nhân giống vô tính in vitro lan dendrobium sp và khảo sát sự thành lập cụm chồi trên môi trường lỏng giá thể cầu giấy lọc

Sinh viên thực hiện :Nguyễn Quốc Phong Trang 13 1970, sau đó giới thiệu ra thị trường thế giới một loạt các giống lai mới với giá thấp, nhờ khả năng thực hiện các công nghệ mới trong cấy

Trang 1

KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC   

Đề tài:

NHÂN GIỐNG VÔ TÍNH IN VITRO LAN

DENDROBIUM SP VÀ KHẢO SÁT SỰ THÀNH LẬP

CỤM CHỒI TRÊN MÔI TRƯỜNG LỎNG GIÁ THỂ CẦU GIẤY LỌC

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP CỬ NHÂN KHOA HỌC CHUYÊN NGÀNH CNSH THỰC VẬT

GIÁO VIÊN HƯỚNG DẪN : Th.S TRẦN TRUNG HIẾU SINH VIÊN THỰC HIỆN : NGUYỄN QUỐC PHONG

Thành phố Hồ Chí Minh, tháng 11/2004

Trang 2

Sinh viên thực hiện :Nguyễn Quốc Phong Trang 2

LỜI CÁM ƠN

Sau thời gian học tập và rèn luỵên tại trường Đại Học Mở Bán Công thành Phố Hồ Chí Minh Đến nay tôi đã hoàn thành trương trình học và luận văn tốt nghiệp

Tôi xin chân thành cảm ơn Ban giám hiệu trường Đại Học Mở Bán Công Xin chân thành cảm ơn quý thầy cô khoa Công Nghệ Sinh Học trường Đại Học Mở Bán Công đã tận tình hướng dẫn tôi trong suốt khoá học 2000 – 2004

Xin cảm ơn Thạc sĩ Nguyễn Thanh Mai và các cán bộ, nhân viên phòng thí nghiệm thuộc khoa Công Nghệ Sinh Học trường Đại Học Mở Bán Công đã tạo điều kiện thuận lợi cho tôi hoàn thành luận văn tốt nghiệp này

Xin cảm ơn Th.S.Lương Thị Mỹ Ngân, giảng viên bộ môn Công Nghệ Sinh Học Trường Đại Học Khoa Học Tự Nhiên Tp Hồ Chí Minh đã nhiệt tình giúp đỡ tôi trong học tập nghiên cứu và thực hiện đề tài luận văn tốt nghiệp này

Chân thành cảm ơn Th.S.Trần Trung Hiếu, giảng viên bộ môn Công Nghệ Sinh Học Trường Đại Học Khoa Học Tự Nhiên Tp Hồ Chí Minh đã trực tiếp giúp đỡ tôi trong học tập nghiên cứu và thực hiện đề tài luận văn tốt nghiệp này

Cuối cùng con xin kính gởi lời biết ơn sâu sắc đến Cha Mẹ cùng tất cả người thân trong gia đình đã hết lòng chăm lo và ủng hộ con trong suốt thời gian học tập

Trang 3

Trang

PHẦN 1 - MỞ ĐẦU 6

PHẦN 2 - TỔNG QUAN TÀI LIỆU. 8

1 NGUỒN GỐC VÀ SỰ PHÂN BỐ 8

2 GIÁ TRỊ KINH TẾ CỦA DENDROBIUM SP 10

2.1 Trong nước 10

2.2 Ngoài nước 11

3 ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC CỦA DENDROBIUM SP 14

3.1 Các giai đoạn phát triển 14

3.1.1 Giai đoạn nẩy mầm 14

3.1.2 Giai đoạn cây con 15

3.1.3 Giai đoạn trưởng thành .15

3.1.4 Giai đoạn ra hoa 15

3.2 Đặc điểm phân loại 16

3.2.1 Dựa vào hình dạng giả hành 16

3.2.2 Dựa vào hình dạng hoa 19

4 CÁC ĐIỀU KIỆN CƠ BẢN ĐỂ NUÔI TRỒNG DENDROBIUM SP 22

4.6 Thay chậu, giá thể và tách chiết 27

4.7 Sâu bệnh và các vấn đề khác 29

4.8 Nhu cầu phân bón 30

5 PHƯƠNG PHÁP NUÔI CẤY MÔ DENDROBIUM SP 33

6 CÁC NGHIÊN CỨU VỀ NHÂN GIỐNG IN VITRO CÂY LAN 35

7 HỆ THỐNG GIÁ THỂ (SUPPORT SYSTEMS) ĐƯỢC SỬ DỤNG TRONG NUÔI CẤY IN VITRO MÔ THỰC VẬT 38

8 HIỆN TƯỢNG THUỶ TINH THỂ (VITRIFICATION) TRONG NUÔI CẤY MÔ THỰC VẬT 41

PHẦN 3 – VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 43

1.VẬT LIỆU VÀ ĐIỀU KIỆN THÍ NGHIỆM 43

a) Địa điểm thí nghiệm 43

b) Mẫu cấy 43

c) Môi trường nuôi cấy 44

d) Điều kiện thí nghiệm 44

Trang 4

2 PHƯƠNG PHÁP THÍ NGHIỆM 46

a) Thí nghiệm 1: Khảo sát sự tăng trưởng của chồi trên môi trường KD lỏng với giá thể là cầu giấy lọc 46

b) Thí nghiệm 2: Khảo sát sự ảnh hưởng của khoáng đa lượng và vi lượng của môi trường KD lỏng lên sự tăng trưởng của lan 47

c) Thí nghiệm 3: Ảnh hưởng của nồng độ BA lên sự hình thành cụm chồi từ chồi bên 48

d) Thí nghiệm 4: So sánh sự thành lập cụm chồi từ chồi bên trên môi trường lỏng giá thể là cầu giấy và môi trường giá thể agar 48

e) Thí nghiệm 5: Ảnh hưởng của BA kết hợp với NAA lên sự tạo lập cụm chồi từ chồi bên trên môi trường lỏng với giá thể là cầu giấy lọc 49

f) Thí nghiệm 6: Khảo sát sự ảnh hưởng của Vitamin B1 lên sự hình thành rễ trên môi trường KD rắn với giá thể là agar 50

g) Thí nghiệm 7 : Sự phát triển cây con ra vườn ươm 51

PHẦN 4 – KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN 53

PHẦN 5 – KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 55

PHẦN 6 – TÀI LIỆU THAM KHẢO 69

PHỤ LỤC 70

Trang 5

CÁC KÝ HIỆU VIẾT TẮT

NAA : α-naphthyl axetic acid

mg/l : Nồng độ chất tan tính bằng mg chứa trong 1 lít dung dịch g/l : Nồng độ chất tan tính bằng gram chứa trong 1 lít dung dịch atm : Đơn vị đo áp suất tính bằng atmosphere

mm : Đơn vị đo chiều dài tính bằng milimetre M : Giá trị trung bình

CV% : Coefficient of Variation Độ biến động tính bằng %

LSD (0,05) : Least Significant Difference Test Độ sai biệt nhỏ nhất có ý nghĩa ở mức độ tin cậy 0,05

Trang 6

Phần 1 :

MỞ ĐẦU

Việt Nam là một quốc gia thuộc vùng khí hậu nhiệt đới thích hợp cho sự

phát triển của nhiều loại phong lan Đặc biệt đối với nhóm Dendrobium là nhóm

lan chịu nhiệt thích ứng với nhiệt độ hơn 200C (Arditti J & R Ernst, 1992) Đây là nhóm lan có hoa to trung bình, hoa bền từ 7-10 ngày rất thích hợp cho việc cắt cành (Pages,1971)

Đất nước chúng ta được thiên nhiên ưu đãi về địa lý, khí hậu cũng như nhiệt độ, ẩm độ và ánh sáng, rất thích hợp với việc trồng phong lan Rừng của chúng ta là một trung tâm có nhiều loài phong lan quí như Ngọc Điểm, Kim Điệp, Long Tu, Thủy Tiên, Hỏa Hoàng, Ý Thảo.v.v với nhiều màu sắc rực rỡ, đa dạng Trong khoảng 600 loài lan nhiệt đới, các nhà nuôi trồng đã chọn lọc được hơn 50 loài nhưng chỉ một số không nhiều thu hút được sự chú ý và hấp dẫn đầu tư phát triển chủ yếu dựa trên giá trị thương mại và khả năng lai giống tốt Phải

kể đến : Cattleya, Cymbidium, Dendrobium, Lycaste, Miltonia, Oncidium,

Odontoglosum, Paphiopedium, Phalaenopsis và các loài Vanda [8, 9]

Từ xưa trong dân gian đã xuất hiện việc nhân giống và nuôi trồng phong

lan Nhóm Dendrobium có khá nhiều loài cây đẹp như Thái Bình, Long Tu, Thuỷ

Tiên,… chủ yếu là khai thác ở rừng, phương thức nhân giống truyền thống bằng kỹ thuật tách chiết nên hệ số nhân còn rất thấp Phong lan cho trái, nhưng trong môi trường tự nhiên tỷ lệ nẩy mầm rất thấp Với công nghệ nhân giống hiện nay, từ một cá thể ban đầu có thể tạo ra vài ngàn đến một triệu cây con

Thị trường phong lan ngày nay đã trở thành một mặt hàng lớn trên quốc tế, thu được nhiều ngoại tệ Ở các nước phát triển như Anh, Mỹ, Đức, Ý, Nhật,

Trang 7

Bỉ, Hà Lan, Na Uy, Phần Lan, Singapore, Hồng Kông v.v đều nhập khẩu rất nhiều hoa phong lan Thái Lan là nước xuất khẩu phong lan nhiều nhất ở Đông Nam Á Việt Nam chúng ta cũng có nhiều triển vọng kinh doanh xuất khẩu hoa phong lan Phong trào chơi lan ở thành phố Hồ Chí Minh trong những năm gần đây phát triển rất mạnh, không những nuôi trồng phong lan trong nước mà còn nhập về các giống lan ngoại để cấy mô nhân giống và nhằm đáp ứng nhu cầu của người tiêu dùng [13]

Ngày nay, với đà phát triển chung của xã hội, nhu cầu thưởng ngoạn những cây có hương hoa đặc sắc, có hình dáng kỳ lạ vẫn không ngừng ngày một tăng cao Để giải quyết những nhu cầu thực tế đó, vấn đề cây giống chính là mối quan tâm hàng đầu và cấp bách hơn cả Nhất là nguồn cây giống đồng đều, sạch bệnh với số lượng lớn và chỉ trong một thời gian ngắn Sự tiến bộ về khoa học tạo giống đã đáp ứng được những yêu cầu đó thông qua con đường nuôi cấy mô Bằng phương pháp nuôi cấy mô, hàng loạt cây trồng mang phẩm chất tốt đã được tạo ra chỉ từ những sinh mô ban đầu Với những điều kiện ứng dụng thực tế đó và với mong muốn hoàn thiện dần từng bước quy trình nuôi cấy mô cho cây cảnh, chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài :

Nhân giống vô tính in-vitro lan Dendrobium sp và khảo sát sự thành

lập cụm chồi trên môi trường lỏng với giá thể là cầu giấy lọc trong hộp nhựa 500ml và chai thuỷ tinh 250ml

Trong quá trình thực hiện do khả năng, điều kiện, trình độ có hạn nên đề tài không thể tránh khỏi những thiếu sót, rất mong nhận được sự đóng góp của quý thầy cô và các ý kiến đóng góp từ độc giả

Trang 8

Phần 2 :

TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1 Nguồn gốc và sự phân bố:

Theo nhà thực vật học A L Takhtajan (1980), lan Dendrobium được xếp

vào:

* Ngành hạt kín: Magnoliophyta

* Lớp một lá mầm: Liliopsida (Monocotyledones) * Phân lớp hành: Liliidae

* Bộ lan: Orchidales * Họ lan: Orchidaceae

* Giống: Dendrobium [1,18]

Hình 1.Dendrobium toboense

Lan rừng có ở nhiều nước trên thế giới : Việt Nam, Thái Lan, Malayxia, Brazil Trên khắp trái đất, hầu như nơi nào có thực vật là có phong lan, nhưng số lượng nhiều ít khác nhau rất lớn liên quan mật thiết đến độ cao [9]

Theo cuốn “Flore générale de L’Indochine” của Le Comte thì nước Việt Nam có số lượng lan rất đa dạng, có trên 634 loài phong lan quí Trong cuốn

Trang 9

“Phong lan Việt Nam” của Trần Hợp thì có 750 chi và 25.000 loại lan rừng Cho tới nay thì số lượng lan được lai tạo hơn 100.000 loại [6]

Dendrobium sp rất phong phú về chủng loại, có rất nhiều loài trong họ Orchidaceae, gồm hơn 1600 loài Phân bố trên các vùng thuộc châu Á nhiệt đới,

tập trung nhiều nhất ở Đông Nam Á và Úc châu Người ta thấy Dendrobium ở

các hải đảo trên Thái Bình Dương đến Hy mã lạp sơn, từ Philippines đến Fidgi, đương nhiên là có cả ở Việt Nam Nếu như các nước Nam Mỹ tự hào về các loài

thuộc giống Cattleya tuyệt đẹp, thì các nước Đông Nam Á cũng hãnh diện vì có giống Dendrobium vô cùng phong phú [7]

Dendrobium là giống lan sống bám trên cây khác cho nên ngay cái tên

khoa học của nó cũng đã có nghĩa như vậy (tiếng Hy lạp dendro là cây, bios là

sống và được hiểu là giống lan “sống trên cây”) [9]

Điều kiện sinh thái cũng rất đa dạng, có nhiều loài chỉ mọc và ra hoa ở vùng lạnh, có loài ở vùng nóng, có loài trung gian Cũng có loài thích nghi với bất cứ điều kiện khí hậu nào [7]

Căn cứ vào nhu cầu nhiệt độ, ta chia lan ra ba nhóm :

▪ Nhóm ưa nóng : chịu nhiệt độ ban ngày không dưới 21oC, ban đêm không dưới 18,5oC Chúng thường ở vùng nhiệt đới

▪ Nhóm ưa lạnh : chịu nhiệt độ ban ngày không quá 14oC, ban đêm không quá 13oC Chúng thường ở vùng hàn đới, ôn đới và các chỏm núi cao vùng nhiệt đới

▪ Nhóm chịu nhiệt độ trung bình : thích hợp với nhiệt độ ban ngày không dưới 14,5oC, ban đêm không dưới 13,5oC

Trang 10

Căn cứ vào cách sống của các loài thuộc giống Dendrobinum có thể chia ra làm hai dạng chính : Dạng thòng (nobile) và dạng đứng (phalaenopsis)

Các loài Dendrobinum dạng thòng đòi hỏi nhiệt độ thấp và kết quả lai giống ít tiến bộ Do vậy, nhiều nhà chơi hoa lan ở thành phố ưa thích các loài

Dendrobinum dạng đứng hơn vì chúng thích điều kiện khí hậu nóng ẩm nên dễ

nuôi cấy thành công, nhiều cây lai phong phú và đa dạng Cả hai dạng đều sống với điều kiện nhiều ánh sáng [7]

2 Giá trị kinh tế của Dendrobium sp :

2.1) Trong nước :

Dendrobium là giống phong lan được trồng và mua bán khá phổ biến ở

thành phố và các tỉnh Nam bộ không chỉ bởi chúng đẹp, phong phú mà chúng còn đa dạng về chủng loại, kiểu dáng, màu sắc và những đặc tính sinh học của

chúng khá phù hợp với khí hậu, thời tiết của miền Nam nước ta Dendrobium

trồng tại thành phố Hồ Chí Minh và các tỉnh lân cận có khả năng cung cấp nội địa khoảng vài chục nghìn cành/1năm Tại những điểm bán lan, mỗi giò

Dendrobium có giá từ 30.000 -50.000đ Nhưng nếu được chăm sóc kỹ, những giò

phong lan này vẫn có thể phát triển tốt trong ba đến bốn năm, và cho ra hoa mỗi năm 2- 3 lần, với năm đến bảy vòi bông nở rộ, nâng giá trị cây lan lên vài trăm nghìn đồng Nhưng số lượng hoa lan cắt cành nhiều khi vẫn không cung cấp đủ cho các ngày lễ lớn ở Việt Nam như các ngày 20 - 11, ngày 8 - 3, ngày 14 - 2, Tết nguyên đán làm cho giá thành trong những ngày đó tăng đột biến [10 ]

Nếu tính đến việc xuất khẩu thì phải trồng cây bằng đường nuôi cấy mô và gieo hạt ngay từ bây giờ, khoảng vài trăm ngàn cây trong một năm, 5 năm sau triển vọng xuất khẩu sẽ thành hiện thực Khí hậu ở Việt Nam cũng giống

Trang 11

như Thái Lan, tùy theo từng vùng phù hợp mà ta phát triển từng loài lan Hiện nay ở thành phố Hồ Chí Minh, Bảo Lộc và các tỉnh lân cận đã trồng thành công

và cho kết quả tốt với các loài Dendrobium dạng đứng [10]

Chương trình trồng lan có thể triển khai ở các vùng nông thôn, ngay cả những vùng đất xấu và đồi núi vừa tạo thu nhập vừa xây dựng lối sống văn hóa yêu thích vẻ đẹp thiên nhiên Quan trọng phải có một mô hình canh tác cụ thể gồm kỹ thuật trồng trọt, chăm sóc, thu hoạch và bảo quản [13 ]

2.2) Ngoài nước:

Dendrobium dạng đứng được trồng tập trung ở Hawaii trên một diện tích

khoảng 25 hecta Năm 1993 thu hoạch khoảng 3,5 triệu cành, trị giá 2,7 triệu USD

Nhu cầu nhập hoa Dendrobium tươi cắt cành ở Hoa Kỳ ngày càng tăng

Từ năm 1990 đến 1994, từ 15,3 triệu cành tăng lên 23,2 triệu cành Giá trị nhập

khẩu hoa lan tăng lên chủ yếu là do tăng số lượng nhập khẩu lan Dendrobium Thái Lan là nước sản xuất Dendrobium cắt cành lớn nhất thế giới, đồng

thời cũng là nhà cung cấp lớn nhất cho thị trường Hoa Kỳ, chiếm khoảng 97%

hoa lan cắt cành nhập khẩu Hoa Kỳ nhập Dendrobium Thái Lan từ 8,6 triệu

cành trong năm 1990 lên đến 16,4 triệu cành năm 1994 Singapore là nhà cung cấp lớn thứ hai trong năm 1994 với 289.000 cành, tiếp đến là Jamaica cung cấp 44.611 cành, New Zealand cung cấp 37.342 cành và Costa Rica cung cấp 23.660 cành Thái Lan xuất sản phẩm đều đặn nhất, từ tháng 2 đến tháng 6 cung cấp khoảng 1,5 triệu cành / tháng, các tháng còn lại từ 700.000 đến 1 triệu cành / tháng.[13]

Trang 12

Giá lan cắt cành ở thị trường Mỹ rất ổn định Dendrobium từ Hawaii là 1,88USD/ cành và Phalaenopsis đến từ Thái Lan 2,50 – 3,38 USD / cành

Hà Lan là quốc gia duy nhất ở Châu Âu có công nghiệp trồng lan xuất khẩu Năm 1993, xuất 51,8 triệu cành Đức là nước nhập khẩu lớn nhất lan cắt cành từ Hà Lan, chiếm khoảng 50% số lượng, tiếp đến là Pháp, Ý, Bỉ, Thụy Sĩ và Áo

Năm quốc gia nhập khẩu lan cắt cành với số lượng lớn ở Châu Âu là Ý, Đức, Hà Lan, Pháp, Anh – 137,6 triệu cành trong năm 1993

Ý là nước nhập khẩu lan cắt cành nhiều nhất ở Châu Âu (75,3 triệu cành năm 1993) Nhập từ Thái Lan khoảng 64 triệu cành, Hà Lan khoảng 10 triệu cành, Singapore 750.000 cành và New Zealand 565.000 cành

Đức là nước nhập khẩu lan cắt cành lớn thứ 2 (29,7 triệu cành trong năm 1993) Nhập từ Hà Lan 16,6 triệu cành, từ Thái Lan 11,7 triệu cành và Singapore 996.000 cành

Hà Lan nhập khẩu 17,5 triệu cành năm 1993, trong đó Thái Lan cung cấp 81,4%, Singapore cung cấp 1,9 triệu cành, 227.000 cành từ New Zealand, 222.000 cành từ Nam Phi

Pháp nhập khẩu 8,1 triệu cành năm 1993, trong đó Hà Lan cung cấp 82,6%, Thái Lan cung cấp 1,3 triệu cành, Singapore cung cấp 42.948 cành và Malaysia cung cấp 12.480 cành

Anh nhập khẩu 7 triệu cành năm 1993, trong đó Thái Lan cung cấp 70,7%, tiếp đến là Hà Lan cung cấp 24%, nhập từ Singapore 123.000 cành

Thái Lan, nước sản xuất lan nhiệt đới cắt cành lớn nhất thế giới, hầu hết

là Dendrobium Đầu tiên là Dendrobium phalaenopsis, ở Pompadour vào năm

Trang 13

1970, sau đó giới thiệu ra thị trường thế giới một loạt các giống lai mới với giá thấp, nhờ khả năng thực hiện các công nghệ mới trong cấy mô và lai tạo Với giá lao động thấp, khí hậu tốt, việc vận chuyển thuận lợi cho phép sản xuất quanh năm

Singapore đã nỗ lực làm một bước đột phá trong công nghiệp hoa lan và đã thành công, xuất 3,8 triệu cành đến Châu Âu năm 1993, Singapore cũng xuất một số lượng khá lớn đến Nhật Bản

Nhật Bản sản xuất một số giống lan nhưng không đủ cung cấp cho thị trường nội địa Nhật Bản được đánh giá là nước nhập khẩu lan lớn nhất thế giới Khoảng 600 hecta đất ở Thái Lan, Singapore, Malaysia, và Indonesia trồng lan chỉ dành cho xuất khẩu đến Nhật Bản Nhật Bản nhập khẩu 5 triệu cành hoa lan cắt cành từ Thái Lan năm 1993 đạt trị giá 17,3 triệu USD, từ Hà Lan 596.000 cành, nhập từ Úc, New Zealand và Nam Phi Lan cắt cành nhập khẩu chủ yếu là

Dendrobium và Phaleanopsis

Đài Loan nhập khẩu 582.000 cành hoa lan từ Thái Lan năm 1993, đạt trị giá 1 triệu USD Hồng Kông nhập khẩu 1,1 triệu cành từ Thái Lan Nam Triều Tiên nhập khẩu 194.000 cành lan từ Thái Lan năm 1993, trị giá 612.000 USD.[17]

Trang 14

Hình 2 Sự đa dạng của lan Dendrobium

Hình 3 Công nghệ trồng lan Dendrobium cắt cành

3 Đặc điểm sinh học của Dendrobium sp :

3.1) Các giai đoạn phát triển : [ 6,7] 3.1.1 Giai đoạn nẩy mầm :

Vì hột lan quá nhỏ, không có chất dự trữ để sử dụng lúc nẩy mầm cho nên nó phải lấy thức ăn có sẵn do nấm cung cấp Vì vậy trong thiên nhiên hột lan chỉ nẩy mầm được khi có sự cộng sinh với nấm Ngày nay, người ta đã thay thế nấm bằng đường trong môi trường gieo hột Sau khi nẩy mầm và chỉ sau khi thành lập

Trang 15

được diệp lục tố ở lá, cây lan con mới có khả năng sử dụng CO2 để tổng hợp hydrat cacbon cần cho sự phát triển của nó qua hiện tượng quang tổng hợp Giai đoạn gieo hạt này được thực hiện trong các phòng nuôi cấy và nhân giống

3.1.2 Giai đoạn cây con :

Ở đây, tất cả nhu cầu cần thiết cho phản ứng quang tổng hợp xảy ra tốt nhất cần được quan tâm để cây lan con phát triển tốt Nước và muối khoáng được cung cấp trong môi trường nuôi cấy, ánh sáng của các bóng đèn dùng để thay thế ánh sáng của mặt trời Khi đã đưa cây con ra trồng bên ngoài thì các nhu cầu ấy gia tăng hơn nhưng không lớn hơn giai đoạn cây trưởng thành

3.1.3 Giai đoạn trưởng thành :

Từ cây con đến cây trưởng thành, cây lan đã tăng trưởng phát triển theo nhiều phương cách, trong đó ta chú ý đến hai phương cách phát triển chính là phát triển cộng trụ và phát triển độc trụ Giai đoạn này cây lan ra rễ, nhảy chồi, ra lá cho nên nhu cầu về ánh sáng, nhiệt độ, phân bón gia tăng, cao hơn giai đoạn cây con Đặc biệt, khi chuẩn bị ra hoa thì các nhu cầu ấy lại khắt khe và nghiêm ngặt hơn Giai đoạn chuẩn bị ra hoa (thời kỳ tượng hoa) xảy ra trước khi ta thấy các chồi hoa xuất hiện trên cây lan Mọi yếu tố tác động vào việc ra hoa phải được đáp ứng vào giai đoạn này nếu không thì chúng sẽ không có hoa

Cũng cần chú ý một hiện tượng khá quan trọng ở lan trong giai đoạn này là thời kỳ nghỉ Thời kỳ nghỉ có thể xảy ra rất ngắn (một hai ngày) hay có thể khá dài (một vài tháng) Thời kỳ ấy có thể xảy ra trước khi có hoa hay sau khi hoa tàn Thời kỳ nghỉ rất quan trọng trong đời sống của cây lan, nếu không được đáp ứng thì cây lan phát triển không tốt, có thể tàn lụi hoặc không ra hoa, nhất

là đối với phần lớn lan rừng

Trang 16

3.1.4 Giai đoạn ra hoa :

Các nhu cầu vào giai đoạn này cũng khác với giai đoạn trưởng thành Người ta gia tăng hàm lượng Bo để trái đậu có hột khoẻ Ánh sáng và nhiệt độ phải thấp xuống để hoa lâu tàn Thời gian ở mỗi giai đoạn thay đổi tùy theo

giống loài lan, ví dụ đối với Dendrobium, từ hột nẩy mầm đến cây con mất

khoảng 6 tháng, từ cây con đến khi trưởng thành có hoa phải mất khoảng 8 - 12 tháng, từ hoa đến trái và hột chín đủ khả năng nẩy mầm mất khoảng 3 - 6 tháng

3.2 Đặc điểm phân loại :[19,20]

Dendrobium sp được Olof Swartz đặt tên vào năm 1799, lúc đó chỉ có 6

loài, nay là giống lớn thứ nhì của họ lan với 1.600 loài nguyên thủy

3.2.1 Dựa vào hình dạng giả hành :

Hình dạng giả hành của Dendrobium rất biến thiên :

* Nhóm có giả hành rất dài và mang lá dọc theo chiều dài của giả hành ấy, thường rụng hết lá khi ra hoa Hoa thường chụm 2-3 cái dọc theo

chiều dài của giả hành Ví dụï: Long tu ( Dendrobium primulinum), Ý thảo (Dendrobium gratio sissimum ), Giả hạc (Dendrobium anosmum)…

* Nhóm có giả hành ngắn, to, tận cùng thường có 2-3 lá dài, bền, không rụng Phát hoa tập trung ở phần này tạo thành chùm, đứng hay

thòng.Ví du ï: Thủy tiên trắng (Dendrobium farmeri), Thủy tiên vàng (Dendrobium thyrsiflorum), Vẩy cá (Dendrobium lindleyi) …

Trang 17

Hình 6 Dendrobium farmeri Hình 7 Dendrobium caesar

Hình 4 Den.chlorostylum Hình 5 Dendrobium sulawesiense

* Nhóm có giả hành rất mảnh mai, dài hay ngắn, có lá dọc theo chiều dài của chúng, dai bền, không rụng Hoa thường cô độc ở nách lá

Hình 8 Dendrobium capilipes Hình 9 Dendrobium aggregatum

Trang 18

Như vậy đặc điểm của nhóm này tất cả đều phụ sinh, giả hành gồm nhiều hay ít lóng Hoa có màu trắng, vàng đến tím

Người ta thường chia ra hai nhóm:

(1) Dendrobium dạng thòng hay là kiểu có giả hành mềm mọc thòng,

thường ở vùng hơi lạnh như Đà Lạt

(2) Dendrobium dạng đứng là kiểu có giả hành cứng mọc đứng, thường ở

vùng nóng hơn

Hình 10 Dendrobium chryseum Hình 11 Dendrobium unicum

Cả Dendrobium dạng thòng và Dendrobium dạng đứng cho thấy có cùng

đặc điểm trong việc tạo lập các giả hành mới và trong sự biệt hóa các chồi sơ khởi ở nách lá dọc theo giả hành Nhưng chúng lại rất khác biệt trong việc tạo chồi hoa

Ở Dendrobium dạng thòng ra hoa từ chồi sơ khởi của giả hành đã trưởng

thành Sự bắt đầu ra nụ hoa hình như có sự liên hệ tới sự trưởng thành của giả hành Các giả hành mới mọc ra trong năm nằm yên hoặc ngủ cho tới khi thuận lợi mới ra hoa Như ở Long tu, Giả hạc chúng chỉ ra hoa ở những giả hành già đã rụng hết lá Lúc khởi đầu ra mầm hoa hầu như tất cả các chồi dọc theo giả hành đều phát triển cùng lúc, chồi ở gần ngọn có khuynh hướng phát triển nhanh hơn

Trang 19

Sự phát triển các hoa theo sát nhau tưởng chừng như chúng nở rộ cùng lúc trên mỗi giả hành

Ở Dendrobium dạng đứng thì hoa mọc cả giả hành cũ lẫn mới Ở giả hành

mới, chồi non nhất ở gần ngọn là chồi đầu tiên phát triển thành vòi hoa, những chồi già phía dưới phát triển sau Nói cách khác sự phát triển của các chồi thành hoa là từ ngọn tới gốc và thường có từ 3 - 4 chồi phát triển thành vòi hoa cùng lúc Các chồi khác, có thể ở giả hành cũ trước đó vẫn có thể nằm chờ rồi phát triển thành vòi hoa về sau

Như vậy với Dendrobium dạng đứng thì có thể thúc cho ra hoa bất kì thời

điểm nào trong năm và không chờ cho giả hành mới phát triển Ngược lại

Dendrobium dạng thòng phải đợi cho giả hành mới trưởng thành đã Chính vì

vậy nhóm Dendrobium dạng đứng là chủ lực của hoa cắt cành

3.2.2 Dựa vào hình dạng hoa :

Theo dạng hoa thì ta có hai nhóm chính

Nhóm có kiểu hoa kín, tròn như Hồ điệp (Phalaenopsis), và nhóm có kiểu xoắn vặn và nhọn như Sừng tê, Sơn dương (Ceratobium) Nhóm có kiểu hoa kín

tròn thường mang một chùm hoa, đôi khi nhiều hơn, chùm hoa ở đỉnh mỗi giả hành, giả hành thấp và màu hoa chủ yếu là tím, đặc biệt có màu trắng tuyền Ngược lại nhóm có kiểu hoa xoắn vặn và nhọn thì mang nhiều cành hoa hơn ở trên đỉnh của giả hành, giả hành cũng cao to hơn, cao đến vài mét, như thân mía Màu hoa của nhóm này là xanh, nâu, vàng cho đến hồng nhạt Cả hai nhóm đều báo hiệu sự ra hoa khi lá ở đỉnh giả hành đã trưởng thành

Trang 20

Hình 12 Dendrobium lineale Hình 13 Dendrobium taranase

Hình14 Dendrobium haleahi glow Hình 15.Dendrobium nobile

Hình 17 Dendrobium thyrsiforum

Sự lai giữa hai nhóm này đã tạo ra những cây lan có chiều cao trung bình và hoa đa dạng về màu sắc và kiểu dáng, từ đó hình thành ra công nghệ hoa cắt

Trang 21

cành ở Dendrobium Những cây lan lai nổi tiếng một thời mà người ta đã trồng như Dendrobium pompadour ( do lai giữa D phalaenopsis x D superbiens) do

Vacherot – Lecoufle tạo ra ở Paris năm 1934 nhưng đã trở thành lan cắt cành

mạnh mẽ ở Thái Dendrobium caesar (do lai giữa D phalaenopsis x D stratiotes)

cây khỏe mạnh rất siêng hoa

Trong các Dendrobium nguyên thủy có hoa đẹp thì nhóm Thủy tiên

thường được trồng phổ biến nhất, tuy nhiên sự phân biệt giữa chúng rất khó, nên có nhiều nhầm lẫn Sự nhận định giữa chúng có thể là:

- Chỉ có một lá ở đỉnh giả hành là Dendrobium lindleyi (Vảy cá)

- Có 2-5 lá ở phần đỉnh mỗi giả hành + Lá đài và cánh hoa màu vàng

* Giả hành hình dùi với nhiều luống rãnh dọc, thường màu ánh vàng

Phát hoa đứng rồi cong Đó là Dendrobium chrysotosum (Thuỷ tiên

vàng)

* Giả hành nhiều góc cạnh Phát hoa thòng, hoa nhỏ hơn nhưng nhiều

hoa khít nhau hơn Đó là Dendrobium densiflorum (Thuỷ tiên mỡ gà)

Hình 16 Dendrobium densiflorum

+ Lá đài và cánh hoa màu trắng, đôi khi ửng hường hay tím

Trang 22

* Giả hành có 4 - 5 cạnh Phát hoa thòng Môi vàng ở trung tâm,

viền trắng ở mép Đó là Dendrobium farmeri (Thủy tiên trắng)

* Giả hành tròn với nhiều luống rãnh Phát hoa thòng Toàn môi

màu vàng cam, dày hoa hơn Đó là Dendrobium thyrsiflorum (Thủy

tiên vàng cam)

Ngoài ra, các loài sau đây cũng thường được trồng:

* Long tu (Dendrobium primulinum) : Hoa hường, hơi trắng phớt hồng

Môi gần như trắng với đốm vàng và tím ở đáy

* Ý thảo (Dendrobium gratiosissimum) : Hoa trắng Môi có bớt vàng * Kim điệp (Dendrobium chrysotosum var delacourii) : Hoa vàng tươi

Môi vàng với trung tâm đậm (ít hoa ở thành phố Hồ Chí Minh)

* Nhất điểm hồng (Dendrobium draconis) : Hoa trắng bóng như sáp với

môi có sọc đỏ gần đáy

* Thạch hộc (Dendrobium crumenatum) : Hoa trắng, môi có bớt vàng

Thơm nhưng mau tàn Ít hoa nhưng nở rộ cùng lúc

* Giả hạc (Dendrobium anosmum, Dendrobium superbum) : Hoa màu

hường có hai bớt đậm màu hay trắng tuyền Rất thơm

4 Các điều kiện cơ bản để nuôi trồng Dendrobium sp :

4.1 Ẩm độ :

Thông thường ẩm độ tương đối tối thiểu 70% thích hợp cho sự tăng trưởng của nhiều loài Tuy nhiên ẩm độ lý tưởng vẫn là ẩm độ của vùng bản xứ mà loại lan đó được tìm thấy

Trang 23

Ẩm độ tương đối của không khí là tỷ số giữa sức trương hơi nước thật sự và sức trương hơi nước bão hòa ở nhiệt độ đó Ẩm độ tương đối được tính bằng phần trăm(%)

e.100H = e : sức trương hơi nước thật sự ew : sức trương hơi nước bão hòa

Ẩm độ tương đối dùng để đo sự cách biệt giữa trạng thái hơi nước của không khí và trạng thái bão hòa Sự cách biệt này do ta cảm giác khô ráo hay ẩm ướt Nếu không khí hoàn toàn khô ráo thì e = 0 tức H = 0%, ở trạng thái bão hoà tức là khi hơi nước biến thành nước ẩm độ bằng 100% đây là ẩm độ trong mây và sương mu[6]

Các nhà vườn đã cố gắng dùng các biện pháp khác nhau để kiểm soát điều kiện ẩm độ tại các vườn lan của họ, nhằm mục đích tạo ẩm độ ổn định cho sự phát triển của cây lan cũng như ngăn ngừa tình trạng nhiễm bệnh và điều khiển sự ra hoa.[7]

Ở Việt Nam, ẩm độ tương đối trung bình hàng năm thay đổi từ 80 - 90% Ẩm độ tối đa trong ngày vào lúc sáng sớm, tối thiểu vào lúc 12 giờ trưa Ở thành phố Hồ Chí Minh, ẩm độ thấp nhất vào tháng hai và tháng ba (74%) và cao nhất vào tháng chín (87%) Còn miền Bắc ẩm độ cao vào tháng hai và tháng ba vì đây là những tháng mát mẻ và có mưa phùn dai dẳng Đây là miền có ẩm độ cao nhất nước vì có mùa khô ngắn, từ tháng 12 đến tháng 1

Miền Trung là miền có ẩm độ thấp vì mùa mưa ngắn, từ tháng 9 đến tháng 12 và do hiệu ứng rất mạnh của dãy Trường Sơn trên luồng gió Phơn trong

Trang 24

mùa hè Vùng Phan Rang là nơi có ẩm độ thấp nhất nước, 79 - 80% vì đây là vùng ít mưa.[9]

4.2 Nhiệt độ:

Nhiệt độ tác động ở cây lan qua con đường quang tổng hợp, cường độ quang hợp gia tăng theo nhiệt độ; thường khi nhiệt độ tăng 10% thì tốc độ quang hợp tăng lên gấp đôi Chính vì vậy mà nhiệt độ cao làm gia tăng sự phát triển dinh dưỡng ở cây lan Vì lý do này mà vào mùa nắng ta tăng lượng phân bón cho lan để đáp ứng nhu cầu dinh dưỡng gia tăng ấy.[6]

Nhiệt độ liên quan đến ánh sáng vì cây có thu tóm nhiệt lượng từ ánh sáng mặt trời và kế đến là tỏa nhiệt ra Phần lớn cây lan chịu được nhiệt độ thấp của ban đêm, ngắn hạn thôi chứ không dai dẳng Ngược lại nhiệt độ cao dai dẳng trong đêm không tốt cho cây vì tiến trình hô hấp gia tăng Tăng tỷ lệ quang hợp để tạo dự trữ cho sự tăng trưởng và trổ hoa của cây lan, nhưng sự hô hấp cao sẽ dùng hết chất đường và nhựa cũng nhanh bằng lúc phản ứng quang hợp tạo ra chúng Sự chênh lệch nhiệt độ giữa ngày và đêm (biên độ nhiệt) có ảnh hưởng đến sự phát triển của cây lan[7]

Nhiệt độ còn ảnh hưởng đến sự ra hoa ở một số lan: ở lan Bạch câu

Dendrobium crumenatum đòi hỏi giảm hạ đột ngột nhiệt độ khoảng 5 – 6oC trong vài giây đồng hồ thì khoảng 9 ngày sau chúng sẽ nở hoa đồng loạt Ở 18,5oC

Dendrobium nobile chỉ tiếp tục tăng trưởng mà không ra hoa nhưng chúng sẽ ra

hoa khi nhiệt độ hạ xuống 13oC hay thấp hơn

Và như vậy, chúng chỉ phát triển tốt nhất ở trong khoảng nhiệt độ cực đại là 35oC, nhiệt độ tối thiểu là 27oC

Trang 25

Những loài ưa lạnh thì thích nhiệt độ 15oC, lý tưởng nhất là 20oC Trái lại những loài ưa nóng hơn (kể cả các loài lan lai hiện trồng tại thành phố Hồ Chí Minh) thì nhiệt độ lý tưởng là 25oC hay cao hơn một chút

Nhu cầu nhiệt độ ở cây lan có khác nhau nên chúng tập trung thành những nhóm lan khác nhau ở những vùng nhiệt độ khác nhau: lan vùng núi cao, lan vùng đồng bằng, lan vùng nhiệt đới, lan vùng ôn đới …[8]

4.3 Ánh sáng :

Ánh sáng là điều kiện rất cần thiết cho sự sinh trưởng và phát triển thông qua quá trình quang hợp và hô hấp Đây cũng là yếu tố quyết định nhất cho sự trổ hoa của lan Tuy nhiên, nhu cầu về ánh sáng của từng loài cũng khác nhau

Ở Dendrobium, nhu cầu về ánh sáng từ 1500 – 3000 lux, khoảng 70% ánh sáng

Trừ những loài ưa sáng hoàn toàn và loài ưa 70% ánh sáng có thể sử dụng ánh sáng trực tiếp của mặt trời, còn các loài khác nên dùng ánh sáng khuếch tán, nếu không cây dễ bị bỏng lá [7]ù

Cường độ quang hợp gia tăng với cường độ ánh sáng Tuy nhiên, khi cường độ ánh sáng vượt qua một trị số giới hạn nào đó thì sự quang hợp không tăng lên nữa và có thể giảm xuống và ánh sáng của trị số này là ánh sáng bão hoà Vì vậy, để ngăn ngừa sự bỏng lá và gia tăng quang hợp của cây, không bao giờ để cây tiếp xúc trực tiếp với nắng vào giữa trưa, ngoại trừ những loài ưa sáng hoàn toàn

Hầu hết Dendrobium đều phát triển mạnh nơi có nhiều sáng Thừa sáng

có thể gây ra vàng lá, cháy lá, các giả hành có thể trở nên trơ trụi trông xấu nhưng cây sẽ thích nghi dần và vẫn ra hoa Trái lại, thiếu sáng, cây sẽ èo uột,

Trang 26

đứng không vững, ít ra hoa, số lượng hoa trên cành cũng ít đi Ánh sáng tốt nhất là vào khoảng 70– 80% [8]

Điều kiện ra hoa cũng chịu ảnh hưởng của thời gian chiếu sáng trong ngày Đối với một số loài như Long tu, Kim điệp … chỉ ra hoa khi được chiếu sáng ít hơn 10giờ/ngày, nghĩa là cần ngày ngắn vì thế chúng chỉ ra hoa vào dịp gần tết.[9]

4.4 Độ thông thoáng :

Độ thông thoáng cũng là một yếu tố cần thiết cho lan phát triển tốt Không khí nơi vườn lan cần được thay đổi mỗi phút Lượng không khí luân lưu này không những cần để làm mát cây mà còn làm thay đổi lượng CO2, cần cho sự quang hợp của cây Lượng CO2 trong không khí là khoảng 340 phần triệu Trên mặt lá lượng CO2 này giảm nhiều vì liên tục bị cây hấp thụ vì vậy không khí cần được đổi mới liên tục để tái lập lượng CO2 chung quanh mặt lá Ở vùng mà thiếu thông thoáng thì rất hầm hơi nhất là khi ẩm độ tăng, nhiệt độ tăng Càng thiếu thông thoáng còn dễ gia tăng bệnh cho lan Nhưng sự thông thoáng quá lớn thì lại gia tăng sự bốc hơi làm cho môi trường có ẩm độ thấp, sự thoát hơi nước của cây cao, cây kém phát triển Vì vậy ở nơi quá thông thoáng như ở sân thượng, nơi đồng trống … thì phải che chắn chung quanh Khoảng cách các nẹp tre trên giàn che, độ dày của lưới che, mật độ của cây cũng ảnh hưởng đến độ thông thoáng, nhiệt độ của vườn lan [6, 7]

4.5 Sự nghỉ của lan :

Khái niệm về mùa nghỉ đối với một số giống lan nói chung và giống

Dendrobium nói riêng là hoàn toàn mới Ở thành phố Hồ Chí Minh và các tỉnh

phía Nam, từ lâu các nhà vườn ở đây đều trồng lan không có mùa nghỉ Mùa

Trang 27

nghỉ là thời gian tuyệt đối đối với giống Dendrobium Sự theo dõi trong năm năm (1979 - 1983) cho thấy rằng đối với loài Dendrobium American Beauty,

Dendrobium Pompadou,… một thời gian nghỉ hai tháng sẽ giúp cây lan đến tuổi

thành thục và có thể thu hoạch từ 3 - 4 cành hoa, mỗi cành từ 20 - 25 hoa rất dễ dàng, một vấn đề mà các nhà trồng lan đang ao ước và đây cũng là mấu chốt

giải quyết phẩm chất các cành hoa Dendrobium sẽ xuất khẩu trong tương lai.[6]

Các loài có lá rụng cần tưới nhiều nước gấp ba lần các loài khác vào lúc tăng trưởng Khi lá bắt đầu vàng thì bớt tưới nước rồi ngưng hẳn, để cây vào nơi mát cho chúng nghỉ ngơi, rụng hết lá trước khi ra hoa Ngay khi thấy các nụ hoa xuất hiện thì tưới nước đều đặn trở lại và chuyển dần ra nơi ánh sáng thích hợp Sự khô hạn này là bắt buộc đối với các loài rụng lá, nếu tưới nước bón phân quanh năm thì sẽ ít hoa hoặc không hoa.[7]

Các loài không rụng lá thường không có mùa nghỉ rõ rệt, có thể là sau khi hoa tàn Với các cây lai thì không có thời gian nghỉ hay có rất ngắn, khi có một số lá vàng và có thể rụng đi, rễ ngừng phát triển Thường chồi mới phát triển cùng lúc với cây lấy lại sự tăng trưởng

Mùa nghỉ của Dendrobium quyết định phẩm chất hoa trong mùa mưa đến Tùy địa phương việc chọn thời gian nghỉ Dendrobium có khác nhau, riêng ở thành phố Hồ Chí Minh, mùa nghỉ của Dendrobium nên bắt đầu từ tháng 3 đến

cuối tháng 4 [8]

4.6 Thay chậu, giá thể và tách chiết :

Dendrobium là một giống lan rất nhạy cảm, khi cấu tạo giá thể không

thích hợp cho việc phát triển của nó và biểu hiện là một số cây con mọc trên ngọn thân của các giả hành Khi có điều này xảy ra phải tiến hành thay chậu, vì

Trang 28

chắc chắn các giá thể trong chậu đã bị hư Hiện tượng này là do cấu tạo một giá thể quá ẩm như xơ dừa Chỉ một thời gian ngắn thay giá thể, xơ dừa bị mục và lắng xuống đáy chậu tạo thành một lớp mùn úng nước Chính vì thế các rễ hoàn toàn trong điều kiện úng thủy sẽ bị thối toàn bộ Do bản năng sinh tồn cây lan sẽ phản ứng bằng cách mọc ra một số cây con trên ngọn để duy trì nòi giống Tưới nước quá nhiều với một giá thể thông thoáng cũng có những hậu quả tương tự

Nếu giá thể là xơ dừa phải hạn chế số lần tưới nước Nếu chậu là quả dừa nguyên phải cưa phần đáy, nếu không thì cây sẽ bị thối vì quá ẩm Cũng có thể

trồng cây lan Dendrobium với căn hành cách đáy chậu khoảng 3cm, rồi rải thật

thoáng xung quanh căn hành một số rễ lục bình sạch Với cách trồng này thì kích thước chậu và cây phải thật tương xứng Tuy nhiên, giá thể than và gạch vẫn tỏ ra hiệu quả nhất.[6]

Các loài Dendrobium nguyên thủy, nhất là các loài thân thòng thường phù

hợp với lối trồng trên cây, trên khúc gỗ, miếng xơ dừa Trái lại, các loại lan lai thích hợp trồng trong chậu cũng như trên khúc gỗ, xơ dừa miếng hay bành vỏ dừa, thậm chí trên sạp phủ lưới

Sau khi trồng, để cây vào nơi mát mẻ, tưới sương cho đến khi rễ non ló ra bấy giờ chuyển dần ra nơi phù hợp Tưới phân 1-2 lần / tuần.[7]

Các loài Dendrobium rất thích tách chiết, nếu không tách chiết sau 3 - 4

năm trồng thì chúng sẽ yếu dần Có thể xắn đứt căn hành giữa các giả hành vào cuối mùa khô và đợi cho đến khi các mắt ngủ ở gốc giả hành phát triển thành chồi mới rồi tách ra để trồng Việc tách chiết thường tiến hành cùng lúc với việc thay chậu Thường thì tách ba đơn vị: gồm hai chồi mới với hai giả hành cũ, nhưng cũng có thể tách từng giả hành một nếu chúng mập, mạnh Các giả hành được tách rời, bỏ hết rễ, phần đỉnh cũng được cắt ngắn cho bằng nhau Chúng

Trang 29

được rải đều trên tấm lưới xếp đôi (có độ dầy để giữ ẩm tốt) để trong giàn có ẩm độ cao, độ sáng yếu Chúng được kích thích ra chồi bằng B1 và NAA hai lần trong tuần đầu Chúng vẫn được tưới nước và phân hàng tuần, khoảng một tháng sau các chồi ở gốc giả hành sẽ đâm ra Các chồi này rất mập và đều Khi chồi cao cỡ 2-3 cm có thể đem trồng riêng với các kiểu cách khác nhau như khi tách chiết Cây sẽ phát triển đều và cho hoa hầu như đồng loạt.[9]

4.7 Sâu bệnh và các vấn đề khác :

Trong quá trình thí nghiệm vấn đề gặp khó khăn là hợp chất phenol tiết ra

từ cơ quan lan Dendrobium bị thương sẽ bị oxy hoá bởi polyphenoloxydase ngoài

không khí Trong nuôi cấy mô và tế bào thực vật các sản phẩm tạo ra do quá trình oxy hoá này làm đen môi trường nuôi cấy và làm mẫu cấy bị chết.[2]

Hợp chất phenol ở thực vật được tổng hợp theo con đường acid shikimic Chu trình bắt đầu từ các carbonhydrat đơn giản, qua các amino acid có nhân thơm 9-phenylalanin, tyrosin Mọi chất phản ứng quan trong của quá trình sinh tổng hợp này là sự chuyển đổi phenylalanin thành cynamic, được xúc tác bởi enzym phenylalanin ammonia lyase (PAL) (Taiz & Zeiger, 1991) Hoạt tính của PAL trong cây chịu sự điều khiển của các điều kiện ngoại cảnh và các yếu tố nội tại (sự nhiễm nấm, sự tổn thương) [12]

Việc hạn chế tối đa sự tiết các hợp chất phenol từ mẫu cấy có ảnh hưởng quan trọng đến thành công của thí nghiệm Nhiều tác giả đưa ra một số phương pháp để hạn chế hiện tượng trên :

▪ Thêm chất chống oxi hoá vào môi trường (than hoạt tính, acid ascorbic…)

Trang 30

▪ Ngâm mẫu trong dung dịch có chất chống oxi hoá trước khi đưa vào nuôi cấy Đặt nuôi mẫu trong điều kiện ánh sáng yếu hoặc để mẩu hoàn toàn trong tối Cấy truyền mẫu sang môi trường mới khi môi trường nuôi cấy bị hoá đem (cấy sốm) [10]

Lan Dendrobium cần được bón nhiều loại phân hữu cơ khác nhau và môi

trường xơ dừa sẽ mục nát sau một thời gian ngắn được trồng Đây là hai nguyên nhân gây ra nhiều sâu bệnh hại cho các loài côn trùng cắn phá rễ trong giá thể

Một loạt rệp dính màu vàng, kích thước rất bé khoảng đầu tăm, thường xuất hiện trên bề mặt lá Loại này tác hại trên cây qua việc hút nhựa

Đối với các loài côn trùng cắn phá Dendrobium, việc loại trừ chúng tương

đối dễ dàng bằng Serpa, Bassa, nồng độ 1/500

Mặc dù Dendrobium là cây kháng bệnh rất mạnh, nhưng cây vẫn bị nấm

và virus tấn công, nếu điều kiện vệ sinh quá kém Nguy hiểm nhất là bệnh khô thân gần gốc và giả hành do một loài virus xâm nhập, làm cho các giả hành bị khô và chết Đây cũng là một trong những nguyên do làm cây mọc cây con trên

ngọn thân Có thể ngừa bệnh cho giống Dendrobium với khoảng cách dài hơn

Cattleya là nửa tháng xịt một lần bằng các loại thuốc ngừa nấm Topsil, Zineb,

Benomyl với nồng độ 1/400.[9]

4.8 Nhu cầu phân bón :

Dendrobium thân đứng là loài lan đòi hỏi dinh dưỡng cao, vì thế chúng

cần rất nhiều phân bón và có thể dùng rất nhiều loại phân bón khác nhau Còn

các loại Dendrobium thân thòng không cần nhiều phân, phải dùng nồng độ thật

loãng Các loại phân vô cơ được dùng thường có công thức 30 -10 - 10 dùng 3 lần / tuần với nồng độ 1 muỗng cá phê / 4 lít Trong suốt mùa tăng trưởng (từ

Trang 31

đầu tháng 5 đến cuối tháng 1) một tháng trước khi bước vào mùa nghỉ (trong suốt tháng 2) ta bón phân 10 - 20 -30 làm 2 lần/tuần để tạo một sức chịu đựng cho cây trước khi bước vào mùa nghỉ Trong mùa tăng trưởng nếu cây có nụ hoa, ta thay phân 30 - 10 - 10 bằng phân 10 - 20 - 20 với chu kỳ bón như trên cho

đến khi hoa tàn Trong mùa nghỉ hoàn toàn không bón phân cho Dendrobium, hay đúng hơn giảm và không bón phân cho Dendrobium khi cây hoàn tất thời kỳ tăng trưởng hằng năm của nó Thường Dendrobium hoàn tất thời kỳ tăng trưởng

vào tháng 9 đến tháng 10 khi mà những lá cuối cùng của nó thấy được trên đỉnh giả hành và thân Thời kỳ tăng trưởng hoàn tất, giảm nước tưới và thức ăn từ từ trong một thời gian khoảng 4 tuần, lúc này cây cần nhiều ánh nắng càng tốt.[6]

Không nên dùng các loại phân riêng rẽ, thường phân bón được dùng ở dạng hỗn hợp gồm vô cơ, và đôi khi những chất phụ gia là các loại sinh tố và các nguyên tố vi lượng Tuy nhiên cần phải sử dụng phân bón đúng liều lượng, thích hợp với mỗi thời kì sinh trưởng của cây lan [11]

Các chất điều hoà sinh trưởng thực vật là những chất hữu cơ (bao gồm chất tự nhiên và nhân tạo) có tác dụng điều tiết các quá trình sinh lý, kích thích hay cản trở quá trình phát triển của cây, ở nồng độ thấp chúng không phải là chất dinh dưỡng (nguyên tố hay các nguyên tố khoáng cần thiết cho thực vật).[12]

Các chất điều hoà sinh trưởng thực vật có ảnh hưởng quan trọng trên mọi quá trình sinh lý diễn ra trong cơ thể thực vật Do đó có ảnh hưởng nhất định tới

sự tạo Protocorm-like bodys và sự tái sinh cây từ các mẫu lan Dendrobium

Auxin là một nhóm các chất được tổng hợp chủ yếu ở đầu thân, đầu rễ, được vận chuyển đến các bộ phận khác nhau của cơ thể để kích thích sự tăng trương tế bào [8]

Trang 32

Cytokinin làm chậm sự lão suy và cản sự tạo rễ nhưng ở nồng độ thấp chúng kích thích sự tạo rễ gián tiếp qua sự phân chia tế bào Trong nuôi cấy mô thực vật người ta thường bổ sung BA vào môi trường để kích thích tạo sơ khởi chồi, tạo cụm chồi hoặc tạo Protocorm-like bodys [10]

Lịch sử và những thành tựu về nuôi cấy mô in-vitro bắt đầu từ những năm

1900 đã được nhà thông thái Haberlandt thử nghiệm rất sớm, ông đã dùng tế bào quá chuyên biệt nên không thành công Năm 1934, White đã thành công trong việc phát hiện ra sự sống vô hạn của việc nuôi cấy tế bào rễ cà chua Năm 1951, Skoog và Miller đã phát hiện ra hợp chất có thể điều khiển sự nhân chồi Năm 1962, Murashige và Skoog đã cải tiến môi trường nuôi cấy đã đánh dấu một bước tiến bộ trong kỹ thuật nuôi cấy mô Môi trường này được sử dụng rộng rãi cho tới ngày nay

Năm 1960-1964, Morel cho rằng có thể nhân giống vô tính lan bằng nuôi cấy đỉnh sinh trưởng Từ đó đến nay, công nghệ nuôi cấy mô tế bào thực vật được phát triển với tốc độ nhanh trên nhiều cây khác và được ứng dụng thương mại hoá.[3,4]

Năm 1964, Ball đã tìm ra mầm rễ từ việc nuôi cấy chồi ngọn Tuy nhiên, việc nuôi cấy này chưa hoàn thiện

Nhân giống in-vitro hay nuôi cấy mô là thuật ngữ mô tả các phương pháp

nuôi cấy các bộ phận thực vật trong ống nghiệm có chứa môi trường xác định ở điều kiện vô trùng Môi trường có chất dinh dưỡng thích hợp như muối khoáng, vitamin, các hormone tăng trưởng và đường Trên các môi trường này cho phép nuôi cấy chồi hoặc các cơ quan như lá, thân, hoa, rễ

Trang 33

Trước kia phương pháp này chỉ để nghiên cứu các đặc tính cơ bản của tế bào Ngày nay nó được ứng dụng thực tiễn vì có mối liên hệ mật thiết với giống cây trồng Các nhà thực vật học đã áp dụng phương pháp này với mục đích sau:

▪ Tạo được quần thể lớn và đồng nhất trong một thời gian ngắn, với diện tích thí nghiệm nhỏ, điều kiện hoá lý kiểm soát được

▪ Tạo được nhiều cây con từ mô và cơ quan của cây mà ngoài thiên nhiên không làm được

▪ Làm sạch nguồn virus cho cây bằng cách cấy mô phân sinh ngọn ▪ Cải tiến các giống cây trồng bằng công nghệ sinh học [4,5]

5 Phương pháp nuôi cấy mô Dendrobium sp :

Nuôi cấy mô đã được thí nghiệm từ thế kỉ 17 nhưng chỉ thành công sau những sưu tầm về môi trường nuôi cấy của White và Gautheret đạt được (1931) Georges Morel, học trò của R.J Gautheret, đã áp dụng phương pháp nuôi cấy mô vào cây lan năm 1956 Ông công bố thành công ấy trên A.O.S (American Orchid Society) vào năm 1960 và giống lan đầu tiên mà ông áp dụng là

Cymbidium Từ đó người ta đã thành công với Miltonia, Phajus, Odontoglossum, Dendrobium và các giống lai của chúng [4]

Phương pháp tách chiết từ cây lan có sẵn không có khả năng cung cấp cây giống đủ để đáp ứng nhu cầu phát triển của ngành trồng lan, vì vậy việc áp dụng thành công phương pháp nuôi cấy mô ở lan là một đóng góp lớn lao cho việc tạo lập ngành công nghiệp hoa lan cắt cành Đây là một phương pháp tạo ra được một số lượng lớn cây giống đồng nhất trong cùng một lúc với thời gian ngắn nhất Đấy cũng là phương pháp tiện lợi hơn gieo hột vì mẫu cấy luôn luôn có

sẵn, không mất thời gian chờ đợi trái chín

Trang 34

Lúc đầu người ta sử dụng mô phân sinh (méristem) hay còn gọi là sinh mô để nuôi cấy Sinh mô là nhóm tế bào chưa chuyên hóa, có đặc tính phân chia mạnh, nằm ở ngọn thân, ngọn rễ hay ngọn chồi bên Lấy sinh mô ấy nuôi trong môi trường dinh dưỡng thích hợp, dưới các điều kiện nhiệt độ, ánh sáng phù hợp, các sinh mô sẽ phân cắt nhanh để phát triển thành những khối tế bào chưa phân hoá ở dạng tiền củ (protocorm) hay mô sẹo (callus) Với khối lượng tế bào này, ta có thể nhân lên thành một số lượng lớn bằng cách cắt chúng ra thành những khối nhỏ, cho vào môi trường dinh dưỡng để nuôi riêng Cứ thế cho đến khi ta không cắt xẻ nữa thì chúng sẽ được điều chỉnh để phát triển thành cây lan con, các cây lan con này được gọi là cây cấy mô (mériclone) [6]

Thời gian và số lần nhân cấy càng nhiều thì khả năng phát triển của mô càng yếu và thoái hoá đi vì vậy mà chỉ nên nhân cấy 2 - 3 lần, nếu muốn số lượng cây con nhiều hơn thì phải lấy sinh mô mới để có thêm tiền củ hay mô sẹo mới

Điều quan trọng là nên cấy sinh mô của những cây mạnh khoẻ, không bệnh tật nhất là bệnh virus Chỉ nên cấy những cây mà ta đã biết rõ các đặc tính tốt của nó, vì vậy mà không nên cấy mô từ cây con gieo hột khi chưa biết hoa của nó

Để khỏi hy sinh một cây lan, nhất là lan quí và hiếm, khi phải sử dụng đỉnh ngọn của nó để nuôi cấy, sau này, người ta có thể dùng các phần khác như biểu bì, rễ non, lá hay cọng phát hoa để nuôi cấy mô

Nuôi cấy mô lan có những bước sau : + Chuẩn bị môi trường cấy + Chuẩn bị mẫu cấy

Trang 35

+ Cắt xẻ và nuôi cấy

Tất cả đều thực hiện dưới điều kiện vô trùng.àn’ tay đều phải được khử trùng [18]

6 Các nghiên cứu về nhân giống in vitro cây lan :

Năm 1899, Noel Bernard, nhà thực vật người Pháp, đã khám phá sự nảy

mầm ở hột lan khi ông khảo sát các hột Neottia nidus – avis nẩy mầm tự nhiên

trong rừng vùng Fontainebleau ở nước Pháp Ông thấy các cây lan con đều nhiễm nấm Mối liên hệ giữa nấm và cây lan con đã được khảo sát từ năm 1850 và sự liên hệ giữa nấm và rễ lan đã được các nhà khoa học nghiên cứu suốt hơn nửa thế kỷ tiếp theo đó nhưng không ai nghĩ rằng sự hiện diện của nấm là cần thiết cho sự nẩy mầm của các hột lan

Năm 1904, Noel Bernard mới thành công trong việc nuôi cô lập các nấm từ rễ lan rồi dùng các nấm ấy nhiễm vào các hột lan Bằng cách đó, Noel Bernard là người đầu tiên đã làm cho 100% hột lan nẩy mầm Sau đó ở Đức, Burgeff cũng theo đuổi công việc tương tự, hai ông cộng tác với nhau để đưa ra phương pháp gieo hột lan có nhiễm nấm trong chai thạch Phương pháp này được gọi là phương pháp gieo hột cộng sinh (semis symbiotiques), làm gia tăng số lượng lớn cây lan trồng từ hột

Năm 1922, Knudson ở Mỹ, lại thành công trong việc thay thế nấm bằng đường ở môi trường thạch để gieo hột Knudson nhận thấy rằng với các chai cấy có chứa thạch và muối khoáng thích hợp thì khả năng nẩy mầm của các hột lan là rất ít hay không có, nhưng nếu có nấm vào thì sự nẩy mầm của hột lan lại xảy ra rất sớm Ông nhận thấy chỉ có một sự khác biệt giữa cây lan và hột lan là sự

Trang 36

sử dụng CO2 trong không khí: Từ CO2 và nước, cây lan tạo ra hydrat carbon (gồm có đường và tinh bột) theo phản ứng:

nCO2 + 2nH2O -> (CH2O)n + nO2 + nH2O

Từ hydrat carbon (CH2O)n ấy và muối khoáng do rễ mang lại, cây lan đã tạo ra được các chất phức tạp cần thiết cho sự phát triển của nó Knudson nghĩ rằng hột lan không mọc được bởi lý do đơn giản là nó thiếu khả năng tạo ra hydrat carbon từ CO2 Khi thí nghiệm để kiểm tra thì ông thành công ngay Ông thấy rằng chỉ cần thêm 2% đường vào môi trường gieo hột chỉ gồm có thạch và muối khoáng, không cần có nấm, hột lan vẫn nẩy mầm tốt Như thế vai trò chính yếu của nấm đối với sự nảy mầm của cây là cung cấp đường Từ đó phương pháp của Knudson đã được sử dụng khắp nơi trên thế giới và gọi phương pháp gieo hột không cộng sinh.[ 6 ]

Tanaka (1987) đề nghị nhân giống Phalaenopsis từ mảnh cắt cuống hoa, và báo cáo rằng có ít biến dị trong việc nhân dòng vô tính bằng phương pháp

này so với các phương pháp khác Tanaka đã nghiên cứu cấy chồi Phalaenopsis

trên các loại giá thể : Agar, gòn không thấm nước, môi trường lỏng có khuấy và thu được những kết quả như sau:

❖ Trong môi trường lỏng có khuấy tỷ lệ nhân của PLB (protocorm – like – body) rất thấp (10–15%) và 70% trong số chúng bị hóa nâu Cho nên việc sử dụng phương pháp này không thích hợp cho việc nhân giống PLB ❖ Trong môi trường có gòn không thấm được sử dụng để hỗ trợ nhân giống

PLB Kết quả cho thấy trọng lương ban đầu tăng 2,5 lần so với môi trường có agar 80% PLB trong 1 đĩa có chứa gòn không thấm so với 67% trong môi trường có agar Tuy nhiên, sau 30 ngày cấy trong đĩa có chứa gòn

Trang 37

không thấm, kích cỡ PLB lớn hơn 2 lần so với 65 ngày cấy trong môi trường agar Những kết quả này chỉ ra rằng sử dụng môi trường có chứa gòn không thấm để nhân giống PLB thì hiệu quả hơn [15]

Ngay từ năm 1960, Morel đã nhận thấy đỉnh sinh trưởng của các loài địa lan (Cymbidium) khi đem nuôi cấy sẽ hình thành các protocorm Khi chia cắt các protocorm và nuôi cấy tiếp thì lại thu được các protocorm mới Khi để trong các điều kiện nhất định thì protocorm có thể phát triển thành cây lan con Hơn nữa, các tế bào ở đỉnh sinh trưởng chứa rất ít hoặc hoàn toàn không có virus, do đó với phương pháp nuôi cấy đỉnh sinh trưởng, Morel có thể phục tráng, tạo các dòng vô tính không bị nhiễm bệnh virus Kỹ thuật này đặc biệt có giá trị với khoai tây, dâu tây, cây ăn quả và nhiều cây nhân giống vô tính khác [ 8 ]

Theo tập san Khoa Học Kỹ Thuật Nông Lâm Nghiệp tháng 6-1999 của

Trần Văn Minh – Nguyễn Văn Uyển đã nghiên cứu nhân giống Dendrobium in

vtro Tác giả đã sử dụng môi trường MS (Murashige & Skoog,1962) có bổ sung

thêm chất sinh trưởng như BA(6-benzyl-aminopurine), IBA(β-indol-butyric acid), IAA(β-indol-acetic-acid), NAA(α-napthalen-acetic acid) và các dịch chiết như chuối và nước dừa(CW-coconut water) Nuôi cấy ở cường độ ánh sáng 2000-3000 lux, nhiệt độ 26-280C, ẩm độ 60-65%, thời gian chiếu sáng là 12giờ/ngày và thời gian nuôi cấy 90 ± 5 ngày Thí nghiệm được bố trí theo khối ngẫu nhiên, có 4 lần lặp lại, mỗi lần lập lại được bố trí cấy 4 bình tam giác, mỗi bình tam giác được cấy 4 mẫu Kết quả thí nghiệm được xử lý theo chương trình thống kê MSTAC (LDS 0.05)

Trang 38

Kết quả đạt được :

* Nhân giống in vitro :

• BA (1ppm) + IAA (0,1ppm) là chất sinh trưởng cơ bản nhân

giống Dendrobium in vitro Nước dừa (15%) và vỏ chuối (10%)

là các chất bổ sung vitamin và acid amin hữu hiệu cho

Dendrobium

• Một số tổ hợp chất sinh trưởng đạt kết quả cao : + BA (1ppm ), IAA (0,1ppm ), Cw (15%)

+ BA ( 1ppm ), IAA ( 0,1ppm ), Cw ( 10% ), chuối ( 15% ) + Hàm lượng đường là ( 2% )

* Tái sinh hoàn chỉnh in vitro :

• Chiều cao chồi khi đưa vào nuôi cấy lớn hơn 10mm

• Dùng cụm chồi đưa vào tái sinh cây hoàn chỉnh nhưng phải qua cấy truyền 2 lần

• Một số tổ hợp các chất sinh trưởng có kết quả cao : + BA ( 0,1ppm ), Cw ( 20%)

Trang 39

nuôi cấy mô thực vật trên các loại môi trường đặc thì tỷ lệ nghịch với nồng độ agar có trong môi trường [14]

Các nghiên cứu trong lĩnh vực nuôi cấy mô trên thế giới gần đây đã chứng minh vai trò kìm hãm cửa agar đối với sự phát triển của nuôi cấy Sự hiện diện của agar làm cho môi trường thiếu độ thông thoáng và cản trở việc khuyếch tán các khí hoà tan cũng như sự hấp thụ nước và các chất khoáng của cây nuôi cấy Rễ của cây nuôi cấy trên giá thể agar có hệ thống bó mạch thường phát triển yếu, do đó cây nuôi cấy mô trong những ngày đầu ở vườn ươm phát triển chậm có tỉ lệ chết cao [11]

Theo Romberger và Tabor (1971), gel làm giảm sự khuyếch tán của các hợp chất có phân tử lượng lớn Họ cho rằng nguyên nhân làm giảm tốc độ tăng trưởng của mô là do sự cố định enzym invertase từ mô vào trong gel Sự cố định này làm giảm trong lượng gluscose và fructose trong mô thực vật (14)

Theo Faye và cộng sự (1986), sự hấp thụ ion nitrat vào chồi và cây con được đặt cấy trên môi trường agar ít hơn trên môi trường lỏng (14)

Các thành phần môi trường mà mô thực vật có thể sử dụng được khi nuôi cấy trên môi trường agar thì ít hơn trong môi trường lỏng, lắc bởi vì trong môi trường agar có thế nước giảm và độ nhớt cao (hạn chế sự khuyếch tán) Điều này dẫn đến ít hơn một nữa bề mặt mô thực vật tiếp xúc với môi trường Khi thế nước giảm dẫn đến sự giảm hấp thu ion vào mô thực vật Theo Debergh (1983) các vi lượng và phosphate có lẽ bị hấp thụ bởi agar, cho nên chúng trở thành các ion mà ít được mô thực vật sử dụng [14]

Heller và Gautheret (1949) đã nuôi cấy các mô thực vật trên giá thể giấy lọc không tro được là ẩm bởi môi trường lỏng Những mẫu thực vật có kích thước

Trang 40

rất nhỏ(đỉnh sinh trưởng ) có thể bị lạc mất khi nuôi cấy trong môi trường lỏng, lắc Nhưng nó có thể được cấy thành công nếu được nuôi cấy trên giấy lọc có dạng hình chữ U hay M (được gọi là giá thể “Heller”) Giấy lọc được cuộn lại và được đặt trong ống nghiệm, cạnh của nó đóng vai trò như cái bấc đèn (Goodwin,1966) Phương pháp này là một trong các phương pháp tạo điều kiện hiếu khí cho mô thực vật tốt nhất, tuy nhiên, đòi hỏi thời gian chuẩn bị môi trường và giá thể rất tốn kém Mặt khác, các mẫu thực vật phát triển tốt trên môi trường agar hay giấy lọc tuỳ thuộc vào đối tượng thực vật được đặt cấy, Davis và cộng sự (1977) nhận thấy rằng những chồi hoa cẩm chướng phát triển

trên agar tốt hơn trên giấy lọc là 0.6% Các chồi bên của Leucospermum không

thể sống sót trên agar, nhưng có thể giữ được trên cầu giấy lọc từ 3-4 tháng Sau đó chúng có thể chuyển đến môi trường agar Kunasaki (1990) cho rằng thời gian nuôi cấy trên cầu giấy lọc kéo dài làm cho mẫu mô thực vật bị thuỷ tinh thể [14]

Yong Soo Part, Syuuichi Kakuta, Astushi Kano & Mitsuyasu Okabe ở trường Shiuzouka University, Nhật Bản nuôi cấy thành công các thể “protocorn

like bodies” của lan Phalaenopsis trong môi trường lỏng giá thể là bông không

thấm

Skidmore và cộng sự sử dụng đĩa peptri nhựa với nhiều lỗ nhỏ có đường kính khoảng 3mm Đĩa này úp ngược lại và đặt trong bình nuôi cấy để là giá thể

nuôi cấy Pnus caribaea trong môi trường lỏng [14]

8 Hiện tượng thuỷ tinh thể (vitrification) trong nuôi cấy mô thực vật

Khi nồng độ của agar không đủ trong môi trường hoặc không nâng đỡ được mô thực vật hoặc làm cho mô thực vật bị thuỷ tinh thể [15]