xây dựng quy trình xác định gen lặn waxy và gen opaque 2 bằng chỉ thị phân tử ssr trên bắp zea may l

Mặc dù được sử dụng nhiều nhưng giá trị dinh dưỡng cung cấp bởi bắp nếp lại thấp do thiếu nhiều loại acid amin thiết yếu không thay thế .[20] Ngoài ra , mô ̣t số lo ại bắp có chứa yế

Tính cấp thi ết đề tài

Bắp có tên khoa học là Zea mays L, là cây ngũ cốc đứng thứ 3 trên thế giới, có tốc độ tăng trưởng cao nhất về sản lượng cũng như năng suất Bắp đóng vai trò quan trọng đối với nguồn lương thực cho con người, là thức ăn cho gia súc, đặc biệt là nguyên liệu lý tưởng cho nhiên liệu sinh học Chính những vai trò nêu trên mà nhu cầu sử dụng bắp cho ngành thực phẩm cũng như các ngành công nghiệp ngày càng tăng Riêng đối với bắp nếp, do đặc tính dẻo, thơm ngon mà nhu cầu sử dụng bắp nếp để ăn tươi và chế biến ngày càng tăng Tính chất đặc biệt trong tinh bột của bắp nếp là bởi enzyme có tên là GBSS (Granule Bound Starch Synthase) được tổng hợp bởi gene trội Waxy Gen này thường xuất hiện đột biến, làm ảnh hưởng đến cấu trúc của enzyme GBSS, làm giảm hoặc bất hoạt hoàn toàn việc tổng hợp amylose (đột biến thành gene lặn waxy) và dẫn đến làm tăng hàm lượng amylopectin, làm cho bắp dẻo hơn Mặc dù được sử dụng nhiều nhưng giá trị dinh dưỡng cung cấp bởi bắp nếp lại thấp do thiếu nhiều loại acid amin thiết yếu không thay thế [20]

Ngoài ra, mô ̣t số lo ại bắp có chứa yếu tố QPM (Quality Protein Maize) - chất lươ ̣ng protein cao, trong đó hàm lượng các loại acid amin không thay thế như: lysine, tryptophan và methionine lớn hơn gấp đôi so với bắp thường Cơ chế của quá trình làm tăng đột ngột hàm lượng các acid amin không thay thế trong nội nhũ của bắp là do gen opaque-2 (O2) Trong hạt bắp thường có chứa nhiều loại protein như zein, glutamin, albumin,… trong đó zein được mã hóa bởi gene opaque-2 chiếm đến 60% nhưng lại có hàm lượng lysine và tryptophan rất thấp Khi gen O2 xảy ra đột biến thành gen lặn (o2), ở bắp QPM sẽ làm ức chế quá trình mã hóa protein này dẫn đến làm tăng hàm lượng của các protein khác và góp phần làm tăng hàm lượng lysine và tryptophan lên đáng kể Tuy vậy, vì đây là một loại bắp tẻ nên hạt thường cứng, không thơm ngon nên

2 thường không được sử dụng để ăn tươi hay chế biến làm thực phẩm cho con người [51]

Xuất phát từ những vấn đề nêu trên, nhu cầu tạo ra giống bắp lai mới từ việc kết hợp các đặc tính dẻo của bắp nếp với yếu tố QPM ở mô ̣t số giống bắp tẻ là r ất cần thiết Nhưng để tạo ra được một giống bắp nếp lai - QPM bằng phương pháp lai và ch ọn lọc kiểu hình truyền thống thì tốn nhiều th ời gian và tốn kém, đặc biệt là phải trải qua nhiều giai đoạn tự thụ phấn để chọn lọc các tính trạng mong muốn vì cả hai tính trạng này đều do gene lặn quy định Tuy vậy, sự phát triển của các kỹ thuật marker phân tử có thể khắc phục những yếu điểm của phương pháp chọn tạo giống truyền thống Từ những cơ sở khoa học và thực tiễn nêu trên , chúng tôi đã thực hiê ̣n đ ề tài “Xây dựng quy trình xác định gene lặn waxy và gene opaque-2 bằng chỉ thị phân tử SSR trên bắp (Zea may L)”

Mục đích nghiên cứu

- Xây dựng quy trình xác định gen waxy và gen opaque-2 trên 14 dòng/giống bắp bằng phương pháp PCR-SSR.

Khả năng ứng dụng đề tài

Phương pháp hiện đại này cung cấp cho các nhà chọn giống ở Việt Nam một cách tiếp cận hiệu quả hơn để lai tạo bắp nếp lai F1 có hàm lượng protein cao, cụ thể là lysine và tryptophan Bằng cách sử dụng các kỹ thuật tiên tiến, phương pháp này giúp rút ngắn thời gian và giảm chi phí trong quá trình lai tạo, nâng cao năng suất và chất lượng của giống bắp nếp lai F1 được phát triển tại Việt Nam.

- Đề tài còn cung cấp một số thông tin về các kỹ thuật sinh học phân tử ứng dụng trong lĩnh vực nông nghiệp.

Gi ới hạn đề tài

- Đề tài mang tính chất xây dựng qui trình, được thực hiện trên số lượng giới hạn các giống/dòng bắp (14 giống/dòng)

TỔNG QUAN

Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước

Do những tính chất đặc biệt, bắp nếp waxy (tính dẻo) và bắp QPM (hàm lượng lysine và tryptophan cao) ngày càng có vai trò quan trọng trong đời sống con người Vì thế, nhu cầu nghiên cứu để lai tạo nhanh giống bắp waxy-QPM càng trở nên cấp thiết Trên thế giới đã và đang có các nhà nghiên cứu sử dụng các kỹ thuật sinh học phân tử để phát hiện gen waxy và gen opaque-2 nhằm khắc phục những nhược điểm trong công tác chọn tạo bắp lai waxy-QPM theo phương pháp truyền thống như chọn lọc kiểu hình, tự thụ phấn nhiều dòng, tốn nhiều thời gian,… Chúng tôi xin trình bày sơ lược một số công trình nghiên cứu tiêu biểu:

- Một nhóm nhà nghiên cứu [37] đã sử dụng các marker SSR: phi022, phi027 và phi061 liên kết với locus waxy để nhận diện các biến thể alen SSR liên kết với gene lặn waxy bằng cách thiết kế các cặp mồi (phi022, phi027 và phi061) để khuếch đại các đoạn SSR liên kết với locus waxy này Dù vậy, trong một báo cáo lại cho thấy các marker SSR này không ổn định cho việc phân biệt waxy và non-waxy Tuy nhiên, báo cáo đó chỉ dừng lại ở việc phân tích sản phẩm PCR-SSR trên gel agarose, có độ phân giải thấp, không phân biệt được các đoạn sản phẩm PCR-SSR, vốn có sự chênh lệch kích thước nhỏ

- Năm 2007, Liu và cộng sự [32] đã thiết kế 4 cặp mồi: P1/P2, P3/P4, P5/P6 và P7/P8 và dùng phương pháp TAIL-PCR để phân biệt 13 dòng bắp nếp và 2 dòng bắp tẻ ở Trung Quốc Tuy nhiên trong số các mồi, chỉ có cặp mồi P7/P8 là có thể phân biệt được bắp nếp và bắp tẻ nhưng cũng chỉ phân biệt được kiểu gen WXWX và wxwx

Các nhà nghiên cứu đã tiến hành lại thí nghiệm và phát hiện mồi P7/P8 không phân biệt được giữa bắp nếp và bắp lai, cũng như giữa bắp nếp và bắp QPM.

- Đối với việc phát hiện gene lặn opaque-2, Peeranuch Jompuk (2006) và Đặng Ngọc Chi (2010) đã sử dụng marker SSR phi057, phi112 và umc1066 liên kết với gen

5 opaque-2 để nhận diện alen lặn opaque-2 Nhưng kết quả chỉ có 2 mồi có thể phân biệt bắp QPM và bắp non-QPM (bắp tẻ, bắp nếp, bắp đường) là phi057 và phi112 [37, 40]

- Tại Việt Nam, Viện nghiên cứu nông nghiệp miền Nam đã thành công trong công tác kiểm tra sự hiện diện của gen lặn opaque-2 bằng mồi phi057 và phi112 Hơn nữa, họ đã xác định được 5 dòng QPM thế hệ mới V152, V64, KQ7, V66 và Q18, có thời gian sinh trưởng trung bình, đặc điểm nông sinh học, chống chịu khá tốt với sâu bệnh, đặc biệt là bệnh thối bắp, năng suất cao đáp ứng nhu cầu chọn tạo giống bắp lai QPM thế hệ mới, nâng cao hiệu quả sản xuất giống F1 [55] Ở nước ta, việc áp dụng kỹ thuật sinh học phân tử vào nông nghiệp còn một số hạn chế Vì thế, chúng tôi đã xây dựng quy trình phát hiện đặc tính gen waxy (bắp nếp) bằng chỉ thị phân tử SSR phi061 là quy trình đ ầu tiên được thực hiện ở Việt Nam, nhằm hướng tới phục vụ cho công tác chọn tạo giống bắp lai waxy-QPM trong nước.

Bắp

2.1 Định nghĩa – T ầ m quan tr ọ ng:

Bắp là một loại cây lương thực có tên khoa học là Zea mays L ssp May, thuộc bộ Poales, họ Poaceae, chi Zea, loài Z mays [53]

Ngô là loại cây lương thực đóng vai trò thiết yếu trong nền kinh tế toàn cầu, xếp thứ ba về diện tích trồng, thứ hai về sản lượng và dẫn đầu về năng suất Dù được du nhập vào Việt Nam khoảng 300 năm trước, ngô vẫn không được chú trọng đúng mức Tuy nhiên, nhờ chính sách của nhà nước trong những năm gần đây, cả năng suất, diện tích và sản lượng ngô đều có sự phát triển vượt bậc.

Bảng 1: Tình hình sản xuất của Việt Nam từ 2003 đến 2007

2.2.1 Nguồn gốc, vị trí phát sinh:

Năm 1926 Vavilov và các nhà khoa học trên thế giới đã chứng minh rằng: Mexico và Peru là những trung tâm phát sinh và đa dạng di truyền của bắp Mexico là trung tâm thứ nhất (trung tâm phát sinh) và vùng Andes (Peru) là trung tâm phát sinh thứ hai, nơi mà cây bắp đã trải qua quá trình tiến hóa nhanh chóng, sau đó lan dần khắp Châu Mỹ Nhận định này cũng được nhiều nhà khoa học: Galinat (1977), Wikess (1980), Katio (1988) chia sẻ Người ta đã tìm thấy hóa thạch phấn bắp Teosine và Tripsacum trong khai quật ở Bellas Artes (thuộc thành phố Mexico) Những khai quật ở hang động Bat của New Mexico đã cung cấp nhiều thông tin về nguồn gốc của bắp Chẳng hạn như người ta đã tìm thấy ở đây cùi bắp dài 2-3 cm và xác định tuổi vào khoảng 3600 năm trước công nguyên (CN) [6, 53]

Cho tới ngày nay vẫn có nhiều giả thuyết về nguồn gốc di truyền của cây bắp Một vài giả thuyết sau: “Là con lai giữa Teosine và thành viên không rõ thuộc chi Andropogoneae”, “Là con lai nhị bội tự nhiên giữa các loài Á châu thuộc chi Maydea và Andropogone ae”, “Là con lai giữa bắp bọc, Teosine và Tripsacum”,

Trong số đó, thuyết Teosine (Beadle (1939); Langham (1940); Langley (1941)) đã cho rằng một hoặc nhiều đột biến xảy ra với cây Teosine đã làm thay đổi một vài cấu trúc, nhờ vậy mà đã tạo nên cây bắp nguyên thủy Thực tế, cho thấy có rất nhiều điểm tương đồng giữa bắp và Teosine về hình thái, tế bào và di truyền, chúng có thể lai với nhau và cho con lai hữu thụ [51] Những giả thuyết trên về nguồn gốc vẫn còn

7 nhiều nghi vấn nên gần đây các nhà khoa học đã sử dụng phân tích DNA làm bằng chứng để khẳng định sự chắc chắn của các giả thuyết đó

Có nhiều cách để phân loại bắp như là dựa vào cấu trúc nội nhũ, đặc điểm sinh học, thời gian tăng trưởng,…Một trong số các cách trên được dùng phổ biến là dựa vào cấu trúc nội nhũ Theo cách này, bắp được chia thành 6 loại chính: bắp đá (flint corn), bắp bột (flour), bắp răng cưa (dent corn), bắp nổ (pop corn), bắp ngọt (sweet corn) và bắp nếp (waxy maize) [13]

- Bắp đá: hạt tròn, nội nhũ chứa nhiều tinh bột ở vùng miền sừng, vỏ hạt có màu trắng ngà, màu vàng hay màu đỏ Hàm lượng tinh bột chiếm từ 56 - 75% khối lượng hạt, trong đó 21% là amylose, 79% là amylopectin

- Bắp bột: hạt bẹt và đầu tròn, mặt hạt nhẵn, nội nhũ có màu trắng đục, cấu tạo xốp, dễ hút nước Hàm lượng tinh bột chiếm từ 55 - 80% khối lượng hạt, trong đó 20% là amylose, 80% là amylopectin

- Bắp răng cưa: hạt to, đẹp, đầu hạt có vết lõm như hình cái răng Hai bên sừng hạt là tinh bột miền sừng, đầu và giữa hạt là chất tinh bột mềm (miền bột) Vỏ hạt màu vàng, đôi khi màu trắng Hàm lượng tinh bột từ 60 - 65% khối lượng hạt, trong đó 21% là amylose, 79% là amylopectin

- Bắp nổ: đây là loại bắp có nội nhũ ở 2 dạng, một là dạng hình giống ngọc trai (mịn và tròn) và dạng giống như hạt lúa (dài) Ngo ài ra, trong nội nhũ cũng có các thành phần như: tinh bột, protein, , phần lớn hàm lượng tinh bột chiếm đa số

- Bắp đường: hạt thường nhăn nheo, vỏ có màu vàng, trắng hoặc tím Hàm lượng tinh bột của nội nhũ khoảng 25 - 47% khối lượng hạt, hàm lượng đường và tinh bột khá cao, có thể lên đến 19 - 31% khối lượng hạt Thành phần tinh bột của bắp đường gồm:

- Bắp nếp: hạt tròn, to, bề mặt nhẵn, màu trắng đục hoặc màu vàng Hàm lượng tinh bột chiếm khoảng 60% khối lượng hạt, trong đó amylopectin chiếm gần 100%, amylose hầu như không đáng kể

- Làm lương thực cho con người: là cây lương thực nuôi sống gần 1/3 dân số trên toàn thế giới, tất cả các nước trồng bắp nói chung đều ăn bắp ở mức độ khác nhau Chẳng hạn như các nước ở Trung Mỹ, Nam Á và Châu Phi sử dụng bắp làm lương thực chính.Vì vậy, trên phạm vi thế giới, bắp vẫn còn là cây lương thực rất quan trọng vì bắp phong phú các chất dinh dưỡng hơn lúa mì và gạo

Bắp làm thực phẩm: trái bắp non được sử dụng trong chế biến thực phẩm (bắp rau) Bắp rau được ưa chuộng vì nó sạch và có hàm lượng dinh dưỡng cao Ngoài ra, bắp nếp, bắp đường cũng được dùng làm thức ăn tươi hoặc đóng hộp làm thực phẩm xuất khẩu [6]

Làm thức ăn cho gia súc: 70% chất tinh trong thức ăn gia súc có nguồn gốc từ bắp Ngoài ra, thân bắp tươi cũng được ủ để làm thức ăn cho gia súc [1]

Bắp nếp

3.1 Ngu ồ n g ố c phát sinh – Đặ c tính :

Bắp nếp được trồng đầu tiên ở gần khu Washington (Mỹ) vào ngày 9 tháng 5 năm

1908 bởi một nhà thực vật học tên là Collins Ông ta đã trồng 53 cây và quan sát đặc tính của chúng một cách kỹ lưỡng, chụp lại bằng hình ảnh và được công bố trong một bản tin của Bộ Nông nghiệp Mỹ vào tháng 12 năm 1909 Sau đó, đến năm 1922, ở đại học Ấn Độ, một nghiên cứu khác của P.Weatherwax, Bloomington báo cáo rằng trong tinh bột của bắp nếp là loại tinh bột hiếm có tên là “erythrodextrin”, ngày nay được biết đến như là amylopectin Ông còn thấy rằng: khi nhuộm tinh bột với dung dịch iôt thì tinh bột của bắp nếp có màu đỏ, ngược lại tinh bột bắp thường có màu xanh Chính vì thế, không lâu sau, Bates và cộng sự ở Pháp khẳng định rằng nội nhũ tinh bột bắp nếp gần như chỉ có amylopetin [14] Sau khi phát hiện ra nó, loại bắp này cũng được tìm thấy ở một số nước ở Đông Nam Á như: Philipin, Miến Điện [19]

Về nguồn gốc di truyền, hiện nay các nhà khoa học đã xác định rằng bắp nếp bắt nguồn từ đột biến đơn gen từ bắp thường, đó chính là do đột biến gen trội Wx thành gen lặn wx Bắp nếp là kết quả đột biến 90% từ dạng bắp răng ngựa, được tìm thấy và thuần hóa ở Mỹ vào những năm 1930 Gần đây, các nhà khoa học cũng chứng minh được rằng bắp nếp còn được thuần hóa từ dạng bắp đá ở Trung Quốc [14]

Bắp nếp có tên khoa học Zea mays L subsp ceratina kulesh, là một trong những loài phụ của Zea mays L Cấu trúc của hạt bắp nếp có bề mặt ngoài bóng hơn bắp tẻ, lớp ngoài cùng của mặt cắt nội nhũ không có lớp sừng, bên trong nội nhũ bóng giống như sáp và được gọi là bắp sáp (nhưng nó không chứa sáp), khi nấu chín có độ dẻo, mùi vị thơm ngon Tinh bột nội nhũ của bắp nếp có hàm lượng amylopectin rất cao (có thể lên đến 100% amylopectin), trong khi bắp thường chứa 75% amylopectin và 25%

10 amylose Khi nhuộm tinh bột bắp nếp với dung dịch I 2 /KI 2% thì chuyển thành màu nâu đỏ, trong khi tinh bột bắp thường chuyển thành màu xanh tím [15, 27]

Gen Waxy nằm trên vai ngắn của nhiễm sắc thể số 9 Gen có chiều dài 3718 bp gồm có 14 exon có kích thước từ 64 - 392 bp và 13 intron có kích thước 81-139 bp trong đó ở các vùng promoter và exon có tỷ lệ G/C rất cao, trung bình khoảng 60% (có thể lên đến 75- 85%) [25, 31]

Hình 2 : Cấu trúc của gen waxy và vị trí đột biến xảy ra trên gen [25]

Chức năng của gen Waxy là mã hóa cho enzyme GBSS (granule-bound starch synthase), đây là một trong những isoenzyme chính xúc tác cho sự tổng hợp amylose, được biểu hiện ở nội nhũ và hạt phấn Ở các dạng bắp tẻ thông thường, gen Waxy là gen trội có kiểu gen WxWx hoặc Wxwx Gen này rất dễ xảy ra đột biến làm ảnh hưởng đến cấu trúc của enzyme GBSS, làm ức chế hoặc bất hoạt hoàn toàn việc tổng hợp amylose Hiện tượng enzyme GBSS bị ức chế hoàn toàn là do đột biến allen trội (Wx) thành allen lặn (wx) trên locus waxy Khi hàm lượng amylose giảm xuống thì hàm lượng amylopectin trong nội nhũ cũng tăng lên đáng kể Như vậy, quá trình đột biến từ

Sự đột biến của gen trội Wx thành gen lặn wx đã làm thay đổi tính chất của hạt ngô, từ bắp tẻ thành bắp nếp Nghiên cứu sâu hơn đã phát hiện ra có hơn 50 loại đột biến liên quan đến gen waxy, chủ yếu là do hiện tượng chèn/xóa đoạn DNA.

Đột biến waxy được gây ra bởi sự chèn các yếu tố di truyền di động như hệ thống Ac/Ds, Spm/En và gen nhảy vào gen waxy Có nhiều loại đột biến waxy khác nhau, bao gồm đột biến chèn hệ thống Ac/Ds (wx-m1, wx-m5, wx-m6, wx-m7, wx-m9), đột biến chèn thụ thể Spm (wx-m8), đột biến chèn yếu tố En-I (wx-844), và đột biến chèn yếu tố retrotransposon (wx-stonor, wx-B5, wx-G) Ngoài ra, đột biến xóa đoạn DNA cũng tạo ra các kiểu đột biến waxy (wx1-B1, wx-B, wx1-B6, wx-C4), cũng như đột biến mất đoạn và thay thế nucleotide đơn (wx-1240, wx-C, wx-BL2).

Trong sự tiến bộ của khoa học kỹ thuật, đặc biệt là di truyền học, nhiều nhà nghiên cứu cũng xác định được một loại đột biến gen waxy do sự chuyển vị của aldehytedehyrogenase rf2 vào đầu 3’ của gen waxy Báo cáo này được trình bày bởi Liu và cộng sự (2007) [32]

Amylose là một polysaccarit mạch thẳng, gồm các đơn vị D-glucose liên kết với nhau bởi liên kết α-1,4 glucozit (khoảng 3000-30000 đơn vị) Amylose có thể tan trong nước Tinh bột chứa nhiều amylose thì khó bị phân huỷ hơn tinh bột nhiều amylopectin Tuỳ theo loài thực vật, phần lớn phân tử amylose chiếm khoảng 30% khối lượng tinh bột Các phân tử iôt chiếm gọn các vòng xoắn ốc trong cấu trúc amylose, do đó làm thay đổi sự hấp thụ màu của tinh bột Vì vậy, có thể nhận biết amylose trong tinh bột bằng dung dịch Iôt Nếu tinh bột chứa amylose thì sẽ quan sát được màu xanh thẫm Amylose trong tinh bột quyết định tính cứng trong bắp và gạo [15]

12 Amylopectin là một polysaccarit và là một polyme đa nhánh của glucose, có trong các vật liệu thực vật Trong cấu tạo của amylopectin có các đơn vị glucose tạo thành mạch thẳng bằng liên kết α 1-4 glycoszit như amylose Nhưng khác với amylose, phân tử amylopectin không tan trong nước và có thêm liên kết α 1-6 glycoszit, liên kết này hình thành mạch nhánh của amylopopectin Amylopectin chiếm khoảng 70% khối lượng tinh bột, phụ thuộc vào nguồn gốc của tinh bột Gạo hạt tròn chứa hàm lượng amylopectin cao, tinh bột gạo nếp, tinh bột khoai tây sáp và tinh bột bắp nếp chứa đến 100% amylopectin, trong khi gạo hạt dài chứa hàm lượng amylopectin thấp Amylopectin quyết định tính dẻo của bắp và gạo [15]

Các nghiên cứu đã chỉ ra vai trò của các enzyme chủ chốt trong tổng hợp tinh bột ADP GlucoPhosphate synthetase (AGPase) chuyển glucose 1 phosphate thành ADP glucose (Pressis và cộng sự, 1991) Tương tự, gen waxy mã hóa và tạo ra enzyme Granule Bound Starch Synthase (GBSS), gắn ADP glucose vào đoạn mồi đầu không khử bằng liên kết 1-4 glycozit, khởi tạo chuỗi amylose.

4 glucan và enzyme Soluble Starch Synthease (SSS) kéo dài chuỗi 1-4 glucan, tổng hợp nên phân tử amylose [17, 20]

Sau khi enzyme SSS kéo dài và tổng hợp nên chuỗi 1-4 glucan thì enzym Starch Branching Enzyms (SBE) có chức năng cắt chuỗi liên kết 1-4 glucan và tạo liên kết α – (1-6) glucan hình thành mạch nhánh và tạo nên các phân tử amylopectin [20] Đối với bắp thường, enzyme GBSS có hoạt tính mạnh hơn enzyme SBE nên phần lớn sản phẩm hình thành của nó là phân tử amylose Vì thế, tinh bột nội nhũ của bắp thường chứa 75% hàm lượng amylose và 25% hàm lượng amylopetin Ngược lại, trong bắp nếp, gen trội waxy (Wx) bị đột biến thành gen lặn (wx) nên làm ức chế tổng hợp amylose của enzyme GBSS Chính vì thế, enzyme SBE hoạt động mạnh và kết quả hình thành phân tử amylopectin Điều này có thể chứng minh trong bắp nếp, thành phần tinh bột của nội nhũ gần như 100% hàm lượng amylopectin [47, 50]

Hình 3: Quá trình tổng hợp tinh bột amylose và amylopectin [36]

Bắp QPM

4.1 Ngu ồ n g ố c phát sinh – Đặ c tính :

Nguồn gốc về di truyền của bắp QPM không được xác định rõ ràng Từ năm

1914, lúc này chất lượng protein trong bắp có mặt trên thế giới còn rất hạn chế vì thiếu các acid amin thiết yếu không thay thế được cho người là lysine và trytophan.Chính vì những yếu tố cấp thiết đó nên sau một thời gian các nhà nghiên cứu đã tìm ra được một số nguyên nhân làm cho chất lượng protein trong bắp giảm đáng kể và từ đó đã tạo ra các giống bắp QPM với chất lượng protein cao

Một số nghiên cứu cho thấy: sự thiếu lysine và tryptophan là do sự hiện diện quá nhiều của một loại protein có tên là zein Đây là một loại protein tan trong rượu chiếm đến 50% protein tổng số trong nội nhũ bắp nhưng lại chứa rất ít các acid amin thiết yếu là lysine và tryptophan Trong nội nhũ bắp gồm có các protein: albumin (tan trong nước), globulin (tan trong dung dịch muối), zein hoặc prolamine (tan trong rượu mạnh) và glutelin (tan trong kiềm) [46] Đối với bắp thường, tỷ lệ trung bình của các dạng protein như sau: albumin 3%, globulin 3%, zein 60% và glutelin 34% Trái lại, protein trong phôi có nhiều albumin hơn (60% tổng protein của phôi) Hàm lượng lysine

14 (0,1g/100g protein) và trytophan trong prolamine (zein trong bắp) thấp, nhưng hàm lượng lysine trong glutelin của bắp cao hơn đáng kể, chiếm khoảng 2 đến 3g/100g protein, thậm chí cao hơn (Vasal, 2001) [51] Chính các yếu tố trên đã làm cho hàm lượng các acid amin thiết yếu không thay thế trong hạt bắp thường rất thấp Vấn đề này được các nhà khoa học tiếp tục nghiên cứu sau đó và mãi cho đến giữa những năm

Vào năm 1964, nhóm nghiên cứu của Mezrtz đã phát hiện đột biến trên gen opaque-2 và flour-2 làm tăng đáng kể hàm lượng lysine Trước đó, đột biến này đã được phát hiện.

30 năm (1935) [37] Đột biến này đã làm biến đổi gene trội opaque-2 (O2), mã hóa cho zein, thành gene lặn o2 ức chế việc tổng hợp protein này và từ đó làm thay đổi tỷ lệ các thành phần protein có mặt trong nội nhũ của bắp thành 13,2% albumin, 3,9% globumin, 22,8% zein và 50,0% glutein Tức là làm tăng tỷ lệ của các protein chứa nhiều lysine và tryptophan Vì thế, bắp QPM có hàm lượng hai acid amin lysine và tryptophan tăng lên đáng kể so với bắp thường [51]

Như vậy, bắp QPM được quy định bởi gen lặn opaque-2 Kiểu hình đột biến của gen này biểu hiệnở một số đặc tính như: nội nhũ cứng, có tính chống chịu sâu bệnh và các điều kiện bất thuận như hạn, úng như bắp thường, phẩm chất dinh dưỡng hạt thương phẩm tốt, ít bị sâu mọt phá hại khi bảo quản và nảy mầm như bắp bình thường Bắp QPM có đầy đủ ưu điểm như các loại bắp thường về năng suất và chống chịu nhưng hàm lượng protein cao hơn và chất lượng protein, đặc biệt hàm lượng lysine và tryptophan gấp đôi bắp thường

Hình 4: Hàm lượng Lysine và tryptophan của bắp thường và bắp QPM [39]

Năm 1920, gen opaque-2 được khám phá lần đầu tiên Năm 1963, đột biến trên gen này quy định hàm lượng lysine, tryptophan trong nội nhũ bắp được tìm thấy Các nhà khoa học đã nỗ lực để tìm kiếm các đột biến mới cải thiện chất lượng protein, làm gia tăng hàm lượng lysine và tryptophan.

Gen opaque-2 nằm trên nhiễm sắc thể số 7, có kích thước 3213 bp bao gồm 6 exon và 4 intron [51]

Hình 5: Cấu trúc của gen opaque-2 dựa trên sự mô tả của Madddaloni và

Schmidt cùng các công sự (1989, 1990)

(Nguồn: https://www.soils.org/publications/aj/articles/95/1/52)

4.3 Vai trò dinh dưỡ ng c ủ a b ắ p QPM :

4.3.1 Vai trò của Lysine và tryptophan:

- Là 1 acid amin thiết yếu đóng vai trò quan trọng trong cơ thể con người, giúp hấp thụ và tiêu hóa thức ăn tốt hơn ở trẻ em và người lớn

Lysin đóng vai trò quan trọng trong việc tăng cường tổng hợp protein, hỗ trợ sự phát triển toàn diện cho trẻ em, ngăn ngừa tình trạng còi cọc Do đó, axit amin này là một thành phần dinh dưỡng không thể thiếu trong khẩu phần ăn hàng ngày để đảm bảo sức khỏe và sự phát triển của trẻ nhỏ.

- Ngoài ra, lysine còn duy trì trạng thái cân bằng nitơ có trong cơ thể, do đó tránh được hiện tượng giản cơ và mệt mỏi

- Tryptophan là 1 trong 4 loại acid amin thiết yếu quan trọng hàng đầu đối với cơ thể Những acid amin này rất quan trọng nhưng cơ thể không tự tổng hợp được Vì thế, con người cần cung cấp tryptophan từ trong nguồn thức ăn

Trong dinh dưỡng, tryptophan đóng vai trò quan trọng cho cả con người và vật nuôi Nghiên cứu trên heo cho thấy việc bổ sung tryptophan giúp cải thiện đáng kể khả năng tiêu hóa và hấp thụ thức ăn của chúng.

- Đối với cơ thể người, tryptophan đóng vai trò quan trọng trong sự sinh trưởng và phát triển của trẻ em Khi bổ sung hàm lượng tryptophan nhất định giúp cơ thể chống lại mất ngủ, giảm sự căng thẳng, lo âu,…

4.3.2 Lợi ích dinh dưỡng và giá trị kinh tề của bắp QPM:

Hiện nay, ở nhiều nước, bắp vẫn là nguồn lương thực chính Tuy nhiên, giá trị dinh dưỡng trong bắp vẫn còn thấp Chính vì thế, các nhà khoa học của CIMMYT đã tạo ra các giống bắp QPM với giá trị dinh dưỡng cao hơn nhằm phục vụ cho nhu cầu dinh dưỡng thiết yếu của con người Bắp này có năng suất bằng hoặc cao hơn, khả năng chống chịu sâu, bệnh tốt hơn và đặc biệt là hàm lượng lysine, tryptophan gần như tăng gấp đôi so với bắp non-QPM để phục vụ cho nhu cầu dinh dưỡng con người

Sự nổi bật về ý nghĩa sinh học và giá trị dinh dưỡng của bắp QPM đã được chứng minh nhiều ở chuột, lợn, trẻ em ở lứa tuổi nhỏ, vị thành niên và người lớn Từ kết quả nghiên cứu thí nghiệm ở lợn, Maner đã kết luận rằng chỉ dùng bắp opaque-2 cũng cung cấp đủ protein cho lợn trong giai đoạn vỗ béo, trước và trong thời kỳ mang thai Ở Guatemala, Bressani đã chỉ ra rằng, bắp QPM đạt 90% giá trị dinh dưỡng của protein trong sữa ở trẻ nhỏ Ở Colombia, số lượng trẻ em mắc bệnh thiếu protein trầm trọng (Kwashiorkor) được chữa khỏi và có được sức khoẻ bình thường bằng những bữa ăn chỉ cần có bắp opaque-2 là nguồn protein duy nhất Bressani đã tổng kết lại những nghiên cứu ở trẻ em đã khỏi bệnh suy dinh dưỡng và thấy rằng QPM là nguồn protein chính cho những đứa trẻ đó Điều này đã dẫn đến sự cân bằng đạm và cải thiện điều

17 kiện về sức khoẻ Tác giả đã đưa ra lời khuyên: QPM là giải pháp có tính thực tế đối với thức ăn được chế biến tại nhà cho trẻ mới cai sữa [51]

Phương pháp phát hi ện đặc tính waxy

5.1.1 Phương pháp xác định tỷ lệ amylose/amylopectin trong tinh bột nội nhũ:

Trong thành phần hóa học của hạt bắp gồm: tinh bột, protein, lipid và vitamin A,B,… Trong một số loại ngũ cốc thì hàm lượng lipid trong hạt chiếm tỷ lệ khá lớn nên trong quá trình tinh sạch cần loại lipid ra khỏi tinh bột Một lý do quan trọng cần loại lipid ra khỏi tinh bột trong nghiên cứu này vì khi lipid liên kết với phân tử amylose sẽ làm ảnh hưởng đến sự hình thành phức hợp amylose-iodine [48] Vì thể, cần loại bỏ tối đa hàm lượng lipid để không ảnh hưởng đến việc xác định % amylose có trong tinh bột

Tinh bột sau khi tách chiết được hòa tan trong dung dịch DMSO 90% Sau đó nhuộm màu với thuốc nhuộm là dung dịch I2/KI Đối với bắp nếp, khi nhuộm tinh bột với dung dịch I 2 /KI 2% thì chuyển thành màu nâu đỏ, trong khi tinh bột bắp thường chuyển thành màu xanh tím [15] Từ màu sắc của dung dịch nhuộm, ta có thể phân biệt bắp thường và bắp nếp Để xác định hàm lượng amylose và amylopectin trong tinh bột của bắp cần phải tiến hành dựng đường chuẩn biểu thị mối tương quan giữa tỷ lệ amylose/amylopectin và giá trị OD Từ đó, giá trị OD mẫu thử được đối chiếu trên đường chuẩn và suy ra

19 được hàm lượng amylose Dựa vào đường chuẩn và giá trị OD đo được của mẫu có thể tính được tỷ lệ amylose và amylopectin trong tinh bột [34]

Sau khi xác định tỷ lệ amylose/amylopectin, chúng tôi tiến hành xử lý số liệu bằng phần mềm thống kê MSTATC để kiểm tra mức độ tin cậy của các lần lặp lại cũng như sự khác biệt có ý nghĩa ở mức độ P = 0.05 của các giá trị % amylose giống/dòng bắp khảo sát

5.1.2 Phương pháp định tính amylose trong hạt phấn:

Phương pháp này cũng có thể xác định trực tiếp kiểu hình bằng cách nhuộm trực tiếp hạt phấn với dung dịch I 2 /KI và soi dưới kính hiển vi Kết quả là đối với bắp tẻ, hạt phấn có màu nâu đậm, là do sự hình thành phức hợp amylose-iode có trong hạt phấn [37] Như vậy, dựa trên màu sắc của thuốc nhuộm, có thể phân biệt được bắp nếp với các loại bắp khác

Phương pháp PCR được Kary Mullis và cộng sự phát minh năm 1985, ông đã đoạt giải Nobel về Hóa học vào tháng 10 năm 1993 cho thành tựu này PCR (Polymerase Chain Reaction) là phương pháp invitro để tổng hợp và khuếch đại một đoạn DNA đặc hiệu của 2 mồi oligonucleotide gắn vào 2 sợi đôi của đoạn DNA đích với sự tham gia của enzyme DNA polymerase

Kỹ thuật tổng hợp DNA ngoài cơ thể cũng tuân thủ những nguyên tắc cơ bản của sao chép DNA trong cơ thể như: giai đoạn biến tính, giai đoạn bắt cặp và giai đoạn kéo dài chuỗi

Giai đoạn biến tính là giai đoạn nhiệt độ tăng nhanh lên đến 95°C và duy trì trong 30 giây đến 1 phút Ở nhiệt độ này, các liên kết hydro giữa hai mạch đơn của phân tử DNA sợi đôi bị phá vỡ, dẫn đến tách đôi DNA.

- Giai đoạn bắt cặp (Anealation): trong giai đoạn bắt cặp, nhiệt độ lai thường duy trì khoảng 50 - 60 0 C, trong thời gian 15 - 60 giây Mục đích của quá trình này là giúp cho các mồi (primer) tìm kiếm và bắt cặp bổ sung đặc hiệu với trình tự đích (DNA hoặc cDNA) tại vị trí mong muốn Nhiệt độ bắt cặp phụ thuộc vào số lượng G,C có trong mồi (primer)

- Giai đoạn kéo dài (Elongation): sau khi mồi (primer) tìm kiếm và bắt cặp bổ sung với trình tự đích, nhiệt độ của phản ứng lại nhanh chóng chuyển về nhiệt độ thích hợp với hoạt động của enzyme DNA polymerase, thường là 72 0 C và giữ ở nhiệt độ này

30 giây đến 2 phút tùy theo chiều dài của đoạn DNA đích cần tổng hợp Trong quá trình tổng hợp DNA polymerase sẽ lấy nucleotide (A, T, G, C) từ môi trường phản ứng để gắn vào đầu 3’ của mồi (primer) theo nguyên tắc bổ sung với trình tự trên phân tử DNA hoặc cDNA đích

Hình 6: Các giai đoạn của phản ứng PCR Thành phần phản ứng: [10]

- DNA khuôn (DNA template): được sử dụng làm khuôn cho các mồi PCR gắn vào vị trí bổ sung với nó, sau đó với sự tham gia của các thành phần cần thiết, phản

21 ứng tổng hợp sẽ diễn ra và tạo thành một đoạn ADN mới giống hệt đoạn DNA nằm giữa hai vị trí gắn mồi

- Mồi (Primer): là những đoạn oligonucleotide ngắn (kích thước 18-30 base) có thể bắt cặp theo nguyên tắc bổ sung vào đoạn khởi đầu và đoạn kết thúc của chuỗi DNA đích khi chuỗi đích này được biến tính thành sợi đơn Mồi có hai vai trò chính: quyết định nên tính đặc hiệu của phản ứng và khởi động enzyme Taq-polymerase vì enzyme này chỉ tổng hợp khi nhận dạng được đầu 3’ của trình tự mồi

- Deoxyribonucleotide triphotphat(dNTP): là nguyên liệu tham gia tạo nên mạch DNA mới, gồm bốn loại dATP, dTTP, dGTP

- Dung dịch MgCl 2 : MgCl 2 là nhân tố cần thiết để enzym Taq hoạt động, nếu nồng độ MgCl 2 thấp sẽ ức chế sự hoạt động của enzym Taq Tuy nhiên, nếu nồng độ quá cao sẽ cho kết quả PCR không đặc hiệu

- Dung đệm (Buffer): dung dịch đệm chung nhất của PCR bao gồm các thành phần KCl, MgCl 2 và Tris Muối KCl góp phần làm tăng hiệu quả của phản ứng, thông thường những mồi cho sản phẩm PCR với kích thước lớn hơn thì hoạt động tốt hơn trong môi trường có nồng độ muối thấp hơn và ngựơc lại những cặpmồi cho sản phẩm PCR ngắn hơn sẽ hoạt động tốt hơn trong môi trường có nồng độ muối cao hơn

- Enzyme polymerase: là một thành phần quan trọng của phản ứng PCR Trong điều kiện thích hợp cùng với các thành phần cần thiết khác, enzym hoạt động tổng hợp nên DNA mới

5.2.2 Kỹ thuật SSR (Simple Sequence Repeat) :

Phương pháp phát hi ện QPM

Sử sụng các thiết bị để phân tích hàm lượng của từng loại amino acid có trong nội nhũ bắp

6.2 D ự a trên marker SSR: Đối với việc phát hiện gene lặn opaque-2, Peeranuch Jompuk (2006) và Đặng Ngọc Chi (2010) đãsử dụng marker SSR phi057, phi112 và umc1066 liên kết với gen opaque-2 để nhận diện alen lặn opaque-2 Mồi phi057, phi112 và umc1066 cho các sản

Sau phản ứng PCR, các sản phẩm có kích thước từ 150 đến 170 bp, 140 đến 160 bp và 154 bp Chỉ có 2 mồi phi057 và phi112 có khả năng phân biệt bắp QPM với bắp không phải QPM (bắp tẻ, nếp, đường) Với kích thước sản phẩm sau PCR là 150 bp, phi112 là chỉ thị phân tử trội Mồi phi057, một chỉ thị phân tử đồng trội, có thể khuếch đại đoạn DNA kích thước 150-158 bp cho alen trội O2 (bắp non-QPM) và đoạn DNA khoảng 167 bp cho alen lặn o2 (bắp QPM) Phi057 được đánh giá là một chỉ thị phân tử hiệu quả trong phát hiện gen opaque-2, hỗ trợ chọn tạo giống bắp QPM.

- 90 tạ/ha, ổn định và triển vọng cho các vùng thâm canh, đặc biệt giống bắp LVN154 có chất lượng protein cao tương đương với giống QPM thế hệ cũ, đạt chuẩn giống bắp QPM của CIMMYT và đã được Bộ Nông nghiệp và PTNT công nhận cho sản xuất thử năm 2011 [55]

VẬT LIỆU – PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

Vật liệu thực vật

Mười bốn giống bắp được thu thập từ nguồn giống của Công ty cổ phần giống cây trồng Miền Nam và CIMMYT được thể hiện như bảng bên dưới:

Bảng 3: Mười bốn giống bắp được nghiên cứu (tên giống và loại bắp)

STT Tên giống Kiể u hình Kiể u gene Ghi chú

1 196TT Bắp Tẻ WXWX/Wxwx

2 YG818 Bắp Tẻ WXWX/Wxwx

3 CML 163 Bắp tẻ QPM(*) O2O2/O2o2 Đối chứng QPM và non-waxy

4 CML161 Bắp tẻ QPM (*) O2O2/O2o2 Đối chúng QPM và non-waxy

5 G196 Bắp Đường SU2SU2/SU2su2

6 G94 Bắp Đường SU2SU2/SU2su2

7 NSSC8080 Bắp N ếp wxwx Đối chứng waxy và non-QPM

8 Nù Bình Chánh Bắp N ếp wxwx nt

10 SSC06 Bắp N ếp wxwx nt

11 CPC Bắp N ếp wxwx nt

13 MX10 Bắp N ếp wxwx nt

(*) : Dòng bắp tẻ QPM có nguồn gốc từ CIMMYT, các dòng bắp còn lại (bắp tẻ, bắp đường và bắp nếp) có nguồn gốc từ công ty giống cây trồng miền Nam

Mồi sử dụng cho nghiên c ứu

Trong nghiên cứu này, chúng tôi sử dụng hai cặp mồi SSR phi057 và phi061 cho xác định kiểu gene QPM và waxy tương ứng Trình tự mồi được tham khảo từ báo cáo của Senior và cộng sự (1998) [35 ] và được tổng hợp bởi công ty IDT, Hoa kỳ

Bảng 4: Trình tự mồi sử dụng cho xác định gene lặn waxy và opaque-2

Gene Marker Trình tự Tham khảo

Các trình tự mồi này cũng đã được kiểm tra các thông số Tm, cấu trúc thứ cấp, độ đặc hiệu trên lý thuyết… Kết quả (bảng 4) cho thấy, tất cả các thông số điều nằm trong tiêu chuẩn cho phép, đảm bảo khả năng nhân bản tốt nhất của mồi Dưới đây là bảng các thông số đặc tính của mồi:

Bảng 5: Thông số đặc tính của mồi

(*): Các cấu trúc thứ cấp chỉ liệt kê các cấu trúc có ∆G nhỏ nhất

Hóa chất để tách chiết DNA

Dung dịch Nitơ lỏng (N 2 ), dung dịch CTAB 2X (CylTrimethylAmmornium Bromide), dung dịch Chloroform/ Isoamyl Ahcohol (24/1), Isopropanol tuyệt đối (bảo quản ở nhiệt độ lạnh), Ethanol 70%, dung dịch TE 1X (Tris 0.1M,EDTA 0.001M), dung dịch Amoniacetate 3M, pH= 5.2.

Hóa chất thực hiện phản ứng PCR

Dung dịch đệm Buffer 10X, dung dịch Deoxynecleoside triphosphate, Enzyme Taq DNA polymerase, dung dịch MgCl2.

Hóa chất dùng cho điện di agarose và polyacrylamide

Dung dịch TAE 50X (242g Tris-base, 57.1 mL glacial acetic acid, 100mL EDTA 0.5M, pH 8.0), dung dịch nạp mẫu (Maximo flourescent loading dye 3X, Genon, Đức) đã bao gồm chất nhuộm huỳnh quang (khô ng sử dụng Ethidium bromide), dung dịch thang chuẩn Ladder

Dung dịch TBE 1X, Acylamide 40%, dung dịch SDS 10%, dung dịch TEMED, dung dịch APS 10%.

Hóa chất để nhuộm bạc nitrate trên gel polyacrylamide

Dung dịch Acid acetic 10%, dung dịch Sodium Carbonate 3%, dung dịch Formandehyte 37%, dung dịch Bạc Nitrate 0.1%, dung dịch Sodium Thiosulfate 10%, dung dịch Natri hydroxyte 3%, dung dịch Ethanol 10%, Axit acetic 0.5%.

Thiết bị và dụng c ụ

Một số thiết bị và dụng cụ chính:

Máy lắc, tủ hút, Becher 500,1000 mL, cân phân tích, máy đo mật độ quang hấp phụ OD, bồn ủ nhiệt, máy PCR, tủ âm sâu -35 0 C, máy ly tâm, hệ thống điện di và chụp hình gel UV, máy vortex, cối ,chày loại nhỏ được hấp khử trùng, pipetman các loại, micropipet, đầu típ các loại, cuvette (d = 1 cm, V = 4 mL), effpendorf 1.5 mL, ống falcol 50 mL,

Phương pháp nguyên c ứu

Sơ đồ : Quy trình thực hiện tổng quát phát hiện đặc tính waxy dựa trên kiểu gen

Sơ đồ trình bày quy trình thực hiê ̣n tổng quát phát hiê ̣n đă ̣c tính waxy dựa trên marker DNA

Quy trình tổng quát phát hiện QPM bằng marker DNA cũng đươ ̣c thực hiê ̣n tương tự như phát hiện đặc tính waxy

2.1 Phương pháp tách chiế t DNA genome c ủ a các gi ố ng b ắ p:

Mối quan tâm hàng đầu khi tiến hành tách chiết các axit nucleic là đảm bảo thu được những phân tử này ở trạng thái nguyên vẹn, không bị phá hủy bởi các tác nhân vật lý hay hóa học Do đó, quá trình tách chiết DNA cần diễn ra ở nhiệt độ thấp nhằm ức chế các enzyme nội bào vốn có thể phân giải axit nucleic thành những mảnh nhỏ hơn, ảnh hưởng đến chất lượng và độ toàn vẹn của axit nucleic thu được.

2.1.2 Quá trình tách chiết DNA trải qua 3 giai đoạn:

Giai đoạn 1: Phá vỡ tế bào bằng phương pháp vật lí hay hóa học Tuỳ từng loại tế bào, có cấu tạo thành và màng tế bào khác nhau, chọn phương pháp áp dụng thích hợp, riêng lẽ hay phối hợp Tế bào thực vật thường được nghiền trong nitơ lỏng để phá vỡ vách tế bào hoặc dùng các chất tẩy để phá màng tế bào

Giai đoạn 2: Loại bỏ các thành phần không mong muốn trong mẫu (protein, lipit, polysaccharide…) chủ yếu là protein Loại bỏ các tạp chất trong mẫu bằng một số dung dịch : phenol, chloroform, phenol/chloroform (1:1) hoặc chloroform-isoamyl alcolhol (24:1), Các dung dịch này có tác dụng làm biến tính protein, đồng thời không hoà tan nucleic acid vì thế sau khi ly tâm protein sẽ tủa thành một lớp nằm giữa pha nước có chứa DNA và pha phenol/chloroform Pha nước có chứa nucleic acid sẽ được thu nhận lại

Giai đoạn 3: Tủa DNA Mục đích của việc tủa là nhằm thu nhận DNA dưới dạng cô đặc, một mặt nhằm bảo vệ chúng khỏi sự phân huỷ của các enzyme, mặt khác để có thể hoà tan chúng lại trong dung dịch theo nồng độ mong muốn Có nhiều cách để tủa DNA: ethanol, isopropanol, butanol, Trong đó hai cách tủa thông dụng là: tủa trong ethanol và tủa trong isopropanol

Trong cả hai phương pháp, DNA sẽ được thu nhận lại bằng ly tâm Sau đó, cặn tủa sẽ được rửa trong ethanol 70% để loại bỏ các muối hoặc các dấu vết của isopropanol còn dính lại trên mẫu DNA sau khi tách chiết sẽ được bảo quản trong dung dịch khử ion hoặc dung dịch đệm TE1X

- Cân 0,5 g mẫu lá tươi bắp 2 tuần tuổi, đặt mẫu trong cối sứ đã hấp khử trùng

- Nghiền kỹ mẫu trong nitơ lỏng (tránh để mẫu ướt)

- Nhanh chúng chuyển mẫu đó nghiền vào tube 1,5 mL, thờm 800 àL thể tớch dung dịch CTAB

- Vortex ở 2500 vòng/phút trong 1 phút cho đều

- Ly tõm 13000 vũng/phỳt, trong 2 - 5 phỳt Thu nhận 700 àL phần dịch nổi chuyển sang eppendorf khác

- Thờm vào eppendorf 700 àL hỗn hợp chloroform - IAA (24:1), trộn đều bằng cỏch đảo ngược ống 5 - 10 lần

- Ly tâm ở 13000 vòng/phút trong 10 phút

- Sau khi ly tõm, thu nhận 600 àL phần dịch nổi phớa trờn (phần chứa DNA) chuyển sang eppendorf mới

- Thờm 600 àL của isopropanol tuyệt đối lạnh và 60 àL ammonium acetate 3M vào mỗi eppendorf chứa dịch nổi ở trên Trộn đều bằng cách đảo ngược ống nhiều lần

- Ủ lạnh mẫu ở 4 0 C trong 3h, tạo điều kiện thích hợp cho việc tủa DNA

- Sau thời gian tủa lạnh, tiếp tục ly tâm ở 13000 vòng/phút trong 10 phút

- Từ từ loại bỏ dịch nổi, thu nhận tủa DNA ở đáy ống

- Rửa DNA bằng cỏch cho vào mỗi ống 900 àL Ethanol 70%, ly tõm 13000 vũng/phỳt trong 5 phút

- Thu tủa DNA và sấy khô ở 60 0 C trong 30 phút để loại hết ethanol

- Bảo quản DNA trong dung dịch TE 1X (thể tớch 100 àL) ở -20 0 C

2.2 Quy trình ph ả n ứ ng PCR-SSR:

Trong nghiên cứu này, hai cặp mồi phi061 và phi057 được sử dụng để khuếch đại hai vùng SSR liên kết với gen waxy và gen opaque-2 Cặp mồi phi057 được thiết kế để khuếch đại vùng SSR liên kết với gen opaque-2, trong khi đó cặp mồi phi061 khuếch đại vùng SSR liên kết với gen waxy Những mồi này cho phép xác định sự đa dạng di truyền của các giống lúa, hỗ trợ trong công tác chọn giống và bảo tồn nguồn gen lúa.

31 đại đoạn DNA có kích thước từ 159 đến 165 bp Trong đó, bắp QPM cho sản phẩm có kích thước 165 bp Các giống bắp non-QPM có kích thước nhỏ hơn Mồi phi061cho sản phẩm PCR có kích thước từ 80 đến 88 bp Trong đó bắp waxy cho sản phẩm có kích thước trong khoảng 80 bp, các giống bắp non-waxy có kích thước lớn hơn [35]

Bảng 6: Thành phần phản ứng PCR

S Thành phần Nồng độ/phản ứng Thể tích

1 Buffer PCR 10X 1X (chứa sẵn 2.5 mM

3 dNTP (10 mM each) 200 àM 0.5 àL

2.3 Phương pháp tối ưu quy trình PCR -SSR:

2.3.1 Thí nghiệm 1: Tối ưu nhiệt độ bắt cặp của mồi phi057 và phi061:

Trong thí nghiệm này, chúng tôi đã tiến hành 12 phản ứng PCR riêng biệt cho mỗi cặp mồi phi057 và phi061 Mỗi phản ứng được thực hiện ở một nhiệt độ khác nhau trong khoảng từ 55 đến 65 0 C Các thành phần của phản ứng được mô tả chi tiết ở trên.

Bảng 7: Chu trình nhiệt của phản ứng PCR

Giai đoạn Nhiệ t độ ( 0 C) Thời gian Chu kỳ

Bi ến tính ban đầu mạch đôi DNA 95 5 phút 1

Bi ế n tính mạch đôi DNA 95 30 giây

Mồi bắt cặp với mạch đơn DNA Khảo sát 45 giây 40

Kéo dài mạch DNA lần cuối 72 5 phút 1

Bảng 8: Thành phần của phản ứng PCR để tối ưu nhiệt độ bắt cặp của mồi phi057 và phi061

STT Thành phần Nồng độ/phản ứng Thể tớch (àL)

1 Buffer PCR 10X 1X (chứa sẵn MgCl 2 2.5 mM ) 2.5

2.3.2 Thí nghiệm 2: Tối ưu nồng độ enzyme Taq-polymerase:

Enzyme Taq polymerase giúp tổng hợp nên mạch DNA mới, là một trong những yếu tố quan trọng, có thể nói là có vai trò quyết định trong sự thành công của phản ứng PCR-SSR Trong thí nghiệm này, chúng tôi khảo sát các nồng độ enzyme khác nhau để xác định nồng độ thích hợp cho hiệu quả cao và tiết kiệm Điều kiện nhiệt độ cho thí nghiệm là nhiệt độ tối ưu khảo sát ở trên

Bảng 9: Thành phần hóa chất khảo sát nồng độ Taq polymerase

STT Thành phần Nồng độ/phản ứng Th ể tớch (àL)

1 Buffer PCR 10X 1X (chứa sẵn MgCl 2 2.5 mM ) 2.5

2.3.3 Thí nghiệm 3: Tối ưu nồng độ mồi

Mồi là thành phần quan trọng ảnh hưởng đến thành công của phản ứng PCR Trong đó, nồng độ mồi đóng vai trò thiết yếu để đảm bảo hiệu quả khuếch đại, tránh bắt cặp không mong muốn và tiết kiệm Nghiên cứu này đã đánh giá các nồng độ mồi từ 0,2 đến 0,6 µM (nồng độ cuối cùng trong phản ứng) để tìm ra nồng độ mồi tối ưu trong điều kiện phản ứng đã xác định trước.

Bảng 10: Thành phần phản ứng PCR tối ưu nồng độ mồi của phi057 và phi061

Thành phần Nồng độ Thể tớch (àL)

Buffer Mix 1X (chứa sẵn 2,5 mM MgCl 2 ) 2,5

MgCl 2 (25 mM) 2,5 mM 0 dNTPs (10 mM each) 200 àM 0,5

Chỳ thớch :X: nồng độ mồi cần khảo sỏt (X=0,2 àM; 0,3 àM; 0,4 àM; 0,5 àM; 0,6 àM)

2.4 Phương pháp điện di và đọ c k ế t qu ả s ả n ph ẩ m PCR-SSR:

Khi các phân tử tích điện được đặt trong một điện trường, chúng sẽ dịch chuyển hướng đến cực dương (+) hoặc cực âm (-) tùy theo điện tích của chúng Các nucleic acid tích điện âm khắp bề mặt phân tử vì có gốc phosphate (PO 4 3- ) trong cấu trúc nên chúng sẽ di chuyển về cực âm trong điện trường Các phân tử DNA trong gel agarose sẽ được quan sát dưới tia UV nhờ dung dịch Flourescent loading dye Điện di gel agarose:

Là phương pháp thông dụng, thích hợp dùng để tách rời các đoạn acid nucleic có kích thước từ 200 bp đến 50 kb Điện di gel polyacrylamide (P AGE - Polyacrylamide Gel Electrophoresis):

Là kỹ thuật điện di gel sử dụng polyacrylamide liên kết ngang với nhau để làm lưới phân tách Nó được dùng để tách DNA từ vài nucleotide đến vài nghìn cặp base hoặc protein theo kích thước và hình dạng của chúng Acrylamide là một monomer, khi có mặt các gốc tự do, được cung cấp bởi thành phần Ammonium Persulphate (APS)và ổn định bởi TEMED (N,N,N’,N; tetramethylethylencediamine) Phản ứng chuỗi được bắt đầu, trong đó các monomer acrylamide được polymer hóa (trùng hợp) thành một chuỗi dài Khi bisacrylamide (N,N’-methylencebisacrylamide) được bổ sung trong phản ứng trùng hợp thì các chuỗi sẽ liên kết chéo (cross-linking) để tạo thành dạng gel Độ xốp của gel được xác định bởi chiều dài của chuỗi và mức độ liên kết chéo Chiều dài của chuỗi polyacrylamide được xác định bằng nồng độ acrylamide trong phản ứng polymer hóa (giữa 3.5% và 20%) [10, 43] Đối với điện di gel polyacrylamide cho DNA thì kỹ thuật này có thể phân tách các đoạn phân tử DNA có kích thước dưới 500 bp [43]

2.4.2 Quy trình điện di: Điện di gel agarose:

- Đổ gel: tùy theo kích thước mà đổ gel với các nồng độ khác nhau Nồng độ gel được tính dựa trên số gam agarose trong 100 mL dung dịch TAE1X

- Sau khi gel đông hoàn toàn, chuyển gel vào bồn điện di và cho dung dịch TAE vào vừa ngập miếng gel

- Trộn 7 àL sản phẩm PCR/5àL DNA tỏch chiết với 2 àL Flourescent loading dye (có sẵn chất nhuộm huỳnh quang) và chuyển vào bên trong giếng

- Tiến hành điện di với hiệu điện thế 60V trong 1h

- Ngay sau khi điện di, cho bảng gel vào bàn soi UV để xem và ghi lại kết quả Điện di gel polyacrylamide:

Trong nghiên cứu này, chúng tôi sử dụng hệ thống điện di ngang polyacrylamide chuyên dụng cho IEF (Isoelectric Focusing) để điện di sản phẩm PCR của mồi phi057 và phi061 Quy trình điện di gồm các bước:

KẾT QU Ả VÀ THẢO LUẬN

Kết quả xây dự ng quy trình PCR-SSR

DNA bộ gene của 14 dòng bắp được tách chiết bằng phương pháp CTAB sử dụng lá non 2 tuần tuổi DNA sau khi tách chiết được điện di trên gel agarose 1% trong thời gian 1 giờ để kiểm tra hiệu quả tách chiết, độ đứt gãy Kết quả điện di DNA tách chiết được thể hiện ở hình dưới:

Hình 7: Kết quả điện di DNA tách chiết trên gel agarose 1%

Dựa vào kết quả (hình 7) điện di, chúng tôi nhận thấy ở tất cả các giếng đều có 1 băng sáng rõ (> 1000 bp) và một băng nằm sát miệng giếng Từ đó có thể kết luận, DNA tách chiết có chất lượng tốt, ít bị đứt gẫy, DNA thu được đồng đều giữa các mẫu DNA này có thể được sử dụng cho các thí nghiệm tiếp theo

1.2 K ế t qu ả đánh giá sơ bộ v ề m ồ i phi057 và phi061:

Mồi sau khi được tổng hợp cần được kiểm tra khả năng hoạt động trước khi sử dụng để thực hiện các thí nghiệm tiếp theo Để đánh giá khả năng hoạt động cũng như kích thước đoạn sản phẩm khuếch đại của mồi, chúng tôi tiến hành thực hiện phản ứng PCR trên DNA của một số dòng bắp như sau:

41 Kiểm tra mồi phi057: DNA bắp QPM (mẫu 3 và mẫu 4); bắp tẻ (mẫu 2); bắp đường (mẫu 5) và bắp nếp (mẫu 12, 13, 14) Trong đó, mẫu QPM được sử dụng như mẫu chứng QPM, mẫu bắp nếp được sử dụng như mẫu chứng non - QPM

Kiểm tra mồi phi061: DNA bắp tẻ (mẫu 2); bắp QPM (mẫu 3, 4); bắp đường (mẫu 5), bắp nếp (mẫu 13, 14) Trong đó các mẫu bắp nếp được dùng làm đối chứng waxy, các mẫu còn lại được dùng làm đối chứng non - waxy

Thành phần phản ứng như sau:

Bảng 13: Thành phần phản ứng PCR khảo sát khả năng hoạt động của mồi STT Thành phần Nồng độ/phản ứng Thể tớch (àl)

1 Buffer PCR 10X 1X (chứa sẵn MgCl2 2.5mM ) 2.5

Nhiệt độ bắt cặp sử dụng cho phản ứng là 57 0 C

42 Sau khi thực hiện phản ứng PCR và điện di trên gel polyacrylamide 7%, chúng tôi được kết quả như sau:

Hình 8: Kết quả điện di sản phẩm PCR kiểm tra khả năng hoạt động của mồi

Dựa vào kết quả trên (hình 8), chúng tôi nhận thấy: mồi phi057 khuếch đại cho ra sản phẩm tương đương khoảng 150 bp so với thang DNA 100 bp Kết quả này hoàn toàn tương thích với kết quả trên lý thuyết, cũng như kết quả tham khảo từ các nghiên cứu trước Dựa theo kích thước có thể chia các mẫu thành 2 nhóm, các mẫu bắp nếp

(non-QPM) có băng nằm dưới (tương đương khoảng 157 bp, theo lý thuyết), các nhóm bắp QPM có có băng kép nằm trên (tương đương kích thước khoảng 165 bp, theo lý thuyết) Ngoài ra ở nhóm bắp QPM còn có thêm băng phụ kép nằm ở vị trí khoảng 180 bp so với thang Riêng đối với 2 giống bắp tẻ (2) và bắp đường (5) có băng trùng với băng của bắp QPM

Như vậy, dựa vào kết quả trên, chúng tôi nhận thấy cặp mồi phi057 có khả năng khuếch đại đoạn sản phẩm PCR đúng với kích thước mục tiêu [37] và có thể được sử dụng trong các khảo sát tiếp theo

43 Tương tự đối với mồi phi061, chúng tôi có kết quả như sau:

Hình 9: Kết quả điện di sản phẩm PCR kiểm tra khả năng hoạt động mồi

(primer) phi061 trên gel polyacrylamide 7%

Với kết quả trên (hình 9), chúng tôi nhận thấy cặp mồi phi061 có khả năng khuếch đại đoạn sản phẩm PCR có kích thước tương đương khoảng 80 - 90 bp so với thang DNA 100 bp Kết quả trên cũng có thể chia các mẫu thành 2 nhóm: nhóm bắp nếp (waxy) gồm các mẫu có băng dưới (khoảng 80 bp theo lý thuyết) và nhóm bắp non-waxy gồm các mẫu có băng trên (kích thước trên 80 bp theo lý thuyết) Như vậy, cặp mồi phi061 cũng có khả năng khuếch đại đoạn sản phẩm PCR đúng với kích thước mục tiêu [37] và có thể được sử dụng cho các khảo sát tiếp theo

1.3 K ế t qu ả t ối ưu phả n ứ ng PCR-SSR:

Tất cả các quy trình tối ưu bên dưới đều sử dụng DNA tách chiết từ giống bắp QPM số 3 Mặc dù kết quả cũng được phân tích trên gel polyacrylamide 6% nhưng do yêu cầu của các thí nghiệm này chỉ cần quan sát sự hiện diện, độ đậm nhạt của các

44 băng để kiểm tra các thông số mà không cần phân tách các băng nên chúng tôi chỉ thể hiện kết quả trên gel agarose 2% với kết quả sáng, rõ và đẹp

1.3.1 Thi ngiệm 1: Tối ưu nhiệt độ bắt cắp mồi phi057 và phi061:

Sau khi tiến hành chạy PCR khảo sát nhiệt độ bắt cặp như trình bày ở trên Sản phẩm PCR được điện di trên gel agarose 2%, chúng tôi được kết quả như bên dưới:

Chú thích: Từ T1 đến T12 tương ứng với các nhiệt độ: 55 0 C, 55.2 0 C, 55.8 0 C, 56.7 0 C, 57.1 0 C, 59.1 0 C, 60.1 0 C, 61.7 0 C, 62.9 0 C, 63.9 0 C, 64.6 0 C, 64.9 0 C

Trong kết quả điện di (hình 10a và 10b), đối với cả mồi phi061 và phi057, chúng tôi nhận thấy, ở tất cả nhiệt độ đều cho duy nhất một băng với độ sáng gần như tương đương nhau Trong đó, ở nhiệt độ khoảng 57 o C có vẻ cho băng sáng nhất ở cả hai mồi Chính vì vậy, chúng tôi quyết định chọn nhiệt độ 57 o C làm nhiệt độ tối ưu cho cả hai mồi, nhiệt độ này cũng gần với Tm của cả 2 cặp mồi Vì thế, việc chọn nhiệt độ bắt cặp của hai mồi còn thuận tiện cho việc thực hiện phản ứng PCR kết hợp giữa hai mồi, thuận tiện cho quá trình thiết kế thí nghiệm

Hình 10a: Kết quả tối ưu nhiệt độ bắt cặp của mồi (primer) phi057 trên gel agarose 2%

Hình 10b: Kết quả tối ưu nhiệt độ bắt cặp của mồi (primer) phi061 trên gel agarose 2%

1.3.2 Thí nghiệm 2: Tối ưu nồng độ enzyme cho phản ứng PCR-SSR với

Để xác định nồng độ tối ưu của enzyme Taq trong phản ứng PCR, 3 nồng độ enzyme (0,5U, 0,75U và 1U) được sử dụng với mỗi loại mồi phi057 và phi061 Các sản phẩm PCR thu được sau phản ứng được điện di trên gel agarose 2% và phân tích.

Kết quả trên (hình 11a và 11b) cho thấy, trên cả 2 mồi, ở tất cả các nồng độ enzyme đều cho 1 băng DNA với độ sáng gần như tương đương nhau Chính vì vậy, để đảm bảo tính hiệu quả, tiết kiệm, chúng tôi quyết định chọn nồng độ enzyme tối ưu cho cả 2 mồi là 0.5U/phản ứng

Hình 11b: Kết quả điện di sản phẩm

PCR- mồi(primer) phi061để tối ưu nồng độ enzyme Taq polymerase trên gel agarose 2%

Hình 11a: Kết quả điện di sản phẩm

PCR- mồi (primer) phi057 để tối ưu nồng độ enzyme Taq polymerase trên gel agarose 2%

1.3.3 Thí nghiệm 3: Tối ưu nồng độ mồi phi057 và phi061:

Kết quả sử dụng quy trình xác định gen opaque-2 đánh giá 14 giống bắp

Chú thích:Bắp nếp: mẫu 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14; Bắp tẻ: mẫu 1, 2; Bắp ngọt

(đường): mẫu 5,6; Bắp QPM:mẫu 3, 4

Hình 15: Kết quả điện di sản phẩm PCR 14 giống bắp của mồi phi057 trên gel agarose 3%

Kết quả trên ( hình 15) cho thấy:

Mồi phi057: cho hình ảnh sáng và rõ nhưng không phân biệt được vị trí khuếch đại đặc hiệu giữa bắp QPM (165 bp) với bắp non-QPM (159 bp) Do kích thước các sản phẩm khuếch đại chỉ khác nhau vài cặp base nên trên gel agarose không thể phân tách được các đoạn DNA đó Vì thế, chúng tôi thực hiện điện di sản phẩm PCR trên gel polyacylamide 7% với mồi phi057

50 Sau khi tiến hành PCR mồi phi057 trên 14 giống bắp chúng tôi được kết quả như bên dưới:

Chú thích:Bắp nếp: mẫu 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14; Bắp tẻ: mẫu 1, 2; Bắp ngọt

(đường): mẫu 5,6 ; Bắp QPM:mẫu 3, 4

Hình 16: Kết quả khảo sát gene opaque-2 trên 14 giống bắp trên gel polyacrylamide 7%

Kết quả trên (hinh 16) cho thấy, ngoài 2 đối chứng dương là bắp QPM được cung cấp bởi CIMMYT có sự hiện diện của băng QPM (băng kép ở phía trên, tương đương với kích thước khoảng 165 bp) còn có 2 giống bắp đường và một giống bắp tẻ số 1 cũng có sự hiện diện của băng này Về kích thước của băng mục tiêu chúng tôi đã thực hiện và thảo luận ở kết quả khảo sát sơ bộ của mồi phi057 (hình 8) Như vậy, với kết quả trên (hình 16), cho thấy 2 giống bắp đường và giống bắp tẻ số 1 có sự hiện diện của gene opaque-2 Do không có điều kiện nên chúng tôi chưa tiến hành đo hàm lượng lysine và tryptophan có trong các giống bắp này để so sánh Ngoài ra, còn lại tất cả các giống bắp nếp đều chỉ có băng dưới với kích thước khoảng 159 bp theo lý thuyết Điều này cho thấy, tất cả các giống bắp nếp đều không có gene opaque-2, tức kiểu hình non-QPM

Kết quả sử dụng quy trình xác định gen waxy đánh giá 14 giống bắp

Tương tự trên, chúng tôi cũng sử dụng quy trình xác định gene lặn waxy và điện di sản phẩm PCR trên gel agarose (3%) và gel polyacrlamide (7%) để đánh giá trên 14 giống bắp Kết quả như sau:

Hình 17: Kết quả điện di sản phẩm PCR 14 giống bắp của mồi phi061 trên gel agarose 3%

Chú thích: Bắp nếp: mẫu 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14; Bắp tẻ: mẫu 1, 2; Bắp ngọt (đường): mẫu 5,6; Bắp QPM: mẫu 3, 4

Kết quả trên (hình 17) cho thấy:

Trên gel agarose: mồi phi061 cũng cho hình ảnh rõ nét và tất cả các đoạn DNA khuếch đại đều có kích thước dưới 100 bp nhưng không thể quan sát được sự khác biệt kích thước của các băng giữa các mẫu Vì vậy, chúng tôi tiến hành điện di sản phẩm PCR của mồi phi061 trên gel polyacrylamide

Chú thích: Bắp nếp: mẫu 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14; Bắp tẻ: mẫu 1, 2; Bắp ngọt (đường): mẫu 5,6; Bắp QPM: mẫu 3, 4

Hình 18: Kết quả khảo sát gene waxy trên 14 giống bắp trên gel polyacrylamide

Chúng tôi nhận thấy kết quả PCR marker phi061 (hình 18) trên 13 giống hoàn toàn tương thích với những thông tin về đặc điểm kiểu hình waxy/non-waxy của các giống mà chúng tôi có và kết quả này cũng hoàn toàn tương thích với kết quả đánh giá dựa trên việc xác định % amylose của mẫu (kết quả không thể hiện ở đây) Cụ thể đối với những giống có kiểu hình bắp nếp (6 giống từ 8 đến 14, giống 13 không xuất hiện băng do mẫu bị trào ra ngoài) có hàm lượng amylose dao động từ 0 đến 4% (theo khảo sát trong nghiên cứu này), khi PCR với mồi phi061 cho một băng DNA bên dưới có kích thước khoảng 80 bp Về kích thước của băng mục tiêu (80 bp), chúng tôi đã thực hiện và thảo luận ở kết quả khảo sát sơ bộ của mồi phi061 (hình 9) Các giống bắp đường, bắp tẻ thường và bắp tẻ QPM đều chỉ có băng trên với kích thước lớn khoảng

53 Với kết quả trên có thể thấy, gel agarose 3% (hình 17 ) cho kết quả sáng, rõ nhưng không có khả năng phân tách các băng đa hình trong nghiên cứu này Trong khi đó, kết quả điện di trên gel polyacrylamide 7% (hình 18), các băng phân tách rõ, có thể phân biệt được bắp tẻ và bắp nếp

Như vậy, chúng tôi có thể kết luận gel agarose không thích hợp để sử dụng trong nghiên cứu này