Protein sinh học.docx

Protein sinh học.docxProtein sinh học.docxProtein sinh học.docxProtein sinh học.docxProtein sinh học.docxProtein sinh học.docxProtein sinh học.docxProtein sinh học.docxProtein sinh học.docxProtein sinh học.docxProtein sinh học.docxProtein sinh học.docxProtein sinh học.docxProtein sinh học.docxProtein sinh học.docxProtein sinh học.docxProtein sinh học.docxProtein sinh học.docxProtein sinh học.docxProtein sinh học.docxProtein sinh học.docxProtein sinh học.docxProtein sinh học.docxProtein sinh học.docxProtein sinh học.docxProtein sinh học.docxProtein sinh học.docxProtein sinh học.docxProtein sinh học.docxProtein sinh học.docxProtein sinh học.docxProtein sinh học.docxProtein sinh học.docxProtein sinh học.docxProtein sinh học.docxProtein sinh học.docxProtein sinh học.docxProtein sinh học.docxProtein sinh học.docxProtein sinh học.docxProtein sinh học.docxProtein sinh học.docxProtein sinh học.docxProtein sinh học.docxProtein sinh học.docxProtein sinh học.docxProtein sinh học.docxProtein sinh học.docxProtein sinh học.docxProtein sinh học.docxProtein sinh học.docxProtein sinh học.docxProtein sinh học.docxProtein sinh học.docxProtein sinh học.docxProtein sinh học.docxProtein sinh học.docxProtein sinh học.docxProtein sinh học.docxProtein sinh học.docxProtein sinh học.docxProtein sinh học.docxProtein sinh học.docxProtein sinh học.docxProtein sinh học.docxProtein sinh học.docxProtein sinh học.docxProtein sinh học.docxProtein sinh học.docxProtein sinh học.docxProtein sinh học.docxProtein sinh học.docxProtein sinh học.docxProtein sinh học.docxProtein sinh học.docxProtein sinh học.docxProtein sinh học.docxProtein sinh học.docxProtein sinh học.docxProtein sinh học.docxProtein sinh học.docxProtein sinh học.docxProtein sinh học.docxProtein sinh học.docxProtein sinh học.docxProtein sinh học.docxProtein sinh học.docxProtein sinh học.docxProtein sinh học.docxProtein sinh học.docx

Sinh protein Câu 1: Trình bày các nguồn cung cấp protein dược dụng

Việc chọn nguồn cung cấp protein dược dụng phải tuân thủ 3 yêu cầu sau:

+ Protein dược dụng cần thu nhận phải đủ lớn về số lượng và hàm lượng

+ Nguồn cung cấp protein dược dụng phải được cơ quan có thẩm quyền công nhận + Được xã hội chấp nhận

1 Protein dược dụng từ vi sinh vật chọn lọc

- Tế bào vi sinh vật thường chứa một lượng đáng kể protein dao động trong khoảng từ 40 đến 80%, tùy thuộc vào điều kiện nuôi cấy và chủng vi sinh vật Ví dụ: ở E coli trung bình 6,9 amino acid được tổng hợp trong 1 giây

- Nhiều protein sử dụng trong công nghiệp được thu nhận từ các chủng vi sinh vật tuyển chọn lọc Chúng đều là vi sinh vật an toàn GRAS Phổ biến là vi khuẩn Bacillus subtilis, lactobacilli, streptomyces Một số loài nấm mốc như Aspergillus, penicillium, Mucor và nấm men Saccharomyces cerevisiae Một số protein dược dụng tạo bởi vi sinh vật chọn lọc như, Streptokinase từ Haemolytic streptococci, Staphylokinase từ Staphylococcus aureus làm tan máu đông dùng trong chữa bệnh đột quỵ

- Nhiều protein thu nhận trong lên men là protein ngoại bào được nuôi cấy tiết thẳng vào môi trường, do đó làm đơn giản hóa quy trình công nghệ và giảm giá thành sản xuất Điển hình như amylase và protease do bacilli và cellulase do nấm Trichoderma veridiae tiết ra

- Đối với protein nội bào, phải tách riêng tế bào khỏi dịch nuôi cấy, sau đó phá vỡ

tế bào, thu nhận dịch protein thô Điển hình là penicilin acylase và glucoisomerase

2 Protein dược dụng từ thực vật

Thực vật vẫn chưa được coi là nguồn cung cấp protein dược dụng có triển vọng, hiện chỉ tập trung vào tạo nguồn protein dược dụng tái tổ hợp từ thực vật Người ta chú ý đến sản xuất protein tái tổ hợp trong lục lạp thể, ty thể và ở hạt

3 Protein dược dụng từ động vật

- Protein dược dụng thu từ máu đáng kể nhất là insulin và protein máu, tuy nhiên

có hạn chế là dễ lây bệnh truyền nhiễm như nhiễm HIV hay bệnh bò điên BSE…,

do virus động vật dễ lây cho người

+ Tạo sinh phẩm dược dụng từ máu

Sinh phẩm protein dược dụng thường được chiếc tách và tinh sạch từ khoảng 5.000 kg huyết tương, tương ứng với khoảng 20.000 người cho máu Sau khi rã đông, bổ sung ethanol và điều chỉnh pH, nhiệt độ Lọc và ly tâm để tách các nhóm

tế bào (hồng cầu, tiểu cầu…) Sau đó tinh sạch và bất hoạt virus Một số protein điển hình: protein làm đông máu, protein chống đông máu, protein làm tan máu đông

+ Nuôi cấy tế bào động vật

Là nguồn cung cấp kháng thể đơn dòng, vaccine và interferon protein điều hòa miễn dịch Nuôi cấy tế bào động vật có triển vọng trong nuôi trồng thịt không cần đến động vật

Nuôi cấy tế bào CHO K1 siêu sản xuất kháng thể đơn dòng IgG1, công nghệ tạo vaccine của Nanogen cũng ứng dụng phương pháp này

Nuôi cấy tế bào động vật còn sử dụng để tạo tạng thay thế nhờ kỹ thuật 3D biopringting, nguồn tạng ghép có thể từ: người hiến, tế bào gốc, từ heo chuyển gen

+ Nguồn protein từ động vật chuyển gen

Tập trung vào tạo protein tuyến sữa, vì protein tái tổ hợp sau khi được tổng hợp sẽ được tiết thẳng vào sữa, vì không ảnh hưởng đến sức khỏe của động vật Thông thường người ta vi tiêm trực tiếp DNA tái tổ hợp vào trứng, cho trứng thụ tinh và chuyển phôi vào dạ con của động vật chửa đẻ hộ để phát triển thành động vật chuyển gene

Lần đầu tiên 7/1/2022 đã ghép tim của heo chuyển gene cho bệnh nhân ở Mỹ, đến ngày 7/3/2022 bệnh nhân chết

4 Sản xuất sinh phẩm protein tái tổ hợp

Trước năm 80, protein hay peptide dược dụng được thu nhận tự nhiên từ cơ thể hoặc tế bào động vật và do vậy giá thành rất cao vì những lý do sau:

* Có rất ít trong mô động vật

* Một số protein như hormone tăng trưởng, insulin… ở động vật không giống hoàn toàn ở người

* Thu nhận protein dược dụng từ động vật thường kèm theo nhiễm virus hoặc DNA virus

Năm 1963 đã thành công tổng hợp hóa học insulin, tuy nhiên sản xuất bằng cách này rất phức tạp, đắt tiền và không thể triển khai ở mức độ công nghiệp

Sự ra đời của kỹ thuật DNA tái tổ hợp tạo protein tái tổ hợp cho phép tạo số lượng lớn r-protein an toàn sinh học Thị trường r-protein tăng nhanh, dự kiến sẽ đạt 337,,68 tỷ USD vào năm 2026

Để tạo số lượng lớn r-protein trong tế bào chủ, người ta phải thiết kế hệ plasmid

có khả năng điều hòa để tạo số lượng lớn r-protein đích

5 Tạo nguồn bằng cách cải biến protein

Trong tự nhiên, phân tử protein sau khi được tạo thành trong tế bào sẽ được cải biến theo khá nhiều cách khác nhau, protein thu nhận ngoài cơ thể sống phải được cải biến nhằm nâng cấp giá trị sử dụng của protein

Trong công nghệ, hiện phổ biến cải biến protein bằng hóa học và enzyme hoặc bằng kỹ thuật protein

* Cải biến protein bằng hóa học và enzyme

Là cải biến hoặc thay thế một vài thứ tự amino acid trong phân tử protein nhằm nâng cấp giá trị sử dụng Ví dụ bổ sung Zn vào dịch insulin làm tăng tính ổn định thuốc tim trong máu Cải biến protein bằng enzyme trong cải biến insulin heo thành insulin người

* Kỹ thuật protein

Là cải biến protein thông qua thay thế amino acid của protein bằng phương pháp sinh học phân tử, chủ yếu bằng kỹ thuật tạo đột biến điểm định hướng

Cải biến và nâng cấp protein chịu được điều kiện cực đoan về pH, nhiệt độ, dung môi hữu cơ…theo một số cách tiếp cận sau:

+ Tạo bổ sung liên kết -S-S-: cấu trúc bền hơn

+ Thay Asn bằng amino acid khác

+ Giảm số lượng nhóm -SH tự do

+ Tăng hoạt lực enzyme

+ Thay đổi tính đặc hiệu của enzyme

Câu 2: Trình bày chức năng sinh học của peptide ở cơ thể người Cho vd chứng minh dựa vào sự hiện diện các peptide có mặt trong sơ đồ? Trình bày các bước tổng hợp hóa học peptide cho vị ngon trên solid phase: Lys-Gly-Asp-Glu-Ser-Leu-Ala Nêu các lý do hoạt chất peptide chủ yếu được tạo ra bằng tổng hợp hóa học?

- Chức năng sinh học của peptide ở cơ thể người: hai chức năng quan trọng nhất bảo vệ và điều hòa

+ Peptide điều hòa gồm neuro peptide, peptide điều hòa và peptide hormone + Peptide bảo vệ luôn có cơ quan tiếp xúc trực tiếp với môi trường xung quanh như da, bề mặt, niêm mạc: peptide độc tố và kháng độc tố, peptide kháng sinh và peptide alkaloid

- Vd chứng minh: Glutathione là một peptide bảo vệ được gan tổng hợp từ

glutamate, cysteine và glycine trong 2 bước được xúc tác bởi các enzyme

glutamate cysteine ligase và glutathione synthetase Peptide này có khả năng diệt các gốc oxit tự do trong cơ thể từ đó giúp chống lão hóa da đồng thời đào thải độc

tố gây hại đến cơ thể người Ngoài ra chúng còn ngăn chặn các bức xạ tiếp xúc gây ảnh hưởng đến da, cơ thể

- Các bước tổng hợp hóa học peptide cho vị ngon (Lys-Gly-Asp-Glu-Ser-Leu-Ala) trên solid phase:

1 Gắn nhóm hoạt hóa carboxyl lên polymer

2 Gắn đầu C của amino acid có đầu N được bảo vệ bằng nhóm Boc lên hạt

polymer qua phản ứng Ester hóa

3 Bỏ nhóm bảo vệ Boc

4 Trùng ngưng với amino acid thứ 2 có đầu C được hoạt hóa

5 Kéo dài sợi peptide (lần lượt lặp lại bước 3 và 4)

6 Loại bỏ nhóm Boc và hạt polymer; thu nhận, tinh sạch và phân tích peptide

- Các lý do hoạt chất peptide chủ yếu được tạo ra bằng tổng hợp hóa học:

+ Đơn giản hơn các phương pháp sinh học, đặc biệt đối với tổng hợp peptide mạch ngắn

+ Có thể dễ dàng điều chỉnh peptide mang lại hoạt tính tốt hơn đồng thời giảm thiểu những tác dụng không mong muốn

+ Dễ tinh sạch, tổng hợp nhanh với số lượng lớn, tiết kiệm chi phí.

Câu 3: Sản xuất insulin trị đái tháo đường: công nghệ sản xuất thuốc insulin: công nghệ truyền thống, cải biến insulin, r-insulin Tạo thuốc insulin.

Insulin là hormone polypeptide được tuyến tụy tạo, đóng vai trò giảm đường huyết Insulin được cô lập lần đầu vào năm 1921 Thứ tự amino acid của nó được xác định vào những năm 1950

1 Bệnh đái tháo đường

Tổng hợp thiếu insulin trong tuyến tụy là nguyên nhân gây bệnh đái tháo đường mãn tính type I và type II với biểu hiện là gia tăng hàm lượng glucose trong máu

và nước tiểu Hiện có khoảng 12 triệu người bị bệnh này làm chết trung bình hàng năm khoảng 600.000 người Nguyên nhân là do rối loạn hệ thần kinh nội tiết, nhiễm virus, do di truyền và phương thức hoạt động sống của con người

2 Công nghệ sản xuất insulin

- Công nghệ sản xuất insulin truyền thống

Ban đầu sử dụng trực tiếp dịch insulin thô từ tụy heo còn chứa tạp chất là một số dẫn xuất insulin, hình thành trong quá trình chiết tách acid-alcohol Dịch insulin nói trên còn chứa proinsulin và peptide màng ruột, somatostatin, glucagon…làm giảm tác dụng của thuốc, đôi khi gây sốc thuốc Điều này rất bất lợi, vì bệnh nhân đái tháo đường thường phải được tiêm liên tục insulin Chế phẩm insulin chủ yếu thu nhận từ bò và heo Do vậy vấn đề tinh chế insulin có một ý nghĩa rất quan trọng

- Cải biến insulin

Năm 1970 thuốc insulin người được cải biến bán tổng hợp từ insulin heo nhờ enzyme Insulin người và heo khác nhau ở vị trí amino acid thứ 30 sơi B, ở người

là Thr, còn ở heo là Ala Dùng enzyme trypsin cắt liên kết peptide 22-23 của sợ B tạo octapeptide Ghép octapeptide tổng hợp hóa học có đuôi là Thr thế vào chỗ Ala tạo ra insulin người

- Sản xuất insulin tái tổ hợp

r-Insulin là sản phẩm r-protein ứng dụng đầu tiên, được tạo ở mức độ không hạn chế, không phụ thuộc vào lượng cung cấp mô tụy từ lò mổ r-Insulin người đầu

tiên nhận được bằng cách ghép plasmid chứa thứ tự DNA (gen) dựa vào thứ tự amino acid năm 1985 để suy ra gen mã hóa sợi A và B insulin vào 2 dòng E coli (dòng K12), lên men thu sinh khối E coli sau đó phá vỡ tế bào E coli thu sợi A và

B Sợi A và B sau đó được tinh sạch Trộn 2 sợi với nhau và tạo điều kiện để tạo liên kết

-S-S-3 Tạo thuốc tiêm insulin

Bình thường sau khi tiêm vào máu, insulin có thời gian bán sống tính bằng phút, hiệu quả chữa bệnh sẽ rất thấp, do vậy phải tìm cách kéo dài tuổi thọ của insulin sau khi tiêm Tạo phức insulin với protamine, tạo huyền phù Zn-insulin Những cải biến này cho phép kéo dài tuổi thọ của insulin sau khi tiêm đến khoảng 36h

Câu 4: Trình bày sơ đồ nguyên tắc chung thu nhận và tinh sạch protein Tạo sản phẩm protein thô, tạo sản phẩm protein tinh

Gồm 3 giai đoạn: Giai đoạn chuẩn bị (Upstream processing), giai đoạn lên men, giai

đoạn thu nhận và tinh sạch protein (Downstream processing).

- Tạo sản phẩm protein thô:

+ Tách sinh khối tế bào từ dịch nuôi cấy: dùng phương pháp lọc trống quay chân không, lọc màng (lọc đường cụt, lọc tiếp tuyến), thổi khí, điện phân.

+ Phá tế bào thu dịch protein thô: dùng phương pháp hóa học, dùng enzyme (lysozyme

từ lòng trắng trứng), phương pháp cơ học (siêu âm, nghiền tốc độ cao kết hợp khuấy trộn với hạt thủy tinh tạo lực cắt phá tế bào, giảm đột ngột áp suất hoặc tạo va đập)

+ Thu nhận protein từ dịch protein thô: tủa bằng dung môi hữu cơ (cồn hay acetone), muối (NH 4 ) 2 SO 4 (amoni sulfate); cô dịch protein thô và tách phân đoạn protein bằng siêu lọc hay lọc ngang Sau đó hòa tan tủa tạo dung dịch protein đậm đặc Ngoài ra có thể tách protein dạng tan và không tan bằng hệ chiết lỏng – lỏng.

+ Tách nucleic acid và lipid: tạo tủa nucleic acid hoặc xử lý nuclease Để tạo tủa DNA

và RNA dùng cationit polyethyle nenimine Cắt nucleic acid bằng nuclease, tách lipid khỏi dịch protein bằng cách cho dịch protein chạy qua cột nhồi vải hoặc bông thủy tinh

có độ xốp nhỏ để giữ lipid trong cột.

- Tạo sản phẩm protein tinh:

+ Ở phòng thí nghiệm: phá tế bào bằng siêu âm hoặc lysozyme và ly tâm tách từng mẻ + Ở quy mô sản xuất công nghiệp: phá tế bào bằng máy, lọc tiếp tuyến hay ly tâm liên lục

+ Tinh sạch bằng sắc ký: sắc ký ái lực, sắc ký trao đổi ion (thông dụng nhất), sắc ký kỵ nước và sắc ký lọc gel

+ Bằng đông khô: dùng trong sản xuất protein dược dụng, kết hợp dịch protein tinh + phụ gia được cấp đông đến -40 o C đến -70 o C để tránh tạo bọt Sau đó cho bốc hơi nước từ trạng thái đóng băng trong chân không thấp.

+ Sử dụng điện di để đánh giá độ tinh sạch và xác định trọng lượng protein Có 2 kiểu điện di: điện di 1 chiều phân tách protein theo khác biệt MW (molecular weight), hình dạng và điện tích Điện di theo điểm đẳng điện (IFF) Điện di 2 chiều kết hợp điện di 1 chiều và điện di theo điểm đẳng điện.

Câu 5: Hiện trạng sử dụng sinh phẩm protein

Chế phẩm protein được sử dụng trong nhiều lĩnh vực khác nhau, nhưng chủ yếu tập trung vào ứng dụng trong y học (thuốc trị bệnh và phân tích, chuẩn đoán bệnh), trong công nghiệp thực phẩm (enzyme và protein không phải là enzyme) và nông nghiệp (thuốc chữa bệnh, kit chuẩn đoán bệnh và enzyme trong chăn nuôi)

Kháng thể đa dòng đã được sử dụng từ lâu trong điều trị Đó là các kháng huyết thanh được sản xuất ở động vật và tách từ máu người Hiện kháng thể đơn dòng chiếm ưu thế Hiện 18 kháng thể đơn dòng đã được phép sử dụng và hơn 90 loại kháng thể đơn dòng khác đang được thử nghiệm lâm sàng

- Ứng dụng của thuốc enzyme

Khá nhiều enzyme hiện đang được sử dụng trong trị liệu: Ancrod (một loại protease nhóm serine), PA, urrokinase làm thuốc kháng đông máu; Factor VII và

IX làm tan máu đông; Asparaginase xử lý một số bệnh ung thư Ngoài ra còn có enzyme nuclease ứng dụng chữa bệnh di truyền u nang

Điển hình là các hormone insulin, glucagon, hormone tăng trưởng người, gonadotrophin và erythropoietin Hiện các sản phẩm đang được thương mại hóa

- Ứng dụng interferon, interleukin và các yếu tố điều hòa miễn dịch

Interferon và interleukin là nhóm phân tử tác động giống hormone gọi chung là cytokine được tạo bởi tế bào leukocyte (bạch cầu) của hệ miễn dịch Tác động điều hòa của cytokine rất phức tạp và được coi là yếu tố điều hòa bổ sung Điển hình là interferon, interleukin và yếu tố làm tan khối u TNF

Emzyme và kháng thể hiện được sử dụng và phân tích các chất trao đổi Trong đó

2 enzyne phosphate kiềm và peroxidase là 2 enzyme được cố định trên kháng thể đơn dòng và xúc tác tạo phản ứng trên test-elisa

Là nhóm thiết bị phân tích trao đổi metabolite, biosenor-enzyme hiện đã được sử dụng khá phổ biến trong chuẩn đoán bệnh phẩm và thực phẩm Enzyme sử dụng trong biosenor được nhốt trong cấu trúc màng nằm trong điện cực màng Ngoài enzyme, kháng thể đơn dòng, DNA và thậm chí tế bào sống cũng được sử dụng làm biosensor