Phân tích Auramin O, Sundan I, Sudan II trong thực phẩm bằng phương pháp RP-HPLC sử dụng vật liệu nanosilica để xử lý mẫu

Phân tích Auramin O, Sundan I, Sudan II trong thực phẩm bằng phương pháp RP-HPLC sử dụng vật liệu nanosilica để xử lý mẫuPhân tích Auramin O, Sundan I, Sudan II trong thực phẩm bằng phương pháp RP-HPLC sử dụng vật liệu nanosilica để xử lý mẫuPhân tích Auramin O, Sundan I, Sudan II trong thực phẩm bằng phương pháp RP-HPLC sử dụng vật liệu nanosilica để xử lý mẫuPhân tích Auramin O, Sundan I, Sudan II trong thực phẩm bằng phương pháp RP-HPLC sử dụng vật liệu nanosilica để xử lý mẫuPhân tích Auramin O, Sundan I, Sudan II trong thực phẩm bằng phương pháp RP-HPLC sử dụng vật liệu nanosilica để xử lý mẫuPhân tích Auramin O, Sundan I, Sudan II trong thực phẩm bằng phương pháp RP-HPLC sử dụng vật liệu nanosilica để xử lý mẫuPhân tích Auramin O, Sundan I, Sudan II trong thực phẩm bằng phương pháp RP-HPLC sử dụng vật liệu nanosilica để xử lý mẫuPhân tích Auramin O, Sundan I, Sudan II trong thực phẩm bằng phương pháp RP-HPLC sử dụng vật liệu nanosilica để xử lý mẫuPhân tích Auramin O, Sundan I, Sudan II trong thực phẩm bằng phương pháp RP-HPLC sử dụng vật liệu nanosilica để xử lý mẫuPhân tích Auramin O, Sundan I, Sudan II trong thực phẩm bằng phương pháp RP-HPLC sử dụng vật liệu nanosilica để xử lý mẫuPhân tích Auramin O, Sundan I, Sudan II trong thực phẩm bằng phương pháp RP-HPLC sử dụng vật liệu nanosilica để xử lý mẫuPhân tích Auramin O, Sundan I, Sudan II trong thực phẩm bằng phương pháp RP-HPLC sử dụng vật liệu nanosilica để xử lý mẫuPhân tích Auramin O, Sundan I, Sudan II trong thực phẩm bằng phương pháp RP-HPLC sử dụng vật liệu nanosilica để xử lý mẫuPhân tích Auramin O, Sundan I, Sudan II trong thực phẩm bằng phương pháp RP-HPLC sử dụng vật liệu nanosilica để xử lý mẫuPhân tích Auramin O, Sundan I, Sudan II trong thực phẩm bằng phương pháp RP-HPLC sử dụng vật liệu nanosilica để xử lý mẫuPhân tích Auramin O, Sundan I, Sudan II trong thực phẩm bằng phương pháp RP-HPLC sử dụng vật liệu nanosilica để xử lý mẫuPhân tích Auramin O, Sundan I, Sudan II trong thực phẩm bằng phương pháp RP-HPLC sử dụng vật liệu nanosilica để xử lý mẫuPhân tích Auramin O, Sundan I, Sudan II trong thực phẩm bằng phương pháp RP-HPLC sử dụng vật liệu nanosilica để xử lý mẫuPhân tích Auramin O, Sundan I, Sudan II trong thực phẩm bằng phương pháp RP-HPLC sử dụng vật liệu nanosilica để xử lý mẫuPhân tích Auramin O, Sundan I, Sudan II trong thực phẩm bằng phương pháp RP-HPLC sử dụng vật liệu nanosilica để xử lý mẫuPhân tích Auramin O, Sundan I, Sudan II trong thực phẩm bằng phương pháp RP-HPLC sử dụng vật liệu nanosilica để xử lý mẫuPhân tích Auramin O, Sundan I, Sudan II trong thực phẩm bằng phương pháp RP-HPLC sử dụng vật liệu nanosilica để xử lý mẫuPhân tích Auramin O, Sundan I, Sudan II trong thực phẩm bằng phương pháp RP-HPLC sử dụng vật liệu nanosilica để xử lý mẫuPhân tích Auramin O, Sundan I, Sudan II trong thực phẩm bằng phương pháp RP-HPLC sử dụng vật liệu nanosilica để xử lý mẫu



PHẠM THỊ CHUYÊN

PHÂN TÍCH AURAMINE O, SUDAN I, SUDAN II TRONG THỰC PHẨM BẰNG PHƯƠNG PHÁP RP-HPLC SỬ DỤNG

VẬT LIỆU NANOSILICA ĐỂ XỬ LÝ MẪU

LUẬN ÁN TIẾN SĨ HÓA HỌC

Hà Nội - 2022

TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM HÀ NỘI

PHẠM THỊ CHUYÊN

PHÂN TÍCH AURAMINE O, SUDAN I, SUDAN II TRONG THỰC PHẨM BẰNG PHƯƠNG PHÁP RP-HPLC SỬ DỤNG VẬT LIỆU NANOSILICA ĐỂ XỬ LÝ MẪU

Chuyên ngành: Hóa học phân tích

Mã số: 9.44.01.18

LUẬN ÁN TIẾN SĨ HÓA HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: 1: PGS.TS Đặng Xuân Thư 2: TS Nguyễn Bích Ngân

Hà Nội - 2022

Tôi xin cam đoan luận án “Phân tích Auramin O, Sundan I, Sudan II

trong thực phẩm bằng phương pháp RP-HPLC sử dụng vật liệu nanosilica để

xử lý mẫu” là công trình nghiên cứu độc lập của riêng tôi, dưới sự hướng dẫn

khoa học của PGS.TS Đặng Xuân Thư và TS Nguyễn Bích Ngân Các số liệu

và kết quả trình bày trong luận án là trung thực và chưa từng được người khác công bố trong các công trình khác

Tác giả luận án

Phạm Thị Chuyên

Em xin chân thành cảm ơn các thầy, các cô Ban Giám hiệu, Phòng Sau đại học, Bộ môn Hóa phân tích, Bộ môn Hóa lí, Khoa Hóa học trường Đại học

Sư phạm Hà Nội, Ban Giám hiệu, phòng Hành chính – Tổng hợp trường Đại học Tây Bắc, các thầy cô, đồng nghiệp Bộ môn Hóa học; Khoa Khoa học Tự nhiên – Công nghệ, trường Đại học Tây Bắc đã tạo điều kiện giúp đỡ em về thời gian và bố trí, phân công, sắp xếp công việc trong quá trình thực hiện luận

án

Em xin trân trọng cảm ơn các thầy, cô Bộ môn Hóa phân tích, Khoa Hóa học, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, đặc biệt thầy PGS.TS Phạm Tiến Đức đã tạo điều kiện giúp đỡ em trong quá trình thực hiện luận án

Tôi xin biết ơn những tình cảm quý giá của người thân, bạn bè và đồng nghiệp đã luôn động viên, chia sẻ, ủng hộ để tôi hoàn thành luận án này

MỤC LỤC

MỞ ĐẦU 1

1 Tính cấp thiết và lí do của đề tài 1

2 Mục đích và nội dung chính của luận án 2

3 Đối tượng, phạm vi nghiên cứu và phương pháp nghiên cứu 3

4 Ý nghĩa khoa học, thực tiễn và đóng góp mới của luận án 4

5 Bố cục của luận án 5

CHƯƠNG 1 -TỔNG QUAN 6

1.1 Chất màu tổng hợp 6

1.2 Cơ chế liên kết của chất màu với vật liệu 9

1.3 Auramine O 11

1.3.1 Cấu tạo, tính chất 11

1.3.2 Đặc tính sinh học và độc tính 13

1.3.3 Tình hình nghiên cứu Auramine O trong thực phẩm 15

1.4 Các hợp chất Sudan 18

1.4.1 Cấu tạo, tính chất 18

1.4.2 Đặc tính sinh học, độc tính của các Sudan 20

1.4.3 Tình hình nghiên cứu các hợp chất Sudan 21

1.5 Một số vấn đề khi định lượng chất màu bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao 26

1.5.1 Hệ số đối xứng của peak sắc ký 26

1.5.2 Các vấn đề peak sắc ký 27

1.5.3 Khoảng tuyến tính, đường chuẩn và đánh giá đường chuẩn 29

1.5.4 Giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ) 33

1.5.5 Độ thu hồi mẫu 34

1.6 Xử lý mẫu thực phẩm 34

1.6.1 Khái quát, phân loại 34

1.6.2 Kỹ thuật chiết lỏng – lỏng ứng dụng xử lý mẫu 36

1.6.3 Xu hướng áp dụng kỹ thuật chuẩn bị mẫu xanh trong phân tích 37

1.7 Vật liệu nanosilica và ứng dụng trong hấp phụ chất màu 40

1.7.1 Các đặc trưng vật lý, hóa học của vật liệu hấp phụ 40

1.7.2 Tính toán thống kê trong xử lý mẫu và phân tích 41

1.7.3 Ứng dụng vật liệu nanosilica chế tạo từ vỏ trấu trong hấp phụ làm giàu mẫu phân tích 43

CHƯƠNG 2: THỰC NGHIỆM 46

2.1 Vật liệu, hóa chất, dụng cụ và thiết bị 46

2.1.1 Vật liệu, hóa chất 46

2.1.2 Dụng cụ, thiết bị 48

2.2 Nội dung nghiên cứu 49

2.2.1 Chuẩn bị mẫu giả 49

2.2.2 Nghiên cứu các điều kiện tối ưu phân tích chất màu bằng HPLC 52

2.2.3 Nghiên cứu các điều kiện chiết 55

2.2.4 Nghiên cứu các đặc tính của nanosilica từ vỏ trấu và điều kiện hấp phụ tối ưu 59

2.2.5 Xác định độ không đảm bảo đo của phương pháp 65

2.2.6 Lấy mẫu thực tế và xử lý mẫu 66

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 73

3-A – ĐỐI VỚI AURAMINE O 73

3.1 Điều kiện tối ưu phân tích Auramine O bằng HPLC 73

3.1.1 Bước sóng 73

3.1.2 Thành phần pha động 73

3.1.3 pH của dung dịch đệm photphat pha động 75

3.1.4 Tỉ lệ thành phần pha động 76

3.1.5 Tốc độ pha động 77

3.1.6 Khoảng phụ thuộc tuyến tính và xây dựng đường chuẩn 78

3.1.7 Khảo sát độ lặp lại 82

3.2 Điều kiện chiết Auramine O tối ưu từ mẫu thực phẩm 83

3.2.1 Hỗ trợ quá trình chiết 83

3.2.2 Dung môi chiết 83

3.2.3 Tỉ lệ mẫu và dung môi 86

3.2.4 Nhiệt độ chiết, thời gian chiết và số lần chiết 87

3.2.5 Độ thu hồi quá trình chiết 89

3.2.6 Ảnh hưởng của nền mẫu 90

3.3 Các điều kiện tối ưu hấp phụ AO trên nanosilica chế tạo từ vỏ trấu 92

3.3.1 Cường độ ion của dung dịch hấp phụ 92

3.3.2 pH của dung dịch hấp phụ 92

3.3.3 Thời gian cân bằng hấp phụ 93

3.3.4 Đường hấp phụ đẳng nhiệt 94

3.3.5 Điều kiện rửa giải AO tối ưu……….…95

3.4 Độ không đảm bảo đo của phương pháp phân tích AO 96

3.5 Kết quả phân tích AO trong mẫu thực 97

3.5.1 Các mẫu măng, miến, dưa chua 97

3.5.2 Các mẫu phấn hoa, cá khô, mì tôm 102

3-B – ĐỐI VỚI HỖN HỢP SUDAN I VÀ SUDAN II 107

3.6 Điều kiện tối ưu phân tích hỗn hợp Sudan bằng HPLC 107

3.6.1 Bước sóng 107

3.6.2 Thành phần pha động 107

3.6.3 Tỉ lệ thành phần pha động 109

3.6.4 Tốc độ pha động 109

3.6.5 Khoảng tuyến tính, đường chuẩn, LOD và LOQ 110

3.7 Điều kiện chiết hỗn hợp Sudan I và Sudan II tối ưu từ mẫu thực phẩm 113 3.7.1 Dung môi chiết 113

3.7.2 Nhiệt độ chiết, thời gian chiết và số lần chiết 114

3.7.3 Tỉ lệ mẫu và dung môi 115

3.8 Các điều kiện tối ưu hấp phụ hỗn hợp Sudan trên nanosilica 116

3.8.1 Ảnh hưởng của lực ion của dung dịch hấp phụ 116

3.8.2 Ảnh hưởng của pH 117

3.8.3 Thời gian cân bằng hấp phụ và ảnh hưởng của nồng độ đầu 119

3.8.4 Đường hấp phụ đẳng nhiệt 119

3.8.5 Điều kiện rửa giải hỗn hợp Sudan tối ưu……… 120

3.9 Độ không đảm bảo đo của phương pháp phân tích hỗn hợp Sudan 121

3.10 Kết quả phân tích hỗn hợp Sudan I và Sudan II trong mẫu thực phẩm123 KẾT LUẬN 129

DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ 131

TÀI LIỆU THAM KHẢO 132

PHỤ LỤC 142

Phụ lục 1: Phổ FT-IR của vật liệu RHNS 142

Phụ lục 2: Phổ EDX của vật liệu RHNS 142

Phụ lục 3: Đường đẳng nhiệt hấp phụ - giải hấp N2 143

Phụ lục 4: Đường phân bố kích thước mao quản 145

Phụ lục 5: Biểu đồ diện tích bề mặt BET 146

Phụ lục 6: Hình ảnh một số mẫu phân tích 147

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1.1: Một số chất màu phụ gia thực phẩm được phép sử dụng ở Việt Nam

……… 6

Bảng 1.2: Phân loại chất màu tổng hợp theo nhóm mang màu……….7

Bảng 1.3: Tóm tắt một số công trình nghiên cứu định lượng Auramine O 15

Bảng 1.4: Công thức, tên gọi và danh pháp các loại Sudan 18

Bảng 1.5: Tóm tắt kết quả một số công trình nghiên cứu định lượng Sudan trong thực phẩm 24

Bảng 1.6: Các giá trị RL. 42

Bảng 2.1: Thành phần các mẫu chuẩn bị cho phương pháp phân tích AO 50

Bảng 2.2: Thành phần các mẫu chuẩn bị cho phương pháp phân tích Sudan 51 Bảng 2.3 Các loại dung môi lựa chọn cho quá trình chiết AO 56

Bảng 2.4: Ký hiệu mẫu và thông tin lấy mẫu 67

Bảng 3.1: Sắc ký đồ AO khi thay đổi thành phần pha động 74

Bảng 3.2: Thông số peak AO ứng với tỉ lệ thành phần pha động khác nhau 76 Bảng 3.3: Thông số peak AO ứng với tốc độ pha động khác nhau 77

Bảng 3.4: Các điều kiện tối ưu phân tích AO bằng HPLC 78

Bảng 3.5: Số liệu đường chuẩn AO 79

Bảng 3.6: Các thông số đường chuẩn dạng Y=a.X+b 79

Bảng 3.7: Diện tích peak AO phụ thuộc hàm lượng 81

Bảng 3.8: Phương trình đường chuẩn và các giá trị MDL, MQL của AO 81

Bảng 3.9: Số liệu khảo sát độ lặp lại phép đo AO bằng HPLC… …………82

Bảng 3.10: Độ thu hồi mẫu trung bình (R %) khi khảo sát phương pháp chiết 83

Bảng 3.11: Hiệu suất chiết AO khi sử dụng các dung môi chiết khác nhau 84

Bảng 3.12: Hiệu suất chiết AO theo tỉ lệ mẫu và dung môi 86

Bảng 3.13: Hiệu suất chiết AO các mẫu MMT phụ thuộc nhiệt độ và thời gian.

87

Bảng 3.14: Độ thu hồi AO trên mẫu MAG và MIG 89

Bảng 3.15: Số liệu khảo sát ảnh hưởng nền mẫu đối với phân tích AO 90

Bảng 3.16: Dữ kiện tính toán độ không đảm bảo đo……… …96

Bảng 3.17: Kết quả phân tích mẫu MI1 theo phương pháp đường chuẩn 98

Bảng 3.18: Hàm lượng AO trong các mẫu măng, miến, dưa chua 101

Bảng 3.19: Kết quả phân tích mẫu PH3 theo phương pháp đường thêm chuẩn 105

Bảng 3.20: Kết quả phân tích hàm lượng AO trong các mẫu mì tôm, phấn hoa, cá khô 105

Bảng 3.21: Sắc ký đồ hỗn hợp Sudan với thành phần pha động khác nhau 108 Bảng 3.22: Các tham số của các peak Sudan I và Sudan II trong PĐ5-S 109

Bảng 3.23: Các điều kiện tối ưu phân tích hỗn hợp Sudan I và Sudan II bằng phương pháp HPLC 110

Bảng 3.24: Số liệu đường chuẩn và LOD, LOQ của hỗn hơp 2 Sudan chuẩn 111

Bảng 3.25: Số liệu đường chuẩn và MDL, MQL trên nền mẫu trắng 112

Bảng 3.26: Hiệu suất chiết hỗn hợp Sudan phụ thuộc dung môi 113

Bảng 3.27: Hiệu suất chiết các Sudan phụ thuộc nhiệt độ và thời gian chiết 114

Bảng 3.28: Hiệu suất chiết các Sudan theo tỉ lệ mẫu và dung môi 115

Bảng 3.29: Dữ kiện tính toán độ không đảm bảo đo 122

Bảng 3.30: Kết quả định lượng Sudan I và Sudan II trong mẫu thực phẩm 125 Bảng 3.31: Độ thu hồi các Sudan trên nền mẫu thực………125

Bảng 3.32: Hàm lượng Sudan I và Sudan II trong mẫu thực phẩm khô ban đầu 126

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1: Công thức cấu tạo của Auramine O 12

Hình 1.2: Bột Auramine O 12

Hình 1.3: Các tính hệ số đối xứng AF 27

Hình 1.4: Hiện tượng peak chẻ 27

Hình 1.5: Các hiện tượng kéo đuôi peak 28

Hình 1.6: Hiện tượng peak nở rộng 29

Hình 1.7: Thiết bị chiết gồm nhiều phễu 36

Hình 1.8: Một hệ thống chiết liên tục 37

Hình 1.9: Các trạng thái tồn tại của CO2 (Ben Finney và Mark Jacobs) 38

Hình 1.10: Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc o o P P f V(P P) P         43

Hình 1.11: Hiển vi điện tử quét của các hạt nanosilica tại các tỉ lệ phóng đại (A) 500nm và (B) 300nm……… ……44

Hình 2.1: Một số công đoạn tạo mẫu giả phân tích AO 50

Hình 2.2: Thế Zeta phụ thuộc pH của dung dịch hấp phụ 60

Hình 2.3: Quy trình xử lý mẫu măng, miến, dưa muối chua, thịt khô 71

Hình 2.4: Quy trình xử lý mẫu cá khô, bim bim, phấn hoa và mì tôm 72

Hình 3.1 Phổ hấp thụ của dung dịch AO chuẩn 1000 µg/L 73

Hình 3.2: Sắc ký đồ AO phụ thuộc pH pha động 76

Hình 3.3: Đường chuẩn AO(1) 80

Hình 3.4: Sắc ký đồ AO tại các giá trị nồng độ trong đường chuẩn 80

Hình 3.5: Đường chuẩn AO(2) 81

Hình 3.6: Đường chuẩn AO(3) 81

Hình 3.7: Sự thay đổi hiệu suất chiết AO trung bình theo dung môi chiết 84 Hình 3.8: Biểu đồ hiệu suất chiết trung bình của AO phụ thuộc số lần chiết 88

Hình 3.9: Ảnh hưởng nồng độ KCl đến sự hấp phụ AO 92

Hình 3.10: Ảnh hưởng pH đến sự hấp phụ AO 93

Hình 3.11: Khảo sát thời gian cân bằng hấp phụ theo nồng độ đầu AO 94

Hình 3.12: Mô hình Langmuir tuyến tính của sự hấp phụ AO 94

Hình 3.13: Hiệu suất thu hồi AO phụ thuộc thời gian rửa giải……….95

Hình 3.14: Hiệu suất thu hồi AO phụ thuộc số lần rửa giải……….96

Hình 3.15: Sắc đồ của MI1 khi pha loãng 3 lần dịch chiết gốc 98

Hình 3.16: Ảnh một số mẫu thực phẩm phân tích AO………98

Hình 3.17: Sắc ký đồ MA1 của dịch chiết gốc pha loãng 10 lần 99

Hình 3.18: Sắc ký đồ MA2 của dịch chiết gốc pha loãng 2 lần 100

Hình 3.19: Sắc ký đồ MA6 của dịch chiết gốc 100

Hình 3.20: Sắc ký đồ MA6 khi thêm chuẩn AO 90 µg/L 100

Hình 3.21: Dung dịch phân tích mẫu phấn hoa PH1 102

Hình 3.22: Sắc ký đồ mẫu phấn hoa PH1 khi phân tích dung dịch B 103

Hình 3.23: Sắc ký đồ phân tích PH1 gốc và PH1 khi thêm chuẩn AO 100 µg/L. 103

Hình 3.24: Sắc ký đồ mẫu PH3 gốc (có hấp phụ bằng RHNS) 104

Hình 3.25: Sắc đồ mẫu PH3 gốc và thêm chuẩn 104

Hình 3.26: Phổ hấp thụ của dung dịch các Sudan 107

Hình 3.27: Sắc ký đồ phân tích dung dịch hỗn hợp chuẩn các Sudan 110

Hình 3.28: Sắc ký đồ hỗn hợp Sudan I và Sudan II theo nồng độ 111

Hình 3.29: Sự phụ thuộc diện tích peak vào nồng độ Sudan 111

Hình 3.30: Đường chuẩn các Sudan trên nền mẫu trắng 112

Hình 3.31: Hiệu suất chiết các Sudan phụ thuộc số lần chiết 115

Hình 3.32: Ảnh hưởng của lực ion đến hiệu suất hấp phụ các Sudan 116

Hình 3.33: Hiệu suất hấp phụ các Sudan khi thay đổi pH của dung dịch 117

Hình 3.34: Hiệu suất hấp phụ theo nồng độ đầu các Sudan 119

Hình 3.35: Đường đẳng nhiệt Langmuir của các Sudan 120

Hình 3.36: Hiệu suất thu hồi các Sudan theo thời gian rửa giải 120

Hình 3.37: Hiệu suất thu hồi các Sudan theo số lần rửa giải 121

Hình 3.38: Dịch chiết mẫu MBB1 sau xử lý 123

Hình 3.39: Sắc ký đồ phân tích mẫu bim bim MBB1 126

Hình 3.40: Sắc ký đồ phân tích mẫu bim bim MBB2 127

Hình 3.41: Sắc ký đồ phân tích mẫu bim bim MBB4 127

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, TỪ VÀ CỤM TỪ VIẾT TẮT

chromatography

Sắc ký lỏng cao áp/ Sắc ký lỏng hiệu năng cao

Research on Cancer

Cơ quan Nghiên cứu Ung thư Quốc tế

Spectrometry

Sắc ký lỏng ghép nối khối phổ

phương pháp

MQL Method quantification limit Giới hạn định lượng của

phương pháp

Control

Đảm bảo chất lượng/kiểm soát chất lượng

MỞ ĐẦU

1 Tính cấp thiết và lí do của đề tài

Cơ quan nghiên cứu Ung thư quốc tế IARC [49] đã xếp một số chất màu tổng hợp vào nhóm các chất có thể gây ung thư như: các chất Sudan, Auramine

O, Rhodamine B, Ponceau 3R,… Những chất màu này có ưu điểm rẻ tiền, bắt màu chuẩn và lên màu nhanh, bền màu, nhưng chúng là những chất độc có khả năng gây bệnh cho người Thực tế đã có nhiều sản phẩm thực phẩm trên thị trường bị phát hiện sử dụng phẩm màu không được phép dùng cho thực phẩm [17, 34, 57,66]

Theo Quy chuẩn kỹ thuật quốc gia về phụ gia thực phẩm - phẩm màu QCVN 4-10:2010/BYT [4] và Thông tư số 21/2019/TT-BNNPTNT của Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn về “Hướng dẫn một số điều của luật chăn nuôi về Thức ăn chăn nuôi”, có quy định rõ tại phụ lục V: Cấm sử dụng Auramine O (AO) và các dẫn xuất của Auramine O trong thức ăn chăn nuôi [3], như vậy AO là chất không được phép có mặt trong thực phẩm tại Việt Nam Mặt khác thông tư 24/2019/TT-BYT ban hành ngày 30 tháng 8 năm 2019 quy định có 57 chất màu được phép sử dụng trong thực phẩm không bao gồm các Sudan và AO Do đó, một phương pháp phát hiện AO và các chất Sudan ở lượng siêu vết trong thực phẩm là rất cần thiết Trong các hợp chất Sudan, thì Sudan I và Sudan II có màu đỏ sáng đẹp mắt, được sử dụng khá phổ biến trong thực phẩm hơn Sudan III và Sudan do đó đề tài chọn hướng nghiên cứu hỗn hợp Sudan I và Sudan II trong mẫu thực phẩm

Hiện nay, Việt Nam mới chỉ có duy nhất một phương pháp được chứng nhận để xác định Auramine O trong thực phẩm và thức ăn chăn nuôi là Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 12267:2018 về “Thực phẩm - xác định hàm lượng Auramine - phương pháp sắc ký lỏng ghép khối phổ (LC-MS/MS)”[1], chưa có phương pháp được chứng nhận để xác định các Sudan trong thực phẩm TCVN

12267:2018 đã áp dụng một quy trình duy nhất chiết tách AO từ các nền mẫu thực phẩm khác nhau bằng dung môi hữu cơ, điều này có thể dẫn đến hiệu suất thu hồi thấp và độ chính xác chưa cao do các mẫu thực phẩm khác nhau có nền mẫu phức tạp không giống nhau, đồng thời LC-MS/MS là hệ thống thiết bị phức tạp đắt tiền, không phổ biến trong các phòng thí nghiệm Ưu điểm của phương pháp HPLC là có thể định lượng đồng thời các chất màu tương tự nhau, phương pháp phân tích và vận hành đơn giản, thiết bị sử dụng phổ biến, tuy nhiên khi phân tích HPLC cần phải xử lý làm sạch ảnh hưởng của nền mẫu Việc sử dụng nanosilica từ vỏ trấu (RHNS) để hấp phụ chất màu Rhodamine B

và Xanh metylen trong dung dịch nước đã được nghiên cứu trên thế giới [20,63], ưu điểm của việc sử dụng RHNS so với kỹ thuật chiết pha rắn (SPE) ở nguồn nguyên liệu nông nghiệp rẻ tiền là trấu, các bước thực nghiệm đơn giản không cần thiết bị phức tạp, sử dụng chính dung môi pha động HPLC để rửa giải chất màu cho hiệu suất hấp phụ- rửa giải cao Tuy nhiên chưa có nghiên cứu nào tiến hành hấp phụ chất màu AO và Sudan từ dịch chiết mẫu thực phẩm

Nhằm tìm kiếm giải pháp chiết, tách phù hợp với từng nền mẫu thực phẩm khác nhau, đồng thời xây dựng phương pháp định lượng chất màu nhân tạo độc hại bằng hệ thống thiết bị đơn giản, phù hợp với các điều kiện phòng

thí nghiệm, chúng tôi tiến hành đề tài “Phân tích Auramin O, Sundan I, Sudan

II trong thực phẩm bằng phương pháp RP-HPLC sử dụng vật liệu nanosilica

Nội dung nghiên cứu chính của luận án:

 Đối với Auramine O:

o Khảo sát tìm điều kiện tối ưu xác định Auramine O bằng phương pháp HPLC

o Khảo sát các điều kiện tối ưu chiết Auramine O từ mẫu thực phẩm phòng thí nghiệm

o Nghiên cứu điều kiện hấp phụ của Auramine O trong dung dịch lên Nanosilica chế tạo từ vỏ trấu (kí hiệu RHNS)

o Áp dụng quy trình đã nghiên cứu để xác định Auramine O trong mẫu thực tế

 Đối với hỗn hợp Sudan I và Sudan II:

o Khảo sát tìm điều kiện tối ưu xác định đồng thời Sudan I và Sudan II bằng phương pháp HPLC

o Khảo sát các điều kiện tối ưu chiết Sudan I và Sudan II từ mẫu thực phẩm phòng thí nghiệm

o Nghiên cứu điều kiện hấp phụ của của hỗn hợp Sudan I và Sudan II trong dung dịch lên Nanosilica chế tạo từ vỏ trấu

o Áp dụng quy trình đã nghiên cứu để xác định Sudan I và Sudan II trong mẫu thực tế

3 Đối tượng, phạm vi nghiên cứu và phương pháp nghiên cứu

Đối tượng, phạm vi nghiên cứu

- Các chất màu Sudan I, Sudan II trong các mẫu thực phẩm: mẫu thịt khô, mẫu bim bim

- Chất màu Auramine O trong các mẫu: măng, miến, phấn hoa, dưa chua,

cá khô, mì tôm

Phương pháp nghiên cứu

- Phương pháp chiết lỏng – lỏng mẫu thực phẩm bằng dung môi hữu cơ

- Phương pháp hấp phụ chất màu trên nanosilica

- Phương pháp phân tích HPLC định lượng chất màu, sử dụng detector mảng Diode Array (PDA)

- Phương pháp phổ hấp phụ phân tử UV-Vis để xác định các bước sóng hấp phụ cực đại của các dung dịch chất màu

Luận án sử dụng các phương pháp phân tích hóa lý hiện đại để đánh giá xác định các đặc trưng của vật liệu hấp phụ: phổ FTIR, SEM, EDX, BET,…

Sử dụng các phương pháp thống kê để xử lý kết quả, đánh giá số liệu thực nghiệm

4 Ý nghĩa khoa học, thực tiễn và đóng góp mới của luận án

- Việc kiểm tra chất màu cấm sử dụng trong thực phẩm với các mẫu ngẫu nhiên tại các phòng thí nghiệm nhỏ ở Việt Nam là ít khả thi, chính vì vậy với mục tiêu nghiên cứu phát triển phương pháp phân tích đơn giản RP-HPLC để đánh giá hàm lượng AO, Sudan I và Sudan II trong một số mẫu thực phẩm trên thị trường là có ý nghĩa lớn

- Luận án đã đưa ra quy trình chung để phân tích các chất màu (Auramine

O và hỗn hợp Sudan I, Sudan II) trong các mẫu thực phẩm Quy trình gồm 2 giai đoạn chính là xử lý mẫu và phân tích định lượng mẫu bằng phương pháp HPLC Giai đoạn xử lý mẫu được thực hiện theo 2 cách với các loại mẫu khác nhau Cách 1: Chiết bằng dung môi hữu cơ Cách 2: Chiết bằng dung môi hữu

cơ - Hấp phụ chất màu trong dịch chiết bằng Nanosilia chế tạo từ vỏ trấu - Giải hấp phụ bằng pha động trong phân tích HPLC Đây là quy trình phân tích chất màu trong thực phẩm chưa được đề xuất trước đó trong bất kỳ công trình nghiên cứu khoa học nào

- Xử lý mẫu bằng phương pháp chiết với dung môi hữu cơ được đánh giá

là phương pháp nhanh, đơn giản dễ thực hiện và chi phí thấp Một điểm ý nghĩa của luận án là đưa ra phương pháp chiết các chất màu bằng dung môi ethanol

(chiết auramine O bằng hỗn hợp ethanol: nước (v/v 70:30, chiết hỗn hợp Sudan

I và Sudan II bằng ethanol tuyệt đối) Với lượng mẫu, thể tích dịch chiết, số lần chiết, nhiệt độ, thời gian chiết phù hợp, sử dụng dung môi chiết chứa dung môi ethanol cho hiệu suất chiết cao đối với nhiều loại mẫu thực phẩm (trên 90%)

mà vẫn đảm bảo được yếu tố: không độc hại với người phân tích và môi trường, chi phí thấp, các bước thực hiện đơn giản và có thể áp dụng chiết được nhiều loại mẫu

- Sử dụng Nanosilica chế tạo từ vỏ trấu để hấp phụ chất màu từ dịch chiết mẫu thực phẩm cũng là một điểm mới của luận án Đây cũng là một bước quan trọng trong xử lý mẫu hướng tới "quy trình xanh" Việc sử dụng nanosilia hấp phụ các Sudan ở điểm đẳng điện trong khi Sudan có tính kỵ nước là một nghiên cứu chưa được đề xuất trước đó (các nghiên cứu hấp phụ chất màu bằng RHNS chỉ tập trung vào chất màu ưa nước như Methylene Blue, Rhodamine B, )

- Luận án đã đưa ra kết quả định lượng phân tích AO, Sudan I và Sudan

II trong nhiều mẫu thực phẩm khác nhau, số liệu có giá trị trong việc tham khảo lựa chọn các loại thực phẩm an toàn đối với người tiêu dùng

5 Bố cục của luận án

Bố cục luận án gồm 147 trang, mở đầu 5 trang; tổng quan 40 trang; thực nghiệm 27 trang; kết quả và thảo luận 56 trang; kết luận 2 trang Luận án có 56 hình và 42 bảng; tài liệu tham khảo 11 trang với 13 tài liệu tiếng Việt và 63 tài liệu tiếng Anh Ngoài ra còn có 6 Phụ lục với độ dài 6 trang

Bảng 1.1: Một số chất màu phụ gia thực phẩm được phép

có những nhóm mang màu quan trọng là: nhóm etylen (-CH=CH-); nhóm azo (-N=N-); nhóm azomethine (-CH=N-); nhóm nitroso (-N=O); nhóm cabonyl (=C=O) Bên cạnh đó, nhóm trợ màu bao gồm những nhóm thế, có thể cho hoặc nhận điện tử như -NH2, -COOH, -SO3H, .chúng làm tăng cường màu của nhóm mang màu bằng cách làm dịch chuyển năng lượng của hệ điện tử

Dựa vào nhóm mang màu người ta phân loại các chất màu tổng hợp thành các nhóm như trình bày trong Bảng 1.2

Bảng 1.2: Phân loại chất màu tổng hợp theo nhóm mang màu

Nhóm azo Trong phân tử chứa

một hay nhiều nhóm mang màu azo và các nhóm trợ màu như -

OH, -NH2, -SO3H

Sudan I

Procion blue MX-R

Nhóm

arylmethane

Trong phân tử có một hay nhiều vòng thơm liên kết thay thế trên methane và các nhóm trợ màu

Auramine O

Nhóm

azomethine

Trong phân tử có nhóm azomethine -CH=N- và các nhóm trợ màu

1.2 Cơ chế liên kết của chất màu với vật liệu

Khi tiếp xúc với vật liệu (sợi dệt, da, chất hấp phụ như silica, than hoạt tính, ) hoặc trong môi trường nước hoặc ở dạng khô phân tán cao với nhiệt độ thích hợp, chất màu sẽ liên kết với vật liệu trong một số điều kiện nhất định Quá trình liên kết này không chỉ xảy ra ở mặt ngoài của vật liệu mà có thể cả trên mặt các thành mao quản, các khoang trống bên trong giữa các chùm đại phân tử của vật liệu Quá trình này cũng không chỉ đơn thuần là các lực liên kết hóa lý (lực liên kết phân tử và lực hấp phụ) mà có cả liên kết hóa học, chất màu

có thể thực hiện liên kết ion hay liên kết hóa trị với vật liệu [12]

Liên kết ion: Liên kết này xuất hiện giữa các tâm tích điện dương của vật

liệu với các gốc mang màu tích điện âm của chất Quá trình diễn ra trong khi

nhuộm là khi chất màu tiếp cận với vật liệu, ion âm của chất màu bị các tâm tích điện dương của vật liệu thu hút và thực hiện liên kết ion hay còn gọi là liên kết muối theo phản ứng 1.1 như sau:

HOOC-P-NH3+ + -O3S-Ar → HOOC-P-NH3O3S-Ar (1.1)

Liên kết của chất màu với vật liệu khá mạnh do có năng lượng lớn, tốc

độ bắt màu nhanh Tốc độ nhuộm có thể được điều chỉnh bằng cách thay đổi giá trị pH của dung dịch chất màu

Liên kết Hidro: Liên kết hidro xuất hiện giữa các nhóm định chức của

vật liệu và chất màu như: hydroxyl, nhóm amin, nhóm amit và nhóm carboxyl khi chất màu và vật liệu tiếp xúc nhau Liên kết hidro này có vai trò khá quan trọng trong một số trường hợp để cố định chất màu trên vật liệu Ví dụ, người

ta dùng chất màu trực tiếp gắn màu vào xơ xenlulo và tơ tằm chủ yếu do lực liên kết hidro, các Sudan hòa tan vào dầu mỡ và nhuộm màu trên thịt cũng một phần do liên kết hidro tồn tại giữa nhóm - OH của Sudan và –COOH của các axit béo trong dầu mỡ, -N-H trong Auramine O tạo liên kết hidro với –OH trong chất xơ của măng, tinh bột của miến,…

Liên kết hóa trị: Liên kết hóa trị xuất hiện khi nhuộm chất màu hoạt tính

(reactive dyes) trên các vật liệu xơ sợi chứa các nhóm hydroxyl –OH (ví dụ sợi cellulose) và nhóm amin –NH2 (ví dụ sợi polyamide hoặc len) Liên kết hóa trị chủ yếu giúp cho chất màu hoạt tính bám màu tốt trên vật liệu đặc biệt với xử

lý ướt

Liên kết Van Der Waals: Liên kết Van Der Waals xuất hiện ở hầu hết

các lớp chất màu khi nó tương tác với vật liệu Đây là lực liên kết ở cấp độ phân

tử và được coi là tổ hợp của các lực hút: lưỡng cực, phân cực cảm ứng và lực phân tán Nó phụ thuộc và loại vật liệu nhuộm là ưa nước hay kỵ nước, cũng phụ thuộc vào phân tử chất màu là có cực hay không có cực, và mức độ tiếp xúc giữa chất màu và vật liệu

Lực tương tác kỵ nước: Xuất hiện khi chất màu có các gốc hydrocacbon

tiếp xúc với vật liệu có cấu trúc phân tử không phân cực Bản thân chúng không đẩy nhau nên chất màu dễ hòa tan và bám dính trên vật liệu Ví dụ điển hình là trường hợp khi nhuộm các loại xơ tổng hợp kỵ nước bằng chất màu phân tán Chất màu phân tán ở dạng bột mịn tuy không tan trong nước nhưng độ phân tán cao, ở điều kiện nhuộm phù hợp (ví dụ nhiệt độ áp suất cao, gia nhiệt khô,…) chất màu sẽ tan vào các xơ tổng hợp kỵ nước Xơ tổng hợp được coi là dung dịch rắn của chất màu phân tán Lực tương tác kỵ nước có vai trò giúp chất màu có độ bền màu cao khi giặt

Sự phân bố đồng đều của các chất màu làm chất phụ gia trong phần lớn các loại thực phẩm có ý nghĩa rằng một hoặc nhiều thành phần của thực phẩm

có thể liên kết với các phân tử chất màu và hoạt động như một chất mang Tuy nhiên, các thành phần nào trong thực phẩm đóng vai trò chất mang màu vẫn chưa được nghiên cứu sâu và rộng Đã có các nghiên cứu chỉ ra rằng thực phẩm chứa protein thì các protein sẽ liên kết tĩnh điện với các nhóm cacboxylic và phenolic của chất màu để tạo ra phức chất protein-chất màu hòa tan được trong nước [14,58] Ngoài ra với các thực phẩm chứa chất béo hoặc các axit amin thì các liên kết hidro hoặc liên kết hóa trị sẽ đóng vai trò chủ yếu khi nhóm cacboxyl, amin trong thực phẩm liên kết với chất màu

1.3 Auramine O

1.3.1 Cấu tạo, tính chất

Auramine O (C.A.S 2465-27-2) hay còn gọi là Vàng ô (kí hiệu AO) là một loại chất màu diarylmethane AO có danh pháp IUPAC là bis[4-(dimethylamino)phenyl]methaniminium chloride; công thức phân tử là

C17H21N3.HCl và công thức cấu tạo như Hình 1.1

Hình 1.1: Công thức cấu tạo của Auramine O

AO có tên gọi khác là Basic yellow 2, Pyocatanium aureum, Aizen auramine, Pyoktanin yellow, Canary yellow, Pyoktanin hoặc C.I 41000

Auramine O tinh thể màu vàng kim (Hình 1.2), nhiệt độ nóng chảy

2670C, tan trong nước (10 mg/ml) và ethanol (20 mg/ml), tan nhiều trong ethylen glycol, methyl ether, acetonitril,…

Auramine O là một chất màu tổng hợp được dùng trong công nghiệp nhuộm vải, giấy, gỗ, in ấn và pha tạo màu sơn Trong y khoa, Auramine O còn được dùng làm chất nhuộm màu huỳnh quang dùng nhuộm nhanh vi khuẩn acid

có trong đờm, vi khuẩn lao nhờ khả năng liên kết với mycolic acid trong thành

tế bào loại vi khuẩn này Để phát hiện các vi khuẩn Mycobacterium tuberculosis người ta sử dụng hỗn hợp chất màu Auramine O và Rhodamine B trong phép nhuộm Auramin- Rhodamin

Hình 1.2: Bột Auramine O

Auramine O là chất không được phép sử dụng trong thực phẩm, mĩ phẩm Theo thông tư số 42/2015/TT-BNNPTNT ngày 16/11/2015 của Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn Việt Nam về Danh mục bổ sung hóa chất, chất

kháng sinh cấm nhập khẩu, sản xuất, kinh doanh và sử dụng trong thức ăn chăn nuôi tại Việt Nam, Auramine O và các dẫn xuất đã bị cấm nhập khẩu, sản xuất, kinh doanh và sử dụng trong thức ăn chăn nuôi gia súc, gia cầm tại Việt Nam [2] Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn cũng quy định giới hạn phát hiện

mà phương pháp phải đạt để phân tích Auramine O trong thức ăn chăn nuôi là

1 mg/kg

Cơ quan Châu Âu về An toàn và Sức khỏe (European Agency for Safety and Healthy at Work, EU-OSHA) ban hành chỉ thị 2004/37/EC quy định về các chất gây ung thư hoặc đột tử Chỉ thị này xếp Auramine O và dẫn xuất của nó vào nhóm các chất không được có mặt trong thành phần mỹ phẩm đồng nghĩa với không được dùng trong phụ gia thực phẩm Bất kỳ phụ gia hoặc thực phẩm nào có mặt AO đều không được phép sử dụng

Tuy nhiên, vì mục đích kinh doanh, đã phát hiện ra có những cơ sở chăn nuôi sử dụng chất Vàng ô trong sản xuất thức ăn gia súc gia cầm với mong muốn tạo màu đẹp cho da, lông, trứng…Các cơ quan chức năng cũng đã phát hiện Auramine O trong măng ngâm, gà luộc sẵn, măng khô, dưa muối, tôm [43]…

1.3.2 Đặc tính sinh học và độc tính

Chất màu tổng hợp Auramine O được Cơ quan Nghiên cứu ung thư quốc

tế (International Agency for Research on Cancer – IARC) trực thuộc tổ chức y

tế thế giới WHO xếp vào nhóm tác nhân gây ung thư số 2B và các sản phẩm của nó được xếp vào nhóm 1 – tức nhóm chắc chắn gây ung thư cho người bị phơi nhiễm [49] Chất này gây nhiễm độc cấp tính đối với các cơ quan động vật sống kể cả con người Các thí nghiệm trên chuột cho thấy khi cho chúng sử dụng nước uống có chứa AO trong thời gian dài sẽ gây ra ung thư biểu mô và

u gan [23, 68], làm tổn thương DNA ở tế bào gan, thận và tủy xương Đối với các thí nghiệm trên tế bào cơ thể người, cho thấy AO cũng gây phá hủy DNA

[53] Nghiên cứu của Case và Pearson (1954) cho kết quả rằng các công nhân tham gia sản xuất Auramine O có nguy cơ phát triển u nhú và ung thư biểu mô bàng quang [26] Ngộ độc AO chủ yếu gây nhiễm độc thần kinh và gan, các biểu hiện lâm sàng có thể thay đổi từ buồn nôn, nôn mửa đến đau bụng, hạ huyết áp, rối loạn nhịp tim khó chữa, co giật và động kinh, thậm chí nhiễm độc nặng có thể gây tử vong [39]

1.3.3 Tình hình nghiên cứu Auramine O trong thực phẩm

Tại Việt Nam nói riêng và trên thế giới nói chung đã có các công trình khoa học nghiên cứu về các phương pháp định lượng AO trong thực phẩm Một số nội dung thuộc các công trình nghiên cứu này được tóm tắt trong bảng 1.3

Bảng 1.3: Tóm tắt một số công trình nghiên cứu định lượng Auramine O

TCVN

12267:2018 2018 ACN tinh khiết

Kênh A: đệm CH 3 COONH 4 0,005 M (pH=3) Kênh B: CH 3 OH tinh khiết

Đệm HCOONH 4 100 mM (pH

2,9): ACN (v/v) Chế độ: Gradient

0,1 μg/kg 0,1 μg/kg UPLC-MS/MS [61]

Đặng Thị Ngọc

Hoa và cộng sự 2020

Không chiết mẫu bằng dung môi, phân tích trực tiếp mẫu nước dưa chua

0,05 μg/g 0,125 μg/g HPLC-PDA [60]

Kyung-Yuk Ko và

cộng sự 2021

CH 3 COONH 4 50 mM trong MeOH 70%

ACN:CH 3 COONH 4 50 mM Chế

độ gradient

1,4 µg/mL (đã quy đổi)

4,0 µg/mL (đã quy đổi)

HPLC-PDA [42]

Ngoài ra AO cũng được nghiên cứu bằng phương pháp phổ huỳnh quang

sử dụng bộ cảm biến là vật liệu composite Nanocarbon [34], bằng phương pháp quang phổ Terahertz kết hợp với mô hình bình phương nhỏ nhất từng phẩn (PLSR) cải biến quang phổ tương quan 2 chiều (2DCOS) [72], bằng phép đo phổ Raman [73]

Nhận xét: Chỉ có một công trình nghiên cứu sử dụng phương pháp UPLC-MS/MS cho thấy có sự xuất hiện của AO trong thực phẩm Số lượng mẫu chứa AO là 57 trong tổng số 211 mẫu nghiên cứu Hàm lượng AO trong mẫu thực phẩm từ 3,2 µg/kg ÷ 13,02 µg/kg Các mẫu thực phẩm chứa AO gồm măng chua, thịt gà, dưa chua, sa tế, cà ri, bột nghệ [61] Các công trình khác đều không phát hiện sự có mặt AO trong mẫu nghiên cứu

Trong mười năm trở lại đây số lượng các nghiên cứu định lượng AO trong thực phẩm có tăng, tuy nhiên vẫn còn hạn chế Các nghiên cứu có đưa ra các phương pháp chiết AO từ nền mẫu thực phẩm khác nhau Quá trình xử lý mẫu sử dụng đa dạng các loại dung môi để chiết tách AO từ mẫu thực phẩm thành phần có chứa methanol, ethanol, acetonitrl, …tuy nhiên nghiên cứu của ZHAO Chun-yu và cộng sự [74] đề xuất phương pháp chiết AO bằng nước là chưa phù hợp bởi độ tan AO trong nước là thấp hơn đáng kể so với độ tan trong các dung môi hữu cơ như EtOH và ACN Ngoài ra cũng có thể dùng phương chiết pha rắn SPE để tách chiết AO trong mẫu [43]

Có thể sử dụng các phương pháp khác nhau để định lượng AO như MS/MS, UPLC-MS/MS, HPLC, phổ huỳnh quang, Vôn-ampe hòa tan, trong

LC-đó phương pháp HPLC là thích hợp để định lượng Auramine O trong thực phẩm

và được sử dụng phổ biến nhất, giới hạn định lượng AO thấp có thể phân tích được hàm lượng cỡ ppb

ớt sử dụng trong các món chiên xào có thể bị trộn thêm Sudan để giữ màu tươi lâu Một số thông tin về các loại Sudan được trình bày trong Bảng 1.4

Bảng 1.4: Công thức, tên gọi và danh pháp các loại Sudan

Công thức cấu tạo Sudan I: C16H12N2O

C.I 12055

C.A.S 842-07-9

M = 248,28

naphthalenol, 2-Hydroxynaphthyl-1-

2-Naphtholazobenzene, Benzene-1-azo-2-naphthol, Benzeneazo-beta-naphthol,

1-(phenyldiazenyl) naphthalen-2-ol

Solvent Yellow, Brasilazina Oil Orange, Brilliant Oil Orange R,…

1-(2,4-1-[(2,4-dimethylphenyl) diazenyl] naphthalen-2-

Cerasin Red, Solvent Red

23, Sudan G, Sudan Red

BK, Fat Soluble Sudan, [4-(phenylazo)phenylazo]-2-naphthol

1-phenyldiazenylphenyl) diazenyl] naphthalen-2-

Sudan R hoặc BB, Scarlet

Crimson, Biebrich scarlet

R fat soluble, Fat Ponceau

R or 4, Oil Red IV, Solvent Red 24

1-[{2-Methyl-4-[(2-methyl phenyl)diazenyl]phenyl}diazenyl]naphthalen-2-ol

Sudan I và II thuộc loại monoazo, sudan III và IV thuộc loại diazo, chúng

có những tính chất hóa học cơ bản là:

Tính oxy hóa: với các chất khử mạnh như Sn, Zn, Fe, có thể khử nhóm azo trong phân tử các hợp chất Sudan tạo thành các amin.

Tính khử: phản ứng với halogen, với acid H2SO4 đậm đặc (phản ứng sulfo hóa)

Phân hủy bởi nhiệt: Các Sudan đều phân hủy dưới tác dụng của nhiệt độ cao (trên 265°C) Đặc biệt khi trong dung dịch có chứa acid hoặc kiềm sẽ thúc đẩy quá trình phân hủy tạo aniline hoặc benzen

1.4.2 Đặc tính sinh học, độc tính của các Sudan

Trước năm 1987 các Sudan đều là những chất được xếp vào nhóm chất không thể xác định chắc chắn gây ung thư cho người (loại 3) bởi IARC [49] Tuy nhiên về sau đó đã có nhiều công trình khoa học nghiên cứu xác định các Sudan đều có độc tính cao với động vật Khi các Sudan vào cơ thể sẽ tách các amin và tăng sinh gây đột biến gan, là nguyên nhân gây tăng sinh không kiểm soát của tế bào Khi tế bào phát triển không kiểm soát được sẽ gây ung thư [61]

Ủy ban về những chất nguy hại của Đức (Committee on Hazardous Substances) đã tiến hành nhiều thí nghiệm về độc tính của Sudan trên chuột: Sudan I gây đột biến gen mạnh do tổn thương chất liệu di truyền của tế bào Từ đó tạo thành các khối u ác tính trong chuột thí nghiệm Dùng liều cao Sudan I sẽ tạo ra các nốt tăng sinh ở gan được xem là yếu tố tiền ung thư, ngoài ra các hợp chất Sudan còn gây ung thư hạch và ung thư bạch cầu cấp

ở chuột thí nghiệm [61]

Ngoài tính độc của bản thân các Sudan thì trong quá trình điều chế sản xuất Sudan có các tạp chất ví dụ 2-naphthol, anilin, 4-aminoazobenzene đều là những chất bất lợi với cơ thể [69] Quá trình khử Sudan II về lý thuyết có thể sinh ra amin 2,4-xylidine (C.A.S 95-68-1) và 1-amino-2-naphthol (C.A.S 2834-92-6) trong đó chất đầu được liệt vào danh sách chất gây ung thư Quá trình khử Sudan IV về lý thuyết có thể tạo ra các amin: o-aminozotoluen (C.A.S 97-

56-3); 1-amino-2-naphthol (C.A.S 2834-92-6), 2,5-diaminotoluen (C.A.S 70-5) và o-toluidine (C.A.S 95-53-4) Trong đó o-aminozotoluen được phân loại là chất gây ung thư loại 2, thử nghiệm trên chó cho thấy gây chết ở liều cao hoặc ung thư bàng quang, ung thư gan Hai chất còn lại cũng là chất gây ung thư loại 2 và gây hại cho môi trường [21]

95-Dựa trên cơ chế tác động của các hợp chất Sudan trên tế bào, một số nhà khoa học cho rằng không có giới hạn an toàn cho Sudan và không ước lượng được nguy cơ khi bị phơi nhiễm trên người Do vậy một số nước đã cấm dùng hẳn chất này trong thực phẩm Liên minh Châu Âu đã ban hành lệnh cấm hoàn toàn đối với các chất phụ gia thực phẩm có chứa Sudan Điều đó có nghĩa là không đưa ra một giá trị ngưỡng cho phép nào của các hợp chất Sudan đưa vào

cơ thể người [21]

Đến nay ở Việt Nam hiện chưa có quy chuẩn, tiêu chuẩn nào về hàm lượng các dạng Sudan trong thực phẩm, dược phẩm và mỹ phẩm Các trung tâm kiểm định chất lượng và một số nhà khoa học đã có những nghiên cứu độc lập về các mẫu thực phẩm, mỹ phẩm trên thị trường (chủ yếu là hàng hóa không rõ nguồn gốc hoặc nguồn gốc Trung Quốc) [6, 9, 10] và cũng đã xác định được một số mẫu

có chứa các dạng Sudan thậm chí với hàm lượng cao [10]

1.4.3 Tình hình nghiên cứu các hợp chất Sudan

Để phân tích định lượng các Sudan hiện nay có 3 phương pháp chủ yếu được sử dụng là: phương pháp sắc ký, phương pháp quang phổ hấp thụ phân

tử, phương pháp Von ampe hòa tan

 Phương pháp cực phổ và Von-ampe hòa tan

Hệ liên kết π trong phân tử làm cho các dung dịch Sudan có tính chất điện hóa, đã có nhiều công trình nghiên cứu Sudan bằng phương pháp cực phổ

và Von-ampe hòa tan kết quả cho thấy các phương pháp này khá phù hợp để định lượng các Sudan Tác giả Zhirong Mo và cộng sự đã sử dụng phương pháp

điện thế xác định Sudan I trong thực phẩm sử dụng điện cực than thủy tinh biến tính tạo màng composit trên nền ống nano đa lớp với chất lỏng ion và chất hoạt động bề mặt dạng gemini Kết quả nghiên cứu đưa ra khoảng tuyến tính nồng

độ Sudan I là 0,05 µmol/l đến 2 µmol/l , với giới hạn phát hiện Sudan I là 0,03 µmol/l [75] Tác giả Xinying Ma và cộng sự đã sử dụng phương pháp Von-ampe hòa tan xác định Sudan II trong thực phẩm sử dụng điện cực than thủy tinh biến tính dưới sự ảnh hưởng tăng cường của NaC12H25SO4 (SDS) Kết quả nghiên cứu cho thấy nồng độ Sudan II tuyến tính trong khoảng 4.10-8 M đến 4.10-6 M và giới hạn phát hiện Sudan II là 8,0x10-9 M [46] Ngoài ra còn một

số các công trình khoa học khác cũng sử dụng phương pháp cực phổ và ampe để xác định các Sudan [28, 29, 45, 51, 71] Như vậy việc thay đổi, biến tính các loại điện cực là một trong những biện pháp cho phép nâng cao độ nhạy, giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng của phương pháp phân tích cực phổ

von-và von-ampe hòa tan

 Phương pháp quang phổ hấp thụ phân tử

Cơ sở của phương pháp này dựa trên tính chất hấp thụ bức xạ điện từ có chọn lọc của chất màu trong vùng quang phổ nhìn thấy Cho nên, về lý thuyết

có thể định lượng Sudan bằng phương pháp quang phổ hấp thụ phân tử Tuy nhiên phương pháp yêu cầu xử lý mẫu nghiêm ngặt và chọn lọc trước khi đo dung dịch hấp phụ để có độ chính xác cao, nhược điểm khác là phương pháp

không định lượng đồng thời các dạng Sudan được

 Phương pháp sắc ký

Trong phân tử các hợp chất azo (bao gồm cả Sudan) có các nhóm cho nhận điện tử, có khả năng liên kết với các dung môi (với các dung môi khác nhau cho lực liên kết khác nhau) nên chúng dễ dàng hòa tan trong dung môi Đây là cơ sở để rửa giải sắc ký Sudan dễ dàng được phân tách và định lượng bằng các phương pháp sắc ký mà phổ biến nhất là phương pháp sắc ký lỏng

hiệu năng cao Tùy vào mục tiêu nghiên cứu có thể định lượng được từng dạng Sudan trong các dung dịch riêng biệt hoặc tất cả các dạng Sudan trong cùng một dung dịch

Nhóm các phương pháp sắc ký khí (GC) bao gồm một số nghiên cứu như: tác giả Erdemir và cộng sự đã định lượng Sudan III trong bột ớt bằng phương pháp GC-MS sau khi chiết xuất chất màu bằng axeton [35]; tác giả Limin He và cộng sự nghiên cứu tồn dư các chất màu Sudan trong trứng bằng phương pháp sắc ký lỏng (LC) và phương pháp GC-MS [38]

Một số công trình nghiên cứu Sudan bằng phương pháp sắc ký lỏng như: tác giả Bùi Thị Ngoan và cộng sự đã xác định Sudan I trong một số loại gia vị bằng kỹ thuật sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) [9]; ngoài ra còn nhiều các công trình nghiên cứu khác cũng sử dụng phương pháp HPLC để định lượng các Sudan [27, 36, 69]

Bảng 1.5 tóm tắt các nội dung cơ bản của một số công trình nghiên cứu định lượng Sudan trong mẫu thực phẩm

Bảng 1.5: Tóm tắt kết quả một số công trình nghiên cứu định lượng Sudan trong thực phẩm

Tác giả/

Tiêu chuẩn

dung môi chiết

Dichloromethane Sudan I: 7

g/kg

Sudan I: 13 g/kg

Sudan II: 6,14 µg/L (đã quy đổi)

Sudan I: 26,6 µg/L (đã quy đổi)

Sudan II: 19,4 µg/L (đã quy đổi)

HPLC-DAD [54]

Umran Seven

Erdemir

µg/kg Sudan II: 2,7 µg/kg

Sudan I: 25,7 µg/kg

Sudan II: 8,9 µg/kg

IV):0,16-Sudan(I-IV):

0,80µg/L

Chế độ gradient

Sudan I: 2,9 µg/kg

Sudan II: 2,8 µg/kg

Sudan I: 9,5 µg/kg

Sudan II: 10,4 µg/kg