nghiên cứu sự dimer hóa của protein rhau dung hợp được cảm ứng bởi cấu trúc g quadruplex song song

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT dH2O distilled water dNTP deoxy Nucleotide Triphosphate EDTA Ethylene Diamine Tetra-acetic Acide FRET Fluorescence Resonance Energy Transfer IPTG Isopropyl β-D-1-th

Trang 1

TRƯỜNG ĐẠI HỌC MỞ THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH - ∞0∞ -

PHAN HÙNG VIỆT

NGHIÊN CỨU SỰ DIMER HÓA CỦA PROTEIN RHAU DUNG HỢP ĐƯỢC CẢM ỨNG BỞI CẤU TRÚC G-QUADRUPLEX SONG SONG

LUẬN VĂN THẠC SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC

TP HỒ CHÍ MINH, NĂM 2021

Nghien cuu su dimer hoa cua protein RHAU dung hop duoc cam ung boi cau truc G quadruplex song songNghien cuu su dimer hoa cua protein RHAU dung hop duoc cam ung boi cau truc G quadruplex song songNghien cuu su dimer hoa cua protein RHAU dung hop duoc cam ung boi cau truc G quadruplex song songNghien cuu su dimer hoa cua protein RHAU dung hop duoc cam ung boi cau truc G quadruplex song song

110Wednesday, June 12, 20246:32:18 PM6:32:18 PM110Wednesday, June 12, 20246:32:18 PM6:32:18 PM110Wednesday, June 12, 20246:32:18 PM6:32:18 PM

Nghien cuu su dimer hoa cua protein RHAU dung hop duoc cam ung boi cau truc G quadruplex song songNghien cuu su dimer hoa cua protein RHAU dung hop duoc cam ung boi cau truc G quadruplex song songNghien cuu su dimer hoa cua protein RHAU dung hop duoc cam ung boi cau truc G quadruplex song songNghien cuu su dimer hoa cua protein RHAU dung hop duoc cam ung boi cau truc G quadruplex song songNghien cuu su dimer hoa cua protein RHAU dung hop duoc cam ung boi cau truc G quadruplex song songNghien cuu su dimer hoa cua protein RHAU dung hop duoc cam ung boi cau truc G quadruplex song songNghien cuu su dimer hoa cua protein RHAU dung hop duoc cam ung boi cau truc G quadruplex song songNghien cuu su dimer hoa cua protein RHAU dung hop duoc cam ung boi cau truc G quadruplex song song

Nghien cuu su dimer hoa cua protein RHAU dung hop duoc cam ung boi cau truc G quadruplex song songNghien cuu su dimer hoa cua protein RHAU dung hop duoc cam ung boi cau truc G quadruplex song songNghien cuu su dimer hoa cua protein RHAU dung hop duoc cam ung boi cau truc G quadruplex song songNghien cuu su dimer hoa cua protein RHAU dung hop duoc cam ung boi cau truc G quadruplex song songNghien cuu su dimer hoa cua protein RHAU dung hop duoc cam ung boi cau truc G quadruplex song songNghien cuu su dimer hoa cua protein RHAU dung hop duoc cam ung boi cau truc G quadruplex song songNghien cuu su dimer hoa cua protein RHAU dung hop duoc cam ung boi cau truc G quadruplex song songNghien cuu su dimer hoa cua protein RHAU dung hop duoc cam ung boi cau truc G quadruplex song songNghien cuu su dimer hoa cua protein RHAU dung hop duoc cam ung boi cau truc G quadruplex song songNghien cuu su dimer hoa cua protein RHAU dung hop duoc cam ung boi cau truc G quadruplex song songNghien cuu su dimer hoa cua protein RHAU dung hop duoc cam ung boi cau truc G quadruplex song songNghien cuu su dimer hoa cua protein RHAU dung hop duoc cam ung boi cau truc G quadruplex song song

110Nghien cuu su dimer hoa cua protein RHAU dung hop duoc cam ung boi cau truc G quadruplex song songWednesday, June 12, 2024

Trang 2

TRƯỜNG ĐẠI HỌC MỞ THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH - ∞0∞ -

PHAN HÙNG VIỆT

NGHIÊN CỨU SỰ DIMER HÓA CỦA PROTEIN RHAU DUNG HỢP ĐƯỢC CẢM ỨNG BỞI CẤU TRÚC G-QUADRUPLEX SONG SONG

Chuyên ngành: Công nghệ sinh học Mã số chuyên ngành: 8 42 02 01

LUẬN VĂN THẠC SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Giảng viên hướng dẫn 1 : TS ĐẶNG THANH DŨNG

Giảng viên hướng dẫn 2 : PGS.TS PHAN THỊ PHƯỢNG TRANG TP HỒ CHÍ MINH, NĂM 2021

Trang 3

THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH KHOA ĐÀO TẠO SAU ĐẠI HỌC

Độc lập – Tự do – Hạnh phúc

GIẤY XÁC NHẬN

Tôi tên là: Phan Hùng Việt

Ngày sinh: 10/06/1983 Nơi sinh: Bình Thuận

Chuyên ngành: Công nghệ sinh học Mã học viên: 1884202010011

Tôi đồng ý cung cấp toàn văn thông tin luận văn tốt nghiệp hợp lệ về bản quyền cho Thư viện trường đại học Mở Thành phố Hồ Chí Minh Thư viện trường đại học Mở Thành phố Hồ Chí Minh sẽ kết nối toàn văn thông tin luận văn tốt nghiệp vào hệ thống thông tin khoa học của Sở Khoa học và Công nghệ Thành phố Hồ Chí Minh

Trang 4

Trang 5

LỜI CAM ĐOAN

Tôi cam đoan rằng luận văn “Nghiên cứu sự dimer hóa của protein RHAU dung hợp được cảm ứng bởi cấu trúc G-quadruplex song song” là bài nghiên cứu của chính tôi Ngoại trừ những tài liệu tham khảo được trích dẫn trong luận văn này, tôi cam đoan rằng toàn phần hay những phần nhỏ của luận văn này chưa từng được công bố hoặc được sử dụng để nhận bằng cấp ở những nơi khác

Không có sản phẩm/nghiên cứu nào của người khác được sử dụng trong luận văn này mà không được trích dẫn theo đúng quy định

Luận văn này chưa bao giờ được nộp để nhận bất kỳ bằng cấp nào tại các trường đại học hoặc cơ sở đào tạo khác

Thành phố Hồ Chí Minh, tháng 04 năm 2021

Phan Hùng Việt

123docz.net - File bi loi xin lienhe: lethikim34079@hotmail.com

Trang 6

LỜI CẢM ƠN

Em xin gửi lời cảm ơn đến TS Đặng Thanh Dũng và PGS.TS Phan Thị Phượng Trang đã hướng dẫn em trong toàn bộ quá trình thực hiện luận văn Cảm ơn thầy cô đã hướng dẫn, động viên và tạo điều kiện thuận lợi nhất để em được học tập, và hoàn thành tốt luận văn

Em xin gửi lời cảm ơn đến các thầy cô khoa Công nghệ sinh học, trường Đại học Mở Thành phố Hồ Chí Minh đã tạo điều kiện thuận lợi để em có cơ hội học tập, trau dồi kiến thức, tiếp cận những điều kiện tốt nhất trong nghiên cứu

Đồng thời cũng cảm ơn tới các anh chị, các bạn, các em ở Trung tâm Khoa học và Công nghệ sinh học đã tận tình hướng dẫn, trao đổi và tạo điều kiện trong suốt quá trình thực hiện đề tài

Cuối cùng, xin cảm ơn gia đình đã luôn là điểm tựa vững chắc trong bất cứ hoàn cảnh nào

Xin cảm ơn tất cả mọi người!

Phan Hùng Việt

123docz.net - File bi loi xin lienhe: lethikim34079@hotmail.com

Trang 7

TÓM TẮT

Nhiều protein trong hệ thống sống thường kết hợp với nhau tạo thành cấu trúc oligomer giúp tăng cường tính ổn định và thực hiện các chức năng sinh học Trong đó, các nghiên cứu đã cho thấy protein dimer đóng góp nhiều vai trò quan trọng trong hoạt động sinh trưởng của tế bào Vì thế, các phương pháp cảm ứng tạo protein dimer đã ra đời nhằm giúp con người chủ động trong việc điều hòa các quá trình sinh học và tiến tới ứng dụng trong y học Đầu tiên, phương pháp thiết kế protein mặc dù đã mang lại những kết quả đáng chú ý nhưng sự dimer chỉ diễn ra theo chiều thuận, dẫn đến việc điều hòa hoạt tính của protein bị cản trở Để khắc phục nhược điểm này, phương pháp sử dụng các chất cảm ứng bên ngoài đã được nghiên cứu và phát triển Cho đến nay, nhiều chất cảm ứng khác nhau đã được sử dụng song vẫb tồn tại những hạn chế nhất định Chẳng hạn, việc sử dụng rapamycin đòi hỏi protein mục tiêu dung hợp với những protein domain có kích thước lớn có thể ảnh hưởng đến chức năng của protein mục tiêu Trong khi đó, cucurbit[8]uril trong hệ thống chủ khách thì ít tan và khó chuyển vào tế bào Vì vậy, việc tìm ra phân tử mới để cảm ứng sự dimer protein là điều rất đáng quan tâm và G-quadruplex là một phân tử có nhiều tiềm năng cho mục tiêu này vì những ưu điểm sau: là trình tự RNA hay DNA nên ít gây trở ngại cho tế bào, kích thước ngắn và dễ tổng hợp hóa học…

Các công bố khoa học đã chứng minh rằng 1 phân tử G-quadruplex có thể liên kết đặc hiệu với 2 phân tử protein RHAU Kết quả này đã hình thành nên ý tưởng dung hợp các protein mục tiêu với đoạn peptide RHAU, sau đó áp dụng sự tương tác đặc hiệu giữa G-quadruplex và RHAU để cảm ứng sự dimer protein Ngoài ra, để đánh giá sự

dimer hóa của protein, có thể sử dụng phương pháp FRET (Fluorescence Resonance

Energy Transfer) với cặp protein chỉ thị màu là CFP và YFP (Cyan Fluorescent Protein

và Yellow Fluorescent Protein) Các protein này có phần quang phổ chồng lấp thỏa mãn

điều kiện của FRET, đồng thời chúng là các protein dễ biểu hiện, có ánh sáng phát quang bền và dễ quan sát

Trang 8

Từ những nhận định trên, đề tài đặt ra mục tiêu “Nghiên cứu sự dimer hóa protein dung hợp với RHAU bởi cấu trúc G-quadruplex song song” nhằm tìm ra một phân tử mới và có tiềm năng cảm ứng sự dimer protein Để hoàn thành được mục tiêu trên, đề tài đã thực hiện các nội dung:

- Dòng hóa tạo plasmid pTD14 mang gen mã hóa cho protein RHAU-YFP - Kiểm tra sự biểu hiện của protein RHAU-YFP trong E coli BL21(DE3)

- Tinh chế thu nhận protein mục tiêu RHAU-YFP

- Kiểm tra sự dimer hóa của RHAU-CFP/RHAU-YFP được cảm ứng bởi cấu trúc G-quadruplex T95-2T bằng phương pháp FRET

Đề tài được thực hiện tại Trung tâm Khoa học và Công nghệ sinh học, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên Thành phố Hồ Chí Minh và đạt được các kết quả:

- Tạo dòng thành công vector pTD14 mang gen mã hóa cho protein dung hợp RHAU-YFP

- Biểu hiện được protein RHAU-YFP trong vi khuẩn E coli BL21 (DE3) với nồng

độ chất cảm ứng là 0,05 mM IPTG ở 16оC qua đêm

- Thu nhận thành công protein RHAU-YFP bằng cột tinh chế HisTrap

- Chứng minh được phân tử G-quadruplex T95-2T đã cảm ứng sự dimer hóa của protein RHAU-CFP và RHAU-YFP

- Xác định được nồng độ G-quadruplex T95-2T tối ưu cho khả năng cảm ứng sự dimer hóa cao nhất trong điều kiện thí nghiệm là 500 µM

Về ý nghĩa, đề tài đã tạo ra một mô hình cho hệ thống cảm ứng mới RHAU tiềm năng cho việc nghiên cứu sự dimer của các protein và tiến tới ứng dụng trên các protein chức năng trong tế bào

G-quadruplex-Nghien cuu su dimer hoa cua protein RHAU dung hop duoc cam ung boi cau truc G quadruplex song songG-quadruplex-Nghien cuu su dimer hoa cua protein RHAU dung hop duoc cam ung boi cau truc G quadruplex song songG-quadruplex-Nghien cuu su dimer hoa cua protein RHAU dung hop duoc cam ung boi cau truc G quadruplex song songG-quadruplex-Nghien cuu su dimer hoa cua protein RHAU dung hop duoc cam ung boi cau truc G quadruplex song song

Trang 9

ABSTRACT

The dimerization of proteins plays an important role in cellular activities such as enzyme activation, signal transmission through receptors and regulation of gene expression Methods that mediate protein dimerization are introduced and developed to help regulate biological processes G-quadruplex is a potential molecule mediating the dimerization of proteins through specifically binding to two RHAU peptides However, to date, this function of G-quadruplex has not been extensively studied In this study, we cloned vector pTD14 carrying the yfp gene fusing with RHAU peptide RHAU-YFP protein was then expressed and purified Dimerization of this protein and RHAU-CFP protein was mediated by G-quadruplex and observed by FRET reaction The results showed that RHAU-YFP protein could be expressed from the cloned vector pTD14 under the temperature of 16OC and the IPTG concentration of 0.05 mM in 24 hours The highest amount of the target protein was yielded with imidazole concentrations between 20 mM and 100 mM when purified through His-tag column The FRET reaction showed that G-quadruplex was capable of mediating the dimerization of proteins RHAU-YFP and RHAU-CFP under the experimental conditions and G-quadruplex at concentration of 500 μM for the highest dimerization ability The results can be used for further studies on the application of G-quadruplex to regulate biological processes in medical research

Trang 10

Chương 1.GIỚI THIỆU 1

1.1 Cơ sở hình thành luận văn 1

1.2 Mục tiêu nghiên cứu 2

1.3 Câu hỏi nghiên cứu 2

1.4 Phạm vi và đối tượng nghiên cứu 3

1.4.1 Phạm vi nghiên cứu 3

1.4.2 Đối tượng nghiên cứu 3

1.5 Phương pháp nghiên cứu 3

1.6 Ý nghĩa nghiên cứu 3

1.7 Kết cấu luận văn 3

Chương 2.CƠ SỞ TỔNG QUAN NGHIÊN CỨU 5

2.1 Sự dimer hóa protein 5

2.1.1 Khái niệm 5

2.1.2 Vai trò 5

2.1.3 Các phương pháp cảm ứng sự dimer protein 6

2.1.3.1 Phương pháp thiết kế protein 7

2.1.3.2 Phương pháp sử dụng các chất bên ngoài 8

2.2 G-quadruplex 12

2.2.1 Cấu trúc 12

Trang 11

2.3.3 Tương tác giữa RHAU và G-quadruplex 17

2.4 Kiểm tra sự dimer protein bằng phương pháp FRET 20

3.1.2.1 Hóa chất dùng trong dòng hóa 27

3.1.2.2 Hóa chất dùng trong biểu hiện, tinh chế protein và kiểm tra FRET 28

3.1.3 Hóa chất khác 29

3.1.4 Môi trường 29

3.1.5 Vật liệu sinh học 29

3.2 Phương pháp 33

3.2.1 Dòng hóa tạo vector pTD14 mang gen mã hòa protein RHAU-YFP 33

3.2.1.1 Thu nhận gen yfp bằng phương pháp PCR 33

3.2.1.2 Xử lý plasmid pTD1 và sản phẩm PCR bằng enzyme cắt giới hạn 35

3.2.1.3 Tạo plasmid tái tổ hợp mang gen mục tiêu pTD14 35

3.2.1.4 Biến nạp sản phẩm nối vào chủng E coli OmniMAX 36

3.2.1.5 Sàng lọc các dòng tế bào E coli OmniMAX mang plasmid pTD14 37

3.2.2 Kiểm tra sự biểu hiện của protein RHAU-YFP trong E coli BL21(DE3) 38

Trang 12

3.2.2.1 Kiểm tra tính tan của protein RHAU-YFP 38

3.2.2.2 Tinh chế protein RHAU-YFP ở thể tích lớn 39

3.2.3 Kiểm tra sự dimer của protein RHAU-CFP và RHAU-YFP được cảm ứng bởi G-quadruplex 41

3.2.4 Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ G-quadruplex lên sự dimer hóa của protein RHAU dung hợp 42

Chương 4.KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN 43

4.1 Dòng hóa tạo vector tái tổ hợp pTD14 mang gen mục tiêu 43

4.1.1 Thu nhận gen yfp bằng phương pháp PCR 43

4.1.2 Tạo vector tái tổ hợp pTD14 mang gen mã hoá protein RHAU-YFP 43

4.1.3 Sàng lọc các dòng tế bào E coli OmniMAX mang plasmid pTD14 45

4.2 Kiểm tra sự biểu hiện của protein RHAU-YFP 47

4.2.1 Kiểm tra mức độ biểu hiện của protein RHAU-YFP theo nồng độ IPTG 47

4.2.2 Kiểm tra tính tan của protein RHAU-YFP 48

4.3 Tinh chế protein RHAU-YFP 49

4.4 Kiểm tra sự dimer của protein RHAU-CFP và RHAU-YFP được cảm ứng bằng G-quadruplex T95-2T 51

4.5 Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ G-quadruplex T95-2T đến sự dimer của protein RHAU 53

Chương 5.KẾT LUẬN – KIẾN NGHỊ 55

5.1 Kết luận 55

5.2 Kiến nghị 55

TÀI LIỆU THAM KHẢO 56

PHỤ LỤC 60

Phụ lục 1 Kết quả giải trình tự pTD14 bằng mồi T7promoter 60

Phụ lục 2 Kết quả kiểm tra sự dimer bằng phương pháp FRET 61

Phụ lục 3 Kết quả khảo sát nồng độ G-quadruplex 66

Trang 13

DANH MỤC HÌNH VÀ ĐỒ THỊ

Trang

Hình 2.1 Sự dimer hóa protein 5

Hình 2.2 Các phương pháp cảm ứng sự dimer protein 6

Hình 2.3 Mô hình mô tả sự dimer theo cấu trúc dây kéo leucine của c-Jun và c-Fos 8

Hình 2.4 Sự dimer bằng hệ thống FRB-Rapamycin-FKBP 9

Hình 2.5 Sự dimer của HQuin1 được cảm ứng bởi Ni2+ 10

Hình 2.6 Sự dimer của caspase-9 được cảm ứng bằng cucurbit[8]uril 11

Hình 2.7 Cấu trúc của G-quadruplex 13

Hình 2.8 Các dạng hình học khác nhau của G-quadruplex 14

Hình 2.9 Vị trí hình thành và chức năng của G-quadruplex 15

Hình 2.10 Cấu trúc của protein RHAU 16

Hình 2.11 Chức năng điều hòa của RHAU ở mRNA Nkx2-5 17

Hình 2.12 Tương tác giữa RHAU và G-quadruplex song song 18

Hình 2.13 Mô hình áp dụng tương tác giữa G-quadruplex và RHAU để cảm ứng sự dimer protein 19

Hình 2.14 Cơ chế của FRET 20

Hình 2.15 Quang phổ của CFP và YFP 21

Hình 2.16 Áp dụng FRET để kiểm tra khả năng dimer của hệ thống G-quadruplex và RHAU 22

Hình 3.1 Sơ đồ vector pTD1 30

Hình 3.2 Thang chuẩn 32

Hình 3.3 Sơ đồ quy trình dòng hóa plasmid pTD14 33

Hình 3.4 Sơ đồ chu trình nhiệt của phản ứng PCR 34

Hình 3.5 Sơ đồ vị trí bắt cặp mồi cho phản ứng PCR khuẩn lạc 37

Trang 14

Hình 3.6 Sơ đồ quy trình tinh chế protein 40

Hình 4.1 Kết quả điện di sản phẩm PCR thu gen yfp 43

Hình 4.2 Sơ đồ vector pTD14 44

Hình 4.3 Kết quả biến nạp sản phẩm nối 44

Hình 4.4 Kết quả điện di sản phẩm PCR khuẩn lạc trên gel agarose 45

Hình 4.5 So sánh giữa kết quả giải trình tự và trình tự lý thuyết 46

Hình 4.6 Kết quả SDS-PAGE khảo sát nồng độ IPTG 48

Hình 4.7 Kết quả SDS-PAGE khảo sát tính tan của protein 49

Hình 4.8 Kết quả tinh chế protein RHAU-YFP 50

Hình 4.9 Kết quả SDS-PAGE protein RHAU-CFP 51

Hình 4.10 Kết quả quang phổ kiểm tra sự dimer bằng phương pháp FRET 53

Hình 4.11 Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ G-QUADRUPLEX T95-2T đến sự dimer protein 54

Trang 15

Bảng 3.8 Các mẫu thí nghiệm trong kiểm tra FRET 41

Trang 16

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT

dH2O distilled water

dNTP deoxy Nucleotide Triphosphate

EDTA Ethylene Diamine Tetra-acetic Acide

FRET Fluorescence Resonance Energy Transfer

IPTG Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside

LB Môi trường Luria-Bertani

LB-Amp Môi trường Luria-Bertani chứa Ampicillin

LB-Agar-Amp Môi trường Agar Luria-Bertani chứa Ampicillin

PMSF Phenyl Methyl Sulphonyl Fluoride

RHAU RNA Helicase associated with AU-rich element

SDS-PAGE Sodium Dodecyl Sulfate Polyacrylamide Gel Electrophoresis

Trang 17

Chương 1 GIỚI THIỆU

1.1 Cơ sở hình thành luận văn

Sự dimer hóa protein là một quá trình sinh học có vai trò rất quan trọng trong hoạt động sống của tế bào Phần lớn các protein sẽ không có hoạt tính nếu chúng tồn tại ở trạng thái monomer, nhưng khi được liên kết với những protein khác để hình thành nên cấu trúc dimer hoặc oligomer thì chúng sẽ được hoạt hóa và có chức năng (Marianayagam et al., 2004) Nhiều nghiên cứu đã cho thấy trong tế bào, sự dimer hóa protein đã giúp hoạt hóa enzyme (Renatus et al., 2001), truyền tín hiệu qua các thụ thể xuyên màng (Gomes et al., 2001) và điều hòa biểu hiện gen (Matthews & Visvader, 2003) Việc kiểm soát quá trình dimer hóa protein sẽ mang lại nhiều ứng dụng quan trọng bao gồm điều hòa các quá trình sinh học diễn ra trong tế bào, định vị protein và đáng chú ý gần đây là ứng dụng trong liệu pháp tế bào (Hill et al., 2018) Vì thế, cho tới nay, nhiều phân tử nhỏ cảm ứng sự dimer hóa protein đã được các nhà khoa học quan tâm và nghiên cứu như rapamycin (Spencer et al., 1993), TMP-Htag (Ballister et al., 2014), ABT-737 (Hill et al., 2018) và cucurbit[8]uril (Dang et al., 2013) Nguyên tắc hoạt động của các chất cảm ứng này là protein quan tâm sẽ được dimer hóa bằng cách gắn lên các phân tử nhỏ thông qua trung gian protein domain - là protein bắt cặp chuyên biệt lên các phân tử nhỏ Rapamycin là một trong những chất cảm ứng mạnh và được sử dụng phổ biến nhất (Inobe & Nukina, 2016), tuy nhiên nó lại gây độc cho tế bào người và cần những protein domain có kích thước lớn nên có thể ảnh hưởng đến chức năng của protein quan tâm Cucurbit[8]uril sử dụng protein domain là những peptide nhỏ hơn, cho dimer hóa hiệu quả nhưng khó đưa vào trong tế bào

Việc sử dụng G-quadruplex có những thế mạnh và tiềm năng riêng mà chưa có nghiên cứu nào thực hiện G-quadruplex là những trình tự DNA hoặc RNA giàu guanine gấp cuộn tạo thành cấu trúc 4 sợi bao gồm các G-tetrad xếp chồng lên nhau trong môi trường hiện diện K+ hay Na+ (Gellert et al., 1962) Thế mạnh và tiềm năng của G- quadruplex được dựa trên bản chất: (i) là những đoạn oligonucletide kích thước nhỏ

Trang 18

(trình tự chỉ với 18 Nu giàu G có thể hình thành cấu trúc G-quadruplex (Heddi et al., 2015) nên có khả năng dễ dàng đưa vào trong tế bào, (ii) là cấu trúc tự nhiên được tìm thấy trong các tế bào eukaryote, điều đó có tiềm năng cho sự gây cảm ứng dimer hóa mà không cần đưa G-quadruplex từ ngoài vào trong tế bào và có ý nghĩa trong miễn dịch Ngoài ra trình tự G-quadruplex dễ dàng được tổng hợp hóa học và thu nhận với số lượng lớn nhờ các kỹ thuật sinh học phân tử Bên cạnh đó, G-quadruplex đã được chứng minh có thể liên kết đặc hiệu với protein RHAU (RNA Helicase associated with AU-rich element) tại 13 amino acid bảo tồn gọi là RSM (RHAU specific motif) (Lattmann et al., 2010) Như vậy, có thể ứng dụng sự tương tác đặc hiệu giữa G-quadruplex và RHAU để cảm ứng sự dimer hóa của các protein bằng cách dung hợp RHAU với các protein quan tâm, sau đó sẽ cảm ứng sự dimer hóa các protein dung hợp bằng G-quadruplex Để phát hiện có sự dimer hóa protein của hệ thống G-quadruplex – RHAU thì phương pháp FRET (Fluorescence Resonance Energy Transfer-Truyền năng lượng cộng hưởng huỳnh quang) có thể được sử dụng với cặp protein phát huỳnh quang CFP (Cyan Fluorescent Protein) và YFP (Yellow Fluorescent Protein) Đây là hai protein dễ biểu hiện, bền và quan trọng là có sự chồng lấp giữa quang phổ phát ra của CFP với quang phổ hấp thụ của YFP nên phù hợp với phương pháp FRET (Bajar et al., 2016)

1.2 Mục tiêu nghiên cứu

Từ những nhận định trên, tôi quyết định thực hiện đề tài với mục tiêu “sử dụng cấu trúc RNA G-quadruplex song song để cảm ứng sự dimer hoá của protein RHAU - CFP và RHAU – YFP”

1.3 Câu hỏi nghiên cứu

Mô hình tương tác mới giữa G-quadruplex và RHAU peptide có thể cảm ứng sự dimer hóa tạo ra hoạt tính của những protein chức năng ở dạng dimer như enzyme hay những protein màng hay không?

Trang 19

1.4 Phạm vi và đối tượng nghiên cứu 1.4.1 Phạm vi nghiên cứu

Đề tài được thực hiện tại Trung tâm Khoa học và Công nghệ sinh học, Đại học Khoa học tự nhiên Thành phố Hồ Chí Minh

1.4.2 Đối tượng nghiên cứu

Các plasmid sử dụng trong luận văn

Sử dụng cho việc cảm ứng sự dimer protein

1.5 Phương pháp nghiên cứu

- Dòng hóa tạo plasmid pRHAU-YFP (pTD14)

- Kiểm tra sự biểu hiện của protein RHAU-YFP trong E coli

- Tinh chế để thu nhận protein mục tiêu RHAU-YFP

- Kiểm tra sự dimer hóa của RHAU-CFP/RHAU-YFP được cảm ứng bởi cấu trúc RNA G-quadruplex bằng phương pháp FRET

1.6 Ý nghĩa nghiên cứu

Tạo ra một mô hình cho hệ thống cảm ứng mới G-quadruplex-RHAU cho việc nghiên cứu sự dimer của các protein và tiến tới ứng dụng trên các protein chức năng trong tế bào

1.7 Kết cấu luận văn

Chương 1: CƠ SỞ TỔNG QUAN NGHIÊN CỨU 1.1 Sự dimer hóa protein

Trang 20

1.1.1 Khái niệm

1.1.2 Các phân tử nhỏ cảm ứng sự dimer hóa 1.2 Tổng quan về G-quadruplex

1.2.1 Khái niệm 1.2.2 Phân loại 1.3 Protein RHAU

1.3.1 Cấu trúc 1.3.2 Chức năng

1.3.3 Tương tác RHAU và G-quadruplex 1.4 Protein chỉ thị CFP và YFP

1.4.1 Cấu trúc

1.4.2 Cơ chế FRET kiểm tra sự dimer protein

Chương 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Vật liệu

2.1.1 Vật liệu sinh học

2.1.2 Thiết bị và dụng cụ thí nghiệm 2.2 Phương pháp

2.2.1 Phương pháp dòng hóa tạo plasmid pRHAU-YFP 2.2.2 Phương pháp biểu hiện protein RHAU-YFP 2.2.3 Phương pháp tinh chế protein RHAU-YFP

2.2.4 Thu nhận các trình tự DNA và RNA hình thành G-quadruplex 2.2.5 Kiểm tra hoạt tính dimer hóa bằng FRET

Chương 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN Chương 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ TÀI LIỆU THAM KHẢO

PHỤ LỤC

Trang 21

Chương 2 CƠ SỞ TỔNG QUAN NGHIÊN CỨU

2.1 Sự dimer hóa protein 2.1.1 Khái niệm

Sự dimer hóa protein là quá trình khi một protein liên kết một protein hình thành cấu trúc heterodimer (nếu 2 protein khác nhau) hoặc homodimer (nếu 2 protein giống

nhau) (Hình 2.1)

Hình 2.1 Sự dimer hóa protein

Sự dimer hóa là quá trình sinh học quan trọng vì phần lớn protein trong tế bào có hoạt tính đều ở dạng dimer hay oligomer thay vì monomer (Dang & Phan, 2016) Nghiên cứu trên ngân hàng enzyme Brenda cho thấy, chỉ có 1/3 (141) enzyme ở người là monomer trong tổng số 452 enzyme, còn lại 311 enzyme oligomer Trong đó có 125 homodimer

2.1.2 Vai trò

Trong hệ thống sống, các protein ít khi hoạt động ở trạng thái monomer mà chúng thường kết hợp với các protein khác để thực hiện các chức năng sinh học (Marianayagam et al., 2004) Trong số đó, sự kết hợp tạo thành cấu trúc dimer giữ nhiều vai trò quan trọng trong tế bào Nhiều nghiên cứu chứng minh sự dimer protein đã điều hòa các hoạt động của tế bào như hoạt hóa enzyme caspase-9 để kích hoạt apoptosis (Renatus et al., 2001); hoạt hóa thụ thể G-protein-coupled receptors (GPCR) để dẫn truyền tín hiệu

Trang 22

(Prinster et al., 2005); kích hoạt các quá trình sửa chữa, sao chép và phiên mã DNA (Marianayagam et al., 2004)

2.1.3 Các phương pháp cảm ứng sự dimer protein

Việc tạo ra các protein dimer sẽ mang lại nhiều ứng dụng trong việc điều hòa các quá trình sinh học và đáng chú ý gần đây là có thể ứng dụng trong liệu pháp tế bào (Hill et al., 2018) Chính vì tiềm năng to lớn đó, nhiều công trình nghiên cứu được thực hiện để tìm ra các phương pháp cảm ứng sự dimer protein như gây đột biến bề mặt protein,

sử dụng phân tử nhỏ, Các phương pháp đó được tổng kết trong Hình 2.2

Hình 2.2 Các phương pháp cảm ứng sự dimer protein

Mũi tên hai chiều mô tả chiều cảm ứng hình thành sự dimer và chiều đảo ngược sự dimer

Trang 23

2.1.3.1 Phương pháp thiết kế protein ❖ Gây đột biến bề mặt protein

Trong những nghiên cứu đầu tiên, các nhà khoa học tiếp cận theo hướng thay đổi cấu trúc của bản thân các protein để giúp chúng có thể tự liên kết lại với nhau Từ đó, ý tưởng gây đột biến bề mặt protein được hình thành và thu về các kết quả đáng chú ý Cụ thể, Shi và các cộng sự tạo ra enzyme caspase-9 có bề mặt đột biến giúp hình thành sự

dimer bằng cách thay thế 5 amino acid trong chuỗi β6 của caspase-9 tự nhiên (Gly402Cys‐Phe‐Asn‐Phe406) thành những amino acid thường hiện diện trong caspase-3 (Cys264-Ile‐Val‐Ser‐Met268) (Chao et al., 2005) Kết quả là caspase-9 đột biến không những hình thành được homodimer trong dung dịch đệm mà còn thể hiện hoạt tính xúc tác và hoạt tính giết tế bào cao hơn so với thể caspase-9 monomer hoang dại

-❖ Sử dụng cấu trúc dây kéo (coiled coil zipper)

Cấu trúc dây kéo được hình thành thông qua tương tác kị nước giữa các vùng giàu leucine của protein Minh chứng cho sự dimer nhờ kiểu cấu trúc này chính là sự tương tác của 2 nhân tố phiên mã c-Fos và c-Jun tại vùng giàu leucine khi chúng thực hiện chức

năng điều hòa quá trình sinh trưởng của tế bào (Hình 2.3) (Vamosi et al., 2008)

Áp dụng cấu trúc dây kéo, nhiều nghiên cứu đã tiến hành dung hợp trình tự giàu leucine vào các protein mục tiêu để kích thích hình thành protein dimer Phương pháp này đã sử dụng để cảm ứng hình thành sự dimer ở nhiều protein như quiescent cell proline dipeptidase (QPP) (Chiravuri et al., 2000), protein kinase (MLK-3) (Leung & Lassam, 1998) và tyrosine hydroxylase (Vrana et al., 1994)

Trang 24

Hình 2.3 Mô hình mô tả sự dimer theo cấu trúc dây kéo leucine của c-Jun và c-Fos

(A) Miền đầu C của Fos-EGFP có độ dài đầy đủ dài hơn 164-AA so với Jun-mRFP1 (B) Domain đầu cuối C của c-Fos215-mRFP1 bị cắt bởi domain của Jun-mRFP1

Tóm lại, phương pháp thiết kế protein đã mang lại nhiều ý nghĩa cho việc nghiên cứu sự dimer nhưng vẫn còn tồn tại một số hạn chế Việc thay đổi trình tự amino acid (gây đột biến bề mặt) đã làm ảnh hưởng đến chức năng sinh học của protein (Chao et al., 2005) Bên cạnh đó, bất lợi chung của phương pháp này là chỉ thực hiện sự dimer theo một chiều, tức là chỉ hình thành mà không tách cấu trúc dimer ra được, từ đó gây khó khăn trong việc điều hòa chức năng của các protein dimer Vì thế, nhằm giải quyết các khó khăn này, phương pháp sử dụng các chất bên ngoài để cảm ứng sự dimer đã được nghiên cứu và trở thành một công cụ hữu hiệu cho các nhà khoa học

2.1.3.2 Phương pháp sử dụng các chất bên ngoài ❖ Sử dụng các phân tử nhỏ

Cho tới hiện nay, nhiều phân tử nhỏ khác nhau đã được sử dụng như ABT-737 (Hill et al., 2018), rapamycin (Inobe & Nukina, 2016), cTMP-Htag (Ballister et al., 2014), HaXS (Erhart et al., 2013) Trong số đó, điển hình là rapamycin, một trong những chất cảm ứng được nghiên cứu nhiều và sử dụng rộng rãi nhất Rapamycin liên kết đặc hiệu với FKBP (FK506 binding protein) và FRB (FKBP rapamycin binding) Các protein

Trang 25

mục tiêu khi dung hợp với FKBP và FRB sẽ được dimer khi có sự hiện diện của

rapamycin (Hình 2.4) Hệ thống FKBP-Rapamycin-FRB đã được ứng dụng để kiểm soát

sự phiên mã và sự di chuyển của protein

Tuy nhiên, rapamycin gây độc cho tế bào người và ức chế miễn dịch Mặc dù, các dẫn xuất của rapamycin đã được khám phá và cho thấy có sự giảm độc lực nhưng lại mang các đặc tính không mong muốn (Hill et al., 2018) Do đó, hệ thống này gây trở ngại cho các nghiên cứu trong tế bào Mặc khác, phương pháp sử dụng các phân tử nhỏ nói chung đòi hỏi những protein domain có kích thước lớn như FRB (92 amino acid), eDHFR (158 amino acid), snap-tag (182 amino acid) và halo-tag (297 amino acid) Điều đó gây nhiều khả năng ảnh hưởng đến hoạt tính của protein mục tiêu khi dung hợp vào những protein domain này

Hình 2.4 Sự dimer bằng hệ thống FRB-Rapamycin-FKBP

❖ Sử dụng ion kim loại

Các nhà khoa học đã chứng minh trên bề mặt xoắn  của cytochrome cb562 có các vị trí amino acid motif tạo ra ái lực mạnh với ion kim loại để áp dụng tạo sự dimer protein (Radford, Nguyen, Ditri, et al., 2010) (Radford, Nguyen, & Tezcan, 2010) Tezcan và các cộng sự đã sử dụng kiểu motif amino acid thứ i và i + 7 để tạo ra HQuin1, một đột biến của cytochrome cb562, bao gồm 2 vị trí tương tác với ion kim loại là histidine tự nhiên ở vị trí 63 (H63) (i) và nhóm Quin gắn với cysteine đột biến ở vị trí 70 (C70) (i + 7) [34] Sau đó, nhóm nghiên cứu đã cảm ứng thành công sự dimer của HQuin1 bằng cách sử dụng các ion kim loại Ni2+, Co2+, Cu2+ và Zn2+ Các ion hóa trị II này sẽ liên kết

với Quin và H63 (Hình 2.5)

Trang 26

Hình 2.5 Sự dimer của HQuin1 được cảm ứng bởi Ni2+

(A) Cấu trúc tinh thể của protein dimer (B) Vị trí nhìn gần vùng liên kết với Ni2+

Các kết quả này đã mở ra tiềm năng dimer khi sử dụng kiểu motif i và i + 7 đối với bất kỳ bề mặt protein nào mà có cấu trúc xoắn  (Radford, Nguyen, & Tezcan, 2010) Phương pháp sử dụng các ion kim loại mang lại nhiều triển vọng để điều khiển các tín hiệu tế bào và điều hòa biểu hiện gen Tuy nhiên, đối với những protein có bề mặt lớn và hình dạng phức tạp cùng với nhiều nhóm chức năng (chứ không chỉ một mình vị trí liên kết của các ion kim loại) sẽ gây ra các tương tác hấp dẫn hoặc đẩy lùi Kết quả là có thể dẫn đến hình thành nhiều thể protein khác nhau nên dẫn đến khó kiểm soát (Salgado et al., 2009)

❖ Hệ thống chủ – khách (host – guest system)

Hệ thống này dựa trên tương tác đặc hiệu giữa cucurbit[8]uril (chủ) và chuỗi peptide 3 amino acid N-terminal phenylalanine-glycine-glycine (FGG) (khách) (Dang et

Trang 27

al., 2013) Trong đó, cucurbit[8]uril là một siêu phân tử gồm 8 monomer glycoluril liên kết với nhau bằng cầu nối methylene Dung T Dang và cộng sự đã dung hợp motif FGG vào caspase-9 monomer không hoạt động, sau đó dùng cucurbit[8]uril cảm ứng tạo thành

caspase-9 dimer hoạt động (Hình 2.6) (Dang et al., 2013)

Hình 2.6 Sự dimer của caspase-9 được cảm ứng bằng cucurbit[8]uril

Mỗi monomer caspase-9 gồm một tiểu phần lớn và một tiểu phần nhỏ; tiểu phần lớn dung hợp với chuỗi FGG Hình phóng lớn thể hiện vùng tương tác giữa cucurbit[8]uril và 2 chuỗi FGG

Hệ thống chủ – khách đã cho thấy hiệu quả dimer ổn định đồng thời giữ được hoạt tính của caspase-9 Hơn nữa, motif FGG rất ngắn (chỉ 3 amino acid), điều đó có thể làm giảm đi khả năng ảnh đến chức năng của protein mục tiêu so với phương pháp sử dụng các phân tử nhỏ như đã trình bày ở trên Tuy nhiên, cucurbit[8]uril lại ít tan và khó đưa vào trong tế bào

Tóm lại, các phương pháp sử dụng các chất bên ngoài đều có thể cảm ứng sự dimer theo 2 chiều: hình thành protein dimer và cảm ứng ngược để tách chúng ra Ưu điểm quan trọng này mang lại thuận lợi cho các nghiên cứu cần điều hòa chức năng của

Trang 28

protein Mỗi chất cảm ứng đều có những cách thức thực hiện và những thế mạnh riêng tạo ra nhiều sự lựa chọn phù hợp với nhiều mục đích và điều kiện nghiên cứu khác nhau Tuy nhiên chúng vẫn còn những hạn chế nhất định để có thể ứng dụng trong y sinh như đã được trình bày ở trên

Vì thế, yêu cầu tìm ra các phân tử mới để cảm ứng sự dimer protein là điều đáng quan tâm Trong khi đó, G-quadruplex là phân tử có nhiều tiềm năng mà cho tới nay vẫn chưa được khai thác

2.2 G-quadruplex 2.2.1 Cấu trúc

Khác với cấu trúc DNA xoắn kép của Watson và Crick, G-quadruplex là những trình tự DNA hoặc RNA giàu guanine mà có cấu trúc bậc hai hình thành dạng gấp cuộn đặc biệt với 4 sợi được tạo nên từ các mặt phẳng G-tetrad xếp chồng lên nhau (Gellet et

al., 2016) (Hình 2.7.) Mỗi G-tetrad chứa 4 phân tử guanine ở 4 góc và được giữ ổn định

nhờ 1 ion kim loại hóa trị I ở trung tâm mặt phẳng Các guanine liên kết với nhau bằng liên kết hydrogen Hoogsteen tại các vị trí N1 – O6 và N2 – N7 để hình thành tổng cộng 8 liên kết hydrogen Hoogsteen trong mỗi G-tetrad (Bhattacharyya et al., 2016) Tính ổn định của G-quadruplex nhờ vào ion kim loại tăng dần từ Li+, Na+ tới K+ (Collie & Parkinson, 2011).

Trang 29

Hình 2.7 Cấu trúc của G-quadruplex

(A) Một G-quadruplex hình thành trên sợi đôi DNA xoắn kép

(B) Một trình tự giàu guanine gấp cuộn tạo thành G-quadruplex với 3 mặt phẳng G-tetrad

(C) Cấu trúc của một G-tetrad với ion kim loại ở trung tâm (M+) Các guanine liên kết với nhau bằng liên kết hydrogen Hoogsteen (đường nét đứt)

2.2.2 Phân loại

Dựa vào số lượng phân tử acid nucleic tham gia tạo ra một G-quadruplex, có các dạng G-quadruplex unimolecular (1 phân tử), bimolecular (2 phân tử) và tetramolecular (4 phân tử); dựa vào chiều của 4 sợi acid nucleic đi qua các G-tetrad dẫn đến dạng G-

quadruplex song song và đối song (Hình 2.8) (Bhattacharyya et al., 2016)

Trang 30

Hình 2.8 Các dạng hình học khác nhau của G-quadruplex

(A): G-tetrad song song

(B): Kiểu (3+1) của nhân G-tetrad

(C): G-tetrad không song song (chiều di chuyển: lên lên xuống xuống) (D): G-tetrad không song song (chiều di chuyển: lên xuống lên xuống)

2.2.3 Chức năng

Những phân tích về bộ gen người cho thấy có hơn 300 000 trình tự có khả năng hình thành G-quadruplex (Rhodes & Lipps, 2015) Đáng chú ý là G-quadruplex không phân bố một cách ngẫu nhiên mà thường xuất hiện ở những vùng chức năng của bộ gen Trong đó, G-quadruplex tồn tại nhiều nhất ở vùng ở telomere, đây là vùng giàu guanine chứa trình tự lặp lại TTAGGG Bên cạnh đó, G-quadruplex cũng được tìm thấy ở vùng promoter, vùng sao chép DNA, vùng 5’UTR của RNA và ở TERRA (bản phiên mã của telomere) Các G-quadruplex này có liên quan đến nhiều quá trình sinh học như tăng sự

ổn định cho telomere; điều hòa quá trình sao chép, phiên mã và dịch mã (Hình 2.9)

(Lipps & Rhodes, 2009)

Trang 31

Hình 2.9 Vị trí hình thành và chức năng của G-quadruplex

(A), (B), (C): trong nhân (A) G- quadruplex hình thành ở vùng promoter gây ức chế phiên mã; (B) G-quadruplex ức chế quá trình sao chép DNA; (C) G-quadruplex ở telomere giúp bảo vệ telomere không bị phân cắt bởi enzyme (D): trong tế bào chất G-quadruplex hình thành ở mRNA gây ức chế quá trình dịch mã

2.2.4 Tiềm năng của G-quadruplex cho nghiên cứu sự dimer protein

G-quadruplex đã được chứng minh có liên kết đặc hiệu với một protein gọi là RHAU theo tỉ lệ 1:2 (Heddi et al., 2015) Kết quả này đã tạo nên tiền đề quan trọng để có thể ứng dụng hệ thống G-quadruplex và RHAU để cảm ứng sự dimer protein ở luận văn này Bên cạnh đó, G-quadruplex còn mang hai ưu điểm đáng chú ý Thứ nhất, đây là cấu trúc bền vững, kích thước nhỏ (chỉ với 24 nucleotide là đã có thể tạo ra G-quadruplex) và dễ dàng tổng hợp hóa học (Hirashima & Seimiya, 2015) Thứ hai, cả G-quadruplex và RHAU đều là những sản phẩm tự nhiên trong tế bào người, do đó tạo

ra triển vọng về sự an toàn cho tế bào khi nghiên cứu in vivo mở triển vọng để phát triển

thuốc và tiềm năng cảm ứng được sự dimer ngay bên trong tế bào mà không cần đưa quadruplex từ ngoài vào trong tế bào

G-Nghien cuu su dimer hoa cua protein RHAU dung hop duoc cam ung boi cau truc G quadruplex song songG-Nghien cuu su dimer hoa cua protein RHAU dung hop duoc cam ung boi cau truc G quadruplex song songG-Nghien cuu su dimer hoa cua protein RHAU dung hop duoc cam ung boi cau truc G quadruplex song songG-Nghien cuu su dimer hoa cua protein RHAU dung hop duoc cam ung boi cau truc G quadruplex song song

Trang 32

2.3 Protein RHAU 2.3.1 Cấu trúc

RHAU là viết tắt của RNA helicase associated with AU-rich element; nguồn gốc của tên gọi này xuất phát từ một nghiên cứu cho thấy đây là một RNA helicase liên kết với vùng trình tự giàu adenine và uracil của mRNA mã hóa cho urokinase plasminogen activator (Booy et al., 2016) Các khám phá sau đó đã cho thấy RHAU còn có khả năng liên kết và tháo xoắn cấu trúc DNA và RNA G-quadruplex (Heddi et al., 2015)

RHAU (còn có tên gọi khác là DHX36 hoặc G-QUADRUPLEXR1) thuộc họ DEAH-box và được tìm thấy trong tế bào người Protein này dài 1008 amino acid bao

gồm 3 vùng: NTR, HCR và CTR như mô tả trên Hình 2.10 (Lattmann et al., 2010)

Hình 2.10 Cấu trúc của protein RHAU

− NTR: Vùng đầu N (N-Terminal Region) kéo dài từ amino acid 1 đến 203 NTR có chứa RSM (RHAU-specific motif), đây là vùng tương tác đặc hiệu với G-quadruplex

− HCR: Vùng lõi helicase (Helicase Core Region) kéo dài từ amino acid 204 đến 615 bao gồm các motif từ I tới VI thể hiện hoạt tính ATPase hoặc helicase − CTR: Vùng đầu C (C-Terminal Region) kéo dài từ amino acid 616 tới 1008

2.3.2 Chức năng

Protein RHAU có vai trò điều hòa quá trình phiên mã và sau phiên mã thông qua

việc tháo xoắn các G-quadruplex tại promoter và mRNA (Huang et al., 2012) (Hình

2.11) Bên cạnh đó, RHAU còn tháo xoắn các G-quadruplex của telomerase RNA ở

người để kích thích sự hình thành cấu trúc RNA xoắn kép P1 ổn định (Booy et al., 2016);

Trang 33

liên kết với mRNA để tham gia vào quá trình đáp ứng với stress tế bào (Chalupnikova et al., 2008) và phân hủy mRNA (Tran et al., 2004)

Hình 2.11 Chức năng điều hòa của RHAU ở mRNA Nkx2-5

Khi không có RHAU: G-quadruplex ức chế sự dịch mã và mRNA bị tích tụ

Khi có RHAU: RHAU tháo xoắn G-quadruplex tạo điều kiện cho ribosome dịch mã; đồng thời RHAU liên kết với vùng ARE (AUrich element) và tác động lên protein HuR (human antigen R) để thực hiện quá trình phân hủy mRNA

2.3.3 Tương tác giữa RHAU và G-quadruplex

RHAU nhận diện và liên kết đặc hiệu với cả DNA và RNA G-quadruplex tại vùng RSM (từ amino acid 54 đến 66) (Lattmann et al., 2010) Đáng chú ý là mặc dù RSM chỉ dài 13 amino acid nhưng nghiên cứu của Heddi và cộng sự đã khảo sát các chiều dài khác nhau của peptide RHAU mà có chứa RSM bao gồm 53, 29, 23, 20, 18, 16, 14, 12, 5, 9 amino acid (Heddi et al., 2015) Kết quả đã cho thấy peptide RHAU chứa 16 amino acid là trình tự ngắn nhất liên kết được với G-quadruplex

Trang 34

Peptide RHAU và G-quadruplex tương tác với nhau dựa trên sự phù hợp về cấu hình Cụ thể, RHAU bao phủ lên mặt phẳng G-tetrad và neo giữ G-quadruplex bằng 3 tương tác tĩnh điện giữa các amino acid tích điện dương với nhóm phosphate tích điện

âm (Hình 2.12) (Heddi et al., 2015)

Hình 2.12 Tương tác giữa RHAU và G-quadruplex song song

(A, B): Tương tác của peptide RHAU18 với G-quadruplex song song (T95-2T) (C, D): Mặt bên và bề mặt trên của phức hợp RHAU18 G-quadruplex

(E): Tương tác của 4 acid của RHAU với 4 phân tử guanine của G-tetrad

(F): Tương tác của 3 amino acid tích điện dương của RHAU với khung phosphate của DNA G-quadruplex

Bên cạnh đó, RHAU chỉ bám được lên G-quadruplex song song, còn dạng đối song thì không bám được (Chen et al., 2018) (Dang & Phan, 2016) Nguyên nhân là đối với G-quadruplex song song, mặt phẳng G-tetrad ở hai đầu 5’ và 3’ không bị các loop che khuất như ở G-quadruplex đối song, vì thế mà RHAU dễ dàng nhận diện và tương tác (Heddi et al., 2015)

Trang 35

Đáng chú ý, mặt phẳng G-tetrad ở đầu 3’ và 5’ đều có thể được nhận diện bởi RHAU Vì thế, sự tương tác có thể diễn theo tỉ lệ 1 G-quadruplex : 2 RHAU Đó cũng chính là một trong những nền tảng quan trọng hình thành nên ý tưởng ứng dụng hệ thống peptide RHAU và G-quadruplex để cảm ứng sự dimer của các protein trong luận văn

này (Hình 2.13) Trong đó, RHAU được chọn là đoạn peptide dài 53 amino aicd (từ vị

trí amino acid 53 tới 105) chứa vùng RSM Peptide này đã được chứng minh là có ái lực mạnh với G-quadruplex và chiều dài vừa phải (Dang & Phan, 2016), điều đó tạo ra thuận lợi cho việc sử dụng để nghiên cứu sự dimer protein

Hình 2.13 Mô hình áp dụng tương tác giữa G-quadruplex và RHAU để cảm ứng sự

dimer protein

Có nhiều phương pháp để kiểm tra khả năng hình thành cấu trúc dimer của peptide RHAU và cấu trúc G-quadruplex Trong đó, phương pháp FRET là phương pháp phổ biến, dễ thực hiện trong điều kiện sẵn có của phòng thí nghiệm Chính vì vậy, phương

Trang 36

pháp FRET sẽ được thực hiện để kiểm tra mô hình này cũng như kiểm tra sự dimer có

xảy ra hay không

2.4 Kiểm tra sự dimer protein bằng phương pháp FRET 2.4.1 Cơ chế

FRET (Fluorescence Resonance Energy Transfer) là sự truyền năng lượng từ một fluorophore thể cho ở trạng thái kích thích sang một fluorophore thể nhận (Hussain,

2009) (Hình 2.14)

Hình 2.14 Cơ chế của FRET

Khi kích thích thể cho bằng một ánh sáng có bước sóng phù hợp, electron của thể cho sẽ hấp thụ năng lượng để chuyển lên trạng thái kích thích, sau đó electron sẽ giải phóng năng lượng để trở về trạng thái cơ bản và xảy ra sự truyền năng lượng cho thể nhận trong một điều kiện thích hợp Tiếp theo, electron của thể nhận hấp thụ năng lượng này và cũng chuyển lên trạng thái kích thích, sau đó eletron trở về trạng thái cơ bản bằng cách giải phóng năng lượng dưới dạng phát huỳnh quang Tóm lại, kết quả của phương pháp FRET sẽ làm giảm cường độ huỳnh quang của thể cho và tăng cường độ huỳnh quang của thể nhận

Điều kiện phù hợp để xảy ra FRET (Hussain, 2009):

− Khoảng cách giữa thể cho và thể nhận từ 1 tới 10 nm Hiệu quả là 3 tới 6 nm

Trang 37

− Quang phổ phát ra (emission spectrum) của thể cho phải có phần trùng lắp với quang phổ hấp thụ (excitation spectrum) của thể nhận

Như vậy, việc kiểm tra hiện tượng FRET sẽ cho thấy sự tương tác hay truyền năng lượng giữa các phân tử nằm đủ gần (1 tới 10 nm), từ đó chứng minh được sự dimer của các phân tử đó Kỹ thuật này đã được ứng dụng để chứng minh trạng thái dimer của nhiều protein (Liao et al., 2019)

2.4.2 Thể cho CFP và thể nhận YFP

Protein CFP (Cyan Fluorescent Protein) và YFP (Yellow Fluorescent Protein) lần lượt là thể cho và thể nhận được sử dụng phổ biến trong phương pháp FRET (Bajar et al., 2016) Ưu điểm của các protein này là dễ biểu hiện, bền và ánh sáng huỳnh quang dễ quan sát Hơn nữa, quang phổ phát ra của CFP có phần trùng lắp với quang phổ hấp thụ

của YFP nên phù hợp với điều kiện của FRET (Hình 2.15) Chính vì vậy, đây là 2 phân

tử được sử dụng trong phương pháp FRET

Hình 2.15 Quang phổ của CFP và YFP

Abs.: Hấp thụ; Em: Phát ra

Trang 38

Từ những cơ sở trên, tiến hành biểu hiện các protein RHAU dung hợp với CFP và YFP Sau đó, FRET được áp dụng để kiểm tra khả năng dimer của 2 protein dung hợp

với RHAU được cảm ứng bởi cấu trúc G-quadruplex (Hình 2.16)

Hình 2.16 Áp dụng FRET để kiểm tra khả năng dimer của hệ thống

G-quadruplex và RHAU

Dựa theo cơ chế FRET, khi kích thích CFP ở bước sóng 420 nm, nếu không có sự dimer, nghĩa là khoảng cách giữa CFP và YFP lớn hơn 10 nm thì CFP sẽ không truyền năng lượng cho YFP mà dùng năng lượng đó để phát quang với peak 475 nm Ngược lại, nếu sự dimer xảy ra, khi đó khoảng cách là từ 1 tới 10 nm, CFP sẽ truyền bớt năng lượng cho YFP, kết quả là làm giảm cường độ phát quang của CFP ở peak 475 nm và làm YFP phát quang với peak 525 nm.

Trang 39

Chương 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

3.1 Vật liệu

3.1.1 Dụng cụ và thiết bị − Bộ điện di protein (BioRad)

− Bộ điện di DNA (Cleaver Scientific) − Cân điện tử (Kern)

− Máy đọc đĩa (BMG Labtech) − Máy đo pH (OHAUS)

− Máy đo quang phổ (NanoVue Plus) − Máy heat nhiệt (Benchmark)

− Máy lắc (Pol-Eko) − Máy ly tâm (Eppendorf) − Máy ly tâm lạnh (Hermle) − Máy PCR (Eppendorf) − Máy Vortex (Biocote)

− Máy soi gel UV (Imagemaster VDS) − Nồi hấp Autoclave (SS325-TOMY) − Tủ an toàn sinh học (Huy Hoàng) − Tủ ấm, tủ sấy (Pol-Eko)

− Tủ lạnh 4°C (Lucland Fukusima) − Tủ lạnh -20°C (Lucland Fukusima) − Tủ lạnh sâu -80°C (Telstar)

Ngoài ra còn có các dụng cụ cơ bản phòng thí nghiệm vi sinh và sinh học phân tử

Trang 40

❖ Phản ứng cắt giới hạn và phản ứng nối:

− Buffer: Tango buffer, T4 DNA ligase buffer (Thermo Scientific)

− Enzyme: BglII, XhoI, T4 DNA ligase (Thermo Scientific)

❖ Kit

− Tách chiết plasmid: GenJET Plasmid Miniprep Kit (Thermo Scientific) − Tinh sạch sản phẩm PCR: GenJET PCR Purification Kit (Thermo Scientific) ❖ Điện di DNA

− Agarose (Bioline) − Safeview (Abm)

− Dung dịch điện di DNA TAE 50X (pH 8,0): Tris-Acetate 40 mM; EDTA 0,1 M pH 8,0 (pha loãng 50 lần trước khi sử dụng)

− Dung dịch nạp mẫu loading dye 6X: 12,5 ml bromophenol blue 1%; 15 ml glycerol 100%; 22,5 ml TAE 1X