Nghiên cứu ảnh hưởng của một số yếu tố đến quá trình ra hoa và bước đầu tạo quả của cây chanh dây tím (Passiflora edulis Sims f. edulis) nuôi cấy in vitro

Nghiên cứu ảnh hưởng của một số yếu tố đến quá trình ra hoa và bước đầu tạo quả của cây chanh dây tím (Passiflora edulis Sims f. edulis) nuôi cấy in vitroNghiên cứu ảnh hưởng của một số yếu tố đến quá trình ra hoa và bước đầu tạo quả của cây chanh dây tím (Passiflora edulis Sims f. edulis) nuôi cấy in vitroNghiên cứu ảnh hưởng của một số yếu tố đến quá trình ra hoa và bước đầu tạo quả của cây chanh dây tím (Passiflora edulis Sims f. edulis) nuôi cấy in vitroNghiên cứu ảnh hưởng của một số yếu tố đến quá trình ra hoa và bước đầu tạo quả của cây chanh dây tím (Passiflora edulis Sims f. edulis) nuôi cấy in vitroNghiên cứu ảnh hưởng của một số yếu tố đến quá trình ra hoa và bước đầu tạo quả của cây chanh dây tím (Passiflora edulis Sims f. edulis) nuôi cấy in vitroNghiên cứu ảnh hưởng của một số yếu tố đến quá trình ra hoa và bước đầu tạo quả của cây chanh dây tím (Passiflora edulis Sims f. edulis) nuôi cấy in vitroNghiên cứu ảnh hưởng của một số yếu tố đến quá trình ra hoa và bước đầu tạo quả của cây chanh dây tím (Passiflora edulis Sims f. edulis) nuôi cấy in vitroNghiên cứu ảnh hưởng của một số yếu tố đến quá trình ra hoa và bước đầu tạo quả của cây chanh dây tím (Passiflora edulis Sims f. edulis) nuôi cấy in vitroNghiên cứu ảnh hưởng của một số yếu tố đến quá trình ra hoa và bước đầu tạo quả của cây chanh dây tím (Passiflora edulis Sims f. edulis) nuôi cấy in vitroNghiên cứu ảnh hưởng của một số yếu tố đến quá trình ra hoa và bước đầu tạo quả của cây chanh dây tím (Passiflora edulis Sims f. edulis) nuôi cấy in vitroNghiên cứu ảnh hưởng của một số yếu tố đến quá trình ra hoa và bước đầu tạo quả của cây chanh dây tím (Passiflora edulis Sims f. edulis) nuôi cấy in vitroNghiên cứu ảnh hưởng của một số yếu tố đến quá trình ra hoa và bước đầu tạo quả của cây chanh dây tím (Passiflora edulis Sims f. edulis) nuôi cấy in vitroNghiên cứu ảnh hưởng của một số yếu tố đến quá trình ra hoa và bước đầu tạo quả của cây chanh dây tím (Passiflora edulis Sims f. edulis) nuôi cấy in vitroNghiên cứu ảnh hưởng của một số yếu tố đến quá trình ra hoa và bước đầu tạo quả của cây chanh dây tím (Passiflora edulis Sims f. edulis) nuôi cấy in vitroNghiên cứu ảnh hưởng của một số yếu tố đến quá trình ra hoa và bước đầu tạo quả của cây chanh dây tím (Passiflora edulis Sims f. edulis) nuôi cấy in vitroNghiên cứu ảnh hưởng của một số yếu tố đến quá trình ra hoa và bước đầu tạo quả của cây chanh dây tím (Passiflora edulis Sims f. edulis) nuôi cấy in vitroNghiên cứu ảnh hưởng của một số yếu tố đến quá trình ra hoa và bước đầu tạo quả của cây chanh dây tím (Passiflora edulis Sims f. edulis) nuôi cấy in vitroNghiên cứu ảnh hưởng của một số yếu tố đến quá trình ra hoa và bước đầu tạo quả của cây chanh dây tím (Passiflora edulis Sims f. edulis) nuôi cấy in vitroNghiên cứu ảnh hưởng của một số yếu tố đến quá trình ra hoa và bước đầu tạo quả của cây chanh dây tím (Passiflora edulis Sims f. edulis) nuôi cấy in vitroNghiên cứu ảnh hưởng của một số yếu tố đến quá trình ra hoa và bước đầu tạo quả của cây chanh dây tím (Passiflora edulis Sims f. edulis) nuôi cấy in vitroNghiên cứu ảnh hưởng của một số yếu tố đến quá trình ra hoa và bước đầu tạo quả của cây chanh dây tím (Passiflora edulis Sims f. edulis) nuôi cấy in vitroNghiên cứu ảnh hưởng của một số yếu tố đến quá trình ra hoa và bước đầu tạo quả của cây chanh dây tím (Passiflora edulis Sims f. edulis) nuôi cấy in vitroNghiên cứu ảnh hưởng của một số yếu tố đến quá trình ra hoa và bước đầu tạo quả của cây chanh dây tím (Passiflora edulis Sims f. edulis) nuôi cấy in vitroNghiên cứu ảnh hưởng của một số yếu tố đến quá trình ra hoa và bước đầu tạo quả của cây chanh dây tím (Passiflora edulis Sims f. edulis) nuôi cấy in vitroNghiên cứu ảnh hưởng của một số yếu tố đến quá trình ra hoa và bước đầu tạo quả của cây chanh dây tím (Passiflora edulis Sims f. edulis) nuôi cấy in vitro

TỔNG QUANNGHIÊNCỨU

Sự ra hoa và ra hoain vitroởthựcvật

1.1.1 Ý nghĩa của sự ra hoa và ra hoa in vitro ở thựcvật

Sự chuyển đổi từ phát triển sinh dưỡng sang sinh sản là một bước ngoặt quan trọng trong vòng đời của thực vật có hoa Thời điểm chuyển đổi này phụ thuộc vào tín hiệu từ môi trường như nhiệt độ, độ dài ngày, chất dinh dưỡng và mật độ cây trồng Ở nhiều loài, sự ra hoa được thúc đẩy bởi sự tích lũy đủ chất dự trữ Quá trình ra hoa bao gồm các giai đoạn khác nhau, với những yêu cầu về hormone và chất dinh dưỡng cụ thể Tuy nhiên, sự phức tạp của quá trình này khiến việc tổng quát hóa trên toàn bộ loài thực vật trở nên khó khăn Các kỹ thuật ra hoa in vitro có thể tạo ra các điều kiện tối ưu để nghiên cứu sinh lý học của quá trình ra hoa, ảnh hưởng của các yếu tố môi trường và tương tác gen, cũng như ứng dụng vào chọn giống và lai tạo.

Trong nghiên cứu sinh học phát triển thực vật, ra hoain vitrotạo điều kiện thuậnlợiđểquansátquátrìnhpháttriểnhoatrongđiềukiệnkiểmsoátchặtchẽ.Việc kiểm soát môi trường nuôi cấyin vitrogiúp tách biệt và phân tích tác động của các yếu tố nội sinh (như hormone) và ngoại sinh (như ánh sáng, nhiệt độ) lên sự ra hoa Kỹ thuật này giúp hiểu rõ hơn về các cơ chế điều hòa sự ra hoa, từ đó tạo cơ sở cho việc điều chỉnh và tối ưu hóa quá trình này trong sản xuất nôngnghiệp.

Trong lĩnh vực chọn giống, kỹ thuật này giúp rút ngắn thời gian cần thiết để cây trồng ra hoa và tạo quả, từ đó tăng tốc quá trình chọn lọc và phát triển các giống câymới.Chẳnghạn,rahoavàtạohạtinvitrođãđượcápdụngthànhcôngtrongviệc đánh giá các giống lúa, giúp nhanh chóng phát hiện và nhân giống những cá thể có đặc tính mong muốn như năng suất cao, có khả năng chống chịu hạn, mặn [19] Ra hoa và tạo quảin vitrocũng góp phần rút ngắn quá trình nhân giống và đánh giá đặc tính hoa ở một số loài loài lan Quá trình nhân giống ở lan thông thường là một quá trình kéo dài, có thể kéo dài 3 - 5 năm Nhưng khi sử dụng nguồn hạt lan, đặc biệt là hạtin vitrokết hợp với các kỹ thuật công nghệ sinh học có thể rút ngắn đáng kể quá trình này[20].

Bên cạnh đó, ra hoa và tạo quảin vitrolà công cụ hỗ trợ đắc lực trong lai tạo và chọn lọc giống cây trồng, đặc biệt là sử dụng phấn hoa từ các loài thực vật hiếm, và có thể hướng tới khả năng tái tổ hợp vật liệu di truyền thông qua thụ tinhin vitroở các dòng không laitạp[2] Nhiều loài cây trồng gặp khó khăn trong việc ra hoa tự nhiên do điều kiện môi trường không phù hợp hoặc sự khác biệt sinh học giữa các loài Kỹ thuậtin vitrokhông chỉ giúp các loài này ra hoa mà còn tạo điều kiện thuận lợichoquátrìnhthụphấnvàtạoquả.Ngoàira,kỹthuậtnàycòngiúpbảotồnvàphục hồi các giống cây trồng quý hiếm hoặc có nguy cơ tuyệt chủng, bằng cách tạo điều kiện cho chúng sinh sản trong môi trường kiểmsoát.

Nhìn chung, ứng dụng công nghệ thụ tinh trong ống nghiệm không chỉ giới hạn trong lĩnh vực nghiên cứu cơ bản về sinh lý học thực vật mà còn mở rộng sang các ứng dụng thực tiễn trọng yếu trong nông nghiệp và công nghệ sinh học thực vật Kỹ thuật này tạo tiền đề cải tiến và phát triển giống cây trồng, đồng thời góp phần bảo tồn cũng như duy trì sự đa dạng sinh học.

1.1.2 Các giai đoạn chính của sự ra hoa ở thựcvật

Mô phân sinh đỉnh chồi (SAM) là một cấu trúc khá phẳng, hình đĩa, thường khóquansátvànóliêntụctạoracácsơkhởilá.Trongquátrìnhpháttriển,đỉnhchồi tăng kích thước và phình to lên theo dạng hình vòm Ở nhiều loài thực vật, đặc điểm hìnhtháinàythườngđượcquansátđikèmvớisựgiatăngsốlầnnguyênphânởdưới vùngtrungtâmvàphíatrênsườnbênvùngmôphânsinh,vàtăngdầnđếnvùngtrung tâm để vùng đỉnh có hình dạng của một nhân nhu mô, được bao phủ bởi các tế bào cókhảnăngphânbàonhanh.Sơkhởihoađượctạothànhởlớpngoàicủavùngtếbào củaSAM.

Sự ra hoa ở thực vật có thể chia thành 3 giai đoạn chính [21]:

Khi cây trưởng thành đạt độ tuổi nhất định, các tín hiệu môi trường tác động, kích thích quá trình chuyển đổi từ phát triển sinh dưỡng sang giai đoạn sinh sản Điểm sinh trưởng đỉnh (SAM) bao gồm một nhóm tế bào nhỏ ngừng tạo ra lá và chuyển sang hình thành mô phân sinh hoa.

Giaiđoạnhìnhthànhmầmhoa:Liênquanđếnsựbiếnđổimôphânsinhngọn thànhmôphânsinhhoadẫntớihìnhthànhsơkhởihoa.Môphânsinhhoahìnhthành ở phía ngoài của vùng mô phân sinh đỉnh, vùng đã cam kết hình thành mô phân sinh hoa.

Giai đoạn hình thành và phát triển cơ quan hoa:Khi quá trình chuyển sang mô phân sinh hoa đã diễn ra, các cơ quan của hoa phát sinh tại các vị trí xác định từ bêntrongcácmôphânsinhnàydướisựđiềukhiểncủacácnhómgenkhácnhau.Nụ hoasaukhitượnghoacóthểtiếptụctăngtrưởngvànởhoa,hoặcvàotrạngtháingủ.

1.1.3 Một số con đường ra hoa chủ yếu ở thựcvật

Trong nhiều thập kỷ, nhiều nghiên cứu đã được tiến hành để làm sáng tỏ các cơ chế phân tử cơ bản của quá trình chuyển đổi hoa ở các cây mô hình, cũng như ở các cây trồng khác Mặc dù mạng lưới điều hòa của các gen tích hợp hoa dường như khá khác biệt giữa các loài thực vật, tuy nhiên, chúng tập trung chủ yếu ở bốn con đường ra hoa chính được bảo tồn, bao gồm con đường ra hoa dựa trên ánh sáng, con đường thọ hàn (xuân hóa), con đường tự chủ và con đường gibberellin Trong đó, những hiểu biết khá toàn diện về các cơ chế phân tử cơ bản của quá trình chuyểnđổi hoa trong cây mô hìnhArabidopsis thalianađã làm sáng tỏ các cơ chế phân tử kiểm soát sự chuyển đổi hoa ở các cây trồng khác Những hiểu biết hiện tại về các con đường ra hoa chủ yếu tập trung vào việc tìm hiểu con đường ra hoa ởArabidopsiscũng như ở một số loài cây trồng, bao gồm cả những cây thuộc chiBrassica[22].

1.1.3.1 Con đường ra hoa dựa trên ánhsáng Ở các vĩ độ khác nhau, độ dài ngày thay đổi là một đặc điểm cơ bản của quá trình diễn biến theo mùa Sự tăng tốc của quá trình chuyển đổi hoa của nhiều loài thực vật chịu ảnh hưởng bởi các điều kiện quang kỳ dài ngắn khác nhau[23].Quang kỳ rất quan trọng vì nó giúp thực vật xác định thời điểm tốt nhất để ra hoa, đảm bảo sự sinh sản thành công trong các điều kiện môi trường thay đổi theo mùa. ỞArabidopsis,ánhsángđượccảmnhậnbởicáctếbàocảmthụánhsáng(Phytochrome AvàE)vàcácflavoproteinnhạycảmvớiánhsángxanh(Cryptochrome1và2).Mối liênhệgiữađộdàingàyvàthờigiannởhoalàproteinCONSTANS(CO).Nhấtquán với điều này, sự biểu hiện củaFLOWERING LOCUS T(FT), một mục tiêu tức thời củaCO, tương quan với những thay đổi trong sự biểu hiệnCOtrong các thể khác nhau Trong quang kỳ dài, mức độCOdồi dào ở thời điểm cuối và đầu của chu kỳ quang kỳ, nhưng trong quang kỳ ngắn, mức độCOcao nhất xảy ra trong bóng tối Nếu quá trình chuyển dịch, hoạt động hoặc độ ổn định củaCOđược kiểm soát bằng ánhsáng,điềunàycóthểcungcấpcơchếmàhoạtđộngcủaCOchỉcóhiệuquảtrong những ngày dài Do đó,COcó thể hoạt động trong một tích hợp nhận biết về độ dài ngày và các cơ chế để thúc đẩy sự ra hoa[22].

Bêncạnhđó,sựrahoaởmộtsốloàithựcvậtchịutácđộngcủachấtlượngánh sáng [22] Chẳng hạn, ánh sáng đỏ xa (735 nm) và xanh lam (440 nm) thúc đẩy quá trìnhrahoathôngquaPhytochromeAvàCryptochrome1và2,tươngứng.Ánhsáng đỏ (660 nm) ức chế sự ra hoa thông qua Phytochrome B, D và E Đối với thực vật được trồng dưới tán cây dày đặc hoặc ở mật độ trồng cao, ánh sáng phản xạ từ thảm thựcvậtlâncậnlàmgiảmtỉlệđỏ/đỏxadodiệplụchấpthụánhsángđỏ.Sựthayđổi vềánhsángnàyđóngvaitrònhưmộttínhiệu vềsựcạnhtranh,gâyramộtloạtphản ứngởthựcvật,dẫnđếnviệcrahoanhanhhơnđểhoànthànhvòngđờitrongmộtmôi trường cạnh tranh ánh sáng do mật độ cao[24].

1.1.3.2 Con đường thọ hàn / xuânhóa

Sự ra hoa của thực vật ở nhiệt độ thích hợp sau một thời gian dài ở nhiệt độ lạnh là một quá trình được gọi là thọ hàn Yêu cầu đối với thọ hàn là một chiến lược sinh sản ở nhiều loài và ứng dụng lai tạo thành một số loại cây trồng để đảm bảo chúng chuyển đổi sinh sản trong mùa đông và ra hoa trong điều kiện thuận lợi của mùa xuân Ở câyArabidopsis, điều này có thể được lập bản đồ như một tính trạng đơn gen với các alen trội củaFRIGIDA (FRI)đối với sự thọ hàn.FRImã hóa một protein mới có chức năng thúc đẩy sự tích tụ của RNA thông tin củaFLOWERINGLOCUSC(FLC).FLCmãhóayếutốphiênmãkìmhãmquátrìnhchuyểnđổihoav à cómốiquanhệđịnhlượnggiữamứcmRNAFLCvàthờigianrahoa.Bằngcáchthúc đẩy sự tích tụ mRNAFLC,FRIngăn chặn quá trình chuyển đổi hoa đến mức độ nó lấn át ảnh hưởng của các điều kiện thuận lợi khác Sự thọ hàn dẫn đến giảm lượng mRNAFLCsao cho mức độ mRNAFLCtương quan với thời gian ra hoa Mức độ mRNAFLCvẫn ở mức thấp sau khi cây được đưa trở lại nhiệt độ ấm hơn, điều này giải thích sự ổn định phân bào của quá trình thọ hàn; tuy nhiên, mức mRNAFLCđượcthiếtlậplạisauquátrìnhgiảmphân.Sựthọhànvẫncóthểđẩynhanhquátrình nở hoa trên nền tảng không biểu hiệnFLC, cho thấy rằngFLCkhông phải là mục tiêuduynhấtcủaquátrìnhnày.Sựthọhànmangtínhchuẩnbịchocâyrahoahơnlà gợilênviệctựrahoa.Điềunàychothấycómộtsựtáchbiệtrõràngvềmặtthờigian giữa xử lý lạnh và ra hoa, điều này cho thấy rằng sự ra hoa có cơ sở biểu sinh[18].

1.1.3.3 Con đường ra hoa tựchủ

Koornneef và cộng sự (1991) đã phân lập các đặc trưng của tập hợp các đột biếnArabidopsisra hoa muộn Ông đã phân loại các đột biến thành các con đường khác nhau trên cơ sở các kiểu hình riêng biệt của chúng và phân tích biến đổi kép.

BốntrongsốcâcthểđộtbiếnmẵngđêxâcđịnhlăFCA,FY,FPAvăFVEđêrahoa muộnhơnsovớicâydạiởcảquangkỳngàydàivàquangkỳngàyngắn[25].Những locus này tạo nên con đường ra hoa tự chủ, phản ánh vai trò của chúng trong việc thúc đẩy sự ra hoa độc lập với độ dài ngày Các thành phần của con đường này ngăn chặnsựtíchtụcủacácmRNAmãhóaFLC,mộtyếutốngănchặnsựrahoa.Tác động này củaFLCphụ thuộc vào hàm lượng, và do đóFLChoạt động như một yếu tố xác định khả năng của các con đường ra hoa để đáp ứng với các tín hiệu Vì vậy, con đường tự chủ thúc đẩy sự ra hoa một cách gián tiếp bằng cách tạo điều kiện đáp ứng các tín hiệu tích cực thúc đẩy sự ra hoa [26].

1.1.3.4 Con đường dựa trên hoạt động củaGibberellin

Gibberellin (GAs) đóng vai trò quan trọng trong tăng trưởng thực vật, bao gồm nảy mầm, kéo dài lá mầm, tổng hợp diệp lục và ra hoa Đột biến làm giảm tín hiệu GAs (GA1) hoặc sinh tổng hợp GAs (GAL-3) gây ra sự chậm trễ ra hoa, đặc biệt trong điều kiện ngày ngắn Xử lý bằng GAs có thể khởi đầu quá trình chuyển đổi hoa Các đột biến trong gen sinh tổng hợp hoặc con đường tín hiệu GAs ảnh hưởng đến thời gian ra hoa GAs hoạt động độc lập với con đường quang chu kỳ Đột biến GA1 kết hợp với đột biến quang chu kỳ biểu hiện kiểu hình cộng gộp, ra hoa muộn trong điều kiện ngày dài GAs thúc đẩy hình thành hoa bằng cách kích thích biểu hiện các yếu tố tích hợp hoa như LEAFY (LFY).

Một số yếu tố ảnh hưởng đến sự ra hoa ởthựcvật

1.2.1 Độtuổi Để chuyển đổi chồi sinh dưỡng thành chồi sinh sản, thực vật cần bước vào giai đoạn trưởng thành Ở giai đoạn này, mô phân sinh ngọn có đủ khả năng đáp ứng với các kích thích ra hoa và cây có khả năng tạo hormone ra hoa[32] Mỗi nhóm cây có thời gian đạt trạng thái trưởng thành khác nhau Chẳng hạn, cà chua đạt trạng thái trưởng thành rất sớm khoảng vài tuần, táo khoảng 4 - 8 năm và cây phong ngô đồng là 25 - 30 năm Trong một số trường hợp, sự ra hoa bị ngăn cản bởi điều kiện tăng trưởng một cách quá mức, ngược lại, hạn chế tăng trưởng trong chừng mực nào đó cũng có thể kích thích ra hoa, tạo quả trong một số trường hợp[33].

Hầu hết thực vật hạt kín đều phải trải qua một giai đoạn sinh trưởng cần thiết trước khi đạt đến trạng thái ra hoa Tuổi ra hoa là đặc tính di truyền của thực vật và thayđổitheoloài;tuynhiêncáctácđộngbênngoàinhưchếđộdinhdưỡng,nhiệtđộ, quangkỳcóthểcóảnhhưởngđếnviệcthayđổiđộtuổirahoa.Chẳnghạn,sựrahoa và tạo quả ở cây Đậu bắp (Abelmoschus esculentus(L.) Moench) bị ảnh hưởng bởi độ tuổi bắt đầu cảm ứng quang kỳ và thời gian cảm ứng quang kỳ[34].

Sự thay đổi nhiệt độ từ đông sang xuân kích thích quá trình sinh sản của thực vật Tín hiệu lạnh kéo dài khiến thực vật cảm ứng ra hoa, gọi là hiện tượng thọ hàn Quá trình này chia làm hai giai đoạn: thực vật cảm nhận tín hiệu lạnh và dựa trên đó hình thành nụ hoa vào xuân hoặc hạ Đa số thực vật cần vài tuần đến vài tháng để ra hoa sau khi trải qua thọ hàn Nhiệt độ lạnh được sử dụng để xử lý thọ hàn thường khác nhau tùy theo loài thực vật, tác động vào mô phân sinh ngọn (nơi phân chia tế bào).

Môphânsinhnhậnbiếtnhiệtđộthấp,tạovàduytrìtínhiệurahoasaunhiềulầnphân chia tế bào và thoát khỏi trạng thái sinh dưỡng sau một thời gian dài Sự truyền tín hiệuthọhànliênquantớiquátrìnhkiểmsoátditruyềnbiểusinh[33].Nhiệtđộcũng được xem là một yếu tố được sử dụng để kích thích sự ra hoain vitroở thực vật Chẳng hạn, cây conPlumbago auriculataLam được duy trì ở nhiệt độ luân phiên 35°C và 25°C trong 12 giờ cho sự hình thành nụ hoain vitrovới tỉ lệ hơn 90%[5].

Sự đa dạng về mặt phân bố của thực vật ngoài tự nhiên có liên quan mật thiết đến thời gian và cường độ chiếu sáng tại khu vực phân bố Ánh sáng rất quan trọng vớihầuhếtcácloàithựcvậtđểtiếnhànhcácquátrìnhtổnghợpcácchấtchocáchoạt động sống Ngoài ra,ánh sáng còn là thông tin môi trường cần thiết đối với sự phát triển ở thực vật Một số loài thực vật dựa trên sự thay đổi độ dài ngày (quang kỳ)đ ể điều chỉnh thời gian ra hoa của chúng phù hợp với những thay đổi theo mùa nhằm tăngkhảnăngsinhsảnthànhcông.Dựavàonhucầuánhsángcóthểchiathựcvậtra làm ba nhóm: cây ngày dài, cây ngày ngắn và cây trung tính[35] Bên cạnh đó, chất lượng ánh sáng không chỉ đóng một vai trò quan trọng trong quá trình sinh trưởng của cây mà còn trong giai đoạn sinh sản của cây [24] Tuy nhiên, phần lớn các loài thực vật có tính chất ban ngày và phần lớn ra hoa sau một thời gian phát triển sinh dưỡng, bất kể quang kỳ[35].

1.2.4 Chất điều hoà sinh trưởng thựcvật

Auxin thường được tổng hợp ở đỉnh chồi, lá non và mô phân sinh, sau đó vận chuyển theo hướng gốc đến rễ và tích tụ ở đó[33] Các sự kiện do auxin kiểm soát baogồmphânchiatếbào,mởrộngtếbàovàbiệthóatếbào,điềuchỉnhcácmôhình tăngtrưởngvàpháttriểnởthựcvật.Sự phânbốcủaauxintrongtoànbộcâychủyếu xảy ra thông qua quá trình vận chuyển phân cực Do đó, auxin được phân bố khác nhaugiữacácmô,tạoramộtkhoảngnồngđộkíchhoạtcácphảnứngpháttriểnởcác cơ quan thực vật khác nhau Sự phát triển hoa là kết quả của sự điều hoà cân bằng giữa kích cỡ mô phân sinh và phối hợp với sự hình thành cơ quan hoa Kích cỡ của mô phân sinh hoa được điều hoà bởi cytokinin, GAs và auxin, trong đó auxin đóng vai trò chính trong sự khởi phát cơ quan hoa cũng như sự phát sinh cơ quan củathực vật Tín hiệu auxin đóng một vai trò quan trọng trong sự phát triển của thực vật và trong các phản ứng tăng trưởng của các cơ quan thực vật đối với các tín hiệu môi trường Tùy thuộc vào nồng độ và đặc điểm nhận dạng mô, auxin có thể kích thích hoặc ức chế sự kéo dài tế bào ở một bên của một cơ quan nhất định, dẫn đến sự phát triển khác biệt và do đó, dẫn đến sự uốn cong của cơ quan hoa[36].

Cytokinin ảnh hưởng đến nhiều quá trình sinh trưởng và phát triển ở thực vật, bao gồm cả quá trình chuyển hóa hoa Bằng chứng cho thấy rằng cytokinin đóng vai trò quan trọng trong quá trình hình thành và phát triển của hoa, từ giai đoạn khởi phát hoa đến giai đoạn nở hoa.

Cytokinin làm tăng số lượng hoa, những thay đổi về cấu trúc cơ quan và những nụ hoa thứ cấp trên câyRosa damascena[37] Nó cũng có thể ảnh hưởngđến biểu hiệnk của các gen cấu trúc hoa Cytokinin làm tăng số lượng cánh hoa ở câyArabidopsisvà tăng kích thước mô phân sinh hoa vì nó thúc đẩy sự biểu hiện genWUSCHELvàứcchếbiểuhiệngenCLAVATA.TácđộngphốihợpcủagenCLAVATAvàWUSCHEL kiểm soát sự tăng sinh tế bào và phân hóa ở mô phân sinh ngọn[ 38].

Cytokinincũngđượcchứngminhlàcóảnhhưởngđếnviệckíchhoạtsựphânbàovà ảnh hưởng cho sự phát triển của hạt phấn ở thực vật[39].

GAsđượctổnghợpchủyếutrongcáccơquanđangsinhtrưởngnhưphôiđang sinh trưởng, lá non, rễ non, quả non, và trong tế bào thì được tổng hợp mạnh ở trong lụclạp.GAskíchthíchkéodàitếbàobởicơchếkiểmsoáthướngcácvisợicellulose mớiđượctổnghợptrongcáctếbào,hiệntượngcótầmquantrọnghàngđầutrongsự tăng trưởng hữu cực của tế bào Nó cũng có tác dụng kéo dài lóng do sự phối hợp hoạt động kéo dài và phân chia tế bào thân Ngoài tác dụng chính là kéo dài tế bào, GAs còn có tác động kích thích sự tăng trưởng của chồi và phá vỡ sự ngủ của chồi, kích thích sự nảy mầm, nảy chồi, sự ra hoa, v.v[33] Trong quá trình ra hoa, GAs kíchthíchsựrahoaởmộtsốloàinhưngnócũngứcchếsựrahoaởmộtsốloàikhác Mặt khác, GAs ít ảnh hưởng đến sự cảm ứng ra hoa ở thực vật ngày ngắn[40].

Axitabscisic(ABA)thườngđượcbiếtđếnvớivaitròtrungtâmtrongcácphản ứngliênquanđếncácstressởthựcvật.SựđónggópcủaABAvàoquátrìnhcảmứng ra hoa vẫn còn gây tranh cãi, vì cả tác động tích cực và tiêu cực đã được ghi nhận[41] ABA thường ức chế sự hình thành nụ hoa, tuy nhiên, nó được báo cáo thúcđẩy sự ra hoa của một số cây ngày ngắn Ở điều kiện hạn hán, sự tích luỹ ABA thường gắn liền với các phản ứng ra hoa sớm ở nhiều loài thực vật [42] Việc sử dụng ABA ngoạisinhgâyrasựthayđổithờigianrahoa,chothấyABAcóthểlàthànhphầnnội sinh ảnh hưởng đến giai đoạn cảm ứng hình thành hoa Ở câyArabidopsis, ABA đã tham gia vào việc kiểm soát quá trình chuyển hoá mầm hoa Trong lá, tín hiệu ABA ảnh hưởng đến sự biểu hiện của các gen ra hoa chịu trách nhiệm sản xuất florigen làFT Ở đỉnh chồi, các yếu tố phiên mãFDtương tác với các protein FT để điều chỉnh phản ứng của ABA Tuy nhiên, ABA cũng điều chỉnh một cách tiêu cực quá trình chuyển đổi hoa bằng cách thúc đẩy trực tiếp quá trình phiên mãFLC[42].

Ethylene (ETH) là một hormone thực vật có chức năng điều chỉnh nhiều khía cạnh của sự sinh trưởng và phát triển của thực vật Là một hormone thể khí, ETH có thể tự do khuếch tán qua màng và được cho là được tổng hợp tại hoặc gần vị trí hoạt động của nó,điều này khác với các hormone thực vật khác Những thay đổi về mức độ ETH gây ảnh hưởng đến các tín hiệu khác nhau để điều chỉnh thời điểm ra hoa ở thựcvật.ETHđóngvaitrònhưmộttínhiệucóthểtươngtácvớisựpháttriểncủasơ khởi hoa, có chức năng như chất điều chỉnh tích cực nhận dạng cơ quan hoa và các gen tăng trưởng, cùng với các con đường truyền tín hiệu nội tiết tố [43] Trong quá trình phát triển hoa, ETH điều chỉnh sự phát triển và trưởng thành của cơ quan sinh sảnvàcánhhoachođếnkhinởhoa.Cácphântíchphiênmã,cácthểđộtbiến,vàứng dụngbênngoàicủacácchấtkíchthíchvàứcchếETHđãchứngminhrằngETHđiều chỉnhsựkéodàicủanhịhoa,sựpháttriểnvàtrưởngthànhcủabaophấnvàphấnhoa, sự hình thành và trưởng thành của nhụy hoa và noãn, và sự lão hóa và rụng củacánh hoa.ETHcũngliênquanđếnquátrìnhchuyểnđổihìnhthànhhoacái,phầnlớnởcác cây đơn tính họ bầu bí Các sự kiện thụ phấn và thụ tinh thành công kích thích đậu quảvàpháttriểnquảsớmởcácloàinhưcàchuavàbíxanhcũngphụthuộcvàoviệc giảm sản xuất ETH ở hoa[44].

1.2.5 Một số chất khác ảnh hưởng đến sự ra hoa ở thựcvật 1.2.5.1 Polyamine

Polyamine (PA), là những hợp chất hữu cơ bao gồm có 2 hoặc nhiều nhóm amin, hoạt động như chất điều hòa sinh trưởng và được coi là phổ biến trong tất cả cácsinhvậtsống.Putrescine(Put),Spermidine(Spd),Spermine(Spm)làcácloạiPA có mặt phổ biến trong sinh vật sống bao gồm cả thực vật Ở thực vật, các PA này đóng một vai trò quan trọng trong các quá trình sinh học trong suốt vòng đời Vì PA có thể tương tác với các đại phân tử của tế bào, chẳng hạn như DNA, RNA, chất nhiễm sắc và phospholipid, cũng như với protein; sự tương tác này giải thích mối quanhệcủachúngvớinhiềuquátrìnhcơbảncủatếbào,baogồmđiềuhòabiểuhiện gen,dịchmã,táicấutrúcchấtnhiễmsắc,kíchhoạtprotein,tăngsinhtếbào,điềuhòa tín hiệu tế bào, ổn định màng và điều chỉnh sự chết của tế bào[45].

PAliênquanđếnviệcđiềuchỉnhcácquátrìnhsinhtrưởngvàpháttriểnởthực vật Chúng ảnh hưởng đến sự phát triển rễ sơ cấp, bên và bất định, cấu trúc thực vật, quá trình tạo phôi soma (SE) và phát sinh cơ quan, ra hoa, quá trình chín của quả, và sự lão hóa của lá và hoa Các phương pháp di truyền, sinh hóa và chuyển gen đã chứng minh rằng quá trình trao đổi chất của các loaiạ

PA khác nhau được điều hòa chặtchẽvàsựmấtcânbằngtrongcânbằngnộimôicủachúngdẫnđếncáckiểuhình bất thường Hơn nữa, mỗi PA có thể có tác động khác nhau đến quá trình trao đổi chất, tăng trưởng và phát triển ở thực vật[46].

PA đóng vai trò quan trọng trong quá trình ra hoa và phát triển cơ quan hoa Ở hoa trưởng thành của Phaseolus vulgaris, noãn chứa nhiều PA tự do hơn các cơ quan hoa khác, trong khi nhị lại chứa nhiều PA liên kết Trong giai đoạn đầu phát triển hoa ở hoa hồng, hàm lượng Put và Spd là 2 loại PA chủ yếu PA gây ức chế sự ra hoa dưới điều kiện cảm ứng quang kỳ ở Lemna pansicostata Ở hoa Citrus sinesis, sự tổng hợp Put và Spd tăng trong suốt giai đoạn đầu phát triển, sau đó giảm rồi tăng lên ở giai đoạn nở hoa Như vậy, loại và hàm lượng PA cần thiết phụ thuộc vào giai đoạn ra hoa và loài thực vật.

Một số nghiên cứu ra hoa và tạo quảinvitro

Một trong những giai đoạn quan trọng nhất trong vòng đờicủathực vật là chuyển đổi từ quá trình sinh dưỡng sang sinh sản[62] Quá trình này bị ảnh hưởng bởi các yếu tố khác nhau, chẳng hạn như PGR, ánh sáng, nhiệt độ và những yếu tố khácđóngvaitròlàcácyếutốkíchhoạthìnhtháiditruyềnchoquátrìnhchuyểnđổi

[1,9].Cónhiềuyếutốảnhhưởngđếnsựrahoainvitronhưdinhdưỡng,khoáng,ánh sáng, nhiệt độ, các PGR Chẳng hạn, nhiệt độ tác động lên hoạt động của enzyme ascorbateperoxidasevàgâyrasựrahoacủacâyArabidopsisthaliana;hoặcđiềukiện ánhsángkhácnhauảnhhưởngđếnsựrahoasớmởtre.Giảmdinhdưỡngvàkhoáng làmtăngtốcđộrahoainvitroởA.thaliana.Paclobutrazole,đènLEDvàsucroseảnh hưởng đáng kể đối với sự ra hoa của câyEuphorbia miliinuôi cấyin vitro Sử dụngAgNO 3 ảnh hưởng tốt đến sự ra hoa của một số loài chiCapsicum[2] Trong số đó,các chất điều hoà sinh trưởng là nhân tố quan trọng trong lĩnh vực ra hoain vitroở thực vật Một số nghiên cứu sử dụng nguồn mẫu và chất điều hoà sinh trưởng khác nhau lên sự ra hoain vitrocủa một số cây trồng được trình bày ở Bảng1.1.

Bảng 1.1 Một số PGR ảnh hưởng đến sự ra hoain vitroở một số loài thực vật

Loài Mẫu cấy ban đầu PGR

Ammi majusL Đốt thân IAA, kinetin, casein hydrolysate, adenin, glutamine, IBA

Ananas bracteatusvar.tricolor Mô sẹo BA, NAA

Artemisia annuaL Cơ quan sinhdưỡng Myo inositol, NAA, BA, GA3, L- asparagine, L-arginine, glutamine

(L.) Moench Chồi ngọn BA, kinetin, IBA, IAA

Sweet Banana Phôi hợp tử NAA, Ag2O3S2

Ceropegia bulbosavar. bulbosa Đốt thân GA3, BA

B.G.Kulk Đốt thân BA, spermine

Chenopodium muraleL Đốt thân BA, IAA, GA3

Cichorium intybusL TCL NAA, BA, IAA

Cichorium intybusL Mô sẹo 2iP, GA3, AgNO3

Citrus nobilisLour xC. delicoisaTenora (Kinnow mandarin) Noãn Kinetin, sucrose

Rchb.f Thân rễ NAA, BA, GA3

Loài Mẫu cấy ban đầu PGR

DendrobiumSecond Love Mô phân sinhđỉnh TDZ, IAA, zeatin

Ellis cv ‘Veitchii’ Đốt thân Paclobutrazole

Kniphofia leucocephala Chồi BA, 2iP, zeatin, GA3

Mill Lá, đoạn thân BA, ABA, IAA

Momordica charantiaL Chồi đỉnh BA, Kinetin

Nicotiana tabacumL TCL IAA, kinetin

Ocimum basilicumL Đốt thân Kinetin, BA, IAA, GA3, NAA

Ocimum basilicumL Chồi ngọn GA3

Oxalis corniculata Chồi ngọn NAA, kinetin

Phyllanthus niruriL Đốt thân BA, kinetin, GA3

Pisum sativumL Lá mầm, đốtthân, chồingọn

Ptilotus spicatusBenth Đốt thân Ethephon, ETH

Nak Chồi đỉnh, chồi nách GA3, GA4, B9

Rhododendronspp Nụ hoa/ Nhị TDZ, 2iP

Ribes nigrumL Đốt thân GA3, IBA, cytokinins

(Turez.) Schishk Rễ, đốt thân, lá 2,4-D, NAA, BA, ABA, ethephon

Scoparia dulcisL Mô sẹo IAA, BA, NAA, IBA, kinetin

(Jaeq) Gaertn Tế bào trần 2,4-D, NAA, BA, zeatin

KỹthuậtinvitrotạođiềukiệnthuậnlợiđểhiểuđượcvaitròcủaPGR,đường, khoáng,ionBạc,v.vđốivớisựrahoavàđặcbiệtlàsựtạoquảtrongmôitrườngđược kiểm soát hoàn toàn, nơi tất cả các yếu tố khác (như yếu tố hóa học, vật lý, sinhhọc) làkhôngđổi.Mộtsốnghiêncứuvềtạoquảinvitrođượcghinhậnởmộtsốloàithực vật khác nhau thể hiện ở Bảng1.2.

Bảng 1.2 Sự tạo quả và hạt ở một số loài thực vật trong điều kiện nuôi cấyin vitro.

Loài Mẫu cấy ban đầu Tạo quả Tạo hạt Hạt có khả năng nảy mầm Nguồn

Hemadri Đốt thân + kth kth [71]

Cucumis sativus Đốt thân + kth kth [72]

Solanumamericanu m, Solanum villosum Cây con + + +

(+: có khả năng, kth: không thể hiện)

Thông thường, sự tạo quảin vitrothường được ghi nhận gắn liền với các nghiên cứu ra hoain vitrovà khả năng tạo quả khác nhau trên mỗi loài thực vật đã được ghi nhận.

Chẳng hạn, câyLycopersicon esculentumtái sinh từ các mẫu cấy lá đãrahoainvitrotrênmôitrườngMSbổsung2mg/LBA,1mg/LABAvà0,5mg/L

IAA.Quảinvitrohìnhthànhtrongvòng162ngàysaukhitựthụphấn[73].Sựrahoa và tạo quả ở cà chua cũng được ghi nhận trong điều kiệnin vitro Cây tái sinh từ các mẫu lá được nuôi cấy trên môi trường chứa Timentin (100 - 400 mg/L) bổ sung kết hợp IAA (0,1 mg/L) và Zeatin (2,0 mg/L) đã ra hoa và tạo quảin vitrovới tần suất cao Ngoài ra, hạt cũng được hình thành trong điều kiệnin vitrovà cho thấy sự nảy mầm bình thường[66].

Việc bổ sung Ag2O3S2đã cải thiện cảm ứng ra hoa và tạo quảin vitrovới tầnsuất cao ở hai loàiSolanum(S americanumvàS villosum) Hoa được tạo ra trongvòng 90 ngày nuôi cấy trong môi trường chứa 40 μM AgM Ag2O3S2 Việc tăng nồng độsucrose lên 5,0% và thụ phấn bằng tay đã nâng cao hiệu suất đậu quảin vitro Tất cả hoa và quả đều có kích thước và màu sắc bình thường so với câyin vivo Tần số nảy mầm của hạt được tạoin vitrolà 86,4% (S americanum) đến 94,5% (S villosum)[10] AgNO 3 (hoặc Ag2O3S2) cũng được sử dụng để gây ra hoa và đậu quảin vitrovới tần suất cao ở một số giốngCapsicum[2].

Trên môi trường MS không có chất điều hòa sinh trưởng PGR, 97% chồi Phyllanthus niruriL nuôi cấy ra hoa và đậu quả in vitro Hoa xuất hiện lần đầu sau 12 ngày, quả hình thành sau 20 ngày nuôi cấy Thêm GA3 0,5mg/L vào môi trường MS thúc đẩy ra hoa in vitro sớm hơn một tuần nhưng ức chế đậu quả Trên chồi tái sinh từ mẫu cấy đốt thân Cleome viscosa cũng ghi nhận ra hoa và tạo hạt in vitro Chồi hoa bắt nguồn từ chồi tỏi sinh trưởng trên môi trường MS bổ sung BA 0,25 mg/L, IBA 0,5 mg/L và sucrose 40 g/L Nụ hoa nở trong điều kiện ánh sáng yếu, chu kỳ chiếu sáng 15 giờ/ngày trong vòng 3 tuần kể từ khi bắt đầu nuôi cấy Chồi không ra hoa trong bóng tối Quả in vitro hình thành sau 5 tuần nuôi cấy Hạt từ quả hình thành cây mới.

Cây conDendrobium officinaleKimuraetMigo có chiều cao 2 - 4 cm, được duy trìin vitrovà cảm ứng ra hoa với tỉ lệ cụm hoa cao nhất (83,2%) và hoa bình thường(73,6%)đượctạoratrênmôitrườngMSbổsung15%nướcdừavà0,1mg/L TDZ trong vòng 9 tuần Hoain vitrođược thụ phấn nhân tạo và hầu hết các hạt tạo thành đều nảy mầm trên môi trường MS[74] Trên câyScrophularia takesimensisNakai, tần số cảm ứng ra hoa lớn nhất (96,8%) thu được khi các chồi được nuôi cấy trên môi trường MS cải tiến có chứa 6% sucrose dưới đèn LED xanh lam trongvòng 45 ngày Cây phát triển hoa được duy trìin vitrocó khả năng hình thành quả [69].

CâyCeropegiarollaeHemadrichotỉlệcảmứngchồihoatốiđa(91,67%)vàsốchồi hoa trên mỗi mẫu cấy (7,33 chồi hoa) trên môi trường MS bổ sung 6% sucrose và NAA Người ta cũng quan sát thấy nang quảin vitrodo kết quả của quá trình tự thụ phấn[71]. ẢnhhưởngcủaPGR,đườngsucrosevànhiệtđộlênsựtáisinhchồi,rahoavà đậuquảinvitrocủacâyWithaniasomniferađãđượcnghiêncứu.Tầnsuấtrahoacao nhất(88%)vớitrungbình8,3hoatrênmỗichồivàtầnsuấtđậuquảlớnnhất(74,9%) thu được khi các ngọn chồi được nuôi cấy trên môi trường MS có bổ sung 0,3 mg/L BAvà60g/

Lsucrose.Hạthìnhthànhtừhoainvitronảymầmvớitỉlệ66%trênmôitrường MS có chứa 0,3 mg/

Khái quát về cây chanhdây tím

Giới(regnum) : Thực vật (Plantae) Ngành(division) : Hạt kín(Magnoliophyta) Lớp(class) : Hai lá mầm (Magnoliopsida) Bộ(ordo) : Sơ Ri(Malpighiales)

Họ(familia) : Lạc Tiên (Passifloraceae) Chi(genus) :Passiflora

Loài(species) :Passiflora edulisSims f.edulis

Thân: cây chanh dây có thân dạng dây leo bán thân gỗ lâu năm, thường xanh hoặc bán thường xanh Mỗi đốt có một tua cuốn phát triển ở nách lá.

Lá: Lá có dạng ba thùy, màu xanh, viền ngoài có dạng răng cưa, cây non lá ít chia thùy và có hình trái xoan.

Hoa: Hoa phát triển ở nách lá, hoa lưỡng tính.

Quả: Quả có dạng hình bầu dục, vỏ quả trơn láng và cứng, đường kính từ 5 - 7 cm, trọng lượng quả từ 80 - 110 gam, có khoảng 100 - 180 hạt/quả [14].

Chanh dây phát triển tốt nhất ở khí hậu cận nhiệt đới Lượng mưa hàng năm cần tối thiểu là 900 mm/năm Loài cây này có rễ ăn nông nhưng chịu được khô hạn bằng cách làm rụng lá Chanh dây chịu được nhiều loại đất và phát triển tốt nhấttrên đất thịt pha cát, thoát nước tốt, độ pH từ 6,5 đến 7,5 Nhìn chung, chanh dây thích nghi với nhiều dạng khí hậu, độ cao (0 - 4.500 m) và hệ sinh thái (từ rừng ẩm nhiệt đới đến các vùng khô hạn)[14].

Hình 1.4 Sự phân bố của chiPassiflora (thể hiện tại vùng màu xám)[14].

Các loàiPassifloratập trung chủ yếu vùng Trung và Nam Mỹ, trong đó Nam Mỹ chiếm phần lớn tổng số loài (Hình 1.4) Một số loài cũng được tìm thấy ở các vùng cận nhiệt đới, thậm chí ôn đới ở Bắc và Nam Mỹ và 24 loài có nguồn gốc từ Đông Nam Á,Úc và các đảo ở Thái Bình Dương Sự đa dạng về loài cao nhất trong họPassifloraceaeđượctìmthấylàởColombia,tạiđâyđãtìmthấy167loài(trongđó có 165 loài bản địa), tiếp theo là Brazil (127 loài) và Ecuador (90 loài) Giốngchanh dây tím phổ biến ngày nay có nguồn gốc từ miền nam Brazil, Paraguay kéo dài đến miền bắc Argentina [75].

1.4.1.4 Giá trị của cây chanhdây

Họ Passifloraceae bao gồm hơn 600 loài Trong đó, chiPassifloralà chi lớn nhất với hơn 520 loài, nhưng phần lớn các loài là hoang dại và ít được biết đến, chỉ mộtsốloàicógiátrịthươngmạiđángkể.Trênthếgiới,ngànhthươngmạichanhdây chủyếudựatrêngiốngchanhdâytím(PassifloraedulisSimsf.edulis)vàchanhdây vàng (Passiflora edulisf.flavicarpa)[14].

Chanh dây thường được ăn tươi hoặc ép lấy nước và chế biến thành các dạng thựcphẩmthươngmạikhácnhau.Quaphântíchchothấycó3nhómhoạtchấtchính trongchanhdâylàalkaloid,glycosidvàflavonoidvàmộtsốchấtnhưtannin,phenol, axit béo[76].

Chanh dây được sử dụng trong các bài thuốc dân gian và dùng trong mỹ phẩm ở nhiều quốc gia Các bộ phận khác nhau của cây được chứng minh là có tác dụng giảm đau, chống lo âu, chống viêm, giảm ho, lợi tiểu, ổn định huyết áp và an thần Nó có tác dụng đầy hứa hẹn đối với việc hỗ trợ chữa trị các rối loạn thần kinh, các bệnh tim mạch và ung thư [77] Ngoài ra, hạt chanh dây cũng cung cấp nhiều dinh dưỡng như chất xơ, protein, carbohydrate và các khoáng chất thiết yếucó thểbổsungvàochếđộănuốngcủaconngườivàthứcănchănnuôi.Bêncạnhđóhạt chanh dây có thể được sử dụng làm nguyên liệu để chiết xuất dầu[78].

1.4.2 Một số nghiên cứu trên cây chanh dây tím trong điều kiện invitro

Các nghiên cứu về cây chanh dây tím nuôi cấy trong điều kiệnin vitrođược ghinhậnhiệntạichủyếutậptrungvàomộtsốgiaiđoạntrongquátrìnhvinhângiống (Bảng1.3).

Bảng 1.3 Một số nghiên cứu trên cây chanh dây tím trong điều kiệnin vitro.

2 Những hiểu biết mới đối với quá trình phát sinh cơ quan in vitrotrên chiPassiflora 2007 [80]

3 Sựphátsinhcơquantừmẫurễcủaloàichanhdâythương mạiPassiflora edulisSims và loài chanh dây hoang dạiPassiflora cincinnataMasters

4 Tạo phôi soma từ phôi hợp tử trưởng thành của kiểu gen cây chanh dây thương mại (Passiflora edulisSims) 2011 [82]

5 Phân tích giải phẫu và cấu trúc của sự phát sinh cơ quanin vitrotừ mẫu rễ của cây chanh dây thương mại

6 Các phản ứng đối với việc tạo phôi soma ở một số loài

7 Sự chuyển đổi phát sinh chồide novohoặc sự tạo phôi soma từ nuôi cấyin vitrophôi hợp tử trưởng thành của chanhdây(PassifloraedulisSims)đượcđiềuchỉnhbằng tỷ lệ giữa auxin và cytokinin trong môi trường nuôicấy

8 Những thay đổi về tế bào và phân tử liên quan đến quá trình tạo phôi soma của chanh dây: mô tả đặc tính cấu trúc và phân tích biểu hiện genSERK 2016 [86]

9 ẢnhhưởngcủaPGRvàchấtchốngoxyhóađếnkhảnăng tái sinh câyin vitrovà tạo mô sẹo từ mẫu lá chanh dây tím 2017 [87]

10 Nghiên cứu tạo mô sẹoin vitrotrênPassiflora edulis

Sims: một cây thuốc quý 2017 [88]

11 Kíchthíchsựphátsinhchồithôngquanuôicấylớpmỏng tế bào lá ởPassiflora edulisSims 2018 [89]

12 Tái sinh cây tam bộiin vitrotừ nuôi cấy nội nhũ của cây chanh dây thương mại 2018 [90]

13 Thiết lập nguồn mẫu cấy vô tính cây chanh dây tím và cây chanh dây vàng 2018 [91]

14 Sự tái sinh chồi và vi nhân giống ở cây chanh dây tím thông qua nuôi cấy các mẫu cấy lớp mỏng tế bào cắt dọc 2019 [92]

16 Nhân giốngin vitrocâyPassiflora edulistừ đoạn thân dưới ảnh hưởng của thành phần môi trường nuôi cấy 2021 [94]

17 Polyethylene glycol thúc đẩy sự trưởng thành của phôi somaởPassifloraedulisSims'UENFRioDourado'bằng cáchtíchlũycácproteinvàđiềuchỉnhhàmlượngcácPAnộisinh 2022 [95]

18 Ứng dụng kỹ thuật nuôi cấy lớp mỏng ở chanh dây trong tái sinh thực vật và vi nhân giống 2022 [96]

19 Các hạt nano selen thúc đẩy sự ra rễ bất định mà không hình thành mô sẹo ở gốc chồi chanh dây thông qua thay đổi cân bằng hormone 2023 [97]

20 Sản xuất chồiin vitrochanh dây sạch virus bằng phương pháp nuôi cấy mô phân sinh đỉnh 2023 [98]

Các nghiên cứu về cây chanh dây tím nuôi cấy trong điều kiệnin vitrođược ghinhậnhiệntạichủyếutậptrungvàomộtsốgiaiđoạntrongquátrìnhvinhângiống

Hiệu quả của nhân giống in vitro ở cây chanh dây tím có thể phụ thuộc vào nguồn mẫu và phương pháp khử trùng Các nghiên cứu đã chỉ ra rằng sử dụng đốt thân in vitro khử trùng bằng AgNPs 0,1% trong 15 phút cho tỷ lệ khử trùng và tái sinh chồi cao nhất Ngoài ra, sử dụng meta-Topoline và ánh sáng đỏ cũng giúp cải thiện hiệu quả nhân chồi Trong khi đó, công nghệ nuôi cấy lớp mỏng tế bào (TCL) và phát sinh phôi soma (SE) được sử dụng rộng rãi để tái sinh cây chanh dây tím in vitro.

1.4.2.1 Nghiên cứu tái sinh chồi dựa trên kỹ thuật nuôi cấy lớp mỏng tếbào

Kỹ thuật TCL được phát triển từ năm 1973 và trở thành một trong những kỹ thuậtnhângiốngđơngiảnvàhiệuquảhiệnnay.MẫucấyTCLbaogồmcácmẫucấy cókíchthướcnhỏ,đượcthiếtlậptừcáccơquankhácnhaucủathựcvật(thân,lá,các cơquanhoa,lámầm,trụlámầm,phôi,v.v).CácmẫucấyTCLthườngđượccắttheo chiềudọc(lTCL,1mm×0,5-10mm)hoặctheochiềungang(tTCL,dàykhoảng0,2

-0,5mmhoặcvàimm).CácmẫucấylTCLchỉchứamộthoặcmộtvàiloạimô,chẳng hạn như một lớp tế bào biểu bì hoặc dưới biểu bì, trong khi mẫu cấy tTCL bao gồm nhiều tế bào từ các loại mô khácnhau.

Các phương pháp dựa trên các kỹ thuật TCL đã được phát triển và ứng dụng thành công cho nhiều loài thực vật để nhân giốngin vitro, chuyển gen, sản xuất hạt nhân tạo, bảo quản lạnh và chọn lọcin vitro Đối với lĩnh vực nuôi cấy mô thực vật, việcsửdụngkỹthuậtTCLcóthểmanglạilợiíchtheonhiềuphươngdiệnnhưmôtả ởHình1.5.Vìvậy,tầmquantrọngcủaTCLtrongcôngtácnuôicấymôvàcôngnghệ sinh học thực vật ở hiện tại và trong tương lai là không thể phủnhận.

Hình 1.5 Một số ưu điểm của kỹ thuật nuôi cấy TCL.

Khi sử dụng mẫu cấy TCL, diện tích bề mặt của mẫu tiếp xúc với môi trường tương đối lớn hơn so với mẫu cấy thông thường và việc vận chuyển các thành phần của môi trường hiệu quả hơn vì chúng có thể tiếp cận các tế bào tiềm năng của mẫu cấy;điềunàychophépquátrìnhhìnhthànhcơquanhoặcphảnứngtạophôidễdàng hơn so với các loại mẫu cấy thông thường Do đó, TCL được sử dụng làm vật liệu nuôi cấy trong quá trình nhân giốngin vitrocủa nhiều loài thực vật, cũng như cần thiết cho việc nhân giống và bảo tồn các loài thực vật có nguy cơ tuyệt chủng và các loàicógiátrịthươngmạicao[96].KỹthuậtTCLđãđượcứngdụngtrênnhiềuloài cây dược liệu nhưScutellaria ocmulgee[99],Withania coagulans[100],Panaxvietnamensisvar.langbianensis[101].Kỹthuậtnàycũngđượcsửdụn gtrongtáisinh nhiềuloàicâyrauvàcâyănquả,chẳnghạnnhưRubusspp.

[102],Ficuscarica[103],Actinidia chinensisPlanch [104] Kỹ thuật TCL đã được ứng dụng thành công trong vinhângiốnghơn20loàiphonglan[105- 108]vànhiềuloàicâycảnhkhácnhưLilium[109],Cattleya forbesiiLindl

[110],Begonia×tuberhybridaVoss [111],CliviaminiataRegel [112] Ngoài ra, kỹ thuật này cũng mang lại tiềm năng tái sinh khả thi cho các mô khó tái sinh của cây hạt trần và cây rừng [113] Ví dụ, một quy trình tạo phôiin vitrohiệu quả từ các mẫu cấy TCL có nguồn gốc từ phôi hợp tử củaPinuspatulađã được báo cáo, vượt qua những hạn chế do sự không tương thích về tăng trưởngin vitrocủa loài cây này[114]. Đốivớichanhdâytím,nhângiốnginvitrochủyếudựavàotáisinhchồi[115] Quá trình tái sinh này đã được thực hiện thành công từ một số loại mô và cơ quan khác nhau, chẳng hạn như trụ lá mầm [80,116], rễ [81], lá [87], nội nhũ [90] và đốt thân [93] Trong đó, kỹ thuật TCL đóng vai trò quan trọng trong quá trình tái sinh chồi của chanh dây tím; tuy nhiên, nguồn mẫu TCL được sử dụng chủ yếu từ lá và lóng thânin vitro[89,92,96] Đối với lóng thânex vitro, Hiếu và cộng sự (2018) cũngbáocáorằngcácmẫuđoạnlóngchỉtạoramôsẹochứkhôngtạochồitrongđiều kiệnnuôicấyinvitro[91].Dođó,việckhảosátsựtáisinhdựatrêncácmẫucấyTCL đối với các nguồn mẫuex vitrosẽ góp phần cải thiện hiệu suất và tăng cường nguồn mẫu ban đầu cho quá trình sản xuất cây chanh dây tíminvitro.

1.4.2.2 Nghiên cứu phát sinh phôisoma

Phát sinh cơ quan là con đường chính cho hệ thống tái sinhin vitrocủa nhiều loài chanh dây[117] Nhiều nghiên cứu đã chỉ ra rằng sự tái sinh cây chanh dây có thể thu được thông qua quá trình hình thành cơ quan từ các mô khác nhau [81,87,96,118] Mặt khác, tái sinh sinh dưỡng thông qua sự phát sinh SE đã được đề xuất để mang lại lợi thế so với phát sinh cơ quan về hiệu quả nhân giống và giảm sự hình thànhcácthểbiếndị[119].TáisinhthựcvậtthôngquaSErấtđượcmongđợiđốivới vinhângiốngđểcảithiệnsựpháttriểncủacâyconđồngnhất[120].Bêncạnhđó,sự phát sinh SE đóng vai trò quan trọng trong nhân giốngin vitrovà bảo tồn nguồn gen củanhiềuloàithựcvật[115,121].Ngoàira,sựphátsinhSEcòncómộtsốứngdụng thiết yếu khác trong nhân giống cây trồng dựa trên các công cụ công nghệ sinh học[122].

Con đường tái tạo này cung cấp một nền tảng hiệu quả cho việc nhân giống cây trồng bằng các kỹ thuật di truyền như công nghệ chuyển gen, công cụ chỉnh sửa bộ gen [123], hoặc đa bội hóa nhân tạo [124] Vì vậy, tái sinh thực vật thông qua sự phát sinh SE là một hướng nghiên cứu tiềm năng.

NỘI DUNG, VẬT LIỆU VÀPHƯƠNGPHÁP

Nội dungnghiên cứu

Đề tài nghiên cứu được thực hiện theo các nội dung được thể hiện ở Hình2.1, cụ thể với 2 nội dung chính nhưsau:

Nội dung 1: Nghiên cứu tạo nguồn mẫu cấy in vitro cây chanh dây tím

Mục đích:Tạo nguồn mẫu cấy số lượng lớn phục vụ cho các thí nghiệm về sự ra hoa và bước đầu tạo quảin vitro.

Nghiên cứu này bao gồm các mục tiêu chính sau: Nghiên cứu tái sinh chồi từ các mẫu cấy mô thân lóng thân in vitro nhằm xác định các điều kiện tối ưu để tái sinh chồi, tìm nguồn gen tái sinh chồi cao và đánh giá tiềm năng chuyển nạp gen tái sinh chồi thành cây hoàn chỉnh Nghiên cứu phát sinh phôi soma (SE) từ mẫu cấy lá ex vitro để xác định các điều kiện tối ưu cho sự hình thành phôi, tìm kiếm nguồn gen có khả năng sinh phôi cao và đánh giá tiềm năng chuyển nạp gen sinh phôi thành cây hoàn chỉnh Nghiên cứu nhân nhanh nguồn mẫu cấy chồi thích hợp để thiết lập hệ thống nhân nhanh chồi in vitro có hiệu quả cao và xác định các điều kiện tối ưu cho quá trình nhân nhanh.

Nội dung 2: Khảo sát ảnh hưởng của một số yếu tố đến quá trình ra hoa và bước đầu tạo quả của cây chanh dây tím trong điều kiện nuôi cấy in vitro

Mục đích:Xác định các ảnh hưởng của một số yếu tố như chất điều hoà sinh trưởngthựcvật(PGR),mộtsốmuốivàhạtnanokimloại,vàpolyamine(PA)đếnsự sinh trưởng, ra hoa và tạo quảinvitro.

Khảo sát ảnh hưởng của PGR ngoại sinh đến quá trình ra hoa và tạo quảin vitro: vitro:

- KhảosátảnhhưởngcủaGA 3 đếnsựsinhtrưởng,rahoavàtạoquảinvitro - Khảo sát ảnh hưởng của ABA đến sự sinh trưởng, ra hoa và tạo quả invitro

Khảo sát ảnh hưởng của bạc và coban đến sự sinh trưởng, ra hoa và tạo quảin

- Khảo sát ảnh hưởng của AgNO 3 đến sự sinh trưởng, ra hoa và tạo quả invitro

- Khảo sát ảnh hưởng của AgNPs đến sự sinh trưởng, ra hoa và tạo quả invitro

- Khảo sát ảnh hưởng của CoNPs đến sự sinh trưởng, ra hoa và tạo quả invitro

Khảo sát ảnh hưởng của PA đến sự sinh trưởng, ra hoa và tạo quảin vitro:

- Khảo sát ảnh hưởng của spermidine (Spd) đơn lẻ đến sự sinh trưởng, rahoa và tạo quả invitro

Hình 2.1 Sơ đồ thể hiện khái quát các nội dung nghiên cứu.

Vật liệunghiêncứu

Trong nghiên cứu này, mẫu lá và lóng thân cây chanh dây tím 6 tháng tuổi được xử lý theo quy trình vô trùng của Hieuvà cộng sự (2018) Quy trình gồm các bước sau: thu thập mẫu từ cây khỏe mạnh, rửa dưới vòi nước chảy 10 phút, khử trùng bằng ethanol (70%) 30 giây và rửa lại bằng nước cất 3 lần Sau đó, mẫu được khử trùng bằng dung dịch AgNPs (0,1%) 15 phút, cuối cùng rửa 3 lần bằng nước cất vô trùng Các mẫu được nuôi cấy trong môi trường MS trong 7 ngày, sau khi kiểm tra không nhiễm khuẩn, nấm thì tiến hành sử dụng cho các thí nghiệm.

Trong nội dung 2, các ngọn chồi từ các chồi tái sinh của cây chanh dây tíminvitrotrong môi trường thích hợp được sử dụng để bố trí các thí nghiệm ra hoa Các nguồn vật liệu thực vật ban đầu được thể hiện sơ lược trong Hình 2.2 Các mẫu cấy trong từng thí nghiệm được mô tả cụ thể trong phần Phương pháp nghiên cứu.

Hình 2.2 Các nguồn mẫu cấy ban đầu của nghiên cứu.

2.2.2 Thiết bị, dụng cụ và hóachất

Thiết bị và dụng cụ:

Một số thiết bị chính được sử dụng bao gồm: máy đo hàm lượng diệp lục SPAD-502 (Nhật Bản), tủ an toàn sinh học ESCO (Singapore), tủ sấy Sanyo MOV- 112, tủ sấyMemmert, cân kỹ thuật Precisa (Nhật Bản), cân điện tử, thước cặp điện tử Mitutoyo (Nhật bản), đèn UV hai bước sóng 254 nm và 365 nm, máy cất nước, máy đo pH, nồi hấp vô trùng Các dụng cụ sử dụng bao gồm dao cấy, đĩa cấy, panh cấy, kéo, ống nghiệm thủy tinh, bình nuôi cấy 250 ml, màng lọc vô trùng, bơm tiêm 5 mL, dây thun, túi nilon chịu nhiệt, găng tay và một số dụng cụ hỗ trợ khác Các dụng cụ chuyên dụng được khử trùng bằng autoclave ở 121°C, 1 atm trong 30 phút.

Dung dịch các hạt nano bạc (AgNPs, 500 ppm) và dung dịch các hạt nano coban (CoNPs, 500 ppm) do Viện Công nghệ Môi trường (VAST) cung cấp Dungdịch AgNPs (kích thước nhỏ hơn 20 nm) thu được theo tỉ lệ: [AgNO3] = 750 - 1000 ppm, [β-chitosan]

= 250 - 300 ppm, [NaBH4] 0 ppm, tỉ lệ mol [NaBH4]/[AgNO3]

= 1/4, tốc độ nhỏ giọt của NaBH4là 10 - 12 giọt/phút[136] Dung dịch CoNPs (20 - 60 nm) thu được dựa trên chất khử NaBH4và chất ổn định carboxymethyl cellulose[137].

The following plant growth regulators (PGRs) were used: 1-Naphthaleneacetic acid (NAA, > 98%, Duchefa Biochemie, Netherlands), 2,4-Dichlorophenoxyacetic acid (2,4-D, > 96%, Duchefa Biochemie, Netherlands), 6-Benzyladenine (BA, Sigma-Aldrich, USA), meta-Topoline (mT, > 99%, Duchefa Biochemie, Netherlands), gibberellic acid A3 (GA3, ≥ 99.5%, Sigma-Aldrich, USA), and abscisic acid (ABA, ≥ 99.5%) Other substances included spermidine (Spd, ≥ 99.5%, Sigma-Aldrich, USA), silver nitrate (AgNO3, 99.99%, Sigma-Aldrich, USA), agar (Viet Xo, Vietnam), and sucrose (Bien Hoa, Vietnam).

MôitrườngMurashigeandSkoog(MS)[135]bổsung30g/Lsucrosevà8g/L agar được sử dụng làm môi trường nuôi cấy cơ bản trong nghiên cứu này Các PGR hoặc các chất khác được thêm vào môi trường MS tùy thuộc vào từng thí nghiệm cụ thể được mô tả trong mục Phương pháp nghiên cứu Môi trường nuôi cấy được điều chỉnhđếnpH=5,8trướckhiđượchấptiệttrùngtrongvòng30phútở121°C(1atm).Các môi trường bổ sung GA3hoặc Spd được bổ sung lạnh vào môi trường nuôi cấy(đã hấp khử trùng) sau khi được vụ trựng thụng qua màng lọc vụ trựng (0,22 àm, Sigma-Aldrich,Mỹ).

Phương phápnghiêncứu

2.3.1 Phương pháp bố trí thínghiệm 2.3.1.1 Nội dung 1: Nghiên cứu tạo nguồn mẫu cấy in vitro cây chanh dâytím

 Thí nghiệm 1:Nghiên cứu tái sinh chồi từ các mẫu cấy TCL từ lóng thânexvitro

Thí nghiệm 1.1 Khảo sát ảnh hưởng của vị trí lóng thân đến sự cảm ứng chồi

Các đoạn lóng thânex vitro(1 cm) ở vị trí lóng thứ 1 đến thứ 5 (tính từ ngọn chồi) được cắt theo chiều ngang với độ dày khoảng 0,2 cm để tạo ra các mẫu cấy tTCL như mô tả ở Hình 2.3 Các mẫu cấy tTCL được tiến hành nuôi cấy trong môi trường MS bổ sung kết hợp 1,5 mg/L BA và 1,0 mg/L NAA[138] để so sánh tỉ lệ cảmứngchồitạicácvịtrílóngkhácnhau.Tỉlệcảmứngchồi(%)đượcghinhậnsau 60 ngày nuôicấy.

Hình 2.3 Thiết lập các mẫu cấy tTCL và lTCL từ lóng thânex vitro.

Thí nghiệm 1.2 Khảo sát sự cảm ứng chồi từ các loại mẫu cấy TCL lóng thân

Mụcđích:SosánhhiệuquảcảmứngchồiinvitrocủamẫucấytTCLvàlTCL tại vị trí lóng thân thíchhợp.

Trong nghiên cứu này, những đoạn lóng thân dài hơn được xác định là có tiềm năng cảm ứng chồi tối ưu (phân tích trong thí nghiệm trước) Chúng được sử dụng làm nguồn cấy Các đoạn lóng thân (1 cm) được cắt theo chiều ngang thành 5 mẫu cấy ngang hoặc cắt theo chiều dọc thành 4 mẫu cấy dọc (Hình 2.3) Các mẫu cấy được nuôi cấy trong cùng điều kiện với thí nghiệm 1.1 để so sánh khả năng cảm ứng chồi giữa hai loại mẫu cấy Tỷ lệ cảm ứng chồi (%) và số chồi (lớn hơn 0,5 cm)/mẫu cấy được ghi nhận sau 60 ngày nuôi cấy.

Thí nghiệm 1.3 Ảnh hưởng của AgNPs đến sự tái sinh chồi từ mẫu cấy TCL

Mục đích:Khảo sát ảnh hưởng của AgNPs đến quá trình tái sinh chồi từ mẫu cấy lTCL và oTCL lóng thân.

Các đoạn thân cây dài khoảng 1 cm và đường kính khoảng 0,4 cm được cắt thành 4 mẫu, sau đó loại bỏ phần bên trong và chỉ giữ lại các lớp tế bào bên ngoài (độ dày khoảng 0,1 cm) để tạo thành mẫu cấy oTCL Mặt dưới của mẫu cấy oTCL được đặt tiếp xúc với môi trường nuôi cấy gồm môi trường MS bổ sung 1,5 mg/L BA và 1,0 mg/L NAA.

[138] và các nồng độ AgNPs (0; 1,0; 3,0; 5,0 và 7,0 mg/L) để khảo sát hiệu quả cảm ứng chồi từ hai nguồn mẫu cấy này Các chỉ tiêu về tỉ lệ cảm ứng chồi (%) và số chồi/mẫu được ghi nhận sau 60 ngày nuôi cấy.

Hình 2.4 Sơ đồ thiết lập mẫu cấy lTCL và oTCL từ lóng thânex vitro.

 Thí nghiệm 2:Nghiên cứu phát sinh phôi soma (SE) từ mẫu cấy láexvitro

Thí nghiệm 2.1 Ảnh hưởng của 2,4-D và NAA đến sự phát sinh SE

Mục đích:Khảo sát ảnh hưởng của 2,4-D và NAA đến sự phát sinh SE từ mẫu cấylá.

Mẫu cấy từ láex vitro(1,0 × 1,0 cm) được sử dụng làm mẫu cấy ban đầu.

Trongthínghiệmnày,cácmẫucấyđượcnuôicấytrongmôitrườngMSđượcbổsung 2,4- D(0;1,0;2,0;3,0và4,0mg/L)hoặcNAA(0;1,0;2,0;3,0và4,0mg/L)đểkhảo sát sự cảm ứng SE.

Mỗi nghiệm thức (NT) được tiến hành với 30 bình nuôi cấy, với 3 mẫu mỗi bình Các chỉ tiêu theo dõi bao gồm tỉ lệ cảm ứng SE (%) và số phôi/mẫu được ghi nhận sau 60 ngày nuôi cấy.

Thí nghiệm 2.2 Ảnh hưởng của auxin kết hợp với AgNPs đến sự phát sinh SE

Mục đích:Khảo sát ảnh hưởng của AgNPs trong môi trường chứa auxin đến sự phát sinh SE từ mẫu cấy lá.

Phương pháp tiến hành: ĐểnghiêncứutácđộngcủaAgNPsđốivớisựphátsinhSE,cácmẫulá(1×1 cm) được nuôi cấy trong môi trường MS có bổ sung loại và nồng độ auxin thích hợp (được nghiên cứu ở thí nghiệm phía trước) và bổ sung AgNPs ở các nồng độ khác nhau(0;0,5;1,0;1,5;2,0;2,5và3,0mg/L).MỗiNTđượctiếnhànhvới30bìnhnuôi cấy, với 1 mẫu cấy mỗi bình Các chỉ tiêu theo dõi bao gồm tỉ lệ cảm ứng SE (%) và số phôi/mẫu được ghi nhận sau 75 ngày nuôi cấy, chỉ tiêu số cây con/mẫu được thu nhận sau 90 ngày nuôi cấy.

 Thí nghiệm 3:Nghiên cứu nhân nhanh nguồn mẫu cấy chồi thíchhợp

Tiếptheo,cácchồitáisinhtừnguồnmẫucấyởNTtốiưuđượckhảosátởcác thí nghiệm trước được chọn và được chuyển sang môi trường nuôi cấy để tiến hành nhânnhanhchồi.Cácchồicóchiềudàikhoảng1cmđượcthunhậnvànuôicấytrong môi trường MS có bổ sung cố định 1,0 mg/Lmeta-Topolin (mT)[93] và AgNPs ở các nồng độ khác nhau (0;

1,0; 3,0; 5,0 và 7,0 mg/L) Mỗi NT được bố trí 30 bình nuôicấy(mỗibình1chồi).Cácchỉtiêuvềtỉlệcảmứngchồi(%),sốchồi/mẫu,chiều cao chồi (cm), và chỉ số SPAD được ghi nhận sau 60 ngày nuôicấy.

2.3.1.2 Nội dung 2: Khảo sát ảnh hưởng của một số yếu tố đến quá trình ra hoa vàbước đầu tạo quả của cây chanh dây tím trong điều kiện nuôi cấy invitro

Mục đích:Xác định các ảnh hưởng của một số yếu tố như chất điều hoà sinh trưởngthựcvật(PGR),mộtsốmuốivàhạtnanokimloại,vàpolyamine(PA)đếnsự sinh trưởng, ra hoa và tạo quảinvitro.

Vậtliệuthínghiệm:Chồichanhdây(từquátrìnhtáisinhthíchhợpđượckhảo sátphíatrên)đượcnhânlêntrongmôitrườngtốiưuđượckhảosátởNộidung1.Các chồi sau khi tái sinh được chuyển sang môi trường MS bổ sung 2,5 mg/L IBA[138] đểkíchthíchtạorễtrongvòng60ngày.Ngọnchồi(từcácchồiđãhìnhthànhrễ)với chiềucaokhoảng1,5cm(baogồm1ngọnvà3lá)đượcsửdụnglàmnguồnmẫucấy cho các thí nghiệm ra hoa và tạo quảin vitro(Hình2.5).

Hình 2.5 Sơ đồ mô tả các giai đoạn bố trí thí nghiệm nghiên cứu sự ra hoain vitro của cây chanh dây tím.

 Thí nghiệm 1: Khảo sát ảnh hưởng của PGR ngoại sinh đến quá trình ra hoa và tạo quảinvitro

Thí nghiệm 1.1.Khảo sát ảnh hưởng của GA3đến sự sinh trưởng, ra hoa vàtạo quảin vitro

Phương pháp tiến hành:Chồi chanh dâyin vitrocao khoảng 1,5 cm được chuyển sang môi trường MS cơ bản chứa 30 g/L sucrose và 8 g/L agar và bổ sungcác nồng độ GA3(0; 1,0; 1,5; 2,0; 3,0 mg/L) Sau khi môi trường MS cơ bản được hấp khử trùng, GA3sẽ được lọc qua màng lọc khử trùng và bổ sung lạnh vào môitrườngnuôicấytrongtủcấyvôtrùng.Cácchỉtiêuliênquanđếnquátrìnhsinhtrưởng và ra hoa (được trình bày phía sau) được theo dõi sau 60 ngày nuôicấy.

Thí nghiệm 1.2.Khảo sát ảnh hưởng của ABA đến sự sinh trưởng, ra hoa và tạo quảin vitro

Phươngpháptiếnhành:Chồichanhdâyinvitrocaokhoảng1,5đượcchuyển sangmôitrườngMScơbảnchứa30g/Lsucrosevà8g/LagarvàbổsungABAở các nồng độ khác nhau (0; 1,0; 1,5; 2,0; 3,0 mg/L) Các chỉ tiêu liên quan đến quá trình sinh trưởng và ra hoa được theo dõi sau 60 ngày nuôi cấy.

 Thí nghiệm 2: Khảo sát ảnh hưởng của bạc và coban đến sự sinh trưởng, ra hoa và tạo quảinvitro

Thí nghiệm 2.1.Khảo sát ảnh hưởng của AgNO3đến sự sinh trưởng, ra hoa vàtạo quảin vitro

Phươngpháptiếnhành:Cácngọnchồicóchiềudàikhoảng1,5cmđượcnuôicấytrongmôitrư ờngMScơbản,30g/Lsucrosevà8g/LagarvàbổsungAgNO3(0;1,0; 3,0; 5,0; 7,0; và 9,0 mg/L) tại các nồng độ khác nhau để khảo sát sự ra hoainvitro.Cácchỉtiêuliênquanđếnquátrìnhsinhtrưởngvàrahoađượctheodõisau60 ngày nuôicấy.

Thínghiệm2.2.KhảosátảnhhưởngcủaAgNPsđếnsựsinhtrưởng,rahoavà tạo quảinvitro

Phươngpháptiếnhành:Cácngọnchồicóchiềudàikhoảng1,5cmđượcnuôi cấytrongmôitrườngMScơbảncóbổsungAgNPsởcácnồngđộkhácnhau(0;1,0; 3,0; 5,0; 7,0; và 9,0 mg/L) Các NT không bổ sung AgNPs được sử dụng làm đối chứng Các chỉ tiêu liên quan đến quá trình sinh trưởng và ra hoa được theo dõi sau 60 ngày nuôicấy.

Thí nghiệm 2.3.Khảo sát sự ảnh hưởng của CoNPs đến sự sinh trưởng, rahoa và tạo quảinvitro

Phương pháp tiến hành:Các ngọn chồi có chiều dài khoảng 1,5 cm đượcchuyểnsangmôitrườngMScơbảnhoặcMSloạibỏthànhphầnmuốiCoCl 2 ,cóchứa30g/

Lsucrosevà8g/LagarvàbổsungCoNPsởcácnồngđộkhácnhau(0;0,1;0,2; 0,3; 0,4 và 0,5 mg/L) để khảo sát sự sinh trưởng và ra hoain vitro Các chỉ tiêu liên quan đến quá trình sinh trưởng và ra hoa được theo dõi sau 60 ngày nuôicấy.

 Thí nghiệm 3: Khảo sát ảnh hưởng của polyamine đến sự sinh trưởng, ra hoa và tạo quảinvitro

Thí nghiệm 3.1.Khảo sát ảnh hưởng của spermidine (Spd) đơn lẻ đến sự sinh trưởng, ra hoa và tạo quảin vitro

Các chồi ngọn chanh dây in vitro kích thước khoảng 1,5 cm được chuyển vào môi trường MS có bổ sung các nồng độ Spd (0; 0,05; 0,1; 0,2; 0,3 mM) để đánh giá khả năng ra hoa in vitro Sau khi hấp khử trùng môi trường cơ bản MS, Spd được lọc qua màng lọc khử trùng và bổ sung vô trùng vào môi trường nuôi cấy trong tủ cấy vô trùng Sau 90 ngày nuôi cấy, các chỉ tiêu liên quan đến sự sinh trưởng và ra hoa được theo dõi và đánh giá.

Thí nghiệm 3.2.Khảo sát ảnh hưởng của spermidine kết hợp đến sự sinh trưởng, ra hoa và tạo quảin vitro

KẾT QUẢ VÀTHẢOLUẬN

Nội dung 2: Khảo sát ảnh hưởng của một số yếu tố đến quá trình ra hoa và bước đầu tạo quả của cây chanh dây tím trong điều kiện nuôi cấyinvitro

DựavàocáckếtquảởNộidung1,cácchồitáisinhtừcácmẫucấyoTCLđược nhân nhanh trong môi trường nhân nhanh chồi thích hợp (môi trường MS bổ sung 1 mg/LmTvà5mg/

LAgNPs).Sauđó,cácchồitáisinh(1cm)đượcchuyểnsangnuôi cấytrongcảmứngrarễ(môitrườngMSchứa2,5mg/LIBA)trongvòng60ngàyđể tạo cây hoàn chỉnh Tiếp theo, các ngọn chồi được thu nhận từ các chồi này với độ dài khoảng 1,5 cm (bao gồm 1 đỉnh chồi và 3 lá) được sử dụng để làm nguồn mẫu cấy cho các thí nghiệm ra hoa và tạo quảinvitro.

3.2.1 Ảnh hưởng của một số PGR ngoại sinh đến quá trình ra hoa invitro 3.2.1.1 Ảnh hưởng của GA 3 đến sự sinh trưởng và ra hoa invitro

Trong môi trường bổ sung GA3, chiều cao chồi chanh dây tím tăng đáng kể tại nồng độ 1,0 mg/L và 1,5 mg/L Số lá đạt cao nhất khi sử dụng 1,0 mg/L GA3 Chỉ số SPAD giảm ở nồng độ 2,0 mg/L và 3,0 mg/L GA3, cho thấy sự giảm hàm lượng chlorophyll.

Mặt khác, các nồng độ GA3bổ sung không kíchthích sự ra hoain vitroở cây chanh dâytím.

Bảng 3.3 Ảnh hưởng của GA3đến sự sinh trưởng của chồi chanh dây sau 60 ngàynuôi cấy.

(cm) Số lá /chồi SPAD

* Trong cùng một cột, các giá trị trung bình theo sau bởi cùng một ký tự (a, b,…) thể hiệnsự khác biệt không có ý nghĩa thống kê ở p