2, và có tên là 8-hydroxylgeraniol (cấu trúc phân tử minh họa như trên Hình 3.19)
Hình 3.20 Sắc ký đồ GC-MS của Octanol-1 tinh khiết
Hình 3.21 Sắc ký đồ GC-MS sản phẩm chuyển hóa của Octanol-1
- Kết quả cho thấy, Octanol-1 có thời gian lưu là 6,8 phút (Hình 3.20) Chuyển hóa Octanol-1 in vitro bằng CYP154A cho sản phẩm duy nhất có thời gian lưu là 8,6 phút (Hình 3.21)
Hình 3.22 Phổ khối (MS) của sản phẩm chuyển hóa Octanol-1 và cấu trúc dự đoán
- Kết quả cho thấy: Sản phẩm chuyển hóa Octanol-1 có độ tinh sạch cao (Hình 3.21) Khi so sánh với thư viện phổ khối NIST 2.0 (National Institute of Standards and Technology), sản phẩm này có độ tương đồng cao nhất với chất có công thức phân tử là C8H18O2, và có tên là 1,7-Octandiol (cấu trúc phân tử minh họa như trên Hình 3.22)
Hình 3.23 Sắc ký đồ GC-MS của Decanol-1 tinh khiết
Hình 3.24 Sắc ký đồ GC-MS sản phẩm chuyển hóa của Decanol-1
- Kết quả cho thấy, Decanol-1 có thời gian lưu là 8,8 phút (Hình 3.23) Chuyển hóa Decanol-1 in vitro bằng CYP154A cho 2 sản phẩm có thời gian lưu lần lượt là 5,7; 10,7 phút (Hình 3.24)
Hình 3.25 Phổ khối (MS) của sản phẩm chuyển hóa Decanol-1 và cấu trúc dự đoán
- Kết quả cho thấy: Sản phẩm chuyển hóa Decanol-1 có độ tinh sạch cao nhất trong 3 sản phẩm (Hình 3.24) Khi so sánh chất này với thư viện phổ khối NIST 2.0 (National Institute of Standards and Technology), nó có độ tương đồng cao nhất với chất có công thức phân tử là C12H26O2, và có tên là 1-Methoxy-3(2- hydroxyethyl)-nonan (cấu trúc phân tử minh họa như trên Hình 3.25)
BÀN LUẬN
Về kết quả biểu hiện enzym CYP154A tái tổ hợp trong E coli
Dựa theo kết quả của nghiên cứu trước đây [8], đề tài tiếp tục sử dụng E.coli làm hệ biểu hiện cho CYP154A Bởi chúng có nhiều ưu điểm nổi bật: Tốc độ tăng trưởng nhanh, năng suất sản phẩm cao với protein tái tổ hợp được biểu hiện chiếm tới 50% tổng số protein của tế bào, trong bộ gen không có gen mã hóa enzym CYP nào
Trong nghiên cứu trước, gen mã hóa CYP154A được đưa vào plasmid pET17b và biểu hiện ở chủng E.coli C43(DE3) đã được khảo sát [8] Tuy nhiên mức độ biểu hiện của enzym này còn thấp Theo Francis và Page, khả năng biểu hiện protein trên hệ biểu hiện phụ thuộc chủ yếu vào 4 yếu tố: (1) protein cần biểu hiện, (2) plasmid biểu hiện, (3) dòng tế bào biểu hiện và (4) điều kiện nuôi cấy, biểu hiện enzym Để thuận lợi cho quá trình xác định tính chất của enzym, chúng tôi nghiên cứu để nâng cao mức độ biểu hiện của enzym này ở E.coli Đầu tiên, gen mã cho enzym CYP154A được chuyển sang plasmid pET32b để so sánh Plasmid pET32b có chứa đoạn gen Trx mã hóa cho protein thioredoxin (Trx-Tag) có độ dài 109 axit amin là protein có thể hỗ trợ quá trình hình thành liên kết disulfide Khi gen mục tiêu khi đưa vào plasmid pET32b thì protein sẽ được biểu hiện ra dưới dạng protein dung hợp với thioredoxin Nếu trong cấu trúc protein có cầu disulfua thì thioredoxin sẽ giúp protein đích khi được biểu hiện ra sẽ được
63 cuộn xoắn chính xác do đó làm tăng mức độ biểu hiện protein [76] Hiệu quả của thioredoxin trong việc tăng mức độ biểu hiện đã được thể hiện đối với CYP154C [77] Tuy nhiên, khi áp dụng với CYP154A thì mức độ biểu hiện của enzym này qua plasmid pET32b không được cải thiện Khi quan sát phổ protein của tế bào biểu hiện chứa plasmid pET32b-CYP154A trên bản SDS-PAGE, chúng tôi quan sát thấy vạch protein ở vị trí có kích thước 63 kDa đậm hơn so với cùng vị trí ở mẫu đối chứng, điều này thể hiện CYP154A đã được biểu hiện Theo tính toán khối lượng phân tử CYP154A dựa trên trình tự protein suy diễn, enzym có kích thước khoảng 48 kDa Sự tăng kích thước từ 48 kDa lên 63 kDa này, được lý giải là do trình tự CYP154A đã được biểu hiện dưới dạng protein dung hợp vớithioredoxin (11,8 kDa), 6 His (840,9 Da), S tag (1,7 kDa) gắn đoạn trình tự acid amin nhận biết enterokinase (606,5 Da) và CYP154A dẫn đến việc tăng kích thước trên Mặc dù CYP154A đã được biểu hiện thông qua pET32b, nhưng khi phá tế bào thì cặn tế bào vẫn giữ nguyên màu hồng ban đầu, hàm lượng protein sau tinh sạch không tăng so với trường hợp biểu hiện với vector pET17b Điều này chứng tỏ một phần protein đã được biểu hiện dưới dạng thể vùi và thioredoxin không giúp tăng mức biểu hiện protein trong trường hợp này Vì vậy, chúng tôi đã tiến hành đồng biểu hiện CYP154A với chaperon GroES/GroEL Plasmid pET17b-CYP154A được đồng biến nạp với plasmid chứa gen mã hóa cho chaperon GroES/GroEL vào E.coli BL21(DE3) GroEL và GroES là hai chaperon từ vi khuẩn Escherichia coli đã được nghiên cứu nhiều nhất [78] GroEL và co- chaperonin GroES kết hợp cùng nhau tạo điều kiện thuận lợi cho việc gấp cuộn của nhiều protein thông qua việc giải phóng phụ thuộc ATP và ngăn chặn sự tập hợp sai của chúng [79] Kết quả cho thấy, khi đồng biểu hiện với chaperon, mức độ biểu hiện của CYP154A tăng gấp 2 lần, từ ~200 nmol/L môi trường nuôi cấy lên ~ 400 nmol/L
Kết quả xác định đặc tính phổ UV ở dạng khử gắn CO của CYP154A cho cực đại hấp thụ ở bước sóng khoảng 450 nm, chứng tỏ CYP154A được biểu hiện ở dạng còn hoạt tính và bền trong quá trình chiết tách, tinh sạch enzym
Về kết quả tinh sạch enzym CYP154A tái tổ hợp
Do enzym được biểu hiện dưới dạng dung hợp với đoạn His-tag (polyhistidine-tag) nên CYP154A được tinh sạch bằng cột His-select® cobalt affinity gel
Kết quả điện di SDS-PAGE (Hình 3.4) cho thấy, ở giếng 3, ngoài băng đậm của CYP154A còn xuất hiện số ít băng mờ ở các vị trí khác Điều đó cho thấy CYP154A chưa được tinh sạch hoàn toàn Có một lượng nhỏ các protein tạp đã liên kết với cột và được rửa giải cùng CYP154A Protein tạp rửa giải cùng với CYP được chia thành 4 nhóm: (1) protein chứa mô típ (motif) bề mặt có khả năng tương tác kim loại, mặc dù ái lực với cột yếu hơn nhiều so với protein His-tag; (2) protein chứa các cụm Histidin hoặc các trình tự acid amin liên tiếp có khả năng tạo liên kết chelat với Co 2+ trên bề mặt như Glycin, Cystein, Glutamat, Aspartat ; (3) protein dung hợp với protein His-tag, ví dụ chaperon; (4) protein có tương tác với hạt agarose – cấu trúc giá đỡ của Co 2+ -NTA [62] Tuy nhiên không dễ để dự đoán được những loại protein nào sẽ tương tác với cột và đồng rửa giải cùng protein His-tag
Qua đánh giá bằng phần mềm ImageJ thì độ tinh sạch của enzym cao, đạt
>90% Do trong E.coli không có enzym CYP nào nên với độ tinh sạch này có thể sử dụng cho các nghiên cứu xác định tính chất của enzym Trong trường hợp cần nghiên cứu cấu trúc tinh thể thì cần loại bỏ hoàn toàn các protein tạp bằng cách áp dụng thêm một số phương pháp tinh sạch khác.
Kết quả khả năng tương tác – chuyển hóa giữa CYP154A với cơ chất
Tính đặc hiệu cơ chất của enzym CYP được quyết định không những bởi các vị trí bảo thủ ở vùng liên kết nhân heme (Heme binding motif), I-helix và K- helix mà còn bởi các trình tự axit amin ở gần vị trí trung tâm hoạt động của chúng [80] Các vùng trình tự này có vai trò quyết định tính linh hoạt của cấu trúc, giữ cấu hình để giúp enzym liên kết với các cơ chất một cách chính xác và phù hợp do đó đảm bảo chức năng của enzym Các enzym có độ tương đồng càng cao thì
65 khả năng có tính đặc hiệu cơ chất giống nhau càng lớn Vì vậy, để xác định enzym có độ tương đồng cao với CYP154A, chúng tôi sử dụng công cụ BLAST so sánh với các protein đã được đăng ký trên ngân hàng NCBI (National Center for Biotechnology Information) Khi phân tích trình tự protein, cho thấy rằng CYP154A có độ tương đồng về trình tự acid amin cao nhất với enzym CYP154A1 (72%) từ chủng Streptomyces coelicolor A3(2) Điều này gợi ý rằng CYP154A là thành viên của phân họ CYP154A1 (Hình 4.1)
Hình 4.1 Kết quả so sánh trình tự của CYP154A với các protein có độ tương đồng cao nhất trong ngân hàng NCBI
CYP154A1 là một monooxygenase có cấu trúc rất đặc biệt của
Streptomyces coelcolor A3(2) : Nhân hem ngược với định hướng nhân hem của hầu hết các CYP Streptomyces, một số gốc axit amin có khả năng tham gia liên kết với cơ chất, chúng kết hợp tạo thành một khoang kỵ nước, kích thước tương đối nhỏ của khoang liên kết cơ chất (340 Å 3 ) [81] Tính đặc hiệu xúc tác được quy định không chỉ bởi trung tâm hoạt động của enzym mà còn chịu ảnh hưởng của các yếu tố bên ngoài vị trí liên kết với cơ chất Những nghiên cứu về các cơ chất của CYP154A1 còn rất khiêm tốn, nhưng với những phân tích trên chúng tôi suy đoán những chất cấu trúc đơn giản, nhỏ gọn và có tính kỵ nước thì có khả năng liên kết và được chuyển hóa bởi CYP154A
66 Trong quá trình tìm kiếm, sàng lọc cơ chất cho CYP154A, chúng tôi đã xuất phát từ những enzym trong cùng họ và phân họ với nó Kết quả tìm được cho thấy: CYP154A8 - một enzym monooxygenase, có khả năng chuyển hóa đa dạng nhóm cơ chất như axit béo chuỗi trung bình: octanoic acid, nonanoic acid, decanoic acid, undecanoic acid, undecanoic acid, tetradecanoic acid, 2,4,6,8- tetramethyl decanoic acid; rượu béo chuỗi trung bình: octanol-1, octanol-2, octanol-3, decanol-1; 2,4,6,8-tetramethyl decan-1-ol, 2,4,6-trimethyloctan-1-ol; một số monoterpen mạch hở: geraniol, nerol, geranyl aceton, neryl aceton ; một số hợp chất thơm: benzyl methyl sulfide, phenyl methyl sulfide [82] Từ đó, chúng tôi dự đoán CYP154A cũng có khả năng chuyển hóa các chất trên Vì vậy, chúng tôi đã thêm các chất đó vào danh sách sàng lọc cơ chất tiềm năng cho CYP154A
Ngoài dữ liệu điều kiện về cơ chất như đã trình bày ở trên, chúng tôi đã tiến hành xác định cơ chất tiềm năng dựa trên sự thay đổi Type I trong quang phổ hấp thụ của phức hợp enzym-cơ chất Kiểu thay đổi Type I xảy ra khi cơ chất thế chỗ phối tử nước của nguyên tử sắt hem, nguyên tử sắt hem sẽ chuyển từ trạng thái spin thấp (LS) sang trạng thái spin cao (HS), dẫn đến xuất hiện đỉnh hấp thụ ở 390 nm và đáy hấp thụ ở 418 nm [68] Trong ngân hàng gồm 52 hợp chất (theo Phụ lục I), chúng tôi đã sàng lọc theo phương pháp này Kết quả thực nghiệm cho thấy CYP154A đã chuyển hóa những chất: Geraniol, Nerol, Octanol-1, Decanol-1
Như vậy CYP154A có khả năng chuyển hóa các hợp chất monoterpen mạch hở như Geraniol và Nerol, hay các fatty alcohol như Octanol-1, Decanol-1
Trong tinh dầu quế, 95% monoterpen được tìm thấy trong rễ cây, nhưng Geraniol chiếm tỷ lệ khoảng 0,18% Geraniol (3,7-dimethylocta-trans-2,6-dien-1-ol) là một monoterpen mạch hở, kỵ nước, có cấu trúc không gian nhỏ gọn, cùng tồn tại với đồng phân lập thể Nerol, chúng là thành phần quan trọng của 250 loại tinh dầu Geraniol là thành phần tạo hương thơm phổ biến nhất trong các sản phẩm tiêu dùng trên thị trường Châu Âu, được phát hiện trong 76% chất khử mùi, 41% chất tẩy rửa và chất tẩy rửa và 33% mỹ phẩm có thành phần tự nhiên Geraniol còn được biết đến với nhiều tác dụng dược lý, cụ thể là kháng khuẩn, chống viêm,
67 chống oxy hóa, chống ung thư, bao gồm các khối u phổi, tuyến tụy, gan, đại tràng và thận, bảo vệ thần kinh, ngăn ngừa sự tiến triển của bệnh Parkinson và các rối loạn thoái hóa thần kinh khác [83, 84] Các dẫn xuất của nó không được đánh giá cao về hoạt tính sinh học nhưng một trong số chúng lại là nguyên liệu để sinh tổng hợp các chất alkaloid monoterpen indole có hoạt tính sinh học mạnh, như strychnine, vinblastine - chất chống ung thư nổi tiếng… [85], đó chính là 8- hydroxygeraniol [86, 87] 8-hydroxygeraniol tổng hợp chủ yếu từ geranyl axetat thông qua các xúc tác hóa học, với hiệu suất đạt 61% [86] Hiện nay, có ít nghiên cứu tổng hợp 8-hydroxygeraniol bởi chất xúc tác sinh học
Kết quả thực nghiệm cho thấy, Geraniol, Nerol đều có khả năng gắn vào trung tâm hoạt động của CYP154A, tạo ra sự thay đổi phổ hấp thụ của dung dịch theo kiểu I với hằng số phõn ly enzym-cơ chất Kd lần lượt là 15,10 + 3,24 (àM) ; 29,40 + 5,04 (àM) Mức độ gắn của Geraniol lớn gần gấp 2 lần so với mức độ gắn của Nerol vào CYP154A Phân tích sản phẩm chuyển hóa Geraniol và Nerol bởi CYP154A bằng phương pháp GC-MS, cả 2 cơ chất trên sau quá trình hydroxyl hóa đều tạo sản phẩm là 8-hydroxygeraniol Như vậy, CYP154A là 1 chất xúc tác sinh học mới có khả năng hydroxyl hóa Geraniol và Nerol tạo thành 8- hydroxygeraniol Điều này mở ra một hướng sinh tổng hợp 8-hydroxygeraniol với hiệu suất cao và rẻ hơn so với phương pháp tổng hợp hóa học
Rượu béo (hoặc rượu chuỗi dài) thường là rượu bậc nhất chuỗi thẳng có trọng lượng phân tử cao, có từ 4-6 đến 22-26 nguyên tử carbon, có nguồn gốc từ chất béo và dầu tự nhiên Các loại rượu béo có giá trị thương mại quan trọng bao gồm rượu lauryl, stearyl và oleyl Chúng là chất lỏng nhờn không màu (số lượng carbon thấp) hoặc chất rắn dạng sáp, nhưng các mẫu không tinh khiết có thể có màu vàng Rượu béo thường có số nguyên tử carbon chẵn và một nhóm rượu (- OH) gắn với carbon cuối cùng Quá chuyển đổi cấu trúc rượu béo chuỗi trung bình bằng cách hydroxyl tạo ra các diol là các monome quan trọng để sản xuất nhựa và polyurethan, được sử dụng rộng rãi trong cuộc sống hàng ngày của chúng ta [88, 89], cụ thể : 1,8-octanediol là nguyên liệu tổng hợp poly (1, 8-octanediol-
68 co-citric acid) (POC) có tính đàn hồi và khả năng phân hủy sinh học, được ứng dụng trong y dược làm vật liệu mang dược chất để giải phóng kéo dài hoặc ứng dụng trong khâu ghép chữa lành vết thương [90, 91] ; 1,10-decanediol có thể được sử dụng để tổng hợp vật liệu màng, vật liệu lưu trữ nhiệt và các vật liệu polymer khác nhau [92] Tuy nhiên, loại diol này vẫn chưa được tổng hợp bằng phương pháp hóa học hoặc sinh học Để có được diol mong muốn, cần phải thêm một nhóm hydroxyl bổ sung vào carbon cuối cùng của rượu béo đơn Nhưng rất khó để các chất xúc tác hóa học xúc tác quá trình oxy hóa một carbon cuối cùng của rượu béo đơn Vì vậy, chất xúc tác sinh học được coi là ưu tiên hàng đầu [88] Nhu cầu thị trường mạnh mẽ đối với các polyme mới thúc đẩy nhiều công trình nghiên cứu phát triển tổng hợp các diol này P450(BM3) tự nhiên và biến thể P450(BM3J) có khả năng hydroxyl hóa tạo ra các diol như 1,4-heptanediol và 1,7- decanediol, CYP153A từ Acinetobacter sp OC4 hydroxyl hóa 1-octanol thành
Trong nghiên cứu này, chúng tôi tiến hành thử nghiệm khả năng chuyển hóa của CYP154A với Octanol-1, Decanol-1, Decanol-2 Kết quả thực nghiệm cho thấy, cả 3 chất trên đều có thể gắn vào CYP154A với hằng số phân ly lần lượt là 20,32 + 4,63 (àM), 23,31 + 6,31 (àM), 34,32 + 7,99 (àM) Hằng số phõn ly enzym-cơ chất càng nhỏ thì khả năng gắn với CYP154A sẽ càng mạnh và ngược lại Theo đó, Octanol-1 có mức độ gắn với CYP154A mạnh hơn các decanol Kết quả phân tích sản phẩm chuyển hóa các rượu béo trên bởi CYP154A-sac9 bằng phương pháp GC-MS cho thấy : CYP154A chuyển hóa Octanol-1 thành sản phẩm 1,7-Octandiol; chuyển hóa Decanol-1 thành 1-Methoxy-3(2-hydroxyethyl)- nonan
Từ các kết quả trên, chúng tôi thấy rằng: CYP154A là một enzym tiềm năng, một chất xúc tác “xanh” và có thể ứng dụng trong ngành dược phẩm để sản xuất ra tiền chất của các hợp chất có hoạt tính sinh học mạnh như 8- hydroxylgeraniol, sản xuất những nguyên liệu mới như các diol, mở ra nhiều hướng ứng dụng trong y dược cũng như các ngành công nghiệp khác
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ KẾT LUẬN
Sau khi tiến hành biểu hiện, tinh sạch và xác định tính chất của CYP154A từ Streptomyces cavourensis YBQ59 tái tổ hợp trong E.coli, chúng tôi rút ra một số kết luận sau:
1 Đã biểu hiện được enzym CYP154A từ vi khuẩn Streptomyces cavourensis YBQ59 tái tổ hợp trong E coli Enzym được biểu hiện tốt nhất khi đồng biểu hiện với chaperon GroES/ GroEL ở E.coli BL21(DE3) với mức độ biểu hiện khoảng 400 nmol/ L môi trường nuôi cấy
2 Đã tinh sạch được CYP154A tái tổ hợp bằng cột His-select® cobalt affinity gel, enzym tái tổ hợp thu được có kích thước khoảng 48 kDa trên điện di đồ SDS-PAGE
3 Đã xác định được một số tính chất của CYP154A tái tổ hợp
- CYP154A tái tổ hợp hoạt động tốt nhất ở pH 7,4; bền tại 30℃ và 37℃, điều kiện bảo quản enzym tốt là ở -20℃ trong đệm KPP, pH 7,4 có chứa Glycerol 50%
