ỨNG DỤNG CÔNG NGHỆ NUÔI CẤY MÔ TẾ BÀO THỰC VẬT TRONG VIỆC NHÂN GIỐNG CÂY CHUỐI MỐC (MUSA SP)

Giáo Dục - Đào Tạo - Khoa học xã hội - Công nghệ thông tin UBND TỈNH QUẢNG NAM TRƯỜNG ĐẠI HỌC QUẢNG NAM KHOA: LÝ – HÓA - SINH ----    ---- KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ỨNG DỤNG CÔNG NGHỆ NUÔI CẤY MÔ TẾ BÀO THỰC VẬT TRONG VIỆC NHÂN GIỐNG CÂY CHUỐI MỐC (MUSA SP) Sinh viên thực hiện: HUỲNH THỊ TRANG MSSV: 2113012735 CHUYÊN NGÀNH: SINH – KTNN KHÓA 2013 – 2017 Cán bộ hướng dẫn: Th.S: HỒ THỊ KIM CÚC MSCB: Quảng Nam, tháng 5 năm 2017 MỤC LỤC I. MỞ ĐẦU ............................................................................................................ 1 1.1. Lý do chọn đề tài ...................................................................................... 1 1.2. Mục tiêu đề tài .......................................................................................... 2 1.3. Đối tượng và địa điểm nghiên cứu ........................................................... 2 1.3.1. Đối tượng nghiên cứu ........................................................................ 2 1.3.2. Địa điểm nghiên cứu .......................................................................... 2 1.4. Thời gian nghiên cứu ................................................................................ 2 1.5. Phương pháp nghiên cứu .......................................................................... 2 II. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU ............................................................................. 3 Chương 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU .................................................................... 3 1.1. Giới thiệu kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật ...................................... 3 1.1.1. Khái niệm ........................................................................................... 3 1.1.2. Tình hình phát triển kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào trong nhân giống cây trồng ........................................................................................................... 3 1.1.2.1 Tình hình phát triển kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào trong nhân giố ng cây trồng trên thế giớ i…………………………………………………………………………………….….3 1.1.2.2 Tình hình phát triển kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào trong nhân giố ng cây trồng ở Việ t Nam……………………………………………………………………………….……..5 1.1.2.2 Tình hình phát triển kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào trong nhân giố ng cây trồng ở tỉnh Quả ng Nam………… ……………………………………………………………………7 1.1.1. Các bước chính trong nhân giống in vitro3;0……………………….. 7 1.1.2.Các chất điều hòa sinh trưởng trong nuôi cấy mô tế bào thực vật 1… 9 1.1.2.3 Auxin…………………………………………………………………...9 1.1.2.4 Cytokinin…………………………………………………………………9 1.1.3. Các chất điều hòa sinh trưởng tronng nuôi cấy mô tế bào thực vậ t 1………………………………………………………………………………..... 9 1.2. Giới thiệu chung về cây chuối ................................................................ 10 1.2.1. Nguồn gốc và phân bố ..................................................................... 10 1.2.2. Phân loại chuối ..................................................................................... 12 1.2.3. Đặc điểm hình thái ........................................................................... 14 1.2.4. Đặc điểm sinh thái 2...................................................................... 15 1.3. Giá trị của cây chuối mốc ....................................................................... 16 1.3.1 Giá trị dinh dưỡng 11 ................................................................... 16 1.3.2 Giá trị dược liệu 18 ...................................................................... 17 1.3.. Giá trị kinh tế 11 ........................................................................... 17 1.4. Tình hình nghiên cứu về kỹ thuật nhân giống chuối bằng phương pháp nuôi cấy mô ....................................................................................................... 18 1.5.1. Tình hình nghiên cứu về kỹ thuật nhân giống chuối bằng phươ ng pháp nuôi cấy mô trên thế giới ...................................................................... 18 1.5.2. Tình hình nghiên cứu về kỹ thuật nhân giống chuối bằng phươ ng pháp nuôi cấy mô ở Việt Nam ........................................................................ 20 1.4.3. Tình hình nghiên cứu về kỹ thuật nhân giống chuối bằng phươ ng pháp nuôi cấy mô ở Quảng Nam ................................................................... 22 Chương 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ........................... 24 2.1. Vật liệu nghiên cứu................................................................................. 24 2.1.1 Nguyên liệu khởi đầu ........................................................................... 24 2.1.2. Dụng cụ, thiết bị và hóa chất nghiên cứu ........................................ 24 2.2. Phương pháp nghiên cứu ........................................................................ 26 2.2.1. Quy trình nuôi cấy mô tế bào ............................................................... 26 2.2.2. Các bước thực hiện quy trình nuôi cấy mô chuối mốc ........................ 27 2.2.2.1. Chọn và xử lý mẫu cấ y……………………….………………………27 2.2.2.2. Khử trùng mẫ u………………………………………….….…….…..27 2.2.2.3. Chọn môi trườ ng………………………………………………..…....28 2.2.2.4. Hấp môi trườ ng………………………………………………..….….29 2.2.2.5. Đưa chuối vào môi trường nuôi cấy khởi độ ng………….……..30 2.2.2.6. Tạ o mô …………………………………………………………..…...30 2.2.2.7. Tái sinh chồi từ mô sẹ o………………………………..…......…….30 2.2.2.8. Nhân nhanh chồ i…………………………………………...……....30 2.2.2.9 Tạo rể cây……………………………………….…………...…31 2.2.2.10. Chuyển ra vườn ươ m……………………………..…………..…...31 2.2.2.11. Đưa ra ruộ ng……………………………………..………………....31 2.2.2.12. Điều kiện nuôi cấy và các chỉ tiêu theo dõi …………………....31 Chương 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ........................................................... 34 3.1. Khảo sát ảnh hưởng của chất khử trùng đến mẫu cấy ............................... 34 3.3. Khảo sát sự ảnh hưởng của nồng độ NAA đến khả năng ra rễ của chồi giống chuối mốc ................................................................................................ 46 Phần 3. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ................................................................ 49 3.1. Kết luận ...................................................................................................... 49 3.2. Kiến nghị .................................................................................................... 49 Phần 4. TÀI LIỆU THAM KHẢO....................................................................... 50 LỜI CẢM ƠN Trong thời gian thực hiện đề tài khóa luận tốt nghiệp, dưới sự hướng dẫn tận tình của giáo viên và các thầy cô trong khoa và được phía nhà trường tạo điều kiên thuận lợi, em đã có một quá trình nghiên cứu học tập tìm hiểu hết sức nghiêm túc để hoàn thành đề tài. Đặc biệt em xin bày tỏ lời cảm ơn sâu sắc đến cô giáo hướng dẫn Ths. Hồ Thị Kim Cúc, giảng viên khoa Lý – Hóa –Sinh trường Đại Học Quảng Nam, cùng Chị Lê Thị Tường Vi – phòng nuôi cấy mô trung tâm ứng dụng và thông tin, khoa học – công nghệ tỉnh Quảng Nam. Đã tạo điều kiện tốt nhất cho em thực hiện và hoàn thành tốt khóa luận tốt nghiệp này. Đồng thời em xin trân trọng cảm ơn các quí thầy cô giáo bộ môn trong khoa Lý- Hóa- Sinh, Trường Đại Học Quảng Nam đã dạy dỗ và truyền đạt kiến thức và kinh nghiệm nghiên cứu khoa học cho em trong suốt khoảng thời gian được học tập tại trường. Xin cảm ơn gia đình, bạn bè và người thân đã động viên, khích lệ, chia sẻ và góp ý cho em trong khoản thời gian hoàn thành khóa luận để em có thể hoàn thành tốt bài khóa luận tốt nghiệp này. Sinh viên thực hiện Huỳnh Thị Trang NHỮNG TỪ VIẾT TẮC TRONG KHÓA LUẬN BA 6 – benzyladenin BAP 6 benzyl Amino Purin CT Công thức Cs Cộng sự IAA Indol -3Axetic Axit IBA 3 indol Butric Axit KTST Kích thích sinh trưởng MS Môi trường cơ bản của Murashige và Skoog NAA α – Napthalen Axetic Axit TB Trung bình 2.4D 2.4 – Dichlorophenoxy Axetic Axit DANH MỤC CÁC BẢNG TRONG KHÓA LUẬN Bảng Nội dung Trang Bảng 1.1 Thành phần dinh dưỡng của các chuối mốc trong 100g chuối chín 16 Bảng 3.1 Kết quả ảnh hưởng của các nồng độ cồn đến khử trùng mẫu 34 Bảng 3.2 Kết quả các đợt cấy mẫu khởi động 37 Bảng 3.3 Ảnh hưởng của nồng độ BA đến khả năng bật chồi của chuối mốc 41 Bảng 3.4 Kết quả theo dõi nuôi cấy nhân nhanh chồi trong môi trường đã chọn 44 Bảng 3.5 Ảnh hưởng của nồng độ NAA đến khả năng ra rễ của chồi giống chuối mốc 46 DANH MỤC CÁC BIỂU ĐỒ TRONG KHÓA LUẬN Biểu đồ Nội dung Trang Biểu đồ 3.1 Ảnh hưởng của các nồng độ cồn đến khử trùng mẫu 35 Biểu đồ 3.2 Số lượng mẫu đưa vào các đợt cấy 37 Biểu đồ 3.3 Tỉ lệ hành công các đợt cấy 38 Biểu đồ 3.4 Ảnh hưởng của nồng độ BA đến khả năng bật chồi của chuối mốc 41 Biểu đồ 3.5 Ảnh hưởng của nồng độ α-NAA đến khả năng ra rễ của chồi chuối mốc 47 DANH MỤC CÁC HÌNH TRONG KHÓA LUẬN Hình Nội dung Trang Hình 3.1 Mẫu khử bằng cồn 50 36 Hình 3.2 Mẫu khử bằng cồn 60 36 Hình 3.3 Mẫu khử bằng cồn 70 36 Hình 3.4 Mẫu khử bằng cồn 80 36 Hình 3.5 Mẫu khử bằng cồn 90 36 Hình 3.6 Mẫu vô khởi động 39 Hình 3.7 Mẫu bị nhiễm 40 Hình 3.8 Chồi yếu (3mllBA) 42 Hình 3.9 Chồi khỏe (3,5mllBA). 42 Hình 3.10 Chồi khỏe, xanh (4mllBA) 43 Hình 3.11 Chồi khỏe (4,5mllBA) 43 Hình 3.12 Chồi yếu (5mllBA) 43 Hình 3.13 Chồi được 2 tuần 45 Hình 3.14. Chồi được 4 tuần 45 Hình 3.15 Chồi được 6 tuần 45 Hình 3.16 Rễ ra dài và khỏe (0,8mll α-NAA) 48 1 I. MỞ ĐẦU 1.1. Lý do chọn đề tài Nuôi cấy mô tế bào thực vật là một ngành khoa học có nhiều triển vọng, được ứng dụng nhiều trong các lĩnh vực kinh tế. Hiện nay, người ta đã bắt đầu ứng dụng khả năng nuôi cấy tế bào thực vật tách rời ở quy mô công nghiệp để thu nhận các sản phẩm, các hoạt chất sinh học có giá trị kinh tế cao. Nhờ ứng dụng các thành tựu mới mẻ của công nghệ sinh học như kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào, kỹ thuật tái tổ hợp di truyền, người ta có thể tạo ra được những giống cây trồng không những có năng suất cao mà còn chống chịu được với sâu bệnh, hạn hán và điều kiện nghèo phân bón. Nhờ bỏ qua được việc lai chéo và khắc phục được sự tương khắc sinh sản mà việc lai tạo giống rút ngắn được nhiều thời gian. Kỹ thuật tái tổ hợp ADN và các kỹ thuật in vitro mở ra khả năng lai khác loài và làm tăng nhanh tính đa dạng di truyền. Đối với các loại cây trồng có giá trị thương mại lớn, kỹ thuật nuôi cấy mô đã đem lại những hiệu quả kinh tế hết sức rõ rệt. Chuối là một loài cây ăn quả được ưa chuộng ở nước ta với thành phần dinh dưỡng cao. Chuối có rất nhiều tác dụng đối với sức khỏe như chữa được một số bệnh liên quan đến tiêu hóa, hệ thần kinh, giúp làm đẹp da…Ở nước ta chuối được trồng phổ biến ở khắp nơi và đem lại nguồn thu nhập tương đối lớn cho người nông dân. Tại Quảng Nam cũng có nhiều giống chuối ngon được trồng, trong đó huyện Tiên Phước là một trong những huyện đi đầu về trồng chuối. Tại đây có rất nhiều giống chuối ngon như: chuối tiêu, chuối lùn, chuối cau, chuối mốc, chuối bom…và chúng đã đem lại cho người dân nơi đây một nguồn thu nhập đáng kể. Những năm gần đây, cây chuối mốc dần được ưa chuộng do giá thành không cao mà lại dễ sử dụng và chế biến. Từ chuối mốc có thể ăn tươi hoặc làm các món ăn từ chuối như: chè chuối, chuối chiên… Tuy nhiên chuối được trồng theo phương pháp truyền thống mang một số nhược điểm như: cây con tách ra sinh trưởng kém, không đồng đều, lâu cho thu 2 hoạch đồng thời mắc một số bệnh do vi khuẩn vi rút gây ra làm giảm chất lượng giống. Với việc áp dụng phương pháp nuôi cấy mô sẽ khắc phục được các nhược điểm trên, cây chuối con sẽ tạo ra với số lượng lớn đồng thời sinh trưởng và phát triên tốt, đặc biệt sạch bệnh và rút ngắn được thời gian thu hoạch. Xuất phát từ lí do trên tôi chọn đề tài : “ Ứng dụng công nghệ nuôi cấy mô tế bào thực vật để nhân giống cây chuối mốc (Musa ssp)” 1.2. Mục tiêu đề tài - Khảo sát nồng độ chất khử trùng ở giai đoạn vô mẫu cây chuối mốc. - Nghiên cứu môi trường thích hợp cho việc nhân nhanh chồi. - Nghiên cứu môi trường thích hợp để ra rễ cây chuối mốc 1.3. Đối tượng và địa điểm nghiên cứu 1.3.1. Đối tượng nghiên cứu Cây chuối mốc (Musa ssp) tại huyện Tiên Phước, Quảng Nam. 1.3.2. Địa điểm nghiên cứu Trung tâm Ứng dụng và Thông tin, KH-CN tỉnh Quảng Nam. 1.4. Thời gian nghiên cứu - Đề tài được nghiên cứu từ tháng 112016 – 32017 1.5. Phương pháp nghiên cứu - Phương pháp thực nghiệm: các thí nghiệm được tiến hành tại Trung tâm Ứng dụng và thông tin, KH-CN tỉnh Quảng Nam - Phương pháp nghiên cứu: nghiên cứu tài liệu, sách báo, internet… - Phương pháp thống kê và xử lí số liệu. 3 II. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU Chương 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Giới thiệu kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật 1.1.1. Khái niệm - Kỹ thuật nuôi cấy mô và tế bào thực vật hay nhân giống in vitro đều là thuật ngữ mô tả các phương pháp nuôi cấy các bộ phận thực vật (tế bào đơn, mô, cơ quan) trong ống nghiệm có chứa môi trường dinh dưỡng thích hợp như muối khoáng, vitamin, đường và các chất điều hòa sinh trưởng thực vật trong điều kiện vô trùng 5. - Nuôi cấy mô tế bào thực vật dựa trên 2 nguyên tắc 5: + Dựa vào tính toàn năng của tế bào: Là khả năng của 1 tế bào hình thành 1 cây hoàn chỉnh trong điều kiện nuôi cấy thích hợp, do trong tế bào có chứa bộ ADN (NST) hoàn chỉnh, chứa toàn bộ thông tin di truyền cho 1 chu kì sống hoàn chỉnh. + Dựa vào khả năng phân hóa và phản phân hóa. Phân hóa: 1 Tế bào hay 1 khối tế bào phân hóa tạo mô, cơ quan, hệ cơ quan. Phản phân hóa: Khi các tế bào đã phân hóa thành các mô chức năng riêng biệt nhưng vẫn có thể quay về trạng thái chức năng phôi sinh ban đầu khi gặp điều kiện thuận lợi. 1.1.2. Tình hình phát triển kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào trong nhân giố ng cây trồng 1.1.2.1. Tình hình phát triển kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào trong nhân giố ng cây trồng ở thế giới Cuối thế kỷ 19, nhà khoa học người Đức Haberlandt (1902) là người đầu tiên đề xuất phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật để chứng minh tính toàn năng của tế bào. Theo ông, mỗi tế bào của bất kỳ cơ thể sinh vật nào đều mang toàn bộ lượng thông tin di truyền của cả sinh vật đó. Vì vậy, khi gặp điều kiện thích hợp mỗi tế bào đều có thể phát triển thành cơ thể hoàn chỉnh 3. Năm 1934, bắt đầu giai đoạn thứ hai trong lịch sử nuôi cấy mô tế bào thực vật, khi White, người Mỹ, nuôi cấy thành công đầu rễ cà chua (Lycopersicum 4 esculentum ) với một môi trường lỏng chứa muối khoáng, glucose và nước chiết nấm men. Sau đó White chứng minh rằng có thể thay thế nước chiết nấm men bằng hỗn hợp ba loại vitamin nhóm B: Thiamin (B1), Pyridoxin (B6) và Nicotinic axit. Từ đó việc nuôi cấy đầu rễ đã được tiến hành trên nhiều loại cây khác nhau 6. Năm 1941. Overbeck ở Mỹ chứng minh tác dụng kích thích sinh trưởng của nước dừa trong nuôi cấy phôi cây họ cà (Datura ). Sau đó năm 1948 Steward xác nhận tác dụng của nước dừa trên mô sẹo cà rốt. trong thời gian này, nhiều chất sinh trưởng nhận tạo thuộc nhóm auxin đã được nghiên cứu và tổng hợp hóa học thành công 3. Trong thời gian từ 1954-1959, kỹ thuật tách và nuôi cấy tế bào đơn, các tế bào sống độc lập không dính với các tế bào khác, đã được phát triển. Muir, Hildebrandt và Riker đã tách các tế bào của mô sẹo thành một huyền phù các tế bào đơn bằng cách đưa lắc trên máy lắc. Nickell (1956) nuôi liên tục được một huyền phù tế bào đơn cây đậu 11. Đến những năm 60, khi đồng thời Stewart (1963), Wetherell và Halperin (1963) cùng thông báo tế bào cà rốt khi nuôi cấy trên môi trường thạch đã tạo thành hàng ngàn phôi, các phôi này phát triển qua các giai đoạn giống như quá trình tạo phôi bình thường ở cà rốt, lúc này tính toàn năng của tế bào càng được khẳng định 15. Vào đầu những năm 1960, Morel là người đầu tiên áp dụng thành công kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật để nhân giống Lan trong ống nghiệm. Morel và Martin (1952) đã tạo được cây Thược dược sạch virut bằng cách dùng đỉnh sinh trưởng để nuôi cấy. Năm 1960 Cooking ở Đại học Nottingham (Anh) công bố có thể dùng men cellulase để phân hủy vỏ cellulose của tế bào thực vật, kết quả thu được các tế bào tròn, không có vỏ bọc, gọi là protoplast. Từ năm 1980-1992 hàng loạt các thành công mới trong lĩnh vực công nghệ gen thực vật được công bố. Nhờ có plasmid, phân tử ADN vòng thường có trong tế bào vi khuẩn, được lắp ghép cấu trúc lại sao cho trong plasmid có gắn thêm một gen xác định đã thực hiện thành công, hàng loạt công trình chuyển gen ngoại lai vào thực vật 4. 5 Việc ứng dụng nuôi cấy mô thực vật trong nhân giống được Nozeran nâng lên một mức mới khi ông nhận thấy sự trẻ hóa của các chồi nách của cây nho và cây khoai tây đem nuôi cấy và cấy truyền nhiều lần trong ống nghiệm. Việc ứng dụng nuôi cấy mô trong nhân giống trên quy mô lớn không còn hạn chế ở cây cảnh mà đã được thực hiện ở quy mô thương mại đối với hàng loạt cây trồng có ý nghĩa kinh tế cao như chuối, cà phê, cọ dầu, sắn, khoai tây, cây ăn quả, cây cảnh,… Và đã có những đóng góp to lớn cho nông nghiệp thế giới 12. Hiện nay, rất nhiều loài hoa như: hoa Lan, Cúc, Đồng tiền...và các loài cây cảnh có giá trị khác cũng được nhân giống theo phương pháp nuôi cấy mô. Hiện có khoảng 30 chi phong Lan được nhân giống phổ biến theo con đường nuôi cấy mô. Ở Mỹ, Anh, Pháp, Hà Lan, Nhật Bản, Trung Quốc, Thái Lan,… việc nhân giống theo con đường này đã trở nên rất phổ biến trên các đối tượng là hoa nhằm mục đích thương mại, điển hình như: - Hà Lan là Quốc gia có lĩnh vực nuôi cấy mô tế bào thực vật rất phát triển, nước này đã ứng dụng lĩnh vực này vào việc nhân và lai tạo các giống cây trồng mới đặc biệt là các loài hoa với đa dạng về chủng loại và màu sắc. - Thái Lan đã sử dụng công nghệ nuôi cấy mô tế bào thực vật để nhân, tạo các loại giống hoa Phong Lan rất thành công 11. 1.1.2.2. Tình hình phát triển kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vậ t trong nhân giống cây trồng ở Việt Nam Việc nghiên cứu nuôi cấy mô thực vật ở Việt Nam chỉ mới bắt đầu từ năm 1975. Ý thức được triển vọng to lớn của ngành công nghệ sinh học trong chọn giống và nhân giống cây trồng, nhiều cơ quan làm công tác giống cây trồng bắt đầu ứng dụng công nghệ này. Trong những năm trở lại đây, công nghệ nuôi cấy mô tế bào thực vật ở Việt Nam cũng đã đạt được những thành tựu nhất định, có rất nhiều tỉnh thành trong cả nước đã xây dựng nhiều phòng thí nghiệm nghiên cứu công nghệ cao để phát triển lĩnh vực nuôi cấy mô tế bào thực vật. Bước đầu đã nhân giống thành công một số loài hoa như: Cúc, Đồng tiền, Lan, Hồng,.... có hệ số nhân giống cao và cây con có chất lượng tốt. 6 Năm 2008 ở nước ta công nghệ nuôi cấy mô đã có những bước đột phá mới. Một số địa phương nhân giống hoa bằng phương pháp nuôi cấy mô để thương mại, ngoài ra còn khôi phục nhiều loài thực vật có nguy cơ tuyệt chủng như các loài Lan rừng quý hiếm (Lan Hài hồng) tại phân viên sinh học Đà Lạt 10. Đà Lạt là địa phương có lĩnh vực nuôi cấy mô tế bào phát triển rất mạnh. Việc lai tạo giống thông qua công nghệ nuôi cấy mô tế bào được phổ biến khá rộng rãi. Tại đây các cơ sở nuôi cấy mô của nhà nước và tư nhân đều phát triển mạnh và nuôi cấy rất nhiều giống cây khác nhau, trong đó chủ yếu là các loại hoa, hầu như nông dân trồng hoa ở Lâm Đồng đều sử dụng cây con giống từ cây nuôi cấy mô và đã trồng hoa với các kỹ thuật mới nên đem lại lợi nhuận kinh tế rất cao 10. Tại những tỉnh thành khác của cả nước cũng đã tiến hành nghiên cứu sản xuất thử nghiệm các giống cây bằng công nghệ nuôi cấy mô tế bào và bước đầu thu được một số kết quả đáng kể, cụ thể như 7: + Phòng nuôi cấy mô của Trung tâm giống và kỹ thuật cây trồng tỉnh Phú Yên hằng năm có thể tạo ra hơn 100.000 cây chuối cấy mô theo yêu cầu của khách hàng. + Từ năm 2001 đến nay, Sở Khoa học và Công nghệ Lạng Sơn hàng năm cung cấp hàng vạn cây giống bạch đàn nuôi cấy mô. + Trung tâm Ứng dụng và chuyển giao tiến bộ khoa học công nghệ tỉnh Vĩnh Phúc vừa ứng dụng thành công việc nhân giống cây Lô Hội bằng phương pháp nuôi cấy mô đây là một loại được liệu quý của địa phương. + Viện sinh học Nông nghiệp của Trường Đại học Nông Nghiệp I Hà Nội là một trong 50 cơ sở chuyên nuôi cấy mô tế bào thực vật, bước đầu cơ sở này đạt được những kết quả tốt như nuôi cấy các loài Phong Lan, Dứa Cayen, khoai tây sạch bệnh, đặt biệt là các loài hoa có giá trị (Lan, Đồng tiền, Cúc,…). Hiện nay công nghệ sinh học tế bào ở Hà Nội đang có bước phát triển nhảy vọt để phục vụ cho nền Nông nghiệp. + Trung tâm Ứng dụng tiến bộ khoa học và công nghệ tỉnh Bình Định luôn đẩy mạnh việc triển khai ứng dụng các thành tựu công nghệ sinh học về nuôi cấy 7 mô thực vật để nhân giống phục vụ công tác giống cây trồng tại địa phương. Trung tâm đã nghiên cứu và hoàn thiện được nhiều quy trình vi nhân giống cây trồng bằng phương pháp nuôi cấy mô các giống cây ăn quả, cây công nghiệp, cây hoa cảnh có giá trị kinh tế cao, phù hợp với điều kiện lập địa ở Bình Định và các tỉnh vùng Nam Trung Bộ và Tây Nguyên, như: chuối, đu đủ; dứa, mía, bạch đàn, keo lai, … và một số loại phong lan (Dendrobium , hồ điệp, ngọc điểm), lay ơn, hoa cúc, hoa huệ, đồng tiền,… So với các nước phát triển trên thế giới, công nghệ sinh học của Việt Nam còn một khoảng cách khá xa. Chúng ta đang bước vào giai đoạn phát triển thứ tư của nuôi cấy mô tế bào thực vật, đó là giai đoạn nuôi cấy mô tế bào thực vật được áp dụng mạnh mẽ vào thực tiễn chọn giống, vào việc sản xuất các chất thứ cấp có hoạt tính sinh học và vào nghiên cứu lý luận di truyền thực vật bậc cao. Nuôi cấy mô tế bào thực vật ở Việt Nam đã thoát khỏi giai đoạn phôi thai của nó, đang phát triển có những đóng góp tích cực vào lý luận sinh học cây trồng và vào thực tiễn phát triển ngành Nông-Lâm nghiệp của nước nhà. 1.1.2.3. Tình hình phát triển kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào trong nhân giố ng cây trồng ở Tỉnh Quảng Nam Tại Trung tâm Ứng dụng và Thông tin KHCN Quảng Nam đã thực hiện thành công đề tài về lĩnh vực nuôi cấy mô tế bào như đề tài: “Ứng dụ ng công nghệ nuôi cấy mô tế bào thực vật để nhân giống hoa Cúc Đại Đ óa (Chrysanthemum sp), Đồng Tiền (Gerbera jamesonii Bolus) và Lan Dendrobium”, các dự án cấp Nhà nước như dự án: “Ứng dụng công nghệ nuôi cấy mô để sản xuất giống và trồng cây ăn quả chất lượng cao tại tỉnh Quả ng Nam”, đây là cơ sở khoa học để tôi thực hiện được đề tài nhân giống cây chuối mốc Tiên Phước 18. 1.1.1. Các bước chính trong nhân giống in vitro 3;10  Bước 1: Chọn lọc và chuẩn bị cây mẹ Trước khi tiến hành nhân giống in vitro cần chọn lọc cẩn thận cây mẹ (cây cho nguồn mẫu nuôi cấy). Các cây này cần phải sạch bệnh, đặc biệt là bệnh virus và đang ở giai đoạn sinh trưởng và phát triển mạnh mẽ. Việc trồng các cây mẹ 8 trong điều kiện môi trường thích hợp với chế độ chăm sóc và phòng bệnh hợp lý sẽ làm giảm tỉ lệ mẫu nhiễm, tăng khả năng sống và sinh trưởng khi tra đưa mẫu vào nuôi cấy in vitro.  Bước 2: Nuôi cấy khởi động Giai đoạn khử trùng mẫu, giai đoạn này cần đảm bảo các yêu cầu như tỷ lệ mẫu nhiễm thấp, tăng tỷ lệ mẫu tái sinh, mô tồn tại, sinh trưởng và phát triển tốt. Khi lấy mẫu cần chọn đúng loại mô, đúng giai đoạn phát triển tốt của cây. Quan trọng nhất là đỉnh chồi ngọn, đỉnh chồi nách, đỉnh chồi hoa và sau đó là đoạn thân, mảnh lá.  Bước 3: Nhân nhanh Là giai đoạn kích thích mô nuôi cấy phát sinh hình thái và tăng nhanh số lượng thông qua các con đường: hoạt hóa chồi nách, tạo phôi vô tính, tạo chồi bất định… Vấn đề là cần xác định được môi trường và điều kiện ngoại cảnh thích hợp để có hiệu quả cao nhất. Theo nguyên tắc chung, môi trường có nhiều Cytokinin sẽ kích thích tạo chồi (AuxinCytokinin < 1: thì kích thích tạo chồi), môi trường có nhiều Auxin sẽ kích thích tạo mô sẹo (AuxinCytokinin >1: kích thích tạo mô sẹo). Chế độ nuôi cấy thường là 25-270 C và 16h chiếu sángngày, cường độ ánh sáng 2000-3000lux. Tuy nhiên đối với mỗi loại đối tượng nuôi cấy khác nhau đòi hỏi chế độ nuôi cấy khác nhau.  Bước 4: Tạo cây in vitro hoàn chỉnh Để tạo rễ cho chồi người ta cấy chuyển sang môi trường tạo rễ. Môi trường tạo rễ thường được bổ sung thêm một lượng nhỏ Auxin. Một số loại cây có thể phát sinh rễ ngay cả khi ta không bổ sung Auxin.  Bước 5: Đưa cây ra ngoài vườn ươm Để đưa được cây ra bên ngoài vườn ươm phát triển tốt ta cần phải đảm bảo một số yêu cầu sau: - Cây đảm bảo về chiều cao, số rễ, số lá. - Giá thể phải tơi xốp, sạch sẽ, thoát nước tốt. - Phải điều chỉnh độ ẩm, chế độ chiếu sáng vườn ươm, cũng như chế độ dinh dưỡng thích hợp. 9 1.1.2. Các chất điều hòa sinh trưởng tronng nuôi cấy mô tế bào thực vật 1 1.1.2.3. Auxin Các loại Auxin Các loại auxin khác nhau được tìm thấy trong tự nhiên là IAA, IBA, 4-Cl- IAA, PAA và các dạng kết hợp của các auxin này. Ngoài ra nhiều đồng đẳng hóa học cũng được tổng hợp. Một số chất trong số đó được sử dụng thường xuyên như NAA, 2,4-D,2,4,5-T, dicamba và 4-CPA. Những auxin được tổng hợp này trong nhiều trường hợp còn hiệu quả hơn cả các auxin tự nhiên. Hiệu quả tác động - Vai trò của auxin trong nuôi cấy mô đã được thiết lập bởi Skoog và Miller năm 1957. Họ quan sát thấy các nhu mô lõi được cắt ra từ thân cây thuốc lá hình thành chồi khi trong môi trường có nồng độ cytokinin cao và nồng độ auxin thấp, hình thành rễ khi nồng độ cytokinin thấp và auxin cao. - Auxin kìm hãm sự tăng trưởng quá nhanh của các chồi nách. 2,4-D thường được cho là một auxin mạnh nhưng nó chỉ có tác dụng trong việc hình thành mô sẹo và phôi sinh dưỡng: 2,4-D là một auxin yếu đối với sự tạo thành mầm rễ bất định hay ức chế các chồi nách. Ngược lại, IAA hay IBA không hiệu quả lắm trong sự hình thành mô sẹo và phôi sinh dưỡng, song lại thể hiện tác dụng cao đối với sự hình thành rễ bất định và ức chế các chồi nách. 1.1.2.4. Cytokinin Các loại Cytokinin Cytokinin là một loại hormone thực vật phức tạp nhất. Cytokinin tồn tại trong tự nhiên là Z, iP, và DHZ và các riboside của chúng như ZR, iPA và DHZR. Ngoài ra các cytokinin liên kết (không hoạt động) và các cytokinin bị phosphoril hóa (hoạt động) đã được tách ra từ mô thực vật. Trong một khoảng thời gian dài, BAP đã được xem như là một cytokinin tổng hợp, nhưng gần đây nó lại được chứng minh là một loại cytokinin tồn tại trong tự nhiên. Ngoài các loại cytokinin thuộc kiểu purine trên, các cytokinin không phải purine cũng đã được báo cáo như thidiazuron (TDZ) và CPPU (4-PU-30). Hiệu quả tác động 10 - Trong thời kì đầu của nuôi cấy mô thực vật Cytokinin đẩy mạnh sự phân chia tế bào, song chúng có vẻ ảnh hưởng đến một bước khác trong chu trình tế bào rồi đến auxin. Vì vậy, việc thêm cytokinin được yêu cầu để mô sẹo sinh trưởng. Trong vi nhân giống, cytokinin được sử dụng để kích thích tạo các nhánh bên. - Nồng độ cytokinin cao sẽ dẫn đến việc mọc ra quá nhiều so với mong muốn. Những ứng dụng khác của cytokinin trong nuôi cấy mô là sự đẩy mạnh quá trình tạo rễ bất định, ngăn chặn sự già cỗi, gây hồi phục do tác động xấu của auxin trên thân mầm, và đôi khi ức chế sự tạo rễ quá mức (chẳng hạn như trong phôi sinh dưỡng đang nảy mầm). Cytokinin ức chế tạo rễ và vì vậy mà không được bổ sung trong môi trường tạo rễ. 1.2. Giới thiệu chung về cây chuối 1.2.1. Nguồn gốc và phân bố Tên khoa học 16: Bộ (ordo) : Gừng (Zingiberales) Họ (familia) : Chuối (Musaceae) Chi (genus) : Chuối (Musa L.) Loài (species) : Musa sp Theo truyền thuyết, cây chuối được cho là xuất phát từ vườn của Enden (thiên đường) do đó tên của nó là Musa paradise có nghĩa là trái của thiên đường. Tên này được gọi đầu tiên cho đến khi được thay bằng từ “banana” bởi những người thuộc bộ tộc African Congo. Từ “banana” dùng để chỉ chuối dùng ăn tươi còn từ “plantain” dùng để chỉ chuối nấu chín để ăn. Tuy nhiên hiện nay việc phân biệt các từ này không còn khác biệt rõ. Chuối là loại cây nhiệt đới được trồng ở Ấn Độ, Nam Trung Quốc, Maylaysia, Việt Nam các nước Đông Phi, Tây Phi, Mỹ Latinh … Các loài chuối hoang dại được tìm thấy rất nhiều ở Đông Nam Á, do đó có thể cho rằng Đông Nam Á là quê hương của chuối 19. Chi chuối (Musa ) có nguồn gốc từ vùng Châu Á nhiệt đới và được thuần hóa rất sớm ở vùng Đông Nam Á. Nhiều loài chuối dại vẫn còn mọc lên ở New Guinea, Malaysia, Indonesia, và Philippines 17. 11 Gần đây, di tích về khảo cổ học và môi trường cổ tại đầm lầy Kuk ở tỉnh Cao Nguyên Tây, Papua New Guinea gợi ý rằng chuối được trồng ở đấy bắt đầu trễ nhất khoảng 5000 năm TCN, nhưng có thể từ 8000 TCN. Vụ khám phá này có nghĩa rằng cao nguyên New Guinea là nơi mà chuối được thuần hóa đầu tiên. Có lẽ những loài chuối dại khác được trồng ở những vùng khác tại Đông Nam Á 18. Một số vùng cô lập ở Trung Đông có thể trồng chuối từ thời gian trước khi Hồi giáo ra đời. Có chứng cớ trong văn kiện rằng nhà tiên tri Muhammad đã biết ăn chuối. Sau đó, văn minh Hồi giáo trải ra nhiều nước, và chuối đi theo. Những văn kiện Hồi giáo (như là bài thơ và truyện thánh) nói đến chuối nhiều lần, bắt đầu từ thế kỷ 9. Vào thế kỷ 10, những văn kiện Palestine và Ai Cập đã nói đến chuối; từ đấy, chuối lan qua Bắc Phi và Tây Ban Nha Hồi giáo. Thực tế là vào thời Trung cổ, chuối từ Granada (Tây Ban Nha) được coi là những chuối ngon nhất trong thế giới Ả Rập 22. Các phytolith được khám phá trong một số cây chuối hóa thạch ở Cameroon từ thiên niên kỷ 1 TCN đã gây ra cuộc tranh luận về lúc bắt đầu trồng cây chuối ở châu Phi. Có chứng cứ ngôn ngữ học rằng người Madagascar đã biết về chuối vào lúc đó. Trước các khám phá này, chứng cớ sớm nhất về sự trồng chuối ở châu Phi có từ cuối thế kỷ 6 CN về sau. Người Hồi giáo Ả Rập đã từng buôn chuối từ bờ biển đông của châu Phi đến bờ biển Đại Tây Dương và về phía nam tới Madagascar. Năm 650, quân đội Hồi giáo mang chuối đến vùng Palestine. Các loài chuối lai (Musa × paradisiaca L.) với nhiều giống được thuần hóa gồm hầu hết các loài chuối không hạt (parthenocarpic banana ) được trồng phổ biến hiện nay 17. Hiện nay trên thế giới có ít nhất 107 quốc gia trồng chuối với nhiều mục đích khác nhau: chủ yếu dùng làm trái cây, kế đến là dùng để lấy sợi , sản xuất rượu chuối và làm cây cảnh 17. Vào năm 2013 chuối đứng hàng thứ tư về giá trị tài chính trong các cây lương thực chính trên thế giới (sau gạo, lúa mì và ngô). 12 1.2.2. Phân loại chuối Phân lọai theo tên gọi thường 17: Chuối được trồng ở khắp các miền trên đất nước ta, tuy nhiên chất lượng và sản lượng chuối ở miền Nam có phần nào cao hơn so với miền Trung và miền Bắc, do điều kiện khí hậu miền Nam nóng và ẩm phù hợp cho sự phát triển của chuối. Có nhiều giống chuối, chúng thường được phân biệt dựa vào hình dạng của cây chuối. - Chuối tiêu: Chuối tiêu được trồng nhiều ở các vùng đồng bằng sông Hồng, sông Cửu Long. Có ba giống chuối tiêu phân loại theo độ cao của thân. + Chuối tiêu lùn: thân cao 1,52m. Lá mọc sít nhau, cuống ngắn lá màu xanh đậm. Trái hơi cong, dài 1416cm, đường kính trái 2,53cm. Mỗi buồng chuối tiêu lùn nặng trung bình 1418kg, có buồng nặng trên 20kg. Thịt chắc, thơm ngọt. Cây sinh trưởng khỏe, chịu gió khá tốt. + Chuối tiêu nhỡ: thân cao 23m. Lá dài hơn giống trên. Trái ít cong hơn trái chuối tiêu lùn, dài 1518cm, đường kính trái 2,53cm. Buồng chuối tiêu nhỡ nặng trung bình 1520kg, có buồng nặng 2530kg. Thịt có màu nhạt hơn mềm hơn chuối tiêu lùn. Mùi vị cũng không thơm ngon bằng chuối tiêu lùn. Cây sinh trưởng khỏe, năng suất cao. + Chuối tiêu cao: thân cao 3,5 4m. Lá dài, to, mọc thưa. Trái to, hơi thẳng, dài 16 20cm, đường kính 3,54cm. Buồng chuối tiêu cao nặng trung bình 2025kg, có buồng nặng 3540kg. Thịt hơi nhão, mùi vị kém nhất trong ba giống chuối tiêu. Cây sinh trưởng khỏe, năng suất cao nhưng chống gió bão kém. Buồng trái nặng dễ gãy đổ. - Chuối sứ (chuối tây, chuối xiêm): Chuối sứ được trồng phổ biến ở nhiều nơi, cây mọc khỏe, cao to, lá dài rộng, cuống lá có phấn trắng. Trái to, ngắn, mập, vỏ mỏng , khi chín vàng tươi, vị ngọt, kém thơm. Buồng nặng 1520kg. Chuối sứ không kén đất, chịu được hạn, úng, đất xấu và chịu rét khá hơn chuối tiêu. Do đó, chuối sứ thường được trồng ở các vùng trung du, miền núi. Khả năng bảo quản, vận chuyến kém. 13 - Chuối ngự: Cây chuối ngự cao khoảng 2,53m, lá xanh mát. Khác với chuối ngự trâu, quả to, ăn nhạt, chuối ngự thóc (hay còn gọi là chuối ngự mít) là loại được tiến vua. Cây chuối ngự mít thấp, trái nhỏ, cuống thanh, vỏ mỏng màu vàng óng, thịt trái mịn, bên ngoài màu vàng nhạt, trong ruột màu vàng sậm, mùi vị thơm và ngọt hơn cả chuối tiêu lùn. - Chuối mật (chuối lá): Chuối mật được trồng rải rác khắp nơi, cây cao lớn 3,54m. Trái lớn có ba cạnh, vỏ dày hơi khó bóc. Thịt trái khi chín màu vàng nhạt, nhão, không thơm, hàm lượng đường thấp, vị ngọt pha chua. Cây sinh trưởng khỏe, năng suất thấp thường được dùng để sản xuất chuối khô - Chuối hột: Cây chuối hột cao lớn 45m, mọc khỏe. Trái có cạnh rõ rệt, vỏ dày nhiều hột. Khi chín vỏ không vàng như các loại chuối khác. Cây sinh trưởng khỏe, chịu được hạn, rét, ít sâu bệnh. Vì có nhiều hột nên chuối hột thường chỉ được dùng để làm rau trong các món ăn hay dùng làm thuốc chữa bệnh. Phân loại dựa theo gen Trước đây theo Linne chuối được chia thành các nhóm: Musa sapentum L : trái chín ngọt, ăn tươi. Musa paradiaca L: khi chín phải nấu mới ăn được. Musacavendish, Musa nana : chuối già lùn. Từ năm 1948, Cheesman đã phân biệt 2 nguồn gốc chính của chuối trồng trọt là: M.acuminita colla và M.balbisiana colla. Trong họ phụ Musoidae có 2 giống Enset và Musa . Từ năm 1995, Simmonds và Shepherd đã dựa vào số điểm đánh giá 15 đặc điểm ngoại hình của chuối để qui định mức độ lai của các giống chuối trồng trọt đối với 2 dòng Acuminita và Balbisiana , trong gen đều có gen A và gen B 24. Vakili và Simmon đã phân loại các giống chuối trồng ở Việt Nam trên cơ sở di truyền như sau 18. - Nhóm AA: gồm chuối Cau, chuối Tiêu, chuối Ba thơm... Nhóm nhị bội AA có một bất lợi là quả bé, năng suất thấp. - Nhóm AAA: gồm nhiều giống trong đó có chuối Già Cui, Già hương, Già lùn, Laba, Bà hương, chuối Cơm, sau này một số giống của Đài Loan được đưa vào Việt Nam nuôi cấy mô. Nhóm chuối Già (Musa cavendish ) thường dùng xuất khẩu quả tươi. 14 - Nhóm AAB: có các giống chuối như chuối Lá, chuối Bom... Chuối Bom được trồng khá nhiều ở tỉnh đồng Nai, thích hợp cho việc làm chuối sấy. - Nhóm ABB: các giống chuối sứ được nhiều người Việt Nam ưa chuộng. - Nhóm BB: có nhóm chuối hột mà phần lớn dùng làm rau ăn sống và dùng làm thuốc. 1.2.3. Đặc điểm hình thái Cây chuối mốc có các đặc điểm về hình thái như sau 2: - Rễ : rễ chùm, có 2 loại: rễ ngang và rễ thẳng + Rễ ngang mọc xung quanh củ chuối và phân bố ở lớp đất mặt từ 030cm, phần nhiều tập trung ở độ sâu 0,15cm, bề ngang rộng tới 23 cm loại rễ này sinh trưởng khỏe, phân bố rộng, đó là loại rễ quan trọng nhất để hút nước và dinh dưỡng nuôi cây. + Rễ thẳng: mọc ở phía dưới củ chuối, ăn sâu 11,5cm, tác dụng chủ yếu giữ cây đứng vững. Rễ chuối chứa nhiều nước, giòn, mềm, yếu, dễ gãy; sức chịu hạn, chịu úng đều kém so với nhiều loại cây ăn trái khác. - Thân chuối gồm 2 phần: thân thật và thân giả. + Thân thật: còn được gọi là củ chuối, có hình tròn dẹt và ngăn, khi phát triển đầy đủ có thể rộng 30cm. Phần bên ngoài xung quanh củ chuối được bao phủ bởi những vết sẹo từ bẹ lá có dạng tròn. Ở đáy mỗi bẹ lá đều có một chồi mầm nhưng chỉ các chồi ở phần giữa củ là phát triển được, có khuynh hướng mọc trồi dần lên. Các sẹo lá mọc rất gần nhau làm thành khoảng cách rất ngắn. Củ chuối sống lâu năm, là cơ quan chủ yếu dự trữ chất dinh dưỡng, đồng thời là nơi để rễ, lá, mầm và cuống hoa mọc ra. Do đó củ chuối to mập là cơ sở đảm bảo cho cây sinh trưởng nhanh, năng suất cao. Xung quanh củ chuối có nhiều mầm ngủ, sau này sẽ phát triển thành cây con. + Thân giả : thân cây chuối là thân giả, hình trụ do nhiều bẹ lá lồng vào nhau làm thành. Khi mầm chuối mới mọc lên thì bắt đầu mọc ra những lá vảy (không có thân lá) có tác dụng bảo vệ mầm chuối. Tiếp đó mọc ra loại lá dài và hẹp gọi là “lá kiếm”. Về sau mọc ra những lá to bình thường gọi là lá thật. Đến khi mầm hoa phân hóa thì mọc ra một lá chót nhỏ, ngắn có tác dụng che chở buồng chuối. 15 - Lá: lá chuối phát triển mạnh nhất từ tháng 5 đến tháng 8, mỗi tháng mọc ra 34 lá, phiến lá to, dày, màu xanh đậm và bóng. Từ tháng 10 trở đi, cách 23 tuần mới ra 1 lá mới, lá thường mỏng, nhỏ, màu xanh nhạt, sinh trưởng chậm. Đến tháng 121 mỗi tháng chỉ mọc được 1 lá. - Hoa chuối: cây chuối con sau khi mọc (hoặc sau khi trồng) 810 tháng bắt đầu hình thành mầm hoa, sau đó khoảng 1 tháng bắt đầu trổ buồng. Hoa chuối thuộc loại hoa chùm gồm 3 loại: hoa cái, hoa lưỡng tính và hoa đực. + Hoa cái: tập trung ở phía gốc cuống buồng, phần này dài nhất (50100 cm). Loại hoa này nở ra trước tiên, nhị cái phát triển, nhị đực thoái hóa. Chỉ có hoa cái là phát triển thành trái được. + Hoa lưỡng tính: nằm ở phần giữa bắp chuối, loại hoa này không nhiều lắm, về sau sẽ rụng và không hình thành trái được. + Hoa đực: nằm ở phía đầu bắp chuối, nhị cái thoái hóa, nhị đực phát triển, dài bằng nhị cái. Loại hoa đực không thể hình thành trái được sau này sẽ khô đi và rụng dần. 1.2.4. Đặc điểm sinh thái 2 - Nhiệt độ: chuối mốc sinh trưởng bình thường ở nhiệt độ 15,5350 C. Dưới 150 C và trên 350 C hoạt động sinh trưởng của cây bị giảm nhanh. Nhiệt độ bình quân thích hợp của chuối là 2425 0 C. - Ánh sáng: trong thời gian sinh trưởng nếu có trên 60 số ngày nắng thì cây chuối sinh trưởng bình thường. Thiếu ánh sáng thì lá phát triển chậm, quang hợp kém. Ánh sáng quá mạnh làm giảm tuổi thọ của lá, rám cuống buồng làm cho chất lượng chuối kém. - Nước: Cây chuối chịu hạn yếu do rễ ăn nông và do sức hút của rễ thấp, chỉ có thể hút khoảng 60 lượng nước có ích trong đất. Cho nên tốt nhất là giữ cho độ ẩm của đất luôn luôn tiếp cận độ ẩm tối đa. - Đất: cây chuối mốc thích hợp với đất đồi, đất ruộng, đất phù sa, đất bãi, có độ pH từ 4,57,5. Rễ chuối thuộc loại rễ chùm, mềm gặp đá sỏi chùn lại, rễ không đâm thẳng mà ngoằn ngoèo, tốn sức, cho nên đất trồng chuối phải có kết cấu đất thuần không có sỏi đá, tầng đất sét gần mặt đất. 16 - Phân bón: rễ chuối sinh trưởng liên tục, do đó cần phải chú ý bón phân cho chuối. Ngoài nguồn phân hữu cơ như phân chuồng, ủ thêm rơm rạ cần phải bón thêm phân hóa học. Các loại khoáng khác ảnh hưởng đến sự phát triển của chuối là P, K, Mg, Ca, Cu, Zn, Mn, Fe, S… 1.3. Giá trị của cây chuối mốc 1.3.1 Giá trị dinh dưỡng 11 Chuối là loại trái cây giàu chất dinh dưỡng. Trái chuối chín chứa 7080 nước, 2030 chất khô, chủ yếu là đường trong đó đường khử chiếm 55. Hàm lượng protein thấp (11,8 ) gồm 17 acid amin, chủ yếu là histidin. Lipid không đáng kể. Acid hữu cơ trong chuối chỉ vào khoảng 0,2 , chủ yếu là axit malic và oxalic, vì thế chuối có độ chua dịu. Chuối chứa ít vitamin (carotene, vitamin B1, C, axit folic, inositol) nhưng hàm lượng cân đối, ngoài ra còn có muối khoáng, pectin và hợp chất polyphenol. Thành phần hoá học của ruột chuối thay đổi theo nơi trồng, độ chín và tháng thu hoạch Bảng 1.1 Thành phần dinh dưỡng của các chuối mốc trong 100g chuối chín Thành phần dinh dưỡng trên 100g quả chín Nước (g) 83,2 Năng lượng (Kcal) 56 Protein (g) 0,9 Lipid (g) 0.3 Glucid (g) 12,4 Celluloza (g) 2,6 Tro (g) 0,8 Calci (mg) 12 Sắt (mg) 0,5 Magie (mg) 27 Mangan (mg) 0,31 Phopho (mg) 25 17 Kali (mg) 286 Natri (mg) 17 Kẽm (mg) 0,32 Đồng (mg) 150 Selen (mg) 1 1.3.3. Giá trị dược liệu 18 Chuối thường dùng để tráng miệng bởi vị thơm ngon và dễ ăn. Ngoài việc dùng chuối như một loại trái cây tráng miệng thì ngày nay mọi người còn dùng chuối như một phương thuốc để chữa bệnh. - Chuối có thể chữa táo bón bởi trong chuối có rất nhiều chất xơ, có tác dụng kích thích sự nhu động của dạ dày, đặc biệt là đối với người lớn tuổi - Tốt cho dạ dày: Bạn chỉ cần sử dụng món ăn được chế biến từ chuối, sữa và mật ong, thì sẽ giúp bình ổn dạ dày và giữ lượng đường trong máu ổn định dưới tác dụng của mật ong. - Vui vẻ: việc ăn chuối mốc sẽ giúp bạn luôn giữ được tinh thần vui vẻ lạc quan nhờ lượng tryptopan mà cơ thể chuyển đổi thành serotonin - Giảm nguy cơ đột quỵ: Các nghiên cứu đã chỉ ra rằng ăn chuối tmốc đều hàng ngày giảm 50 nguy cơ bị đột quỵ. 1.3.4. Giá trị kinh tế 11 Nói đến đặc sản Tiên Phước, người ta thường nghĩ ngay đến tiêu, lòn bon, thanh trà, măng cụt …Thế nhưng chuối vẫn là một loại cây trái đặc trưng tại vùng đất nổi tiếng cây trái này và đã đem lại nguồn thu nhập đáng kể cho người dân địa phương. Tại huyện Tiên Phước hầu như vườn nhà nào cũng trồng chuối mốc, hộ trồng ít cũng vài chục bụi, hộ trồng nhiều lên đến hàng trăm bụi chuối. Và chuối gần như là nguồn thu nhập chính của nhiều gia đình. Thường ngày người dân từ các xã Tiên Lộc, Tiên An, Tiên Thọ, Tiên Phong và thị trấn Tiên Kỳ huyện Tiên Phước đem chuối đến bán tại chợ đầu mối thuộc xã Tiên Thọ để cung cấp cho người tiêu dùng khắp nơi trong tỉnh Quảng Nam. Mỗi buồng chuối bình quân giá bán được từ 30 – 50 nghìn đồng. Tại Quảng Nam người ta thường dùng chuối mốc để thờ cúng tổ tiên là chủ yếu. 18 1.4. Tình hình nghiên cứu về kỹ thuật nhân giống chuối bằng phương pháp nuôi cấy mô 1.5.1. Tình hình nghiên cứu về kỹ thuật nhân giống chuối bằng phươ ng pháp nuôi cấy mô trên thế giới Chuối là đối tượng cây ăn quả có hình thức sinh sản vô tính với phương thức nhân giống truyền thống là sử dụng chồi nách làm giống trồng những thế hệ kế tiếp. Vì vậy, sử dụng kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào nhân giống chuối đã được nghiên cứu, ứng dụng từ rất lâu tại nhiều nước trên thế giới như Malayxia, Australia, Pháp, Trung Quốc… và đã góp một phần đáng kể phục vụ ngành sản xuất chuối xuất khẩu. Theo Reuveni O (1986), kỹ thuật nuôi cấy invitro chuối có một số ưu điểm sau (dẫn theo Hoàng Nghĩa Nhạc) 1. - Nhân được số lượng lớn giống từ cây ban đầu đã xác định tính trạng. - Chất lượng cây giống hoàn toàn sạch bệnh, tránh được những sâu hại lây nhiễm qua nguồn đất (tuyến trùng). Vì vậy, tiết kiệm được chi phí hóa chất cho xử lý đất - Cây nuôi cấy mô có thể trồng một vụ với mức độ thâm canh cao, thời gian sinh trưởng ngắn, có thể điều khiển được thời gian thu hoạch. - Tỷ lệ cây sống cao trên điều kiện đồng ruộng (>98), khả năng sinh trưởng nhanh hơn cây có nguồn gốc từ chồi nách. - Cây giống invitro phát triển đồng đều, ra hoa đồng loạt và thời gian thu hoạch ngắn. - So với cây giống từ chồi...

NỘI DUNG NGHIÊN CỨU

1.1 Giới thiệu kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật

- Kỹ thuật nuôi cấy mô và tế bào thực vật hay nhân giống in vitro đều là thuật ngữ mô tả các phương pháp nuôi cấy các bộ phận thực vật (tế bào đơn, mô, cơ quan) trong ống nghiệm có chứa môi trường dinh dưỡng thích hợp như muối khoáng, vitamin, đường và các chất điều hòa sinh trưởng thực vật trong điều kiện vô trùng [5]

- Nuôi cấy mô tế bào thực vật dựa trên 2 nguyên tắc [5]:

+ Dựa vào tính toàn năng của tế bào: Là khả năng của 1 tế bào hình thành 1 cây hoàn chỉnh trong điều kiện nuôi cấy thích hợp, do trong tế bào có chứa bộ ADN (NST) hoàn chỉnh, chứa toàn bộ thông tin di truyền cho 1 chu kì sống hoàn chỉnh

+ Dựa vào khả năng phân hóa và phản phân hóa

Phân hóa: 1 Tế bào hay 1 khối tế bào phân hóa tạo mô, cơ quan, hệ cơ quan Phản phân hóa: Khi các tế bào đã phân hóa thành các mô chức năng riêng biệt nhưng vẫn có thể quay về trạng thái chức năng phôi sinh ban đầu khi gặp điều kiện thuận lợi

1.1.2 Tình hình phát tri ể n k ỹ thu ậ t nuôi c ấ y mô t ế bào trong nhân gi ố ng cây tr ồ ng

1.1.2.1 Tình hình phát triển kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào trong nhân giống cây trồng ở thế giới

Cuối thế kỷ 19, nhà khoa học người Đức Haberlandt (1902) là người đầu tiên đề xuất phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật để chứng minh tính toàn năng của tế bào Theo ông, mỗi tế bào của bất kỳ cơ thể sinh vật nào đều mang toàn bộ lượng thông tin di truyền của cả sinh vật đó Vì vậy, khi gặp điều kiện thích hợp mỗi tế bào đều có thể phát triển thành cơ thể hoàn chỉnh [3]

Năm 1934, bắt đầu giai đoạn thứ hai trong lịch sử nuôi cấy mô tế bào thực vật, khi White, người Mỹ, nuôi cấy thành công đầu rễ cà chua (Lycopersicum

VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

Vật liệu nghiên cứu

- Củ chuối thu hoạch từ cây 6 tháng tuổi hoặc các cây con sinh ra từ gốc cây chuối mẹ 2-3 tháng tuổi

- Mô cấy là phần đỉnh sinh trưởng của củ chuối có kích thước 1-2 cm 2 , cao 0,5-0,8 cm, trong mô cấy có nhiều chồi nách tiềm ẩn (chồi bên)

2.1.2 D ụ ng c ụ , thi ế t b ị và hóa ch ấ t nghiên c ứ u

 Dụng cụ và thiết bị nghiên cứu

- Phòng chuẩn bị môi trường, khử trùng môi trường nuôi cấy, bảo quản dung dịch mẹ Gồm có nồi hấp môi trường, tủ lạnh, bếp điện, cân điện tử, cân phân tích, ống đong, pipet, máy đo pH,…

- Phòng cấy vô trùng gồm tủ cấy, đèn UV, các dụng cụ đã hấp vô trùng,…

- Phòng lạnh nuôi cấy gồm kệ sắt, đèn chiếu sáng, nhiệt kế, máy điều hòa,…

- Các dụng cụ gồm: đèn cồn, đĩa peptri, dao cắt mẫu kéo, bông gòn, chai ống nghiệm vô trùng loại 250ml, 500ml, bình tam giác 250ml, giấy vô trùng, dây thun,…

- Hóa chất dùng để pha môi trường nuôi cấy gồm các thành phần cơ bản sau: + Các muối khoáng đa lượng và vi lượng

+ Nguồn cacbon: một số loại đường

+ Các chất điều hòa sinh trưởng

+ Các chất hữu cơ bổ sung: nước dừa, dịch chiết nước men, dịch chiết khoai tây, chuối khô…

- Các loại hóa chất dùng để rửa và khử trùng trong quá trình nuôi cấy: + Cồn 70 0

+ Nước cất, nước cất vô trùng

+ Dung dịch xà phòng loãng 10%

Tất cả các thí nghiệm nghiên cứu đối với cây chuối đều dựa trên môi trường cơ bản là MS 1962 (Murashige- skoog), môi trường này bao gồm các thành phần chính như sau:

* Thành phần khoáng đa lượng:

* Thành phần khoáng vi lượng:

Na2MoO4 2H2O : 0,25mg/l MnSO4 4H2O : 22,3mg/l ZnSO4.4H2O : 8,6mg/l CuSO4.5H2O : 0,025mg/l CoCl2 6H2O : 0,025mg/l

* Các chất sinh trưởng: BA; NAA

* Các thành phần khác: Đường (Saccharose) :15-30g/l Agar-Agar : 6 - 8g/l

Axit amin; EDTA; than hoạt tính;…

Phương pháp nghiên cứu

2.2.1 Quy trình nuôi c ấ y mô t ế bào

Các công đoạn trong quy trình nhân giống chuối mốc thể hiện ở sơ đồ sau:

Tạo và nhân nhanh chồi Tái sinh chồi từ mô sẹo

Tạo rễ cây Ươm chuối trong vườn

Bầu chuối và trồng ra ruộng Đưa mẫu chuối vào môi trường nuôi cấy

Tạo mô sẹo Tái sinh chồi trực tiếp

Xử lí mẫu Hấp môi trường

Chọn mẫu Chọn môi trường

2.2.2 Các b ướ c th ự c hi ệ n quy trình nuôi c ấ y mô chu ố i m ố c

2.2.2.1 Chọn và xử lý mẫu cấy

Chọn lọc cây mẹ bao gồm các đặc tính tốt của cây như: Cây sinh trưởng khỏe mạnh, năng suất cao, chất lượng quả ngon và phải đúng giống Đặc biệt ở cây chuối mốc cần phải chú ý không chọn các cây bị bệnh do virut, vi khuẩn

Dùng xẻng đào cây chuối đã được chọn để lấy phần gốc chuối, đào sao cho củ chuối càng ít bị tổn thương càng tốt (do khi bị tổn thương thì các vi sinh vật dễ xâm nhập, khi nuôi cấy dễ bị nhiễm)

 Xử lí mẫu chuối trước khi đưa vào phòng thí nghiệm

Rửa sạch mẫu chuối dưới vòi nước cho sạch toàn bộ đất bám bên ngoài, dùng kéo cắt gọn các rễ quanh củ chuối, rửa lại bằng nước xà phòng loãng 10%, tiếp tục rửa lại bằng nước sạch rồi để ráo trước khi đem vào phòng thí nghiệm

 Trước khi đưa vào phòng cấy

- Rửa củ chuối dưới vòi nước sạch nhiều lần, dùng dao tách bỏ lần lượt từng bẹ một, sau khi tách bẹ phải rửa kỹ dưới vòi nước sạch rồi mới tách bẹ tiếp theo Khi tách bẹ phải đồng thời cắt gọn phần củ chuối, để dễ khử trùng

- Tính từ trong ra ngoài còn khoảng 7-8 bẹ thì dừng, cắt gọn phần củ chuối, rửa lại thật sạch và ngâm trong nước xà phòng loãng khoảng 15 phút

- Tiếp theo dùng bàn chải đánh thật sạch toàn bộ củ chuối trong vòng 4-5 phút, rồi rửa sạch dưới vòi nước sạch khoảng 10 phút, sau đó cho ra đĩa sạch đã được lau bằng cồn để tiến hành khử trùng

- Phun cồn cho ướt củ chuối và dùng bông vô trùng lau toàn bộ mẫu trong vòng 2-3 phút, tiếp tục phun cồn và lau tương tự 3 lần và rửa lại bằng nước cất vô trùng, tiếp tục phun cồn và lau kĩ 2-3 lần nửa, rửa thật sạch bằng nước cất vô trùng, cho vào đĩa đã khử trùng để mang vào phòng cấy

Các mẫu chuối mang vào sẽ được khử trùng lần lượt: Phun cồn ướt mẫu chuối sau đó dùng bông vô trùng lau mẫu chuối trong vòng 2-3 phút, tiếp tục phun và lau tương tự 2 lần nửa, rửa bằng nước cất vô trùng, tách thêm 2-3 bẹ nửa và cắt gọn phần củ của mẫu cấy (tách bẹ này xong phải rửa bằng nước cất và lau bằng cồn rồi mới tách bẹ tiếp theo), sau khi khử trùng xong ta tiến hành đưa tất cả các mẫu cấy vào trong tủ cấy

Lau lại cồn lần cuối và tiến hành cắt mẫu để đưa vào môi trường nuôi cấy Để tìm ra chất khử trùng và nồng độ tốt nhất trong quá trình khử mẫu ta tiến hành khử trùng mẫu với các thí nghiệm ở 2 nồng độ cồn khác nhau là:50%, 60%, 70%, 80% và 90% trong khoảng thời gian là 15 phút Sau đó tiến hành kiểm tra mức độ nhiễm và mức độ sống của các mẫu làm thí nghiệm, chọn ra chất khử trùng mẫu tốt nhất

* Thí nghi ệ m 1 Kh ả o sát ả nh h ưở ng c ủ a n ồ ng độ c ồ n đế n kh ử trùng m ẫ u

Công thức môi trường Chất dùng khử trùng mẫu

Chúng tôi tiến hành khảo sát ở mức độ tái sinh chồi và sinh trưởng của cây con được hình thành từ các mẫu cấy trên môi trường MS cơ bản (1962) có bổ sung vào đó các phytohormon với tỉ lệ và nồng độ khác nhau để từ đó tìm ra môi trường nuôi cấy thích hợp nhất cho sự sinh trưởng và phát triển của đối tượng cần nghiên cứu

Môi trường được sử dụng trong nuôi cấy cây chuối mốc gồm:

- Môi trường vô mẫu (MT1): MS cơ bản + 8g/l agar + 100ml/l nước dừa

- MT nhân nhanh (MT2): MS cơ bản + 8g/l agar + 100ml/l nước dừa + + 1g/l than hoạt tính + BA khảo sát ở các nồng độ 3ml/l, 3,5ml/l, 4ml/l, 4,5ml/l, 5ml/l

- MT ra rễ (MT3): MS cơ bản + 8g/l agar + 100ml/l nước dừa + g/l than hoạt tính + NAA khảo sát ở các nồng độ 0,2ml/l, 0,4ml/l, 0,6ml/l, 0,8ml/l, 1ml/l Phương pháp khảo sát gồm 2 thí nghiệm cơ bản sau:

* Thí nghi ệ m 1 Kh ả o sát s ự ả nh h ưở ng c ủ a BA đế n kh ả n ă ng nhân nhanh ch ồ i c ủ a chu ố i m ố c (MT2)

Công thức môi trường Nồng độ BA (ml/l)

* Thí nghi ệ m 2 Kh ả o sát s ự ả nh h ưở ng c ủ a NAA đế n kh ả n ă ng ra r ễ c ủ a chu ố i m ố c (MT3)

Công thức môi trường Nồn độ α-NAA (ml/l)

Sau khi pha chế lượng môi trường vừa đủ ta tiến hành phân phối môi trường vào các bình tam giác 250ml khoảng 65ml, đậy nút bông, bọc giấy bên ngoài và cho môi trường vào nồi hấp Chú ý khi phân phối môi trường cần phân phối vừa phải, hợp lí không nên quá mỏng hoặc quá dày Dùng giấy dán đánh dấu rõ môi trường MT1, MT2 và MT3

Môi trường cần được hấp ở 121 0 C và áp suất 1atm trong thời gian 30-40 phút, sau đó lấy môi trường ra bảo quản ở nhiệt độ phòng

2.2.2.5 Đưa mẫu chuối vào môi trường nuôi cấy khởi động

- Sau khi mẫu cấy được khử trùng xong đưa vào tủ cấy để tiến hành cấy mẫu

- Trong tủ cấy vô trùng tiến hành đưa mẫu chuối đã chuẩn bị vào môi trường nuôi cấy (MT1) sao cho mẫu cấy cố định vừa phải vào môi trường

- Dùng dao và panh đã được vô trùng tách 2-3 bẹ chuối, cắt gọn phần củ chuối sao cho còn lại phần đỉnh sinh trưởng với kích thước khoảng 1,5cm 2

- Các thao tác cấy phải được tiến hành càng nhanh càng tốt để hạn chế bị nhiễm Sau khi cấy xong đậy nắp , bao gói, ghi tên môi trường, mẫu cấy, ngày, tháng, năm…

- Điều kiện nuôi cấy : nhiệt độ 21 0 C, cường độ chiếu sáng 2500-3000 lux, thời gian chiếu sáng 12 h/ngày, độ ẩm 75-80%

- Chọn mẫu (là các mẫu chuối sống – sạch lấy từ nuôi cấy khởi động)

- Cắt bỏ phần chuối bị thâm và chết, chỉ lấy chồi được sinh ra

- Chồi thu được tiến hành cắt lát mỏng ngang hoặc dọc

- Đặt các lát chuối đã được cắt vào môi trường (5-6 lát/ 1 bình)

- Đậy nắp, bao gói ghi tên môi trường, mẫu cấy, ngày, tháng, năm, đem vào phòng nuôi mẫu

2.2.2.7 Tái sinh chồi từ mô sẹo

- Ta tiến hành cắt khối mô sẹo đã được hình thành từ trên với kích thước

- Sau khi cấy tiến hành đậy nắp, bao gói ghi tên môi trường, mẫu cấy, ngày, tháng, năm,…

- Điều kiện nuôi cấy: nhiệt độ 21 0 C, cường độ chiếu sáng 2500-3000 lux, thời gian chiếu sáng 12 giờ/ngày, độ ẩm 75-80%

- Chọn mẫu (các mẫu chuối sống, sạch đã được nuôi cấy vô trùng)

- Cắt bỏ phần chuối bị thâm và chết, chỉ lấy chồi chuối được sinh ra từ mẫu đó

- Đặt mẫu vào môi trường nhân nhanh cụm chồi

- Đậy nắp, bao gói ghi tên môi trường (MT2), mẫu cấy, ngày, tháng, năm…đem vào phòng nuôi mẫu

Sau khi nhân chồi đủ số lượng ta tiến hành chọn chồi cao khoảng 2-3cm, có đỉnh sinh tưởng đầy đủ đưa vào môi trường tạo rễ (MT3) để tạo cây hoàn chỉnh in vitro

Trong điều kiện nuôi cấy bình thường như trên, rễ sẽ phát sinh sau 10-15 ngày Sau 30 ngày có thể đưa chuối ra vườn ươm

Khi chuối cấy mô có rễ, có kích thước trung bình từ 6-8 cm (đo cả lá) được lấy ra khỏi bình, rửa sạch thạch và cấy ngay vào luống ươm với khoảng cách 10 x 10cm Luống ươm thường rộng 1m, cao 15cm, làm với các vật liệu xốp như: bụi dừa, mạt cưa, tro trấu, đất trộn phân hoai đập mịn và giữ ẩm liên tục

Sau 1 tuần chuối bắt đầu sinh trưởng có thể tưới dung dịch phân khoáng loãng Thời gian ươm lá từ 30-40 ngày