Tìm Hiểu Hệ Hệ Thống Sắc Ký Uhplc Và Hplc.pdf

Trang 1

UHPLC and HPLC Method Optimization

Trang 2

Nội Dung

Cấu tạo cơ bản của hệ sắc ký lỏng

Một số vấn đề thường gặp và cách khắc phục

UHPLC VS HPLC

Trang 3

Trang 4

• Pump with Degasser

• Autosampler

• Column (installed in a Column Compartment)

• Detector (to detect compounds – DAD, MS, ELSD etc.)

• Computer with control software

HPLC System General Design

Detector

Column &

Column Thermostat

Autosampler Pump

Trang 5

Binary pumps

Quaternary pumps

Pumps

Trang 6

Pumps

Isocratic pump

• Only one pumphead, one solvent and only for

isocratic methods!

• Solvent enters pump head, which consists of 2

pistons and the pressure damper in between

• System has purge valve to switch the flow either

to the system or to the waste

solvent

Piston 1

Piston 2 Pump head

Low Pressure Mixing Gradient pump

• Similar Structure like Isocratic Pump with one pump head

• Has an additional Solvent Proportioning Valve (MGCV = Multi Channel Gradient Valve) which proportions up to 4 solvents in solvent

packages according to the programmed gradient

• The solvent combining and mixing takes place before the pump head

hence the term LOW PRESSURE MIXING

• A degasser is mandatory and is positioned between the solvents and MCGV

Trang 7

Pumps

Binary Gradient Pump

• Two pump heads – each pumping from

one solvent bottle

• Solvents meet after leaving the pump

heads

• Then solvents pass through the

damper, mixer, and finally the purge

valve

• The solvent combining and mixing

takes place after the pump head hence

the term HIGH PRESSURE MIXING

• Degasser is not mandatory, but highly

recommended

Trang 8

Why Vacuum Degassing?

Pumps

Trang 9

Pumps

Influence on Detector Baseline

Trang 10

Flow-through design

Fixed-loop design

Autosampler

Trang 11

Manual Injector Fixed Loop injector Variable Loop injector

Principle Sample loop is

switched in and out of solvent stream

Sample loop is switched in and out of solvent stream Sample loop, needle and metering device are switched in

and out of solvent stream

Sample Waste High High in full loop fillings none

Inj volume flexibility

Summary of Autosampler types

Trang 12

Column Thermostat

Reproducibility

Sample Solubility and Solvent Viscosity

- Certain chemical compounds may have low solubility in the HPLC mobile phase and if they are injected into the flow stream they may precipitate or other difficulties may arise

- Higher temps will lower solvent viscosity so back pressure will be lower

Selectivity

- Temperature is an important parameter for Method development

Trang 13

“ Forced air ” versus “ Still air ” column compartment

• A “ Forced air ” column compartment is not ideal for

UHPLC analysis, it enhances the effects of frictional

heating Leading to broader peak, worse separation.

• A “ Still air ” column compartment, such as the

InfinityLab LC Multicolumn Thermostat module, is

better suited.

Column Thermostat UHPLC Frictional Heating

Temperature Control and Related Effects

Trang 14

Loss of Peak Resolution

Thermal Mismatch Issues

• Centre of column below oven temperature

• Higher viscosity, lower linear velocity in centre

• Higher retention in centre

Trang 15

1290 Infinity II DAD 1290 Infinity II RID 1290 Infinity II ELSD 6475 Triple quadrupole

LC/MS

Detector

There are many detection principles used to detect the compounds eluting from an HPLCcolumn

Detector Selectivity Sensitivity

Uv-Vis Semi-selective Medium Refractive index Universal Low Fluorescence Selective High Evaporative Light Scattering * Universal Medium Mass Spec* Selective High

Which detector to choose?

It depends on the analyte and the need for selectivity and sensitivity!

Evaporative Light Scattering Mass Spectrometry

And differ in terms of sensitivity, selectivity, and linear range:.

• Sensitivity defines the lowest concentration of a compound that

can be detected.

• Selectivity determines how specific a detector can be for a

certain compound.

• The linear range describes the concentration range of a compound,

in which the detector delivers a linear response signal.

The most common are based on:

UV-Vis Absorption

Refractive Index

Fluorescence

Trang 16

Mobile Phase

Right LC column

Keep

“System clean”

Sample prepare

Troubleshooting

Instrument

Shorter is Better

II Vấn đề

thường gặp

III Làm sạch

Hệ thống

Trang 17

I Phát triển phương pháp

Workflow chọn cột; Agilent solutions

1

Trang 21

Kích thước hạt và cột

Cách chọn Cột

Trang 22

Cách chọn Cột

Trang 23

How to choose the right HPLC column

https://www.agilent.com/search/gn/lc-column-usp-designation

Trang 24

2 3

Thay đổi phân tách

• Thay đổi thời gian lưu

• Ghost peak or Carry over

II Vấn đề thường gặp trong sắc ký

Trang 26

Áp suất hệ thống thay đổi

Inline filter frit bị tắt • Xác định vị trí

• Dung môi HPLC-grade; lọc

• Ngăn chặn sự phát triển vi sinh vật

Capillaries, needle

và needle seat bị tắt

Guard hoặc column inlet frit bị tắt 1 phần

Trang 27

Syringe Filter Selection Tool

https://www.agilent.com/search/gn/syringe-filter-selector

Solvent Filtration

Sample Filtration

• 0.2 µm filter

• Regenerated cellulose (RC) (ideal)

• Nylon (dung dịch kiềm)

• PTFE (chemical resistance) Technical Overview:Operational manual: 5994-1504EN5994-1507EN

Trang 28

• Dung môi và đệm đã lọc

• Không thêm MP “mới” vào MP “cũ”

• Bottle tối màu cho MP là nước

• Frit 2µm cho cột kích thước hạt 3.5/5µm

• 0.5µm cho kích thước hạt 1.8/2.7µm

Inline Filters

Ngăn chặn VSV trong Solvent Bottle

2.1 mm 0.2 µm 2.1 mm0.5 µm 4.6 mm0.2 µm 4.6 mm0.5 µm 4.6 mm2.0 µm

Trang 29

Column clean “Stronger solvents”

• Mobile phase (không muối đệm)

“ Khi sử dụng CH 2 Cl 2 và n-Hexan , cột phải được rửa bằng IPA

trước khi sử dụng pha động”

Ngược lại để

cân bằng

> 25mL (10V column) mỗi loại dung môi RP

Trang 31

Rò rỉ đường dẫn

áp cao • Kiểm tra trực quan• Instrument diagnostic testsPha động (MP) sai • Kiểm tra MP• Bình chứa dung môi và ống kết nối

Áp suất thấp

Trang 32

“ Rò rỉ và tầm quan trọng của fittings "

Stainless Steel (SS) fittings là lựa chọn tốt nhất

cho áp suất cao

Trang 33

Không khí trong

hệ thống

• Prime và flush

• Kiểm tra dung môi

• Kiểm tra degasePump head

• Thực hiện pump head diagnostic tests

• Thay thế bộ phận lỗi

• Bảo trì

Ảnh hưởng của tạo bọt

• Kiểm tra dòng chảy (solvent bottle đến pump head inlet)

• Làm sạch và thay thế

• Đảm bảo dung môi đặt trên đầu vào pump

Áp suất dao động

Trang 34

Part 2.2: Changes in

"Peak Shape"

"Why Did That Happen?"

Trang 35

Peak shapes

Fronting Broadening

Hình dạng peak

Trang 36

Peak shape: “Tailing peaks”

Trang 37

Tương tác thứ cấp

Hình dạng peak

Trang 38

Bonded phases - endcapping

Bonded embedded polar group

phases-Bonded phases for

high pH

Bonded phases high aqueous

Hình dạng peak

• Tăng cường tương tác chất phân tích Khi MP có H2O lớn

Trang 40

Kết nối kém

Hình dạng peak

Kết nối kém

Fixed!

• Ngoài tailing; có thể broaden hoặc split peaks

• Ảnh hưởng đến tất cả các peak, đặc biệt các

peak rửa giải sớm

• Carry over

“Agilent A-Line Quick Connect Fitting”

Trang 41

Peak shape: “Fronting peak”

Symmetry < 0.9

Hình dạng peak

Trang 42

Peak shape: “Split”

Hiệu ứng dung môi

Đường dẫn mẫu

Nhiễm bẩn

Hình dạng peak

Trang 43

Hiệu ứng dung môi

1: Caffein 2: Salicilamide

SB-C8, 4.6 x 150mm; 5µm MP: 82% H2O : 18% ACN

Lực rửa giải dung môi (mẫu) >

< Pha động

Hình dạng peak

Trang 44

Doublet

Hình dạng peak

Column void •• Thay cộtTiền cột

• Hạn chế pH cao

Tắt Frit •• Backflush cộtInline filter

• Tiền cột và làm sạch mẫuColumn fitting

Tương kị dung môi mẫu và MP • Sử dụng pha động

!

Quan trọng

Các chất có hệ số lưu giữ thấp sẽ ảnh hưởng nhiều nhất

Trang 45

Hình dạng peak

Peak shape: “Broadening”

t

Detector settings • Tăng data collection rate

(đảm bảo cycle/s MS; sử dụng dMRM)

Kết nối lỗi • Kiểm tra lại kết nối

Extra tubing volume

lớn

• Các tubing có đường kính bé để giảm extra volumne

Dwell volume •nồng độ gradient ban đầu Chương trình tiêm mẫu hoặc giảm

Trang 46

Hình dạng peak

First the green dots: the peak is defined by 24 values

and shows a well-integrated profile

2 Second the red dots/line: the peak is only described

by six measurements, the peak area is smaller (limit

of detection is smaller) and the calculated efficiency is

only 89% of the blue-lined peak

3 Third the yellow dots/line: the peak is severely

distorted, retention time and peak area are unreliable

and a calculated efficiency shows only 39% of the

reality

 Savitzky-Golay (1964): 12-15 points per peak

 Dyson (1998): 100 points per peak

Trang 47

Hình dạng peak

Data Rate/Acquisition Frequency

Trang 48

Hình dạng peak

Pre-column Heater

Scherzo SM-C18 MF, 100 x 2mm A: MeOH/H2O/FA 20/80/0.1/ B: MeOH/ 50mM HCOONH4 20/80 0-100% B(0-5min) 100%B (5-7min)

0.2 mL/min (10 MPa), 37 o C, 20uL Single Quad MS (ESI)

Metal

Trang 49

Peak width 0.018 min

min

Resolution 1.902

0

Extra tubing volume

Length 10 mm 50 mm 100 mm 150 mm

Tubing id Volume Volume Volume Volume 0.17mm (green) 0.227 µL 1.1 µL 2.27 µL 3.3 µL 0.12mm (red) 0.113 µL 0.55 µL 1.13 µL 1.65 µL

Start Extra Volume

End Extra Volume

Trang 50

Part 2.3: Changes in

"Separation"

"Why Did That Happen?"

Trang 51

Peak shape: “Ghost peak”

Peak rửa giải muộn từ

lần tiêm trước •• Flush cột (post gradient) Check blank

Tương tác với bề mặt

kim loại •• Passivate thiết bịSử dụng LC và cột Bio-inertChất bẩn, tạp trong

mẫu và dung môi •• Làm sạch mẫuDung môi có độ tinh khiết cao

Nhiễm bẩn PEG

Changes in Separation

Trang 52

Nhiệt độ cột dao động Buồng điều nhiệt

Cân bằng không đủ Cân bằng cột ít nhất 10 Vcol

Thành phần MP Bộ trộn hoặc chuẩn bị mới

Tốc độ dòng Check dao động áp suất

Thể tích Gradient

Delay khác nhau

Changes in Separation

Trang 54

III Loại bỏ nhiễm bẩn LC

Cleaning to Eliminate Contamination in LC

1

Trang 55

Don’t Forget the Seal Wash and Needle Wash

Ngăn chặn muối đệm trên pump seal

 Nước deion:Isopropanol (IPA) (90/10)

 Rửa seal phải thực hiện định kỳ bất kể thiết bị có

thu thập dữ liệu hay không

 Setup tự động trên hệ bơm 1290

 Đảm bảo dung môi rửa seal không được trống

Sử dụng needle wash để giảm carryover

 Dung môi mới

Cleaning to Eliminate Contamination in LC

Trang 56

Giảm Carry-Over là chìa khóa phân tích lượng vết

sử dụng LC-MS/MS

Thành phần và thứ tự rửa là chìa khóa để có hiệu năng tốt…

e.g S1: 2% Organic/water S2: 90/10 ACN/Water S3: 50/50 MeOH/ACN

Luôn luôn quay về S1 để đảm bảo quá trình sắc ký tốt nhất

Thể tích tiêm bé

Độ nhạy detector lớn, yêu cầu làm sạch

Trang 57

Shutdown State and Instrument Flushing

Shutdown State

Sử dụng ngày hôm sau

• MP tốc độ thấp (0.01 – 0.1mL/phút)

• Rửa cột hoặc bảo quản thời gian dài

20/80 organic/water tiếp đến 80/20 organic/water hoặc

100% organic

Instrument flushing

• Tháo cột, ngắt kết nối detector

• Rửa với nước, kết nối detector

• Tiêm nước 2-3 lần với maximum volume

• Rửa với 100% dung môi hữu cơ để bảo quản

Trang 58

High PERFORMANCE Liquid Chromatography!

ULTRA High PERFORMANCE Liquid Chromatography!!

Trang 59

Introduction: Modern LC (UHPLC) vs HPLC

May 17, 2024

59

Trang 60

Modern LC Increased Performance: What does this mean?

Introduction: Modern LC (UHPLC) vs HPLC

Application

Pressure 840 bar Run time 33 min

Trang 61

5 µm particles

• For smaller particles the height of the

theoretical plate decreases

• Therefore the number of theoretical plates in a

column with given length increases

• The optimal flow rate at the minimum point of

each curve shifts to the right which also

improves throughput due to higher flow rates

Column with higher number of theoretical plates required

How To Increase Resolution – Van Deemter Plot

May 17, 2024

61

Trang 62

Column with higher number of theoretical plates required

Increase in column length will also increase run time (adjust gradient time)

Decrease in particle size will increase pressure

No Run Time Increase!

Increase Resolution – Decrease Particle Size

Column length (mm) Number of plates N 5 μm particles Number of plates N 3.5 μm particles Number of plates N 1.8 μm particles

Trang 63

No Run Time Increase!

Applying Columns With Smaller Particles

min

mAU

0 20 40

width gives increased sensitivity

May 17, 2024

63

Trang 64

Modern LC Increased Performance: What does this mean? Modern LC (UHPLC) vs HPLC Continued…

Application

May 17, 2024

64

Trang 65

Smaller particles give increased peak height

A: Absorption

ci: Sample concentration

Vi: Injection volume

VR: Retention volumeN: Number of theoretical plates

1200 µl/min; 10 sec peak w baseline = 200 µl; 10 µl injection

600 µl/min ; 2 sec peak w baseline = 20 µl; 2 µl injection Factor 2 sensitivity

May 17, 2024

65

Trang 66

Modern LC Increased Performance: What does this mean?

Modern LC (UHPLC) vs HPLC Continued…

Application

Pressure 1150 bar Run time 0.35 min

Trang 67

Column length (mm) Number of plates N 5 μm particles Number of plates N 3.5 μm particles Number of plates N 1.8 μm particles

Decrease in column length will decrease run time (adjust gradient time)

Decrease in particle size will maintain resolution

Shorter column with same number of theoretical plates required

No Resolution Loss!

Increase Throughput

2

2 1

1

p

c p

c

d

L d

L

N = =

May 17, 2024

67

Trang 68

mAU

0 20 40 60 80 100 120 140

min

mAU

0 20 40 60 80

Decrease Run Time – Reduce Column Length

• Decreased run time due to reduced column length

• No loss in resolution due to same number of

theoretical plates

• Increased pressure due to smaller particles

(despite shorter columns)

Trang 69

5 µm particles

• For modern column particles the optimum flow

rate (lowest height of a theoretical plate)

increases

• For modern column particles the separation

efficiency suffers less when increasing the flow

• Using modern column particles, if

instrumentation flow and pressure

specifications and columns flow and pressure

specifications allow it, the flow rate can be

increased for further gains in throughput

Ideal flow rate for modern column particles

How To Increase Resolution – Van Deemter Plot

May 17, 2024

69

“horizontal”

Trang 70

No Resolution Loss!

Apply Van Deemter Rules - Speed Up Run Times

• Decreased run time due to increased flow rate

• No loss in resolution, number of theoretical plates

not influenced by flow rate

min

mAU

0 20 40 60 80 100 120

Tiêu đề	UHPLC and HPLC Method Optimization
Tác giả	Phan Xuan Dai
Trường học	Red Star Vietnam Company Limited – CMS Branch (REDSTAR-CMS)
Chuyên ngành	Chromatography
Thể loại	Presentation
Năm xuất bản	2024

Định dạng
Số trang	73
Dung lượng	6,47 MB