Nghiên cứu sinh tổng hợp ergothioneine từ Aspergillus oryzae và ứng dụng để hạn chế quá trình oxy hoá của đậu nành lên men Bacillus subtilis chịu nhiệt

Nghiên cứu sinh tổng hợp ergothioneine từ Aspergillus oryzae và ứng dụng để hạn chế quá trình oxy hoá của đậu nành lên men Bacillus subtilis chịu nhiệt.Nghiên cứu sinh tổng hợp ergothioneine từ Aspergillus oryzae và ứng dụng để hạn chế quá trình oxy hoá của đậu nành lên men Bacillus subtilis chịu nhiệt.Nghiên cứu sinh tổng hợp ergothioneine từ Aspergillus oryzae và ứng dụng để hạn chế quá trình oxy hoá của đậu nành lên men Bacillus subtilis chịu nhiệt.Nghiên cứu sinh tổng hợp ergothioneine từ Aspergillus oryzae và ứng dụng để hạn chế quá trình oxy hoá của đậu nành lên men Bacillus subtilis chịu nhiệt.Nghiên cứu sinh tổng hợp ergothioneine từ Aspergillus oryzae và ứng dụng để hạn chế quá trình oxy hoá của đậu nành lên men Bacillus subtilis chịu nhiệt.Nghiên cứu sinh tổng hợp ergothioneine từ Aspergillus oryzae và ứng dụng để hạn chế quá trình oxy hoá của đậu nành lên men Bacillus subtilis chịu nhiệt.Nghiên cứu sinh tổng hợp ergothioneine từ Aspergillus oryzae và ứng dụng để hạn chế quá trình oxy hoá của đậu nành lên men Bacillus subtilis chịu nhiệt.Nghiên cứu sinh tổng hợp ergothioneine từ Aspergillus oryzae và ứng dụng để hạn chế quá trình oxy hoá của đậu nành lên men Bacillus subtilis chịu nhiệt.Nghiên cứu sinh tổng hợp ergothioneine từ Aspergillus oryzae và ứng dụng để hạn chế quá trình oxy hoá của đậu nành lên men Bacillus subtilis chịu nhiệt.Nghiên cứu sinh tổng hợp ergothioneine từ Aspergillus oryzae và ứng dụng để hạn chế quá trình oxy hoá của đậu nành lên men Bacillus subtilis chịu nhiệt.Nghiên cứu sinh tổng hợp ergothioneine từ Aspergillus oryzae và ứng dụng để hạn chế quá trình oxy hoá của đậu nành lên men Bacillus subtilis chịu nhiệt.Nghiên cứu sinh tổng hợp ergothioneine từ Aspergillus oryzae và ứng dụng để hạn chế quá trình oxy hoá của đậu nành lên men Bacillus subtilis chịu nhiệt.Nghiên cứu sinh tổng hợp ergothioneine từ Aspergillus oryzae và ứng dụng để hạn chế quá trình oxy hoá của đậu nành lên men Bacillus subtilis chịu nhiệt.Nghiên cứu sinh tổng hợp ergothioneine từ Aspergillus oryzae và ứng dụng để hạn chế quá trình oxy hoá của đậu nành lên men Bacillus subtilis chịu nhiệt.Nghiên cứu sinh tổng hợp ergothioneine từ Aspergillus oryzae và ứng dụng để hạn chế quá trình oxy hoá của đậu nành lên men Bacillus subtilis chịu nhiệt.Nghiên cứu sinh tổng hợp ergothioneine từ Aspergillus oryzae và ứng dụng để hạn chế quá trình oxy hoá của đậu nành lên men Bacillus subtilis chịu nhiệt.Nghiên cứu sinh tổng hợp ergothioneine từ Aspergillus oryzae và ứng dụng để hạn chế quá trình oxy hoá của đậu nành lên men Bacillus subtilis chịu nhiệt.Nghiên cứu sinh tổng hợp ergothioneine từ Aspergillus oryzae và ứng dụng để hạn chế quá trình oxy hoá của đậu nành lên men Bacillus subtilis chịu nhiệt.Nghiên cứu sinh tổng hợp ergothioneine từ Aspergillus oryzae và ứng dụng để hạn chế quá trình oxy hoá của đậu nành lên men Bacillus subtilis chịu nhiệt.Nghiên cứu sinh tổng hợp ergothioneine từ Aspergillus oryzae và ứng dụng để hạn chế quá trình oxy hoá của đậu nành lên men Bacillus subtilis chịu nhiệt.Nghiên cứu sinh tổng hợp ergothioneine từ Aspergillus oryzae và ứng dụng để hạn chế quá trình oxy hoá của đậu nành lên men Bacillus subtilis chịu nhiệt.Nghiên cứu sinh tổng hợp ergothioneine từ Aspergillus oryzae và ứng dụng để hạn chế quá trình oxy hoá của đậu nành lên men Bacillus subtilis chịu nhiệt.Nghiên cứu sinh tổng hợp ergothioneine từ Aspergillus oryzae và ứng dụng để hạn chế quá trình oxy hoá của đậu nành lên men Bacillus subtilis chịu nhiệt.Nghiên cứu sinh tổng hợp ergothioneine từ Aspergillus oryzae và ứng dụng để hạn chế quá trình oxy hoá của đậu nành lên men Bacillus subtilis chịu nhiệt.Nghiên cứu sinh tổng hợp ergothioneine từ Aspergillus oryzae và ứng dụng để hạn chế quá trình oxy hoá của đậu nành lên men Bacillus subtilis chịu nhiệt.Nghiên cứu sinh tổng hợp ergothioneine từ Aspergillus oryzae và ứng dụng để hạn chế quá trình oxy hoá của đậu nành lên men Bacillus subtilis chịu nhiệt.Nghiên cứu sinh tổng hợp ergothioneine từ Aspergillus oryzae và ứng dụng để hạn chế quá trình oxy hoá của đậu nành lên men Bacillus subtilis chịu nhiệt.Nghiên cứu sinh tổng hợp ergothioneine từ Aspergillus oryzae và ứng dụng để hạn chế quá trình oxy hoá của đậu nành lên men Bacillus subtilis chịu nhiệt.

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ

QUÁ TRÌNH OXY HOÁ CỦA ĐẬU NÀNH

LÊN MEN BACILLUS SUBTILIS CHỊU

NHIỆT

Cần Thơ, 2023

CÔNG TRÌNH ĐƯỢC HOÀN THÀNH TẠI

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ

Người hướng dẫn chính: PGS.TS Nguyễn Công Hà

Luận án được bảo vệ trước hội đồng chấm luận án tiến sĩ cấp trường

Xác nhận đã xem lại của Chủ tịch Hội Đồng

Có thể tìm hiểu luận án tại thư viện:

- Trung tâm Học liệu, Trường Đại học Cần Thơ

- Thư viện Quốc gia Việt Nam

DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ

of the bright color of fermented soybean using ergothioneine biosynthesized

by Aspergillus oryzae Legume Science https://doi.org/10.1002/leg3.165

mốc Aspergillus Oryzae trên môi trường phụ phẩm tinh bột gạo Tạp chí

Nông nghiệp và phát triển nông thôn

http://tapchinongnghiep.vn/tapchi/detail/12354 15(1), 56-63

Chương 1 GIỚI THIỆU 1.1 Tính cấp thiết của luận án

Đậu nành lên men được làm từ những hạt đậu nành, lên men tự nhiên bằng

lợi khuẩn Bacillus tạo thành một hỗn hợp dai, dính, mùi khá hăng, còn hương

vị lại bùi bùi (chứa nhiều Acid Glutamic) Độ nhớt càng cao thì chất lượng đậu nành lên men càng tốt và vị càng ngọt Món ăn giàu giá trị dinh dưỡng: protein, canxi, magie, vitamin, folate, choline, omega, vitamin K1 v.v và rất tốt cho hệ tiêu hóa Vitamin K1: đóng một vai trò quan trọng trong quá trình đông máu

Tuy nhiên, quá trình oxy hóa lipid là nguyên nhân chính làm giảm chất lượng của đậu nành lên men nói riêng và sản phẩm thực phẩm nói chung Theo Dietary Reference Intake, DRI, trong 100 g đậu nành lên men chứa 11 g chất béo Quá trình oxy hóa lipid từ lâu đã được công nhận là một vấn đề lớn trong việc lưu trữ các axit béo trong thực phẩm Quá trình oxy hóa xảy ra bởi một số cơ chế phân tử như tạo ra các tiền chất oxy phản ứng và các gốc

tự do (Ahmed et al., 2016) Do vậy, để hạn chế việc oxy hoá chất béo bên cạnh các biện pháp kỹ thuật có thể dùng chất chống oxy hoá và trong nghiên cứu này ergothioneine đã được sử dụng với vai trò đó Ergothioneine (ESH)

là chất chống oxy hóa mạnh nhất trong các chất chống oxi hóa từng được phát hiện, mạnh hơn glutahione và vitamin E Nhiều nghiên cứu cho thấy rằng ngoài là một chất chống oxy hóa mạnh mẽ theo đúng nghĩa, ergothioneine giúp chất chống oxy hóa khác tái sinh, kéo dài tuổi thọ hữu ích Nghiên cứu cũng chỉ ra rằng ergothioneine có thể giúp bảo vệ gan và thận thông qua quá trình oxy hóa (Konishi, 1972)

Ergothioneine được tổng hợp bởi nhiều loại vi sinh vật, đặc biệt là nấm (bao

gồm cả trong quả thể nấm) và vi khuẩn actinobacteria, nhưng không được

tổng hợp bởi thực vật và động vật thu nhận nó thông qua đất và chế độ ăn uống của chúng (Borodina et al., 2020) Có vài nghiên cứu về sinh tổng hợp

ESH, tuy nhiên sinh tổng hợp ESH từ A.oryzae trên nguồn nguyên liệu là

phụ phẩm tinh bột vẫn chưa được nghiên cứu trong khi đó phụ phẩm tách ra

từ quy trình chế biến tinh bột gạo vẫn còn nhiều dinh dưỡng để sử dụng cho các công đoạn chế biến tạo ra các sản phẩm khác, điển hình như sử dụng làm môi trường nuôi cấy nấm mốc để sinh tổng hợp các hợp chất chống oxy hóa

là hướng đi rất triển vọng Với hy vọng A.oryzae là một nguồn để sinh tổng

hợp chất chống oxy hóa ESH với hàm lượng cao, an toàn, dễ thu nhận sẽ làm tiền đề cũng như tiềm năng tạo ra các sản phẩm có chứa hợp chất chống oxy hóa giúp cải thiện sức khỏe con người, là chất chống oxy hoá mạnh trong thực phẩm dùng thay thế các chất oxy khác trong tương lai

1.2 Mục tiêu nghiên cứu

- Xác định được các điều kiện lên men thích hợp để chế biến sản phẩm đậu

nành lên men từ B subtilis chịu nhiệt

- Đánh giá được mức độ oxy hoá lipid trong quá trình lên men đậu nành

- Xác định được các điều kiện thích hợp cho quá trình sinh tổng hợp ESH từ

A oryzae

- Xác định được tỷ lệ dịch chiết ESH bổ sung giúp hạn chế oxy hoá lipid trong chế biến sản phẩm đậu nành lên men

1.3 Đối tượng và phạm vi nghiên cứu

Đối tượng nghiên cứu của luận án là phụ phẩm từ quá trình sản xuất tinh bột

gạo, đậu nành, nấm mốc A oryzae, và vi khuẩn B subtilis chịu nhiệt Tiến

hành xác định điều kiện nuôi cấy (nồng độ chất cảm ứng, độ ẩm, pH, mật số nấm mốc) thích hợp để sinh tổng hợp được hàm lượng ESH cao nhất Xây dựng được quy trình chế biến đậu nành lên men với các thông số và điều kiện thích hợp thông qua việc xác định hàm lượng protease sinh ra trên sản phẩm Dịch chiết ESH được sử dụng để tiến hành nghiên cứu bổ sung vào quá trình chế biến đậu nành lên men giúp hạn chế sự oxy hóa lipid

1.4 Ý nghĩa của luận án

1.4.1 Ý nghĩa khoa học

Luận án đạt ý nghĩa về cơ sở khoa học trong việc nghiên cứu xác định các yếu tố ảnh hưởng đến sự thay đổi hàm lượng các chất dinh dưỡng, thành phần có hoạt tính sinh học (protid, lipid, glucid, protease, thành phần lipid, ESH), đặc tính kháng oxi hóa, TBARs, của đậu nành lên men và ergothioneine trong suốt quá trình sản xuất đậu nành lên men bởi vi khuẩn

B subtilis Xác định các nguyên nhân gây oxy hoá lipid trong quá trình sản

xuất đậu nành lên men Xác định các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình sinh tổng hợp ESH và ứng dụng ESH vào việc chống oxy hoá trong quá trình lên men đậu nành

1.4.2 Ý nghĩa thưc tiễn

Luận án đạt ý nghĩa về cơ sở khoa học trong việc nghiên cứu xác định các yếu tố ảnh hưởng đến sự thay đổi hàm lượng các chất dinh dưỡng, thành phần có hoạt tính sinh học (protid, lipid, glucid, protease, thành phần lipid, ESH), đặc tính kháng oxi hóa, TBARs, của đậu nành lên men và ergothioneine trong suốt quá trình sản xuất đậu nành lên men bởi vi khuẩn

B subtilis Xác định các nguyên nhân gây oxy hoá lipid trong quá trình sản

xuất đậu nành lên men Xác định các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình sinh tổng hợp ESH và ứng dụng ESH vào việc chống oxy hoá trong quá trình lên men đậu nành

1.6 Nội dung nghiên cứu

Để đạt được các mục tiêu đề ra, luận án nghiên cứu triển khai các nội dung

cơ bản sau:

- Nghiên cứu qui trình chế biến sản phẩm đậu nành lên men từ B subtilis

và xác định sự oxy hoá lipid trong quá trình lên men

- Sinh tổng hợp và chiết suất ESH từ A oryzae

- Ứng dụng ESH trong chế biến đậu nành lên men

Chương 2 TỔNG QUAN 2.1 Giới thiệu về đậu nành

Đậu nành là loài bản địa của Đông Á Loài này giàu hàm lượng chất đạm protein, protein đậu nành là một loại protein chất lượng cao với điểm số axit amin điều chỉnh khả năng tiêu hóa protein (PDCAAS) là 1,00; gần bằng với một số protein từ các nguồn động vật, chẳng hạn như thịt và sữa Protein đậu nành chứa các axit amin thiết yếu cân đối ngoại trừ những loại có chứa lưu huỳnh như methionine (Qin et al., 2022)

Sản phẩm từ cây đậu nành được sử dụng rất đa dạng như dùng trực tiếp hạt thô hoặc chế biến thành đậu phụ, ép thành dầu đậu nành, nước tương, làm bánh kẹo, sữa đậu nành, okara

2.2 Giới thiệu về ergothioneine (ESH)

Ergothioneine (ESH; 2-mercaptohistidine trimethylbetaine) còn có tên khác

là L-Ergothioneine, (+)-Ergothioneine hay Thiasine Ergothioneine là một axit amin thio-histidine betaine bất thường có các hoạt động chống oxy hóa mạnh Nó được tổng hợp bởi nhiều loại vi sinh vật, đặc biệt là nấm (bao gồm

cả trong quả thể nấm) và vi khuẩn actinobacteria, nhưng không được tổng

hợp bởi thực vật và động vật thu nhận nó thông qua đất và chế độ ăn uống của chúng (Borodina et al., 2020) Ergothioneine được phát hiện vào năm

1909 và được đặt tên theo tên của loại nấm mốc đầu tiên được làm sạch, với cấu trúc được xác định vào năm 1911 (Mann & Leone, 1953) Ergothioneine

là một amino acid tự nhiên và là dẫn xuất của thiourea histidine, chứa một nguyên tử lưu huỳnh trên vòng imidazole Ergothioneine được tổng hợp từ

ba amino acid: cysteine, methionine và histidine Histidine là một tiền chất của ergothioneine với cysteine cung cấp một phần nhóm sulfhydryl (-SH)

và methionine cung cấp ba nhóm methyl Chuỗi phản ứng sinh tổng hợp các ergothioneine bắt đầu từ quá trình methyl hóa của histidine tạo thành trung gian hercynine và sau đó trải qua sulfhydration để tạo thành ergothioneine

(Ashida et al., 2005) Ergothioneine (ESH) có nhiều ứng dụng trong khoa học thực phẩm như một chất chống oxy hóa mạnh Nhiều thử nghiệm trong ống nghiệm đã chứng minh khả năng chống oxy hóa và bảo vệ tế bào của ESH chống lại một loạt các tác nhân gây căng thẳng tế bào, nhưng vai trò chống oxy hóa vẫn chưa được xác minh đầy đủ trong cơ thể sống Tuy nhiên,

sự tích tụ, phân bố mô và đặc tính nhặt rác, tất cả đều làm nổi bật khả năng ESH hoạt động như một chất chống oxy hóa sinh lý (Cheah & Halliwell, 2012)

Đặc biệt, ergothioneine được biết đến như là một tác nhân loại bỏ mạnh

mẽ các gốc tự do hydroxyl (.OH) và ức chế nhóm (.OH) từ hydrogenperoxide, được xúc tác bởi ion sắt hoặc đồng Ferrylmyoglobin được hình thành khi deoxymyoglobin và metmyoglobin được tiếp xúc với hydrogen peroxide, metmyoglobin được giảm xuống khi có mặt của ergothioneine

Nấm là nguồn thực phẩm chính nhưng tốc độ tăng trưởng chậm, thấp và quy trình chiết xuất tốn thời gian dẫn đến chi phí sản xuất cao Vì vậy, các nguồn ESH thay thế và bền vững là cần thiết (Takusagawa et al., 2018)

2.3 Giới thiệu về Phụ phẩm tinh bột gạo (BPSI)

Trong gạo có chứa protein, chất xơ, khoáng chất và phytochemical có hoạt tính sinh lý như γ-oryzanol, acid ferulic và tocopherols (Sharif et al., 2014) Protein gạo là một loại protein chất lượng cao (Juliano, 1994) và là một thành phần thực phẩm ít gây dị ứng có thể hữu ích trong các công thức cho trẻ sơ sinh (Helm & Burks, 1996) Protein gạo cũng đã được báo cáo là có tác dụng chống ung thư (Kawamura et al., 1993) Gạo từ cây lúa (Oryza sativa) sau khi tách vỏ trấu, thành phần hạt lúa gồm 20% vỏ ngoài (vỏ trấu), 70% tinh bột trong nội nhũ, 1-2% là mầm và 7-8% là lớp cám bao bên ngoài nội nhũ Gạo có chứa một lượng các chất dinh dưỡng và các hợp chất có hoạt tính sinh học, bao gồm protein, chất xơ và chất hóa học có nguồn gốc thực vật với hoạt tính chống oxy hóa mạnh, chống tiểu đường, hoạt tính chống dyslipidemic và chống viêm (Boonloh et al., 2014; Choi et al., 2010)

2.4 Quá trình sinh tổng hợp ESH

Các nghiên cứu ban đầu về sinh tổng hợp ESH ở nấm cho thấy con đường bắt đầu bằng quá trình methyl hóa enzyme của nhóm α-amino của L-histidine ba lần bởi S-adenosyl-L-methionine để tạo ra hercynine Nhóm lưu huỳnh sau đó được thêm vào bằng cách ghép cysteine với hercynine để tạo thành một S- (-amino-β- carboxyethyl) -Ergothioneine sulfoxide qua một con đường không xác định cần oxy và sắt (II) Chất trung gian này sau đó được chuyển đổi thành ESH và pyruvate thông qua một enzyme yêu cầu pyridoxal chưa biết Các nghiên cứu chi tiết về sinh tổng hợp ESH ở vi khuẩn

chưa được thực hiện; tuy nhiên, việc sử dụng tiền chất phóng xạ đã chỉ ra

rằng con đường tương đương với nấm Các nghiên cứu với Actimomycetes Mycobacterium tuberculosis và M smegmatis đã phát hiện ra rằng con đường sinh tổng hợp ESH ở Actinomycetes tương tự như ở nấm Con đường

tạo ESH của nấm thì cysteine làm chất cho lưu huỳnh Có sự bất ngờ là ESH cũng được tổng hợp theo phương pháp yếm khí (Jason & Katherine, 2019) Các nghiên cứu quá trình sinh tổng hợp ESH từ acid amin L-histidine thông qua tiền chất trung gian là hercynine, sau đó kết hợp lưu huỳnh từ cystein tạo sản phẩm cuối (Heath et al., 1953; Heath & Wildy, 1956; Melville et al., 1957) Có 2 phản ứng chính trong sinh tổng hợp ESH (là hình thành liên kết

CS oxy hóa và phản ứng phân cắt liên kết CS tiếp theo, dẫn đến chuyển nguyên tử lưu huỳnh từ cysteine hoặc γ-glutamyl cysteine sang chuỗi bên imidazole của histidine) (Hu et al., 2014) Barger and Ewins (1911) xác định cấu trúc và phát hiện ra ESH là dẫn xuất trimethylbetaine của histidine với

1 nhóm thiol gắn vào vị trí C2 của vòng imidazole Năm 2018, Takusagawa

et al nghiên cứu sản xuất ESH sử dụng Aspergillus oryzae biểu hiện quá

mức các gen egt-1 và egt-2 đã thành công trong sản xuất ESH (231,0 mg/kg môi trường gạo, cao hơn 20 lần so với loại hoang dã) Pfeiffer et al (2011) chứng minh rằng một số loài vi khuẩn lam có thể tạo ra đến 800 mg/kg trọng

lượng khô hợp chất này, chế phẩm vi khuẩn lam (ví dụ Aphanizomenon aquae và Spirulina platensis) làm chất bổ sung chế độ ăn uống cho người

flos-Các acid amin histidine, cysteine và methionine đóng vai trò là tiền chất để tổng hợp hợp chất này (Askari & Melville, 1962)

Chương 3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.1 Phương tiện nghiên cứu

3.1.1 Địa điểm và thời gian thí nghiệm

Địa điểm: các thí nghiệm chủ yếu được tiến hành tại phòng thí nghiệm D106,

Bộ môn Công nghệ thực phẩm, Khoa Nông nghiệp, Trường Đại học Cần Thơ, phòng thí nghiệm Khoa Nông nghiệp - Thuỷ sản, Trường Đại học Trà Vinh và Trung Tâm Ứng Dụng Tiến Bộ Khoa Học Và Công Nghệ Cần Thơ Thời gian thực nghiệm: từ tháng 5/2017 đến tháng 12/2020

3.1.2 Dụng cụ, thiết bị

- Thiết bị sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC-High Performance Liquyd Chromatography) Shimazu, Model: SLC-10AVP/RF, 10 AXL/FCV, Nhật Bản

- Máy đo mật độ quang phổ Multiskan Spectrum, Nhật Bản

- Máy đo màu (Model: WR-10, hãng sản xuất: FRU – Trung Quốc)

- Thiết bị đồng hóa DLAB - Mỹ Model: D-500

- Máy cô quay chân không Labconco, Hàn Quốc

- Máy ly tâm Centaur 2 (U.K), máy ly tâm lạnh HermLe Z323K (Đức)

- Bể siêu âm UC-10

- Máy đo pH (inoLab)

- Máy ghép mí chân không (Model: G-88, Trung Quốc)

- Cân điện tử (210 g/0,01 g), Nhật Bản

- Cân điện tử AR2140 (210 g - max cap)/0,0001 g, Ohaus Corp Brook, NJ,

Mỹ

- Màng lọc Nylon Syringe 0,22 µm, ống tiêm

- Dụng cụ thủy tinh: phễu chiết, bình định mức 5 mL, 50 mL, 100 mL, erlen

50 mL, đĩa petri, …

- Một số dụng cụ, thiết bị khác: Ống Falcon, ống nghiệm, pipette, micropipette 1mL, 10 mL, ống đong,

3.1.3 Hóa chất

- Chuẩn L-(+)-ergothioneine (C9H15N3O2S), Sigma

- Thuốc thử 3,5- Dinitrosalicylic acid (DNS), Across

- Thuốc thử DPPH: 2,2-Diphenyl-2-picrylhydrazyl, Sigma

- Thuốc thử TBARs: 2 Thiobarbituric acid, Sigma

- 4-dimethyl aminoazobenzen-4-sulfonyl chloride, Merck

- 5-Sulfosalicylic acid dihydrate, Merck

- DTT: 1,4-Dithiothreitol, Across

- MMI: 2-Mercapto-1-methylimidazole (Methimazole), Sigma

- Môi trường MPA, Agar, Glucose, Peptone, NH4NO3, CaCl2, Ethanolic

- Các dung môi dùng trong phân tích bằng HPLC của Fisher (methanol, acetonitrile, nước DI, …) và một số hóa chất khác (glucose, NH4NO3, CaCl2, v.v.) đạt độ tinh khiết cho phân tích

Hóa chất: mua ở Công Ty TNHH Thiết Bị - Hóa Chất Khoa Học Kỹ Thuật

An Khánh, Cần Thơ và công ty TNHH Công nghệ Đồng Hành Phát, TpHCM 3.1.4 Nguyên liệu sử dụng

- Vi khuẩn B subtilis (được phân lập từ phòng thí nghiệm sinh học của Khoa Nông nghiệp Thủy sản, Đại học Trà Vinh)

- Đậu nành sử dụng trong nghiên cứu là giống 860-3 được cung cấp từ Khoa Nông Nghiệp, Trường Đại học Cần Thơ

- Chủng nấm mốc Aspergillus oryzae (A oryzae), dạng Koji, mua của công

ty Nhật

- Phụ phẩm (cặn bột gạo) từ quy trình sản xuất tinh bột gạo được thu nhận ở

cơ sở sản xuất bột Tư Nương (số 91 khóm 2, Phường 2, TP Sa Đéc, tỉnh Đồng Tháp) Mẫu được di chuyển về phòng thí nghiệm, được đóng gói và bảo quản ở -18°C để phục vụ cho toàn bộ thí nghiệm

3.2 Phương pháp nghiên cứu

3.2.1 Phương pháp chuẩn bị mẫu

- Phương pháp chuẩn bị mẫu phụ phẩm từ quá trình sản xuất tinh bột gạo: Phụ phẩm bột gạo sau khi thu nhận về phòng thí nghiệm được trữ đông ở nhiệt độ -18°C, xác định độ ẩm nguyên liệu bằng phương pháp sấy đến khối lượng không đổi Theo đó môi trường nuôi cấy được bổ sung nước để điều chỉnh đến độ ẩm thử nghiệm, đồng thời pH môi trường cũng được điều chỉnh bằng dung dịch NaOH 1M Tiếp theo bột được gia nhiệt bằng bể điều nhiệt

ở 85°C khoảng 60 phút đến khi tinh bột được hồ hóa (bột chín) cho thêm 25% trấu (thử nghiệm thăm dò đã được thực hiện với kết quả 25% trấu cho hiệu quả tốt nhất) vào để tạo độ xốp và tạo nên những khoảng trống giúp không khí lưu thông bên trong môi trường một cách dễ dàng (Nguyễn Đức Lượng và ctv., 2004) Mẫu bột này được sử dụng cho các thí nghiệm sinh tổng hợp ESH và chỉ được chuẩn bị khi thực hiện thí nghiệm, không làm mẫu trước

- Phương pháp chuẩn bị nguyên liệu đậu nành: Đậu nành sau khi mua về từ

Bộ môn di truyền giống thuộc Khoa Nông nghiệp, Trường Đại học Cần Thơ được sàng loại tạp chất, những hạt hỏng hốc, sau đó được chia nhỏ, cho vào túi PE hàn kín và bảo quản trong tủ đông ở -18°C để sử dụng cho toàn bộ thí nghiệm

- Phương pháp phân lập và trữ chủng B.subtilis:

Lấy 1g mẫu đem pha loãng với các độ pha loãng từ nồng độ 10-1 đến 10-5, sau đó hút 0,1 ml dịch pha loãng trãi trên bề mặt đĩa thạch đã được chuẩn

bị sẵn với môi trường MPA, ủ ở 37 oC trong 48 giờ, cấy truyền 4-5 lần cho đến khi chủng được làm thuần, quan sát hình thái khuẩn lạc Dòng vi khuẩn sau khi làm thuần được trữ giống trong môi trường thạch nghiêng ở 4°C (Hạnh & ctv., 2016)

Phương pháp định danh vi khuẩn B.subtiluis: sử dụng các phương pháp sinh hóa để bước đầu sàng lọc các dòng vi khuẩn thuộc chi Bacillus Các dòng vi khuẩn phân lập được mô tả đặc điểm khuẩn lạc, xác định hình thái bằng phương pháp nhuộm gram, nhuộm bào tử, quan sát hình dạng, kiểm tra một

số đặc tính sinh hóa như thử nghiệm catalase, methyl red, khả năng tổng hợp enzyme amylase, protease để xác định vi khuẩn thuộc chi Bacillus Sử dụng phần mềm BLAST để so sánh trình tự gen của dòng vi khuẩn phân lập với trình tự tham chiếu từ cơ sở dữ liệu 16S ribosomal RNA (Bacteria and Archaea type strains) (Hân & ctv., 2021) Mẫu được phân tích tại công ty Macrogen Hàn Quốc

3.2.2 Phương pháp phân tích

- Xác định hoạt tính protease theo phương pháp Anson cải tiến (Anson, 1938)

- Xác định protein tổng số theo phương pháp Kjeldahl (TCVN 8125:2009)

- Xác định lipid tổng theo phương pháp Soxhlet (TCVN 8181:2009)

- Xác định độ ẩm theo phương pháp sấy đến khối lượng không đổi (AOAC 925.10, 2005)

- Hàm lượng đường khử (%) được xác định bằng phương pháp Fehling (TCVN 4594:1988)

Xác định hàm lượng đường tổng bằng phương pháp Lane-Eynon (AOAC 968.28-1969, 2000)

- Phân tích hàm lượng tro bằng phương pháp nung (AOAC, 2000b)

- Hàm lượng polyphenol tổng TPC (%GEA/g) được xác định theo phương pháp so màu của Premakumari et al., 2010

- Xác định hoạt tính chống oxy hóa (total antioxydant activity – Radical Scavenging Activity) bằng quang phổ UV-Vis theo phương pháp của Fu & Shieh, 2002

DPPH Phân tích mức độ oxy hóa chất béo qua chỉ số TBARs (Ke & Woyewoda, 1979)

- Xác định mức độ oxy hóa chất béo theo chỉ số peroxyde (AOAC, 2000a)

- Xác định hàm lượng Ergothioneine bằng hệ thống HPLC (đầu dò UV-Vis) theo phương pháp của Wi Young Lee et al., 2006 và Yeong Seon Yang et al., 2016

- Mật số nấm mốc được xác định bằng phương pháp đếm gián tiếp thông qua khuẩn lạc mọc trên môi trường thạch đĩa (TCVN 8989:2012)

- Mật số vi khuẩn Bacillus subtilis được xác định bằng phương pháp đếm khuẩn lạc (đếm gián tiếp) (TCVN 4884:2005)

- Màu sắc được đo bằng máy đo màu FRU (Model: WR-10, Trung Quốc)

- Phân tích hàm lượng acid béo tự do theo phương pháp chuẩn độ (TCVN 6127:2010)

- Phân tích hàm lượng Genistein bằng quang phổ UV-Vis theo phương pháp của César et al., 2008

3.2.3 Phương pháp thu thập và xử lý số liệu

Các thí nghiệm được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên với 3 lần lặp lại Số liệu thu thập được xử lý, vẽ đồ thị, tính độ lệch chuẩn (STDEV) bằng phần mềm Microsoft Office, Excel 2010 Kết quả của các thí nghiệm được phân tích và thống kê sử dụng chương trình Stagraphics Centrution 16.1 và phần mềm Excel Phương pháp phân tích phương sai (ANOVA) và kiểm định LSD, kiểm định Ducan được sử dụng để kết luận về sự sai khác giữa nghiệm thức Các thí nghiệm có tính kế thừa, kết quả tối ưu ở thí nghiệm trước được sử dụng làm thông số cố định cho thí nghiệm sau

3.3 Sơ đồ bố trí thí nghiệm tổng quát

Nội dung 1: Xây dựng quy trình chế biến sản phẩm đậu nành lên men từ B

subtilis chịu nhiệt và xác định sự oxy hoá lipid trong quá trình lên men

Thí nghiệm 1: Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng của quá trình lên men đậu nành (pH, nhiệt độ, mật số vi khuẩn và thời gian lên men)

a) Khảo sát ảnh hưởng của pH đến quá trình lên men đậu nành

* Mục đích

Xác định được pH thích hợp để tạo ra đậu nành lên men có hoạt tính enzyme cao

Nhân tố A: pH, có 4 mức độ:

A1: pH=6 A2: pH=6,3 A3: pH=7 A4: pH=8

Hình 3.1: Sơ đồ bố trí thí nghiệm tổng quát

* Chỉ tiêu theo dõi

Hoạt tính protease, hàm lượng protein tổng, lipid tổng, glucid tổng, % DPPH

* Chỉ tiêu theo dõi

Hoạt tính protease, hàm lượng protein tổng, lipid tổng, glucid tổng, % DPPH

* Kết quả thu nhận

Xác định được điều kiện nhiệt độ thích hợp cho quá trình lên men đậu nành c) Khảo sát ảnh hưởng của mật số vi khuẩn và thời gian lên men đến quá trình lên men đậu nành

Nhân tố D: thời gian, có 3 mức độ (giờ):

D1: 36 giờ D2: 48 giờ D3: 60 giờ

* Chỉ tiêu theo dõi

Hoạt tính protease, hàm lượng protein tổng, lipid tổng, glucid tổng, % DPPH

E1: pH=6 E2: pH=6,3 E3: pH=7 E4: pH=8

* Chỉ tiêu theo dõi

Hàm lượng lipid tổng, % DPPH, IC50, hàm lượng acid béo tự do, TBARs

và hàm lượng peroxide

* Kết quả thu nhận

Xác định được giá trị pH thích hợp mà tại đó sự oxy hoá lipid diễn ra ít nhất b) Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ đến sự oxy hóa lipid trong quá trình lên men đậu nành

* Chỉ tiêu theo dõi

Hàm lượng lipid tổng, % DPPH, IC50, hàm lượng acid béo tự do, TBARs

Nhân tố G: thời gian, có 4 mức độ (giờ):

G1: 24 giờ G2: 36 giờ G3: 48 giờ G4: 60 giờ

* Chỉ tiêu theo dõi

Hàm lượng lipid tổng, % DPPH, IC50, hàm lượng acid béo tự do, TBARs

và hàm lượng peroxide

* Kết quả thu nhận

Xác định được thời gian lên men thích hợp mà tại đó sự oxy hoá lipid diễn

ra ít nhất

Từ đó chọn nhiệt độ, pH và thời gian lên men thích hợp để tạo ra sản phẩm

ít bị oxy hoá nhất và làm yếu tố cố định ở thí nghiệm tiếp theo

Nội dung 2: Sinh tổng hợp và chiết xuất ESH từ A oryzae

Thí nghiệm 3 Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ chất cảm ứng trong môi trường lên men sinh tổng hợp lên sự gia tăng hàm lượng ESH

* Mục đích

Xác định được nồng độ chất cảm ứng (3 acid amin: histidine, cysteine và methionine) tối ưu trong phạm vi khảo sát giúp gia tăng khả năng sinh tổng hợp ESH

Nhân tố H: Hàm lượng histidine, giá trị nằm trong khoảng 0 mg ≤ m ≤ 120

mg (Dựa trên một nghiên cứu trước đó đã thực hiện trên cám gạo và thí

nghiệm thăm dò để xác định khoảng nồng độ cho thí nghiệm này), 3 mức độ (mg/20g mẫu):

H1: 0 H2: 60 H3: 120

Nhân tố I: Hàm lượng cysteine, giá trị nằm trong khoảng 0 mg ≤ m ≤ 120mg (Dựa trên một nghiên cứu trước đó đã thực hiện trên cám gạo và thí nghiệm thăm dò để xác định khoảng nồng độ cho thí nghiệm này), 3 mức độ (mg/20g mẫu):

I1: 0 I2: 60 I3: 120

Nhân tố J: Hàm lượng methionine, giá trị nằm trong khoảng 0 mg ≤ m ≤ 120mg (Dựa trên một nghiên cứu trước đó đã thực hiện trên cám gạo và thí nghiệm thăm dò để xác định khoảng nồng độ cho thí nghiệm này), 3 mức độ (mg/20g mẫu):

J1: 0 J2: 60 J3: 120

Thí nghiệm 4 Khảo sát thời gian và nhiệt độ sử dụng trong trích ly ESH

- Mục đích: Xác định thời gian, nhiệt độ trích ly thích hợp trong phạm vi khảo sát đến hàm lượng và khả năng ESH cao nhất

Nhân tố P nhiệt độ gia nhiệt, °C:

P1: 80±1 P2: 85±1 P3: 90±1 P4: 95±1 P5: 100±1 Nhân tố Q thời gian, phút:

Q1: 5 Q2: 10 Q3: 15 Q4: 20

Chỉ tiêu theo dõi: hàm lượng ESH, DPPH

Kết quả thu được: Xác định nhiệt độ và thời gian thích hợp trích ly ESH nhiều nhất

Nội dung 3: Ứng dụng ESH trong chế biến đậu nành lên men

Thí nghiệm 5 Khảo sát hàm lượng ESH bổ sung và khả năng hạn chế sự oxy hóa lipid tại các giai đoạn trong quá trình sản xuất đậu nành lên men

- Mục đích: Xác định hàm lượng ESH thô bổ sung thích hợp nhằm hạn chế

sự oxy hóa lipid tại các giai đoạn trong quá trình sản xuất đậu nành lên men Nhân tố ESH ở các tỉ lệ 0%, 2%, 4%, 6%, qua 3 giai đoạn trong quá trình lên men (trong mẫu đậu nành nguyên liệu trước khi chế biến, sau khi ngâm, sau khi hấp)

Chỉ tiêu theo dõi: TPC, DPPH, IC50, Lipid tổng, peroxyt, TBARs, acid béo

tự do, độ ẩm

Kết quả thu nhận: đậu nành lên men đã được xử lý chống oxy hoá bằng ESH

Chương 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1 Nội dung 1: Nghiên cứu qui trình chế biến sản phẩm đậu nành lên

men từ B subtilis và xác định sự oxy hoá lipid trong quá trình lên men