Cndt2_Trần Đức Phúc_21126471.Pdf

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH KHOA KHOA HỌC SINH HỌC

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH KHOA KHOA HỌC SINH HỌC

2.2.1 Khái niệm về sinh vật biến đổi gen – GMO 7

2.2.2 Tại sao phải kiểm tra GMO 7

2.2.3 Kiểm tra GMO trên bắp 7

2.2.4 Phương pháp xác định GMO trên bắp 8

CHƯƠNG 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 9

3.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu 9

3.2 Vật liệu nghiên cứu 9

3.2.1 Đối tượng nghiên cứu 9

3.2.2 Thiết bị và dụng cụ 9

3.2.3 Hóa chất sử dụng trong nghiên cứu 9

3.3 Phương pháp nghiên cứu 9

3.4 Các bước tiến hành 9

3.4.1 Ly trích DNA 9

3.4.2 Điện di định tính DNA ly trích và đo OD 12

3.4.3 Khuếch đại DNA bằng phản ứng PCR 12

3.4.4 Điện di phát hiện mẫu GMO 13

CHƯƠNG 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 14

4.1 Kết quả 14

4.1.1 Kết quả điện di định tính DNA 14

ii

4.1.2 Kết qủa đo OD kiểm tra lượng DNA ly trích 14 4.1.3 Kết quả điện di phát hiện GMO 15 4.2 Thảo luận 15

DANH SÁCH CÁC BẢNG

Bảng 3.1 Thành phần hỗn hợp các chất trong phản ứng PCR 13 Bảng 3.2 Thông số chu trình nhiệt của phản ứng PCR 13

iv

DANH SÁCH CÁC HÌNH

Hình 2.1 Quy trình xác định bắp GMO bằng kỹ thuật PCR 8

Hình 3.1 Mẫu sau khi thêm 600 μL SDS buffer 10

Hình 3.2 Mẫu ly tâm ở 10000 vòng/phút trong 5 phút 10

Hình 3.3 Mẫu sau khi ly tâm 11

Hình 3.4 Mẫu sau ly tâm ở 10000 rpm trong 10 phút 11

Hình 4.1 Kết quả điện di DNA tổng số của giếng số 11 xuất hiện band sáng rõ 14 Hình 4.2 Kết quả đo OD 14

Hình 4.3 Kết quả đồ thị sau khi đo OD 15

Hình 4.4 Kết quả điện di phát hiện GMO 15

1.2 Mục tiêu thực hành

Xác định được bắp GMO, phân biệt được bắp GMO và bắp hữu cơ bằng phương pháp PCR

1.3 Nội dung thực hành

Thu mẫu: tiến hành thu hạt của bắp GMO

Ly trích DNA: tiến hành ly trích DNA từ các mẫu nghi ngờ là GMO làm nguồn

6

nguyên liệu cho điện di và cho phản ứng Polymerase Chain Reaction (PCR)

Điện di lần 1: Tiến hành điện di nhầm kiểm tra mẫu ly trích có chứa DNA hay không

Đo quang phổ: đo lường nồng độ mẫu DNA

Phản ứng Polymerase Chain Reaction (PCR): khuếch đại vật liệu DNA, các đoạn gene mong muốn bằng các cặp mồi chuyên biệt

Điện di lần 2: tiến hành điện di mẫu PCR nhầm phát hiện GMO Đọc kết quả: đọc kết quả dựa vào đối chứng dương của cây GMO

2.2 Tổng quan về GMO

2.2.1 Khái niệm về sinh vật biến đổi gen – GMO

Sinh vật biến đổi gene - GMO (Genetically modified organisms) là sinh vật có bộ gene được chèn một hoặc nhiều đoạn DNA làm bộ gene của sinh vật biến đổi, nhằm tăng các đặc tính ưu việt có chọn lọc

2.2.2 Tại sao phải kiểm tra GMO

Công nghệ sinh học phát triển: ngày càng nhiều thực phẩm có nguồn gốc là cây trồng GMO

Quan điểm xã hội: chưa quen, không thích nghi kịp, tâm lý lo sợ

Lợi ích và tác hại chưa xác định rõ ràng: mất cân bằng tự nhiên, nguy cơ gây gây hại cho sức khỏe và đa dạng sinh học

2.2.3 Kiểm tra GMO trên bắp

Bắp biến đổi gen là những loại đậu đã được được tạo ra bằng cách thay đổi gen – DNA dưới tác động của các kỹ thuật sinh học hiện đại (phương pháp chuyển gen, gây đột biến gen hoặc chỉnh sửa gen) Bắp GMO giống bắp được cấy thêm những tính trạng của giống sinh vật khác, làm cho giống bắp này được dễ trồng trọt, dễ sản xuất ngay cả trong những môi trường khắc nghiệt Ngoài ra, GMO còn tạo ra giống bắp có tuổi đời

8

lâu hơn, màu sắc bắt mắt, đều hạt hơn và giá thành rẻ hơn Bắp biến đổi gen để chống lại thuốc diệt cỏ và sản xuất dầu tốt cho sức khoẻ hơn

2.2.4 Phương pháp xác định GMO trên bắp

Kỹ thuật PCR, đây là một kỹ thuật nhằm tạo ra một lượng lớn bản sao DNA mục tiêu trong ống nghiệm dựa vào các chu kỳ nhiệt Sau đó tiến hành điện di và đọc kết quả

Hình 2.1 Quy trình xác định bắp GMO bằng kỹ thuật PCR

9

CHƯƠNG 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

3.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu

Thời gian thực hiện nghiên cứu từ trong khoảng tháng 06/2024

Địa điểm được thực hiện tại phòng Phòng 105 Tòa A2 Viện nghiên cứu Công nghệ Sinh học và Môi trường, Trường Đại học Nông Lâm Thành phố Hồ Chí Minh

3.2 Vật liệu nghiên cứu 3.2.1 Đối tượng nghiên cứu

Mẫu bắp GMO, bắp ăn, đậu nành

3.2.2 Thiết bị và dụng cụ

Máy điện di, máy PCR, máy ly tâm và máy đo quang phổ

3.2.3 Hóa chất sử dụng trong nghiên cứu

Hóa chất gồm: PCI buffer; CHCl3; Isopropanol; Ethanol 70oc; TE buffer, Master mix; Gelred; SDS buffer; loading dye; gel agarose; dung dịch đệm điện di (TAE hoặc TBE)

3.3 Phương pháp nghiên cứu

Dùng kỹ thuật điện di để kiểm tra DNA tổng số Xuất hiện band sáng là do có DNA trong mẫu, DNA sẽ được glycerol nặng hơn kéo lắng xuống đáy giếng, giúp DNA tránh khuếch tán ra bên ngoài, đồng thời làm băng điện di đẹp và gọn hơn Cuối cùng, để quan sát được DNA cần phải nhuộm phân tử này bằng các chất nhuộm như Gelred, Và ngược lại nếu không có DNA trong mẫu những phản ứng trên sẽ không xảy ra và đồng thời band sáng cũng không xuất hiện

Điện di sản phẩm PCR kiểm tra DNA ly trích có gen chuyển vào hay không Thông qua điện di sản phẩm PCR có ladder, có band sáng xuất hiện nếu mẫu ly trích DNA tồn tại DNA chuyển gen Và ngược lại nếu band không xuất hiện, thì đó không phải GMO

3.4 Các bước tiến hành 3.4.1 Ly trích DNA

Bước 1: chuẩn bị mẫu bắp GMO, cho một số hạt bắp vào túi zip nhỏ và dùng chày để nghiền Sau đó chuẩn bị tube sạch và cho vào tube một lượng nhỏ vừa đủ (quá nhiều hay quá ít cũng sẽ khiến cho quá trình ly trích và điện di trở nên khó khăn)

Bước 4: đem tube trên đi ly tâm ở 10000 rpm trong 5 phút Sau ly tâm hút 500 μL dịch nổi qua tube mới

Hình 3.4 Mẫu sau ly tâm ở 10000

Hình 3.3 Mẫu sau khi ly tâm: a) Sau khi thêm

CHCl3; b) Hút dịch nổi sang tube mới

12

3.4.2 Điện di định tính DNA ly trích và đo OD

Đem mẫu đậu nành sau khi ly trích sẽ được đem đi điện di để xác định có DNA hay không

Nguyên tắc: các đoạn DNA mang điện tích âm nên di chuyển trong điện trường theo chiều từ cực âm sang cực dương Trên bảng gel agarose, các đoạn DNA có kích thước khác nhau sẽ di chuyển với tốc độ khác nhau trong điện trường

Sau khi tách chiết được DNA của đậu nành, ta tiến hành thực hiện điện di

Bước 1: chuẩn bị gel Cần xác định lượng agarose cần dùng để đạt được nồng độ agarose và thể tích mong muốn Cho dung dịch gel vào lò vi sóng và đun sôi cho đến khi các hạt agarose tan hoàn toàn Làm nguội agarose xuống khoảng 60oC trước khi đổ gel vào khay có mang lược gel

Bước 2: chuẩn bị bồn điện di Khi gel nguội và đặc lại, khay gel được đặt vào bồn điện di, ngập trong dung dịch đệm điện di Lược gel được tháo ra tạo nên các “giếng” rỗng dành để cho mẫu điện di vào

Bước 3: chuẩn bị mẫu Hút 5μL mẫu DNA trộn cùng với 10 μL loading dye (bromophenol blue, glycerol)

Bước 4: hút 15 μL hỗn hợp trên vào giếng điện di, điện di trong vòng 30 phút với hiệu điện thế 100V

Bước 5: điện di sau đó chụp gel và quan sát kết quả

Bước 6: Tiến hành đo nồng độ bằng máy Biodrop, hút 2-3 μL mẫu bỏ vào máy và đợi kết quả đo được khi gel nguội và đặc lại, khay gel được đặt vào bồn điện di, ngập trong dung dịch đệm điện di Lược gel được tháo ra tạo nên các “giếng” rỗng dành để cho mẫu điện di vào

3.4.3 Khuếch đại DNA bằng phản ứng PCR

Nguyên lý hoạt động: việc tổng hợp DNA dựa trên mạch khuôn là một trình tự đích DNA ban đầu, khuếch đại, nhân số lượng bản sao của khuôn này thành hàng triệu bản sao thông qua hoạt động của enzyme polymerase và một cặp mồi đặc hiệu cho đoạn DNA này

Bảng 3.2 Thông số chu trình nhiệt của phản ứng PCR

Tiếp theo lấy sản phẩm sau khi PCR (đã khuếch đại vật liệu di truyền) tiến hành điện di để phát hiện các mẫu GMO

3.4.4 Điện di phát hiện mẫu GMO

Sau khi PCR Điện di với 5 µL mẫu + Gelred 10 µL và điện di trong vòng 35 phút ở 100V

Thực hiện điện di lần 2 để phát hiện xem độ khuếch đại của mẫu bắp thường có trùng với độ khuếch đại của GMO hay không (dựa vào promoter 35S) Vì chúng ta không biết bắp thường có GMO hay không Việc mẫu có band sáng có cùng độ khuếch đại với promoter 35S là dương tính (mẫu đậu nành GMO) Ngoài ra, việc điện di lần 2, đối với mẫu từ bắp GMO, giúp ta quan sát được ngoài promoter 35S còn có các promoter khác

14

CHƯƠNG 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

4.1 Kết quả

4.1.1 Kết quả điện di định tính DNA

Dựa vào hình ta thấy kết quả điện di ra của mẫu 1 ở giếng 11 xuất hiện band sáng đều tựa như mẫu thử ở giếng 1

Hình 4.1 Kết quả điện di DNA tổng số của giếng số 11 xuất hiện band sáng rõ 4.1.2 Kết qủa đo OD kiểm tra lượng DNA ly trích

Ta có tỷ số OD260/OD280= 2,032 Quá trình tinh sạch DNA với nồng độ 106,3 ng/µL, nồng độ DNA có đủ điều kiện để thực hiện phản ứng PCR

Hình 4.2 Kết quả đo OD