Trên thực tế, hệ vi sinh vật tạp nhiễm trong thức ăn chăn nuôi, đặc biệt là nấm mốc, men và các vi khuẩn sinh độc tố gây bệnh như E.coli, Salmonella đã gây không ít khó khăn và thiệt hại
PHUẽ LUẽC
PHỤ LỤC 1: QUI TRÌNH XÁC ĐỊNH CÁC LOẠI VI SINH VẬT
7.1- PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH TỔNG SỐ NẤM MỐC, MEN
(Tiêu chuẩn trích dẫn và tham khảo: TCVN 5750-1993)
Nấm men và nấm mốc là các vi sinh vật đơn bào hoặc đa bào, hình thành các khuẩn lạc trong môi trường lựa chọn ở 25 ±1 0 C theo các điều kiện xác định trong tiêu chuẩn này
Cấy một lượng mẫu thử ở độ pha loãng phù hợp vào môi trường thạch YDC, nuôi trong điều kiện hiếu khí ở 25 ± 1 0 C trong 3, 4 và 5 ngày Đếm số khuẩn lạc nấm men, nấm mốc và biểu thị kết quả bằng số khuẩn lạc trong 1g mẫu
Lấy 2 đĩa petri vô trùng, dùng pipet vô trùng cho vào mỗi đĩa 1ml dạng huyền phù ban đầu của mẫu ( có độ pha loãng d= 10 –1 ) Lấy 2 đĩa petri vô trùng khác, dùng pipet lấy dung dịch mẫu ở độ pha loãng d = 10 –2 tiến hành như trên với các độ pha loãng cao hơn( phụ thuộc vào mức độ nhiễm nấm mốc, nấm men dự kiến của mẫu để sao cho mỗi đĩa chỉ mọc dưới 150 khuẩn lạc), cần sử dụng pipet riêng cho mỗi độ pha loãng Đổ khoảng 15ml môi trường thạch YDC ơ 45 ±1 0 C vào mỗi đĩa petri Thời gian từ khi cho dung dịch mẫu vào đĩa đến khi đổ môi trường không được quá 15 phút
Trộn cẩn thận dịch cấy và môi trường, để môi trường đông lại Đổ một đĩa để kiểm tra độ vô trùng của môi trường cũng bằng 15ml môi trường thạch YDC với thao tác tương tự như trên nhưng không có dịch cấy
Lật úp các đĩa đã chuẩn bị đặt vào tủ ấm đã duy trì ở 25 ± 1 0 C trong 3, 4 và 5 ngày
• Đọc kết quả Đếm khuẩn lạc nấm men, nấm mốc sau 3, 4 và 5 ngày nuôi cấy Chỉ giữ lại để đếm các đĩa mọc ít hơn 150 khuẩn lạc Đếm ở hai độ pha loãng liên tiếp, mỗi độ pha loãng đếm 2 đĩa Nếu sau 5 ngày, các khuẩn lạc phát triển mạnh bao trùm cả mặt đĩa gây khó đếm hoặc khó phân biệt thì có thể lấy các số đếm của ngày thứ 3 hoặc ngày thứ 4 để tính kết quả
Tổng số nấm men, nấm mốc trong 1g mẫu(X) được tíng theo công thức sau: d n n
C: tổng số khuẩn lạc nấm men, nấm mốc đếm được trên 4 đĩa của hai độ pha loãng liên tiếp n1: số đĩa ở độ pha loãng đầu (n2 = 2) n2: số đĩa ở độ pha loãng kế tiếp (n2 = 2) d: hệ số pha loãng ứng với độ pha loãng đầu
Làm tròn kết quả tới hai số có nghĩa ( chẳng hạn 28.640 làm tròn là 29.000) và biểu thị theo biểu thức sau: a × 10 n
Trong đó: a: số thập phân tương ứng có giá trị từ 1,0 đến 9,9 n: số mũ phù hợp của 10
7.2- PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH E.COLI
(Tiêu chuẩn trích dẫn và tham khảo: ISO 4831 -1993)
E.coli là các vi khuẩn Coliforms có khả năng sinh trưởng hiếu khí ở to 37 0 C ± 0.5 0 C Trong môi trường nuôi cấy có lactose thể lỏng, kèm theo việc tạo thành acid và sinh khí trong vòng 48h
Số lượng Ecoli trong mẫu được xác định bằng phương pháp MPN
3- Môi trường nuôi cấy: BGBL, EC EMB, BHI hay NA
4- Môi trường sinh hoá: NB, MR-VP medium, thạch nghiêng Simon Citrat 5- Tiến hành xác định
Cân 25g mẫu, thêm 225ml nước muối 0,85%, đồng nhất mẫu trong 1 phút
- Lấy 1ml dung dịch pha loãng ban đầu cho vào 9ml nước muối 0,85%, ta được dùng dịch pha loãng 10 -2 , tiếp tục pha loãng để được dung dịch pha loãng 10 -3 10 -4 …
- Thức ăn chăn nuôi dạng viên, thức ăn chăn nuôi đã qua chiếu xạ: pha loãng đến nồng độ10 -1 , 10 -2 , 10 -3
- Thức ăn chăn nuôi dạng bột không qua chiếu xạ: pha loãng đến nồng độ 10 -2 , 10 -3 ,10 -4
- Nguyên liệu trong nước( bắp, tấm, cám): pha loãng đến nồng độ 10 -2 , 10 -3 , 10 -4
- Nguyên liệu nhập: pha loãng nồng độ 10 -1 , 10 -2 , 10 -3
- Cấy 1ml mẫu vào 10ml môi trường BGBL, mỗi nồng cấy 3 ống, ủ ở 37 0 C/24-48h
- Ecoli tăng sinh trên môi trường chọn lọc EC: chọn ống những BGBL dương tính, dùng que cấy lấy 1 vòng vi khuẩn cấy sang 10ml môi trường EC, ủ ở 44,5 0 C/24h
- Cấy phân lập trên môi trường EMB: chọn những ống EC dương tính, cấp phân lập trên môi trường EMB, ủ ở 37 0 C/24h
- Chọn khuẩn lạc điển hình có màu tím ánh kim trên môi trường EMB cấy sang môi trường BHI hoặc NA, ủ ở 37 0 C/18-24h
- Thử phản ứng sinh hoá IMViC:
+ Indol: Lấy khuẩn lạc nghi ngờ từ môi trường BHI hoặc NA cấy sang môi trường canh trypton, ủ ở 37 0 C/18-24h Cho vào môi trường 0,5ml thuốc thử kovacs, lắc đều, nếu xuất hiện một lớp màu đỏ trên bề mặt môi trường là dương tính(+), nếu có lớp màu vàng trên bề mặt là âm tính(-)
+ Methy red, VP: Lấy khuẩn lạc nghi ngờ từ môi trường BHI hoặc NA cấy sang 10ml môi trường canh MRVP, ủ ở 37 0 C/18-24h
MR: Lấy 5ml môi trường đã nuôi cấy cho vào ống nghiệm vô trùng , cho vào vài giọi thuốc thử methy red Nếu môi trường có màu đỏ là dương tính(+), nếu môi trường có màu vàng là âm tính(-)
VP: Cho vào ống canh khuẩn còn lại 0,2ml dung dịch KOH 40% và 0,6ml α- naphthol, lắc, để yên trong 1 giờ Nếu xuất hiện một lớp màu đỏ trên bề mặt môi trường là dương tính(+), nếu bề mặt môi trường không đổi màu là âm tính(-) + Citrat: Lấy khuẩn lạc nghi ngờ từ môi trường BHI hoặc NA cấy sang 10ml môi trường thạch nghiêng Simon Citrat, ủ ở 37 0 C/18-24h
Mật độ(CUF/g)= chỉ số MPNì độù pha loóng thứ nhất được cấy
7.3- PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH SALMONELLA
(Tiêu chuẩn trích dẫn và tham khảo: TCVN 4829 – 2001)
Salmonella là vi khuẩn hình gậy, hai đầu hơi tròn, gram(-), không tạo bào tử, di động Sinh trưởng trong điều kiện hiếu khí hoặc yếm khí tuỳ nghi Vi khuẩn có những đặc tính sinh hoá và huyết thanh được qui định trong qui trình này
Căn cứ vào tính chất sinh hoá và kháng nguyên của vi khuẩn để xác định
3- Môi trường nuôi cấy: nước pepton đệm RV(Rappaport- Vassliadis), Tetrathionat hay Selenit, XLD, SS, NA hoặc TSA
4- Môi trường sinh hoá: thạch nghiêng KIA, thạch sâu Kysine Iron agar, canh
Urease, canh NB, MR-VP medium m, kháng huyết thanh đa giá
Cân 25g mẫu trong túi PE vô trùng, bổ sung 225ml dung dịch pepton đệm và đồng nhất mẫu trong 1 phút Ủ ở 37 0 C/18-24h
Hút 0,1ml mẫu đã tăng sinh sang 10ml môi trường Rappapport-Vassliadis Soya Pepton, ủ ở 42 0 C /18-24h và môi trường Selenit Cystin Broth, ủ ở 37 0 C/18-24h
Dùng que cấy vòng, lấy 1 vòng canh vi khuẩn từ môi trường tăng sinh chọn lọc(RV) cấy phân lập trên môi trường XLD và từ môi trường Tetrathionat cấy phân lập lên môi trường SS Agar, ủ ở 37 0 C/18-24h sau khi ủ, chọn các khuẩn lạc điển chiếm gần hết khuẩn lạc ) để thực hiện bước khẳng định sinh hoá và thử mghiệm kháng nguyên
Chọn 5 khuẩn lạc nghi ngờ từ môi trường phân lập cấy sang môi trường Na hoặc TSA Ủ ở 37 0 C/18-24h, các khuẩn lạc xuất hiện trên môi trường này được sử dụng cho các thử nghiệm sinh hoá
+ Thử nghiệm Lyssyn decaboxylase và di động: Lấy 1 vòng vi khuẩn từ môi trường NA hoặc TSA cấy trên môi trường thạch sâu Lysine Iron Agar, ủ ở
- Lyssin decaboxylase: Màu môi trường có màu tím như ban đầu là dương tính(+), môi trường có màu vàng là âm tính(-)
- Di động: Vi khuẩn mọc lan ra khỏi đường cấy là dương tính(+), vi khuẩn không mọc lan ra khỏi đường cấy là âm tính(-)
+ Thử nghiệm Urease: Lấy 1 vòng vi khuẩn từ môi trường NA hoặc TSA cấy lên 3ml môi trường Ure broth Sau khi nuôi cấy ở 37 0 C/18-24h, nếu môi trường chuyển sang màu hồng cánh sen là dương tính(+), môi trường giữ nguyên màu vàng cam là âm tính(-)
+ Thử nghiệm Indol: Lấy 1 vòng vi khuẩ từ môi trường NA hoặc TSA cấy lên 3ml môi trường canh Trypton Sau khi nuôi cấy ở 37 0 C/18-24h, cho vào môi trường 0,5ml thuốc thử Kovacs, lắc đều, nếu xuất hiện một lớp màu đỏ trên bề mặt môi trường là dương tính(+), nếu có lớp màu vàng trên bề mặt là âm tính(-)
