nghiên cứu phát triển hệ thống phát hiện protein dựa trên hệ thống vi lưu thao tác tập trung protein tích hợp vi cảm biến miễn dịch kiểu tụ phẳng

37Hình 2.2: Mô hình thiết kế của chip tập trung và phát hiện protein: a các kênh vi lỏng tập trung protein vào vùng bắt giữ nơi các kháng thể được cấy lên điện cực vàng, protein đã bị bắ

Trang 1

LUẬN ÁN TIẾN SĨ NGÀNH ĐIỆN TỬ VIỄN THÔNG

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ

luan van tot nghiep, luan van thac si, luan van cao hoc, luan van tong hop luan van tot nghiep, luan van thac si, luan van cao hoc, luan van tong hop luan van tot nghiep, luan van thac si, luan van cao hoc, luan van tong hop luan van tot nghiep, luan van thac si, luan van cao hoc, luan van tong hopluan van tot nghiep, luan van thac si, luan van cao hoc, luan van tong hop luan van tot nghiep, luan van thac si, luan van cao hoc, luan van tong hopluan van tot nghiep, luan van thac si, luan van cao hoc, luan van tong hop luan van tot nghiep, luan van thac si, luan van cao hoc, luan van tong hopluan van tot nghiep, luan van thac si, luan van cao hoc, luan van tong hop luan van tot nghiep, luan van thac si, luan van cao hoc, luan van tong hop luan van tot nghiep, luan van thac si, luan van cao hoc, luan van tong hop luan van tot nghiep, luan van thac si, luan van cao hoc, luan van tong hopluan van tot nghiep, luan van thac si, luan van cao hoc, luan van tong hop luan van tot nghiep, luan van thac si, luan van cao hoc, luan van tong hopluan van tot nghiep, luan van thac si, luan van cao hoc, luan van tong hop luan van tot nghiep, luan van thac si, luan van cao hoc, luan van tong hopluan van tot nghiep, luan van thac si, luan van cao hoc, luan van tong hop luan van tot nghiep, luan van thac si, luan van cao hoc, luan van tong hop luan van tot nghiep, luan van thac si, luan van cao hoc, luan van tong hop luan van tot nghiep, luan van thac si, luan van cao hoc, luan van tong hopluan van tot nghiep, luan van thac si, luan van cao hoc, luan van tong hop luan van tot nghiep, luan van thac si, luan van cao hoc, luan van tong hopluan van tot nghiep, luan van thac si, luan van cao hoc, luan van tong hop luan van tot nghiep, luan van thac si, luan van cao hoc, luan van tong hopluan van tot nghiep, luan van thac si, luan van cao hoc, luan van tong hop luan van tot nghiep, luan van thac si, luan van cao hoc, luan van tong hop luan van tot nghiep, luan van thac si, luan van cao hoc, luan van tong hop luan van tot nghiep, luan van thac si, luan van cao hoc, luan van tong hopluan van tot nghiep, luan van thac si, luan van cao hoc, luan van tong hop luan van tot nghiep, luan van thac si, luan van cao hoc, luan van tong hopluan van tot nghiep, luan van thac si, luan van cao hoc, luan van tong hop luan van tot nghiep, luan van thac si, luan van cao hoc, luan van tong hopluan van tot nghiep, luan van thac si, luan van cao hoc, luan van tong hop luan van tot nghiep, luan van thac si, luan van cao hoc, luan van tong hop luan van tot nghiep, luan van thac si, luan van cao hoc, luan van tong hop luan van tot nghiep, luan van thac si, luan van cao hoc, luan van tong hopluan van tot nghiep, luan van thac si, luan van cao hoc, luan van tong hop luan van tot nghiep, luan van thac si, luan van cao hoc, luan van tong hopluan van tot nghiep, luan van thac si, luan van cao hoc, luan van tong hop luan van tot nghiep, luan van thac si, luan van cao hoc, luan van tong hopluan van tot nghiep, luan van thac si, luan van cao hoc, luan van tong hop luan van tot nghiep, luan van thac si, luan van cao hoc, luan van tong hop luan van tot nghiep, luan van thac si, luan van cao hoc, luan van tong hop luan van tot nghiep, luan van thac si, luan van cao hoc, luan van tong hopluan van tot nghiep, luan van thac si, luan van cao hoc, luan van tong hop luan van tot nghiep, luan van thac si, luan van cao hoc, luan van tong hopluan van tot nghiep, luan van thac si, luan van cao hoc, luan van tong hop luan van tot nghiep, luan van thac si, luan van cao hoc, luan van tong hopluan van tot nghiep, luan van thac si, luan van cao hoc, luan van tong hop luan van tot nghiep, luan van thac si, luan van cao hoc, luan van tong hop luan van tot nghiep, luan van thac si, luan van cao hoc, luan van tong hop luan van tot nghiep, luan van thac si, luan van cao hoc, luan van tong hopluan van tot nghiep, luan van thac si, luan van cao hoc, luan van tong hop luan van tot nghiep, luan van thac si, luan van cao hoc, luan van tong hopluan van tot nghiep, luan van thac si, luan van cao hoc, luan van tong hop luan van tot nghiep, luan van thac si, luan van cao hoc, luan van tong hopluan van tot nghiep, luan van thac si, luan van cao hoc, luan van tong hop luan van tot nghiep, luan van thac si, luan van cao hoc, luan van tong hop luan van tot nghiep, luan van thac si, luan van cao hoc, luan van tong hop luan van tot nghiep, luan van thac si, luan van cao hoc, luan van tong hopluan van tot nghiep, luan van thac si, luan van cao hoc, luan van tong hop luan van tot nghiep, luan van thac si, luan van cao hoc, luan van tong hopluan van tot nghiep, luan van thac si, luan van cao hoc, luan van tong hop luan van tot nghiep, luan van thac si, luan van cao hoc, luan van tong hopluan van tot nghiep, luan van thac si, luan van cao hoc, luan van tong hop luan van tot nghiep, luan van thac si, luan van cao hoc, luan van tong hop luan van tot nghiep, luan van thac si, luan van cao hoc, luan van tong hop luan van tot nghiep, luan van thac si, luan van cao hoc, luan van tong hopluan van tot nghiep, luan van thac si, luan van cao hoc, luan van tong hop luan van tot nghiep, luan van thac si, luan van cao hoc, luan van tong hopluan van tot nghiep, luan van thac si, luan van cao hoc, luan van tong hop luan van tot nghiep, luan van thac si, luan van cao hoc, luan van tong hop

luan van tot nghiep, luan van thac si, luan van cao hoc, luan van tong hop luan van tot nghiep, luan van thac si, luan van cao hoc, luan van tong hop luan van tot nghiep, luan van thac si, luan van cao hoc, luan van tong hop luan van tot nghiep, luan van thac si, luan van cao hoc, luan van tong hopluan van tot nghiep, luan van thac si, luan van cao hoc, luan van tong hop luan van tot nghiep, luan van thac si, luan van cao hoc, luan van tong hopluan van tot nghiep, luan van thac si, luan van cao hoc, luan van tong hop luan van tot nghiep, luan van thac si, luan van cao hoc, luan van tong hop

luan van tot nghiep, luan van thac si, luan van cao hoc, luan van tong hop luan van tot nghiep, luan van thac si, luan van cao hoc, luan van tong hop luan van tot nghiep, luan van thac si, luan van cao hoc, luan van tong hop luan van tot nghiep, luan van thac si, luan van cao hoc, luan van tong hopluan van tot nghiep, luan van thac si, luan van cao hoc, luan van tong hop luan van tot nghiep, luan van thac si, luan van cao hoc, luan van tong hopluan van tot nghiep, luan van thac si, luan van cao hoc, luan van tong hop luan van tot nghiep, luan van thac si, luan van cao hoc, luan van tong hopluan van tot nghiep, luan van thac si, luan van cao hoc, luan van tong hop luan van tot nghiep, luan van thac si, luan van cao hoc, luan van tong hop luan van tot nghiep, luan van thac si, luan van cao hoc, luan van tong hop luan van tot nghiep, luan van thac si, luan van cao hoc, luan van tong hopluan van tot nghiep, luan van thac si, luan van cao hoc, luan van tong hop luan van tot nghiep, luan van thac si, luan van cao hoc, luan van tong hopluan van tot nghiep, luan van thac si, luan van cao hoc, luan van tong hop luan van tot nghiep, luan van thac si, luan van cao hoc, luan van tong hopluan van tot nghiep, luan van thac si, luan van cao hoc, luan van tong hop luan van tot nghiep, luan van thac si, luan van cao hoc, luan van tong hop luan van tot nghiep, luan van thac si, luan van cao hoc, luan van tong hop luan van tot nghiep, luan van thac si, luan van cao hoc, luan van tong hopluan van tot nghiep, luan van thac si, luan van cao hoc, luan van tong hop luan van tot nghiep, luan van thac si, luan van cao hoc, luan van tong hopluan van tot nghiep, luan van thac si, luan van cao hoc, luan van tong hop luan van tot nghiep, luan van thac si, luan van cao hoc, luan van tong hop

Trang 2

LUẬN ÁN TIẾN SĨ NGÀNH ĐIỆN TỬ VIỄN THÔNG

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ

luan van tot nghiep, luan van thac si, luan van cao hoc, luan van tong hop luan van tot nghiep, luan van thac si, luan van cao hoc, luan van tong hop luan van tot nghiep, luan van thac si, luan van cao hoc, luan van tong hop luan van tot nghiep, luan van thac si, luan van cao hoc, luan van tong hopluan van tot nghiep, luan van thac si, luan van cao hoc, luan van tong hop luan van tot nghiep, luan van thac si, luan van cao hoc, luan van tong hopluan van tot nghiep, luan van thac si, luan van cao hoc, luan van tong hop luan van tot nghiep, luan van thac si, luan van cao hoc, luan van tong hopluan van tot nghiep, luan van thac si, luan van cao hoc, luan van tong hop luan van tot nghiep, luan van thac si, luan van cao hoc, luan van tong hop luan van tot nghiep, luan van thac si, luan van cao hoc, luan van tong hop luan van tot nghiep, luan van thac si, luan van cao hoc, luan van tong hopluan van tot nghiep, luan van thac si, luan van cao hoc, luan van tong hop luan van tot nghiep, luan van thac si, luan van cao hoc, luan van tong hopluan van tot nghiep, luan van thac si, luan van cao hoc, luan van tong hop luan van tot nghiep, luan van thac si, luan van cao hoc, luan van tong hopluan van tot nghiep, luan van thac si, luan van cao hoc, luan van tong hop luan van tot nghiep, luan van thac si, luan van cao hoc, luan van tong hop luan van tot nghiep, luan van thac si, luan van cao hoc, luan van tong hop luan van tot nghiep, luan van thac si, luan van cao hoc, luan van tong hopluan van tot nghiep, luan van thac si, luan van cao hoc, luan van tong hop luan van tot nghiep, luan van thac si, luan van cao hoc, luan van tong hopluan van tot nghiep, luan van thac si, luan van cao hoc, luan van tong hop luan van tot nghiep, luan van thac si, luan van cao hoc, luan van tong hopluan van tot nghiep, luan van thac si, luan van cao hoc, luan van tong hop luan van tot nghiep, luan van thac si, luan van cao hoc, luan van tong hop luan van tot nghiep, luan van thac si, luan van cao hoc, luan van tong hop luan van tot nghiep, luan van thac si, luan van cao hoc, luan van tong hopluan van tot nghiep, luan van thac si, luan van cao hoc, luan van tong hop luan van tot nghiep, luan van thac si, luan van cao hoc, luan van tong hopluan van tot nghiep, luan van thac si, luan van cao hoc, luan van tong hop luan van tot nghiep, luan van thac si, luan van cao hoc, luan van tong hopluan van tot nghiep, luan van thac si, luan van cao hoc, luan van tong hop luan van tot nghiep, luan van thac si, luan van cao hoc, luan van tong hop luan van tot nghiep, luan van thac si, luan van cao hoc, luan van tong hop luan van tot nghiep, luan van thac si, luan van cao hoc, luan van tong hopluan van tot nghiep, luan van thac si, luan van cao hoc, luan van tong hop luan van tot nghiep, luan van thac si, luan van cao hoc, luan van tong hopluan van tot nghiep, luan van thac si, luan van cao hoc, luan van tong hop luan van tot nghiep, luan van thac si, luan van cao hoc, luan van tong hopluan van tot nghiep, luan van thac si, luan van cao hoc, luan van tong hop luan van tot nghiep, luan van thac si, luan van cao hoc, luan van tong hop luan van tot nghiep, luan van thac si, luan van cao hoc, luan van tong hop luan van tot nghiep, luan van thac si, luan van cao hoc, luan van tong hopluan van tot nghiep, luan van thac si, luan van cao hoc, luan van tong hop luan van tot nghiep, luan van thac si, luan van cao hoc, luan van tong hopluan van tot nghiep, luan van thac si, luan van cao hoc, luan van tong hop luan van tot nghiep, luan van thac si, luan van cao hoc, luan van tong hopluan van tot nghiep, luan van thac si, luan van cao hoc, luan van tong hop luan van tot nghiep, luan van thac si, luan van cao hoc, luan van tong hop luan van tot nghiep, luan van thac si, luan van cao hoc, luan van tong hop luan van tot nghiep, luan van thac si, luan van cao hoc, luan van tong hopluan van tot nghiep, luan van thac si, luan van cao hoc, luan van tong hop luan van tot nghiep, luan van thac si, luan van cao hoc, luan van tong hopluan van tot nghiep, luan van thac si, luan van cao hoc, luan van tong hop luan van tot nghiep, luan van thac si, luan van cao hoc, luan van tong hopluan van tot nghiep, luan van thac si, luan van cao hoc, luan van tong hop luan van tot nghiep, luan van thac si, luan van cao hoc, luan van tong hop luan van tot nghiep, luan van thac si, luan van cao hoc, luan van tong hop luan van tot nghiep, luan van thac si, luan van cao hoc, luan van tong hopluan van tot nghiep, luan van thac si, luan van cao hoc, luan van tong hop luan van tot nghiep, luan van thac si, luan van cao hoc, luan van tong hopluan van tot nghiep, luan van thac si, luan van cao hoc, luan van tong hop luan van tot nghiep, luan van thac si, luan van cao hoc, luan van tong hopluan van tot nghiep, luan van thac si, luan van cao hoc, luan van tong hop luan van tot nghiep, luan van thac si, luan van cao hoc, luan van tong hop luan van tot nghiep, luan van thac si, luan van cao hoc, luan van tong hop luan van tot nghiep, luan van thac si, luan van cao hoc, luan van tong hopluan van tot nghiep, luan van thac si, luan van cao hoc, luan van tong hop luan van tot nghiep, luan van thac si, luan van cao hoc, luan van tong hopluan van tot nghiep, luan van thac si, luan van cao hoc, luan van tong hop luan van tot nghiep, luan van thac si, luan van cao hoc, luan van tong hop

Trang 3

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan các kết quả trình bày trong luận án là công trình nghiên cứu của tôi dưới sự hướng dẫn của PGS.TS Bùi Thanh Tùng và GS.TS Chử Đức Trình Các số liệu kết quả trong luận án hoàn toàn trung thực và chưa được công bố ở bất kỳ công trình nào trước đây Các kết quả lấy từ các tài liệu tham khảo đều được trích dẫn đầy đủ theo đúng quy trình

Nội, ngày tháng năm 2021

Vũ Quốc Tuấn

luan van tot nghiep, luan van thac si, luan van cao hoc, luan van tong hop luan van tot nghiep, luan van thac si, luan van cao hoc, luan van tong hop luan van tot nghiep, luan van thac si, luan van cao hoc, luan van tong hop luan van tot nghiep, luan van thac si, luan van cao hoc, luan van tong hopluan van tot nghiep, luan van thac si, luan van cao hoc, luan van tong hop luan van tot nghiep, luan van thac si, luan van cao hoc, luan van tong hopluan van tot nghiep, luan van thac si, luan van cao hoc, luan van tong hop luan van tot nghiep, luan van thac si, luan van cao hoc, luan van tong hopluan van tot nghiep, luan van thac si, luan van cao hoc, luan van tong hop luan van tot nghiep, luan van thac si, luan van cao hoc, luan van tong hop luan van tot nghiep, luan van thac si, luan van cao hoc, luan van tong hop luan van tot nghiep, luan van thac si, luan van cao hoc, luan van tong hopluan van tot nghiep, luan van thac si, luan van cao hoc, luan van tong hop luan van tot nghiep, luan van thac si, luan van cao hoc, luan van tong hopluan van tot nghiep, luan van thac si, luan van cao hoc, luan van tong hop luan van tot nghiep, luan van thac si, luan van cao hoc, luan van tong hopluan van tot nghiep, luan van thac si, luan van cao hoc, luan van tong hop luan van tot nghiep, luan van thac si, luan van cao hoc, luan van tong hop luan van tot nghiep, luan van thac si, luan van cao hoc, luan van tong hop luan van tot nghiep, luan van thac si, luan van cao hoc, luan van tong hopluan van tot nghiep, luan van thac si, luan van cao hoc, luan van tong hop luan van tot nghiep, luan van thac si, luan van cao hoc, luan van tong hopluan van tot nghiep, luan van thac si, luan van cao hoc, luan van tong hop luan van tot nghiep, luan van thac si, luan van cao hoc, luan van tong hopluan van tot nghiep, luan van thac si, luan van cao hoc, luan van tong hop luan van tot nghiep, luan van thac si, luan van cao hoc, luan van tong hop luan van tot nghiep, luan van thac si, luan van cao hoc, luan van tong hop luan van tot nghiep, luan van thac si, luan van cao hoc, luan van tong hopluan van tot nghiep, luan van thac si, luan van cao hoc, luan van tong hop luan van tot nghiep, luan van thac si, luan van cao hoc, luan van tong hopluan van tot nghiep, luan van thac si, luan van cao hoc, luan van tong hop luan van tot nghiep, luan van thac si, luan van cao hoc, luan van tong hopluan van tot nghiep, luan van thac si, luan van cao hoc, luan van tong hop luan van tot nghiep, luan van thac si, luan van cao hoc, luan van tong hop luan van tot nghiep, luan van thac si, luan van cao hoc, luan van tong hop luan van tot nghiep, luan van thac si, luan van cao hoc, luan van tong hopluan van tot nghiep, luan van thac si, luan van cao hoc, luan van tong hop luan van tot nghiep, luan van thac si, luan van cao hoc, luan van tong hopluan van tot nghiep, luan van thac si, luan van cao hoc, luan van tong hop luan van tot nghiep, luan van thac si, luan van cao hoc, luan van tong hopluan van tot nghiep, luan van thac si, luan van cao hoc, luan van tong hop luan van tot nghiep, luan van thac si, luan van cao hoc, luan van tong hop luan van tot nghiep, luan van thac si, luan van cao hoc, luan van tong hop luan van tot nghiep, luan van thac si, luan van cao hoc, luan van tong hopluan van tot nghiep, luan van thac si, luan van cao hoc, luan van tong hop luan van tot nghiep, luan van thac si, luan van cao hoc, luan van tong hopluan van tot nghiep, luan van thac si, luan van cao hoc, luan van tong hop luan van tot nghiep, luan van thac si, luan van cao hoc, luan van tong hopluan van tot nghiep, luan van thac si, luan van cao hoc, luan van tong hop luan van tot nghiep, luan van thac si, luan van cao hoc, luan van tong hop luan van tot nghiep, luan van thac si, luan van cao hoc, luan van tong hop luan van tot nghiep, luan van thac si, luan van cao hoc, luan van tong hopluan van tot nghiep, luan van thac si, luan van cao hoc, luan van tong hop luan van tot nghiep, luan van thac si, luan van cao hoc, luan van tong hopluan van tot nghiep, luan van thac si, luan van cao hoc, luan van tong hop luan van tot nghiep, luan van thac si, luan van cao hoc, luan van tong hopluan van tot nghiep, luan van thac si, luan van cao hoc, luan van tong hop luan van tot nghiep, luan van thac si, luan van cao hoc, luan van tong hop luan van tot nghiep, luan van thac si, luan van cao hoc, luan van tong hop luan van tot nghiep, luan van thac si, luan van cao hoc, luan van tong hopluan van tot nghiep, luan van thac si, luan van cao hoc, luan van tong hop luan van tot nghiep, luan van thac si, luan van cao hoc, luan van tong hopluan van tot nghiep, luan van thac si, luan van cao hoc, luan van tong hop luan van tot nghiep, luan van thac si, luan van cao hoc, luan van tong hopluan van tot nghiep, luan van thac si, luan van cao hoc, luan van tong hop luan van tot nghiep, luan van thac si, luan van cao hoc, luan van tong hop luan van tot nghiep, luan van thac si, luan van cao hoc, luan van tong hop luan van tot nghiep, luan van thac si, luan van cao hoc, luan van tong hopluan van tot nghiep, luan van thac si, luan van cao hoc, luan van tong hop luan van tot nghiep, luan van thac si, luan van cao hoc, luan van tong hopluan van tot nghiep, luan van thac si, luan van cao hoc, luan van tong hop luan van tot nghiep, luan van thac si, luan van cao hoc, luan van tong hopluan van tot nghiep, luan van thac si, luan van cao hoc, luan van tong hop luan van tot nghiep, luan van thac si, luan van cao hoc, luan van tong hop luan van tot nghiep, luan van thac si, luan van cao hoc, luan van tong hop luan van tot nghiep, luan van thac si, luan van cao hoc, luan van tong hopluan van tot nghiep, luan van thac si, luan van cao hoc, luan van tong hop luan van tot nghiep, luan van thac si, luan van cao hoc, luan van tong hopluan van tot nghiep, luan van thac si, luan van cao hoc, luan van tong hop luan van tot nghiep, luan van thac si, luan van cao hoc, luan van tong hop

Trang 4

LỜI CẢM ƠN

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới GS.TS Chử Đức Trình và PGS.TS Bùi Thanh Tùng, đã giúp tôi định hướng và triển khai đề tài nghiên cứu Với sự giúp đỡ của các thầy, tôi đã thực hiện được các nội dung nghiên cứu, giải quyết các vấn đề được đặt ra trong quá trình nghiên cứu và có được những kết quả quan trọng trong luận án này

Tôi xin chân thành cảm ơn các thầy cô, cán bộ Bộ môn Vi cơ điện tử và vi hệ thống, Khoa Điện tử viễn thông và Trường Đại học Công nghệ, ĐHQGHN đã hỗ trợ tôi trong quá trình học tập và nghiên cứu tại trường

Tôi xin chân thành cảm ơn tiến sĩ Đỗ Quang Lộc, Trường đại học Khoa học Tự nhiên, ĐHQGHN, đã có những thảo luận giá trị đóng góp cho luận án và hỗ trợ trong quá trình chế tạo, thử nghiệm Bên cạnh đó tôi xin cảm ơn thạc sĩ Trần Như Trí, Trường Đại học Công nghệ, ĐHQGHN đã hỗ trợ trong đo đạc thử nghiệm và thu thập dữ liệu từ mạch đo kết nối với máy tính

Cùng với đó, tôi xin chân thành cảm ơn giáo sư Chun-Pin Jen và thạc sỹ Syuan Wu, Đại học quốc gia Chung Cheng, Đài Loan, đã có những hỗ trợ về nguyên vật liệu, trang thiết bị, cũng như tham ra hỗ trợ nghiên cứu, chế tạo thử nghiệm Tôi cũng xin chân thành cảm ơn tiến sĩ Nguyễn Ngọc Việt đã hỗ trợ tôi trong quá trình đo đạc trong thời gian làm nghiên cứu sinh tại Đại học Quốc gia Chung Cheng, Đài Loan

Meng-Cuối cùng, tôi xin cảm ơn gia đình và bạn bè đã luôn động viên tôi trong những lúc khó khăn để hoàn thành luận án này

Vũ Quốc Tuấn

Trang 5

MỤC LỤC

LỜI CẢM ƠN II

MỤC LỤC IIIDANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT VII

Vai trò của việc phát hiện protein trong chẩn đoán bệnh 7

Kỹ thuật xét nghiệm ELISA 8

Kỹ thuật hóa mô miễn dịch (IHC) 9

Kỹ thuật đếm dòng chảy (flow cytometric) 9

Kỹ thuật Protein microarrays 9

Kỹ thuật sử dụng kênh vi lỏng 10

Tổng quan các nghiên cứu về phát triển chip sinh học và chip phát hiện protein 11

Các nghiên cứu về chip sinh học ở trong nước 12

123docz.net - File bi loi xin lienhe: lethikim34079@hotmail.com

Trang 6

Các nghiên cứu về chip sinh học ở nước ngoài về phát hiện protein

14

Chip vi kênh tập trung protein giúp giảm thời gian xét nghiệm và tăng khả năng phát hiện protein 19

Dòng chảy điện di và dòng chảy điện thẩm 20

Làm giàu, làm nghèo ion 20

Chip vi kênh tập trung protein dựa trên nguyên lý dòng chảy EOF và làm nghèo ion 23

Cảm biến sinh học kiểu trở kháng và tụ điện sử dụng các phương pháp đo điện trong xét nghiệm sinh học và xét nghiệm protein 32

Kết luận chương 34

CHƯƠNG 2.NGHIÊN CỨU PHÁT TRIỂN VÀ CHẾ TẠO HỆ THỐNG PHÁT HIỆN PROTEIN DỰA TRÊN HỆ THỐNG VI LƯU THAO TÁC TẬP TRUNG TÍCH HỢP CẢM BIẾN MIỄN DỊCH KIỂU TỤ PHẲNG 36

Hệ thống phát hiện protein với các chức năng tập trung, chọn lọc và phát hiện 36

Tập trung protein 41

Nguyên lý hoạt động của bộ tập trung protein 41

Phương pháp tạo kênh nano bằng cách sử dụng điện áp thấp DC đánh thủng lớp tiếp xúc 42

Chọn lọc và phát hiện protein sử dụng cảm biến miễn dịch kiểu tụ phẳng tích hợp trong kênh vi lỏng 44

Cảm biến miễn dịch kiểu tụ điện phẳng 44

Mô hình cảm biến miễn dịch kiểu tụ phẳng hai điện cực 46

Tụ bề mặt 48

Tính toán cho mô hình cảm biến tụ phẳng 48

123docz.net - File bi loi xin lienhe: lethikim34079@hotmail.com

Trang 7

Phương pháp đo phổ trở kháng (EIS) 49

Nghiên cứu phát triển mạch đo phân tích trở kháng 51

Chế tạo chip vi kênh tập trung và phát hiện protein 58

Chế tạo kênh vi lỏng 58

Chế tạo điện cực trên kính, gắn nano vàng trên phiến kính 60

Gắn kênh vi lỏng lên chip 61

Tập trung và phát hiện protein trên chip điện cực tròn 69

Cảm biến miễn dịch tụ phẳng điện cực tròn 69

Trang 8

Kết quả khảo sát cảm biến cấu trúc răng lược với các nồng độ muối

PBS khác nhau 85

Phát hiện và theo dõi các lớp sinh hóa được hình thành trên điện cực trong quá trình gắn kháng thể dựa trên phương pháp đo điện dung ở tần số cao 90

Kết quả tập trung và phát hiện protein trên chip có cấu trúc điện cực hình răng lược 95

Kết luận chương 98

KẾT LUẬN 101

DANH MỤC CÔNG TRÌNH CÔNG BỐ 103

TÀI LIỆU THAM KHẢO 104

PHỤ LỤC 113

Trang 9

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT

STT Chữ viết tắt Nghĩa tiếng anh Nghĩa tiếng việt

1 ELISA Enzyme linked-immunosorbent assay

Xét nghiệm ELISA

dịch

5 EIS Electrical impedance spectroscopy Phổ trở kháng 6 IDEAs Integreted digitated electrode

arrays

Điện cực răng lược (nhiều thanh điện cực xen kẽ)

8 PDMS Polydimethylsiloxan Tên vật liệu 9 PBS Photpha salt solution Muối phốt phát

Trang 10

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1: Kích thước của cảm biến điện cực tròn 70

Trang 11

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1 Các phương pháp xét nghiệm protein dựa trên phương pháp xét nghiệm miễn dịch 8Hình 1.2 Khái niệm của một chip sinh học được chia theo các thành phần chức năng 12Hình 1.3 Cảm biến điện hóa dựa trên công nghệ in điện cực [73] 13Hình 1.4 Cảm biến sinh học gắn kháng thể trong kênh vi lỏng sử dụng phương pháp đo

trở kháng [20] 16Hình 1.5 Mô hình thiết kế và phát hiện các hạt sinh học dựa trên việc đếm số hạt đi qua

một cảm biến trở kháng [51] 17Hình 1.6 Nguyên lý làm giàu, làm nghèo ion dựa trên cấu trúc kênh nano [59] 21Hình 1.7 Thiết kế của chip tập trung protein dùng màng lọc ion: (a) mô hình thiết kế của

chip vi kênh bao gồm hai kênh micro được liên kết với nhau bằng một màng lọc ion; (b) sơ đồ nguyên lý chứng minh hoạt động của chip vi kênh khi vùng nghèo ion sau đó dòng chảy protein được lái đến và bị tích lũy gần vùng nghèo ion [39] 24Hình 1.8 Thiết kế chip trung protein dựa trên cấu trúc kênh vi lỏng sử dụng bộ lọc nano

tạo ra vùng nghèo ion dùng để bẫy protein [77] 25Hình 1.9 Cấu tạo của một chip vi kênh chế tạo bằng PDMS để tập trung protein [36] 26Hình 1.10 Protein nồng độ 10 nM được tập trung lại theo thời gian được theo dõi bằng

phương pháp đo cường độ huỳnh quang với hai điện áp đặt vào hai kênh lần lượt là 100 V và 200 V [36] 27Hình 1.11 Protein được tập trung với các nồng độ thấp ban đầu khác nhau được khảo sát

hiệu suất tập trung trong thời gian khoảng 30 phút [36] 28Hình 1.12 Cấu trúc chip vi lỏng với hai bước dùng để tập trung protein với 3 kênh lỏng

cỡ micro tạo nên cấu trúc đối xứng và cách nhau bởi khe 40 µm [38] 29Hình 1.13 Mô tả cấu trúc chip tập trung protein bằng phương pháp đánh thủng điện áp:

(a)Thiết kế; (b) chế tạo; (c) hình thực tế của chip tập trung protein bằng cách sử dụng hạt nano vàng chèn vào giữa lớp PDMS và kính nền [12] 31Hình 2.1: Nghiên cứu giải pháp thực hiện chip xét nghiệm protein với ba chức năng tập

trung, chọn lọc và phát hiện 37Hình 2.2: Mô hình thiết kế của chip tập trung và phát hiện protein: (a) các kênh vi lỏng

tập trung protein vào vùng bắt giữ nơi các kháng thể được cấy lên điện cực vàng, protein đã bị bắt đặc hiệu được phát hiện bằng phương pháp đo trở kháng; (b) cấu trúc thiết kế của chip, kháng thể cấy lên điện cực vàng trong kênh vi lỏng có chiều cao 2 µm 39Hình 2.3: Nguyên lý hoạt động của bộ tập trung protein dựa trên dòng chảy điện thẩm

và cấu trúc đứt gãy nano làm nghèo ion 41

Hình 2.4: Cấu trúc đứt gãy nano được tạo ra trong chip hai kênh vi lỏng bằng cách cung

cấp nguồn DC điện áp cao để đánh thủng chỗ tiếp giáp của PDMS và tấm kính

Trang 12

ở khe giữa hai kênh: (a) sử dụng điện áp cao để tạo đứt gãy nano; (b) sử dụng nano vàng gắn lên tấm kính chỗ khe giữa hai kênh để tạo cấu trúc đứt gãy 43Hình 2.5: Cấu trúc của một cảm biến biến miễn dịch kiểu tụ phẳng 45Hình 2.6 Mô hình của cảm biến miễn dịch tụ phẳng hai điện cực: (a) mô hình điện của

cảm biến cấu trúc tụ phẳng hai điện cực; (b) mạch điện tương đương của cảm biến 47Hình 2.7 Sơ đồ khối của mạch đo phổ trở kháng dải tần từ 10 kHz đến 200 kHz 52Hình 2.8 Khảo sát mạch đo phổ khuếch đại Lock-in với tín hiệu có cộng thêm nguồn

nhiễu trắng: tín hiệu 100 mVpk-pk trước và sau khi cộng với 2 Vpk-pk nhiễu trắng 55Hình 2.9 Kết quả khảo sát mạch đo: (a) sai số của bộ khuếch đại Lock-in ở dải tần từ 10

kHz đến 90 kHz với các tỉ lệ tín hiệu trên tạp khác nhau; (b) sai số của bộ khuếch đại ứng với các tỉ lệ tín hiệu trên tạp 56Hình 2.10 Kết quả sử dụng module đo phổ trở kháng để đo giá trị tụ 104 pF và trở 47

kΩ được mắc nối tiếp của mạch RC ở dải tần từ 10 kHz đến 200 kHz: (a) kết quả đo tổng trở; (b) góc pha thay đổi; (c) giá trị điện trở R đo được trong mạch mắc nối tiếp; (d) giá trị tụ điện đo được trong mạch mắc nối tiếp 57Hình 2.11 Quy trình chế tạo kênh vi lỏng 59Hình 2.12 Quy trình chế tạo chip bao gồm tạo điện cực, gắn hạt nano vàng và gắn vi

kênh lên chip 62Hình 2.13 Thiết kế hệ gắn vi kênh lên chip có vùng nano vàng và điện cực; (a) hình mô

tả hai phần chip và vi kênh cùng với mô tả thiết bị gắn bao gồm phần dịch chuyển và phần gắn lên vi kênh; (b) hình ảnh thực tế của hệ thống gắn kênh lên chip 63Hình 2.14 Quy trình gắn kháng thể bắt giữ protein lên điện cực vàng 65Hình 2.15 (a) Chip sau khi được chế tạo; (b) Mô-đun đo kết nối với chip sau khi được

chế tạo 66Hình 3.1 Thiết kế cảm biến miễn dịch loại trở kháng hình dạng tròn: (a) kích thước và

hình dạng cảm biến tròn trong kênh vi lỏng; (b) kháng thể gắn lên trên điện cực vàng để bắt giữ protein BSA 70Hình 3.2 Quá trình tập trung protein của chip điện cực tròn thực hiện trong thời gian 30

phút 72Hình 3.3 Cường độ huỳnh quang tại vùng tập trung và phát hiện tăng lên trong quá trình

tập 2 µl mẫu chứa 10 µM protein BSA 73Hình 3.4 Chip vi kênh sau khi được gắn kháng thể và đo theo thời gian 74Hình 3.5 Trở kháng thay đổi trước khi và sau khi tiến hành tập trung protein tại vùng có

cảm biến 75Hình 3.6 Đồ thị biểu diễn phần thực và phần ảo thay đổi theo tần số đo trên cảm biến

trước và sau khi tập trung A) Đồ thị trở kháng phần phần thực B) Đồ thị trở kháng phần phức 76

Trang 13

Hình 3.7 Kết quả thực nghiệm trên chip protein sau khi mạch đo được thiết kế lại: (a) Tổng trở thay đổi trước và sau tập trung; (b) Tụ nối tiếp thay đổi trước và sau tập trung 77Hình 3.8 Thiết kế của điện cực cấu trúc răng lược tích hợp trong kênh vi lỏng 81Hình 3.9 Mô hình cảm biến sinh học kiểu tụ răng lược: (a) các thành phần điện của mô

hình đo; (b) sơ đồ tương đương của mô hình đo 85Hình 3.10 Kết quả tổng trở kháng của 4 nồng độ muối PBS khác nhau lần lượt với 1mM,

5 mM, 10 mM và 20 mM khảo sát ở dải tần từ 1 kHz đến 1 MHz 86Hình 3.11 Đồ thị phần thực và phần ảo của cảm biến đo trên nồng độ muối 1 mM, 5

mM, 10 mM và 20 mM: (a) Phần thực; (b) phần ảo 88Hình 3.12 Kết quả đo các nồng độ muối khác nhau ở tần số 1 MHz: (a) độ dẫn thay đổi

tương ứng với nồng độ muối PBS; (b) tụ nối tiếp tương đương thay đổi tương ứng với nồng độ muối PBS 89Hình 3.13 Các lớp sinh hóa có mặt trên bề mặt điện cực tương đương với các lớp điện

môi xếp chồng lên nhau tạo thành một mạch tụ nối tiếp 91Hình 3.14 Quá trình theo dõi các lớp sinh hóa PEG, EDC, ANTI, Biotin được cấy lên

bề mặt của cảm biến: (a) Phổ trở kháng thay đổi sau mỗi bước; (b) Tụ nối tiếp thay đổi sau mỗi bước 93Hình 3.15 Đồ thị phần thực và phần ảo của trở kháng thay đổi tương ứng với ba lớp Au,

PEG và EDC: (a) phần thực; (b) phần ảo 94Hình 3.16: Sự thay đổi trở kháng và tụ nối tiếp tương ứng với các lớp sinh hóa được gắn

lên lần lượt với Au(chip ban đầu), lớp PEG, EDC, Antibody (kháng thể), Biotin và protein: (a) Tổng trở thay đổi ở 1MHz; (b) Tụ nối tiếp thay đổi ở 1MHz 97Hình 3.17 Trở kháng và cường độ huỳnh quang thay đổi trong quá trình tập trung protein

ở điện cực răng lược 98

Trang 14

MỞ ĐẦU Lý do chọn đề tài

Chip sinh học ứng dụng trong xét nghiệm bệnh phẩm đã phát triển rất mạnh mẽ trong những năm gần đây với mục đích thay thế cho các thiết bị xét nghiệm đắt tiền và giảm sự cồng kềnh của thiết bị xét nghiệm Các chip sinh học dựa trên cấu trúc nano và micro cũng được phát triển với một số mục đích như giảm thời gian xét nghiệm, giảm giá thành xét nghiệm, tăng khả năng phát hiện bệnh, đáp ứng nhu cầu xét nghiệm tại chỗ hoặc theo dõi tình trạng của bệnh nhân tại nhà cũng như chăm sóc sức khỏe định kỳ và theo dõi đáp ứng trong quá trình điều trị

Dựa trên phương pháp xét nghiệm miễn dịch kết hợp với các phương pháp vật lý, các chip sinh học đã được phát triển rất đa dạng với nhiều loại khác nhau Rất nhiều kit phát triển trong xét nghiệm bệnh học bằng cách kết hợp phương pháp xét nghiệm miễn dịch với các phương pháp quang học như nhuộm màu chỉ thị hay nhuộm huỳnh quang đã được nghiên cứu và thương mại hóa Đánh giá định tính và định lượng có thể được thực hiện bằng việc đo cường độ huỳnh quang hoặc vạch màu Các kit phát triển cũng có kích thước nhỏ gọn với giá thành rẻ và có thể được sử dụng một lần Bên cạnh đó các chip sinh học đã được phát triển dựa trên nền tảng kênh vi lỏng dùng để tập trung, phân tách và phát hiện các đối tượng sinh học Các loại chip này dựa trên nền tảng phòng thí nghiệm trên một chip (Lab on a Chip (LoC)) được phát triển cho các bài toán xét nghiệm ung thư, xét nghiệm DNA hoặc xét nghiệm protein đã được nhiều rất nghiên cứu triển khai và nhiều nghiên cứu trong số đó đã được đăng ký bằng sáng chế cũng như thành sản phẩm thương mại

Trong các loại xét nghiệm này, xét nghiệm protein đóng một vai trò quan trọng trong phát hiện và chẩn đoán nhiều loại bệnh khác nhau cũng như được áp dụng vào xét nghiệm ung thư Các mẫu xét nghiệm bệnh phẩm có thể là mẫu máu, mẫu nước tiểu hay mẫu mô tế bào của cơ thể người Một số loại protein trong cơ thể người xuất hiện trong nước tiểu, máu hoặc ở mô tế bào và tăng đột biến là chỉ dấu sinh học của một căn bệnh nào đó Việc phát hiện một lượng nhỏ của một loại protein nào đó trong

Trang 15

mẫu phẩm có một vai trò quan trọng trong việc phát hiện sớm và chẩn đoán bệnh cũng như theo dõi trong quá trình điều trị bệnh Xét nghiệm protein hiện đã được thực hiện phổ biến trong các cơ sở y tế bằng các thiết bị phân tích hiện đại, cồng kềnh và đắt tiền Để thay thế các thiết bị cồng kềnh và đắt tiền, các chip sinh học đã được nghiên cứu và phát triển với nhiều ưu điểm như thiết bị nhỏ gọn nhưng vẫn đáp ứng được yêu cầu về khả năng phát hiện, với lượng lấy mẫu nhỏ, dễ vận hành và giảm thời gian xét nghiệm Do vậy, luận án này đặt ra vấn đề tiến hành nghiên cứu phát triển chip kênh vi lỏng phát hiện protein nhằm hướng tới xây dựng và phát triển thành một thiết bị xét nghiệm nhỏ gọn bao gồm các các ưu điểm như: khả năng phát hiện với lượng lấy mẫu nhỏ, chính xác, nhanh chóng, tự động và nhỏ gọn, và giảm giá thành của thiết bị

Mục đích của luận án

Luận án tập trung nghiên cứu phát triển một hệ thống chip vi kênh tích hợp các chức năng tập trung làm giàu protein, chọn lọc protein đặc hiệu nhằm hướng tới xây dựng và phát triển một thiết bị xét nghiệm nhỏ gọn cho ứng dụng chăm sóc và theo dõi sức khỏe tại chỗ

Đối tượng nghiên cứu

Đối tượng nghiên cứu bao gồm:

- Hệ thống kênh vi lưu tập trung protein bằng cấu trúc đứt gãy nano ở điện áp thấp để làm giàu làm nghèo ion cùng với nguyên lý dòng chảy điện thẩm nhằm tập trung protein

- Cảm biến miễn dịch kiểu tụ điện phẳng hai điện cực tích hợp trong kênh vi lỏng nhằm bắt giữ chọn lọc và phát hiện protein

- Phương pháp đo và phân tích trở kháng, điện dung và mạch điện tử đặc dụng đo và phân tích trở kháng cảm biến miễn dịch kiểu tụ điện phẳng hai điện cực

Trang 16

Phạm vi nghiên cứu

Trong khuôn khổ luận án này, nghiên cứu sinh tập trung nghiên cứu hệ thống vi lưu phát hiện protein bao gồm các chức năng tập trung, chọn lọc và phát hiện protein cùng với việc nghiên cứu phát triển mô-đun đo và phân tích trở kháng áp dụng cho vi cảm biến miễn dịch kiểu tụ phẳng trong việc phát hiện protein Nghiên cứu sử dụng hạt nano vàng có đường kính 13nm chèn vào lớp tiếp xúc giữa vật liệu PDMS và kính trên chip có gắn cảm biến miễn dịch đã được tiến hành nhằm tạo giảm điện áp đánh thủng xuống 50 V để tạo ra đứt gãy cấu trúc nano áp dụng cho việc làm giàu và làm nghèo ion trong kênh Kênh vi lưu được tiến hành nghiên cứu tích hợp vi cảm biến miễn dịch kiểu tụ phẳng với cấu trúc điện cực tròn và răng lược tại vùng tập trung nhằm chọn lọc và phát hiện protein Phương pháp đo phân tích trở kháng, tụ điện được nghiên cứu áp dụng cho vi cảm biến miễn dịch kiểu tụ phẳng hai điện cực với kích thước dưới 100 µm tích hợp trong vi kênh Từ đó, mô-đun đo trở kháng áp dụng cho vi cảm biến sinh học được nghiên cứu thiết kế và chế tạo đã đáp ứng cho bài toán đo và phát hiện protein trên vi cảm biến

Các phương pháp nghiên cứu đã sử dụng

Các phương pháp nghiên cứu bao gồm phương pháp xây dựng mô hình, tính toán lý thuyết kết hợp với các phương pháp thực nghiệm, chế tạo cấu trúc và đo đạc trên những thiết bị hiện đại Dựa trên những tính toán lý thuyết, các chế độ đo đã được xây dựng nhằm đo đạc trên các cấu trúc chip vi kênh đã được chế tạo Các kết quả đo trên các máy đo hiện đại cũng như mạch đo tự phát triển đã chứng minh khả năng làm việc của chip vi kênh đã được nghiên cứu phát triển

Trang 17

- Nghiên cứu thiết kế chế tạo hệ thống vi lưu có chức năng tập trung, chọn lọc và phát hiện protein giúp tăng khả năng phát hiện protein với một lượng thể tích lấy mẫu nhỏ, và đẩy nhanh quá trình xét nghiệm

- Sử dụng hạt nano vàng có kích thước 13 nano mét cho phép điện áp đánh thủng và điện áp hoạt động dưới 50 V trên chip vi kênh thao tác tập trung có tích hợp vi cảm biến miễn dịch kiểu tụ phẳng hai điện cực Việc giảm điện áp đánh thủng và điện áp hoạt động của bộ tập trung giúp hạn chế việc sôi kênh phá hủy kênh và vi điện cực tích hợp trong vi kênh

- Phương pháp đo điện dung ở tần số cao và điện áp thấp đối với vi cảm biến sinh học miễn dịch kiểu tụ phẳng cấu trúc răng lược để áp dụng cho bài toán phát hiện các lớp sinh hóa gắn trên bề mặt cảm biến

Ý nghĩa thực tiễn của đề tài

Hệ thống vi lưu thao tác tập trung protein có tích hợp cảm biến miễn dịch kiểu tụ phẳng đã được nghiên cứu và phát triển trong luận án này có nhiều ưu điểm Hệ thống vi lưu với ba chức năng bao gồm chức năng tập trung, chọn lọc và phát hiện protein tạo ra một thiết bị nhỏ gọn ứng dụng trong việc xét nghiệm tại chỗ Cụ thể, với việc tập trung protein trong kênh vi lỏng, thời gian xét nghiệm được giảm xuống, khả năng phát hiện cũng được tăng lên đáng kể ở cùng một một lượng mẫu nhất định Do vậy, chức năng tập trung của chip vi kênh có tính ưu việt về lượng lấy mẫu xét nghiệm Chức năng chọn lọc và phát hiện tích hợp trong kênh tạo ra khả năng tự động hóa trong xét nghiệm giúp đơn giản hóa trong quá trình vận hành Việc tích hợp cảm biến trong vi kênh cũng tạo ra một chip hoàn chỉnh với kích thước nhỏ gọn thay thế cho các thiết bị, hệ thống quang học cồng kềnh và đắt tiền Mạch đo và phân tích trở kháng đã được phát triển để tích hợp với chip vi kênh tạo ra một thiết bị nhỏ gọn để hướng tới phát triển các thiết bị chăm sóc tại chỗ (Point of Care) với giá thành rẻ thay thế các thiết bị cồng kềnh và đắt tiền mà vẫn đáp ứng được bài toán xét nghiệm

Trang 18

Nội dung của luận án ngoài phần mở đầu và kết luận được tổ chức thành 3 chương với các nội dung:

Chương 1: Tổng quan về phát triển chip sinh học ứng dụng trong phát hiện protein

Trong chương này, các phương pháp xét nghiệm protein hiện đang được nghiên cứu và triển khai trên thực tế được trình bày các ưu nhược điểm Bên cạnh đó, các kỹ thuật tập trung protein bằng phương pháp làm giàu và làm nghèo ion trên nền chip vi kênh nhằm giảm thời gian xét nghiệm và tăng khả năng phát hiện cũng được giới thiệu Dựa trên phân tích những ưu nhược điểm của các kỹ thuật đã được nghiên cứu phát triển, phần cuối của chương trình bày về đề xuất nội dung nghiên cứu của luận án

Chương 2: Nghiên cứu phát triển và chế tạo hệ thống phát hiện protein dựa trên hệ thống vi lưu thao tác tập trung tích hợp cảm biến miễn dịch kiểu tụ phẳng

Chương 2 trình bày nội dung nghiên cứu phát triển chip vi lỏng với ba chức năng tập trung, chọn lọc và phát hiện protein bao gồm thiết kế và thực nghiệm chế tạo chip dựa trên công nghệ vi chế tạo Bên cạnh đó, nội dung về thiết kế, chế tạo và khảo sát mạch đo và phân tích trở kháng áp dụng cho chip tập trung và phát hiện protein cũng được trình bày chi tiết

Chương 3: Phát hiện protein dựa trên hệ thống vi lưu thao tác tập trung tích hợp cảm biến miễn dịch kiểu tụ phẳng

Nội dung của chương 3 trình bày các kết quả đạt được của việc phát triển chip tập trung, chọn lọc và phát hiện protein với cấu trúc chip được tích hợp cảm biến miễn dịch kiểu tụ phẳng cấu trúc điện cực tròn và cấu trúc điện cực răng lược Lượng mẫu 2µl của 10 µM protein FITC-BSA đã được tiến hành tập trung trong kênh vi lưu với điện áp tiến hành dưới 50 V Phương pháp đo trở kháng đã được áp dụng để phát

Trang 19

hiện protein sau khi được tiến hành tập trung Trình bày nội dung nghiên cứu giải pháp sử dụng phép đo điện dung của cảm biến ở tần số cao (1 MHz) trên cấu trúc cảm biến điện cực hình răng lược nhằm phát hiện và theo dõi các lớp sinh hóa có mặt trên điện cực của cảm biến trong quá trình gắn kháng thể cũng như protein bị bắt giữ sau khi tiến hành tập trung

Phần kết luận tổng hợp các nội dung nghiên cứu và kết quả đạt được của luận án cũng như đưa ra phương hướng triển khai các nghiên cứu tiếp theo

Trang 20

Chương 1 TỔNG QUAN VỀ NGHIÊN CỨU VÀ PHÁT TRIỂN CHIP SINH HỌC ỨNG DỤNG TRONG PHÁT HIỆN PROTEIN

Vai trò của việc phát hiện protein trong chẩn đoán bệnh và các kỹ thuật xét nghiệm protein

Vai trò của việc phát hiện protein trong chẩn đoán bệnh

Protein được cấu thành từ các loại axit amin đóng một vai trò quan trọng trong cơ thể người Các protein đóng vai trò trao đổi chất và có vai trò trong hệ miễn dịch Các loại protein là thành phần cấu thành trong các tế bào Vì vậy, xét nghiệm protein là một xét nghiệm quan trọng trong việc chẩn đoán và điều trị nhiều loại bệnh trong đó có bệnh ung thư [2, 3, 25, 28, 64, 76, 80] Các xét nghiệm phân loại và đánh giá về các protein trong máu và trong các mô đã được thực hiện [3] Xét nghiệm các loại protein trong máu có thể được sử dụng để đánh giá ung thư tuyến tụy [33] Khoảng hơn 100 loại protein đặc biệt có trong huyết thanh và huyết tương được phát hiện và đánh giá áp dụng trong việc xét nghiệm [3] Các nhóm protein có trong tế bào cũng đóng một vai trò quan trong trong chẩn đoán ung thư vú [80] [64] Sự có mặt và tăng lên đáng kể của một nhóm protein như casein kinase Ie, p53, annexin XI, CDC25C, eIF-4E và MAP kinase 7 được tìm thấy ở mô tế bào ác tính của ung thư vú [28] PARP protein là một chỉ dấu xuất hiện trong mô tế bào ung thư buồng trứng [76] Để xét nghiệm protein, các phương pháp dựa trên xét nghiệm miễn dịch đã được sử dụng cũng như đang được nghiên cứu phát triển đáp ứng nhu cầu ngày càng tăng của việc áp dụng xét nghiệm protein trong chẩn đoán và điều trị bệnh

Việc xét nghiệm protein về cơ bản dựa trên xét nghiệm miễn dịch với nhiều kỹ thuật khác nhau như kỹ thuật hóa mô miễn dịch (immunohistochemistry) viết tắt tiếng anh là IHC [76, 80], kỹ thuật xét nghiệm phân tích sinh hóa (enzyme linked-immunosorbent assay) viết tắt tiếng anh là ELISA [64, 76], kỹ thuật đếm dòng chảy tế bào (flow cytometry) [24] Các kỹ thuật liệt kê ở trên hiện đang được sử dụng rộng

rãi trong xét nghiệm sinh học cũng như xét nghiệm bệnh ở các trung tâm y tế Hình

Trang 21

1.1 mô tả các phương pháp phổ biến đang được sử dụng cũng như đang được phát

triển trong xét nghiệm protein

Hình 1.1 Các phương pháp xét nghiệm protein dựa trên phương pháp xét nghiệm miễn dịch

Kỹ thuật xét nghiệm ELISA

Kỹ thuật xét nghiệm ELISA dựa trên xét nghiệm miễn dịch sử dụng kháng thể có gắn link enzyme để phản ứng tạo màu Protein bị bắt dính vào kháng thể và chất cơ được đưa vào để hình thành phản ứng tạo màu Sau các quá trình ủ và rửa thì mẫu được đưa vào máy soi màu để phát hiện một loại protein cụ thể Phương pháp ELISA hiện đang được sử dụng phổ biến ở các cơ sở y tế với nhiều ưu điểm như giá thành rẻ

Trang 22

hơn, dễ dàng triển khai giúp xét nghiệm nhanh bệnh phẩm Tuy nhiên việc xét nghiệm mẫu dựa trên phương pháp này đòi hỏi lượng lấy mẫu lớn ít nhất là cỡ vài chục µl và khả năng phát hiện protein ở nồng độ thấp không cao

Kỹ thuật hóa mô miễn dịch (IHC)

Kỹ thuật hóa mô miễn dịch cũng được áp dụng trong xét nghiệm sinh thiết Các mô sau khi được lấy mẫu cũng được xét nghiệm dựa trên phương pháp miễn dịch sử dụng kháng thể có gắn chất phát huỳnh quang hoặc chất tạo màu Sau khi tiến hành nhuộm mẫu thì phần mềm xử lý ảnh được sử dụng để đo vùng phát màu cũng như cường độ Tuy nhiên phương pháp trên cũng gặp những hạn chế khi nồng độ protein cần được phát hiện xuống thấp và cường độ cần được thực hiện chuẩn hóa Các phần mềm xử lý ảnh giúp định lượng thì có sẵn nhưng không được sử dụng phổ biến và hoặc chưa được chuẩn hóa giữa cường độ sáng với mức giá trị của nồng độ

Kỹ thuật đếm dòng chảy (flow cytometric)

Kỹ thuật đếm dòng chảy (flow cytometric) được cho là hiệu quả hơn hai kỹ thuật trên khi thay vì phát hiện sự thay đổi trên một diện tích thì các hạt sinh học có thể được đếm khi đi qua một cửa sổ phát hiện trong dòng chảy Tuy nhiên kỹ thuật này đòi hỏi sự phức tạp khó khăn khi vận hành thiết bị Cộng với việc thiết bị giá thành cao nên là một vấn đề lớn trong việc triển khai đại trà

Kỹ thuật Protein microarrays

Protein microarrays là kỹ thuật dùng để phân tích và chức năng hóa hàng nghìn protein cùng một lúc với hiệu suất cao Để làm được điều này, các nhà nghiên cứu đã tiến hành giảm không gian kích thước vùng xét nghiệm từ cỡ mm xuống cỡ µm Việc không gian xét nghiệm đã được chia nhỏ ra hàng nghìn lần tạo điều kiện để phân tích cùng một lúc hàng nghìn loại protein khác nhau Dựa vào tùy loại mục đích, chúng được chia làm hai loại bao gồm: protein microarray dùng để chức năng hóa và protein microarray phân tích [22] Ở công nghệ microarray, phương pháp xét nghiệm miễn dịch được thực hiện tại hàng nghìn hoặc hàng vạn điểm trên cùng một tấm nền có thể là vật liệu kính trong suốt nơi kháng thể được cấy lên bề mặt Các bộ dịch chuyển

Trang 23

tọa độ hoạt động để nhỏ hoạt chất xuống bề mặt và hoạt động như một máy in để định vị dung dịch cấy xuống các điểm [61] Protein microarrays có thể cấy nhiều loại kháng thể để phát hiện nhiều loại protein khác nhau Sau đó, các kháng thể có gắn chất chỉ thị màu được sử dụng để đánh dấu giúp phát hiện protein bằng cách sử dụng các camera Phát hiện và phân tích nhiều loại protein khác nhau cũng được áp dụng để xét nghiệm ung thư dựa trên chỉ dấu các loại protein [25] Mặc dù vậy, phân tích protein được dựa trên việc sử dụng kháng thể trong một số trường hợp có tính đặc hiệu không cao Việc nhuộm nhiều màu khác nhau để phát hiện trong một số trường hợp có thể phá hủy liên kết phân tử dẫn đến sai lệch kết quả xét nghiệm và đặc biệt là độ nhạy không cao khi áp dụng để phát hiện các protein có nồng độ thấp [61]

Kỹ thuật sử dụng kênh vi lỏng

Các kỹ thuật nêu trên đa phần đang được áp dụng phổ biến ở các trung tâm y tế cũng như bệnh viện và đóng một vai trò quan trọng trong việc xét nghiệm và điều trị bệnh thông qua các xét nghiệm nước tiểu, máu và sinh tiết tế bào Tuy nhiên, để tăng khả năng phát hiện bệnh thì bài toán đặt ra là phải phát hiện các protein với nồng độ thấp hơn với một lượng lấy mẫu nhỏ hơn và giảm thời gian xét nghiệm Cùng với đó là việc tăng tính tự động hóa giúp đơn giản trong vận hành Cuối cùng là bài toán về giảm giá thành và tiện lợi trong quá trình xét nghiệm cũng được đặt ra Để đáp ứng bài toán này, các nghiên cứu về chip sinh học ( Lab-on-a-Chip) dựa trên nền tảng chip vi kênh (Microfluidic) với nhiều ưu điểm đã và đang được khai thác để tạo ra những thiết bị xét nghiệm nhỏ gọn mà vẫn đáp ứng được các yêu cầu của bài toán xét nghiệm Các loại xét nghiệm sinh học nói chung dựa trên việc phát triển chip vi kênh với nhiều ưu điểm đã và đang được phát triển mạnh để ứng dụng trong sinh học Các chip vi kênh này có thể kế thừa từ các phương pháp phổ biến nêu trên như phương pháp ELISA, IHC, phương pháp đếm dòng chảy tế bào bằng cách tích hợp vào trong vi kênh với việc giảm kích thước xuống cỡ micro-mét Ưu điểm của kênh vi lỏng là các hạt sinh học có thể được phân tách, tập trung với lượng lấy mẫu nhỏ Quá trình xét nghiệm có thể được diễn ra một cách tự động và làm đơn giản hóa cho người vận hành Với kích thước nhỏ gọn, chip sinh học trên nền tảng cấu trúc kênh vi lỏng mở

Trang 24

ra một hướng nghiên cứu triển vọng trong việc phát triển các thiết bị xét nghiệm nhỏ gọn mà vẫn đáp ứng được bài toán xét nghiệm phát hiện bệnh và theo dõi bệnh tại chỗ [2]

Thông thường một chip sinh học được tích hợp một hoặc nhiều chức năng như chức năng tập trung, phân tách hạt sinh học, chọn lọc và phát hiện Các loại hạt sinh học có đặc tính vật lý khác nhau như kích thước, tính chất mang điện hoặc bị tác động bởi trường điện từ được khai thác trong các phương pháp tập trung và phân tách hạt Các cấu trúc vi kênh thông thường được chế tạo bằng vật liệu PDMS Với các ưu điểm của cấu trúc micro-mét, việc xét nghiệm chỉ cần một mẫu bệnh phẩm với thể tích chỉ một vài µl đã có thể đáp ứng được việc xét nghiệm để cho ra kết quả [2],[8]

Tổng quan các nghiên cứu về phát triển chip sinh học và chip phát hiện protein

Một chip sinh học có thể bao gồm một hoặc nhiều chức năng được tích hợp trong một không gian nhỏ nhằm phát hiện các đối tượng sinh học có thể là tế bào ung

thư, protein, vi rút hoặc vi khuẩn [49] Hình 1.2 mô tả và phân loại các chip sinh học

theo các chức năng của chip Các mẫu dùng để xét nghiệm có thể chứa tế bào ung thư, các protein, vi rút hay vi khuẩn Nhằm tăng khả năng phát hiện, các bộ tập trung, phân tách hạt sinh học đã được phát triển để tích hợp trong chip sinh học Các nguyên lý tập trung hay phân tách hạt sinh học dựa vào các thuộc tính vật lý của hạt sinh học khác nhau như kích thước hạt, khả năng mang điện của hạt hay sử dụng các hạt từ như một hạt trung gian có gắn kháng thể để bắt giữ kháng nguyên nhằm phân tách khỏi dòng chảy

Các phương pháp phân tách hay tập trung trong các chip này thường dựa vào các nguyên lý dòng chảy cơ học, các nguyên lý điện hoặc sử dụng hạt từ Quá trình tập trung hay phân tách được diễn ra trong các kênh vi lỏng trước khi quá trình chọn lọc và phát hiện được thực hiện Các chip sinh học có thể có hoặc không có chức tập trung hay phân tách phụ thuộc vào mục đích phát triển của các nhà nghiên cứu Đối với chức năng chọn lọc, phương pháp xét nghiệm miễn dịch đã được áp dụng nhằm

Trang 25

bắt giữ đặc hiệu một loại hạt sinh học cụ thể Để bắt giữ chọn lọc, các nghiên cứu sử dụng kháng thể, DNA hay Aptamer được gắn trên một tấm nền có tích hợp trong chip sinh học Thông thường, chức năng chọn lọc và chức năng phát hiện được kết hợp lại để tạo ra một cảm biến miễn dịch Cảm biến miễn dịch có thể được phân loại tùy thuộc vào phương pháp vật lý được sử dụng để phát hiện Các chip sinh học thường được kết hợp với các mạch điện được phát triển để chuyển đổi các tín hiệu quang, cơ hay điện sang tín hiệu điện chuẩn nhằm xử lý, phân tích và hiển thị thông tin về cảm biến

Hình 1.2 Khái niệm của một chip sinh học được chia theo các thành phần chức năng

Các nghiên cứu về chip sinh học ở trong nước

Cảm biến sinh học cũng được nhóm các nhà khoa học ở trong nước tiến hành nghiên cứu và phát triển tại các trường đại học và các viện nghiên cứu Nhóm nghiên cứu tại viện ITIMS trường đại học Bách khoa Hà Nội đã phát triển loại cảm biến sinh học dùng để phát hiện vi rút cúm bằng cách sử dụng phương pháp xét nghiệm miễn dịch trên nền tảng cấu trúc carbon- nanotubes [69] Bên cạnh đó, các cấu trúc cũng được nhóm phát triển lên một bước để tạo thành dạng chip linh kiện dựa trên cấu trúc

Trang 26

có hiệu ứng transitor trường để phát triển một loại cảm biến phát hiện phenols trong nước [5]

Nhóm nghiên cứu của GS Trần Đại Lâm tại Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam cũng đã và đang phát triển các cảm biến sinh học cho ứng dụng trong y tế Dựa trên cấu trúc cảm biến điện hóa loại điện cực in, một trong những hướng nghiên cứu đã được tiến hành là sử dụng các hạt nano từ được cấy trên nền điện cực cảm biến nơi gắn các đầu dò DNA để bắt đặc hiệu vi rút HIV [53] Bằng cách sử dụng cấu trúc trên, cảm biến sinh học sử dụng nguyên lý đo điện hóa có thể phát hiện được virut HIV nồng độ 50 pM

Hình 1.3 Cảm biến điện hóa dựa trên công nghệ in điện cực [73]

Nhóm nghiên cứu của phó giáo sư Trương Thị Ngọc Liên ở viện Khoa học và công nghệ Việt Nam – Hàn Quốc (VKIST), Bộ Khoa học và công nghệ đã nghiên cứu phát triển một cảm biến sinh học dựa trên công nghệ in điện cực carbon để thực hiện xét nghiệm miễn dịch loại HCg là một loại protein trong máu người đóng vai trò trong xét nghiệm thai kỳ và phát hiện ung thư Kháng thể được gắn trên cảm biến giúp bắt giữ protein sau đó phương pháp đo điện hóa được áp dụng để phát hiện sự thay đổi trở kháng trên bền mặt của cảm biến [73]

Trang 27

Hình 1.3 mô tả cấu trúc của một cảm biến điện hóa dựa trên công nghệ in điện cực

Điện cực tham chiếu được gắn phủ Ag/AgCl lên trên bề mặt Kháng thể sau đó được phủ lên điện cực làm việc dùng bắt đặc hiệu loại protein HCg Sau khi protein bị bắt giữ, phương pháp đo điện hóa được sử dụng để đo nồng độ thấp của protein bị bắt dính vào kháng thể trên bề mặt

Các nghiên cứu về cảm biến sinh học ở Việt Nam đã được thực hiện trên nền tảng công nghệ micro và nano để phát triển các chip dựa trên xét nghiệm miễn dịch Phương pháp đo điện hóa được khai thác để giúp phát hiện các đối tượng sinh học dựa trên sự thay đổi các giá trị điện của cảm biến Với đa dạng nhiều loại cảm biến khác nhau, các nghiên cứu trong nước đã góp phần trong sự phát triển mạnh mẽ thời gian gần đây của ứng dụng cảm biến sinh học trong xét nghiệm bệnh phẩm Các chip sinh học đã được phát triển trong nước chủ yếu là chip xét nghiệm có bao gồm chức năng chọn lọc và phát hiện gọi chung là cảm biến miễn dịch Hướng phát triển tích hợp cảm biến miễn dịch vào trong kênh vi lỏng của hệ thống vi chip có nhiều chức năng được tích hợp thêm như chức năng tập trung hoặc phân tách trên nền tảng LoC hướng tới tự động hóa, giảm thời gian xét nghiệm vẫn là một hướng mở để các nghiên cứu tiếp tục được tiến hành

Các nghiên cứu về chip sinh học ở nước ngoài về phát hiện protein

Để phát triển chip xét nghiệm protein, phương pháp xét nghiệm miễn dịch đã được áp dụng vào trong phát triển các chip sinh học là các loại cảm biến miễn dịch có cấu trúc nhỏ từ mili-mét xuống micro-mét trong các vi chip Bằng việc kết hợp giữa phương pháp xét nghiệm miễn dịch với các phương pháp vật lý như phương pháp quang và phương pháp điện, protein bị kháng thể bắt giữ có thể được phát hiện

Tuy nhiên bài toán phát hiện protein còn được phát triển thêm một bước nhờ sử dụng hệ thống kênh vi lưu nhằm tự động hóa quá trình xét nghiệm, tăng khả năng phát hiện, giảm thời gian và giảm thể tích mẫu xét nghiệm Để làm được điều này, protein trong hệ thống kênh vi lỏng có thể được tập trung lại trước khi được chọn lọc và phát hiện bằng cách sử dụng các nguyên lý vật lý để lái và bẫy protein Nhiều

Trang 28

nghiên cứu đã tiến hành phát triển hệ thống kênh vi lỏng sử dụng phương pháp điện để tập trung protein lại trong một vùng nhỏ trước khi protein được phát hiện

Phát hiện protein dựa trên xét nghiệm miễn dịch có thể được thực hiện ở trong kênh vi lỏng hoặc các cấu trúc vi cơ Trong các chip vi kênh, các kháng thể sinh học thường được gắn lên trên tấm nền có thể là điện cực vàng để bắt và bám giữ protein Các phương pháp vật lý được sử dụng để phát hiện ra protein tại vùng phát hiện như phương pháp quang học và phương pháp đo điện Phương pháp quang đã được dùng phổ biến ở xét nghiệm ELISA [16]

Bên cạnh đó, các phương pháp đo điện thường được sử dụng kết hợp với xét nghiệm miễn dịch tạo ra các cảm biến miễn dịch kiểu điện áp dụng trong việc phát hiện protein [10, 16, 17, 20, 73] Phương pháp đo trở kháng với nhiều ưu điểm như giá thành rẻ, cảm biến dễ dàng tích hợp trong vi chip cũng như các kênh vi lỏng và các mạch điện được thiết kế nhỏ gọn đã được khai thác trong các nghiên cứu Phương pháp đo phổ trở kháng trên cảm biến điện hóa cũng được khai thác triệt để trong phát hiện protein [10, 16, 17] Bên cạnh đó, các hạt nano vàng cũng được sử dụng kết hợp với phương pháp đo trở kháng khi chúng được gắn với kháng thể làm thay đổi trở kháng giữa hai điện cực Từ đó với nồng độ protein bắt giữ khác nhau dẫn đến thay đổi trở kháng của cảm biến [40]

Cấu trúc vi cảm biến cũng có thể được phát triển để tích hợp trong dòng chảy kênh vi lỏng Việc phát triển các chip vi kênh cũng được áp dụng để phát hiện protein với mục đích để giảm tối thiểu lượng lấy mẫu cần thiết Ở các thiết kế này, các kháng thể có thể được cấy lên trên cảm biến được tích hợp ở trong kênh với không gian cỡ micro-mét Sau đó phương pháp đo trở kháng được sử dụng để phát hiện sự có mặt của protein trong kênh vi lỏng [20, 51] Cảm biến miễn dịch dựa trên nguyên lý đo trở kháng tích hợp trong kênh vi lỏng đã được nghiên cứu nhằm đáp ứng được yêu cầu tạo ra các thiết bị xét nghiệm nhỏ gọn có thể xét nghiệm bệnh phẩm chỉ với một lượng mẫu phẩm rất nhỏ thậm chí chỉ cần vài nano-lít [72]

Trang 29

Hình 1.4 Cảm biến sinh học gắn kháng thể trong kênh vi lỏng sử dụng phương pháp đo trở kháng [20]

Hình 1.4 mô tả thiết kế chế tạo của một chip vi kênh tích hợp cảm biến trở

kháng có gắn kháng thể bắt protein trên các điện cực [20] Các cặp điện cực được thiết kế dọc kênh vi lỏng cho phép bắt các protein trong kênh trước khi nó được phát hiện Phương pháp đo phổ trở kháng được áp dụng cho thấy sự thay đổi khi có mặt các lớp phân tử được cấp lên trên điện cực Cụ thể là điện trở được quan sát thấy tăng lên sau khi lớp kháng thể gắn lên so với trước khi gắn kháng thể, tiếp theo là trở kháng tăng lên tương ứng khi protein bị bắt giữ trên các điện cực Trên cấu trúc này, các nhà nghiên cứu đã sử phương pháp đo trở khảng được áp dụng để phát hiện 100 µg/ml của protein BSA trong vi kênh

Một phương pháp khác dùng để phát hiện protein nồng độ thấp trong kênh vi lỏng là áp dụng phương pháp xét nghiệm miễn dịch kết hợp với việc sử dụng hạt từ để định lượng protein Việc định lượng được thực thi bằng cách đếm hạt từ bị giữ lại bằng liên kết kháng thể-protein-kháng thể-hạt từ Sau đó hạt từ được đếm khi dòng chảy đưa nó đi qua một cảm biến trở kháng và việc đếm được thực hiện bằng phương

Trang 30

pháp đo xung khi điện trở thay đổi ( Hình1.5) Để thực hiện điều này, một chip vi

kênh đã được thiết kế với hai chức năng chính là chức năng bắt giữ protein rồi sau đó bắt giữ hạt từ có gắn kháng thể và chức năng đếm hạt từ Một vùng bắt giữ protein được thiết kế trong kênh có độ cao 30 µm và độ rộng 300 µm Đầu tiên kháng thể bắt giữ protein được cấy lên trên bên trong kênh lỏng

Hình 1.5 Mô hình thiết kế và phát hiện các hạt sinh học dựa trên việc đếm số hạt đi qua một cảm biến trở kháng [51]

Cùng với đó, hạt từ với kích thước 2.8 µm được chức năng hóa gắn kháng thể cũng được đưa vào với mẫu có protein Lúc này các hạt từ bị bắt giữ bởi protein do có gắn kháng thể và lắng xuống dưới đáy Liên kết hạt từ-kháng thể-protein-kháng

Trang 31

thể đạt được hiệu quả cao sau 1 tiếng ủ Tiếp theo đó, nghiên cứu sử dụng dòng chảy đầu tiên để rửa kênh loại đi những hạt sinh học không bị bắt cặp với kháng thể Cuối cùng, một dòng chảy mạnh hơn được sử dụng để đưa hạt từ bứt ra khỏi bề mặt của vùng bắt giữ Bằng cách đếm số lượng hạt từ đánh giá định lượng protein một cách tương đối khi chúng mang thông tin của protein bắt giữ hạt từ ở liên kết kháng thể-protein-kháng thể-hạt từ Một bộ khuếch đại vi sai được thiết kế để phát hiện thay đổi trở kháng của hạt từ Đặc biệt, với việc sử dụng cấu trúc chip vi kênh này, protein Interleukin 6 (IL-6) nồng độ 50 pM có thể được phát hiện chỉ với hơn 4 µl lấy mẫu thấp hơn giới hạn 500 pM và 100 µl của phương pháp ELISA

Để đếm các hạt từ đi qua cửa sổ phát hiện là hai điện cực, trong thiết kế này đòi hỏi ngoài mạch khuếch đại vi sai dùng để đo được xung khi các hạt đi qua thì phải cần thêm một máy khuếch đại Lock-in thương mại dùng để loại nhiễu Để phát triển ứng dụng tạo ra các thiết bị nhỏ gọn có thể cầm tay hoặc cho các ứng dụng theo dõi sức khỏe tại nhà và theo dõi bệnh theo thời gian thì yêu cầu đặt ra cần phải phát triển một mạch hoàn thiện có kích thước nhỏ gọn tích hợp vào thiết bị có thể đo được các hạt cỡ micro [51] Có thể thấy bài toán phát triển mạch điện đo trở kháng có tích hợp khuếch đại lock-in riêng cho chip sinh học là một bài toán nghiên cứu đã được đặt ra nhằm phát triển những thiết bị cầm tay ứng dụng trong xét nghiệm tại chỗ Phương pháp xét nghiệm miễn dịch đã được nghiên cứu kết hợp với phương pháp đo điện nhằm ứng dụng trong phát hiện protein tạo ra một hướng triển vọng trong việc xây dựng các thiết bị xét nghiệm bệnh phẩm cầm tay có kích thước nhỏ gọn Các cấu trúc vi chip kênh vi lỏng đã được ứng dụng vào xét nghiệm protein giúp giảm thiểu lượng mẫu bệnh phẩm cần thiết để xét nghiệm

Tuy nhiên với nhu cầu giảm thiểu lượng lấy mẫu trong khi vẫn tăng độ nhạy phát hiện protein ở nồng độ thấp, một hướng nghiên cứu khác là tiến hành tập trung protein trong kênh vi lỏng trước khi nó được phát hiện Việc tập trung protein lại trong một vùng nhỏ giúp tăng khả năng phát hiện protein ở nồng độ thấp từ đó tăng khả năng phát hiện bệnh sớm

Trang 32

Chip vi kênh tập trung protein giúp giảm thời gian xét nghiệm và tăng khả năng phát hiện protein

Việc phát hiện protein ở nồng độ thấp với yêu cầu lượng lấy mẫu bệnh phẩm nhỏ được giải quyết bằng cách phát triển các cấu trúc chip vi kênh để tập trung protein trước khi protein được phát hiện Phát hiện protein bằng cách tập trung lại ở một vùng nhỏ cũng giống như tín hiệu được khuếch đại trước khi đo Protein tập trung lại ở một vùng nhỏ làm tăng nồng độ tại đó hệ quả là tăng khả năng phát hiện lên đến hàng triệu lần với mẫu protein có nồng độ rất thấp[77],[72] Bằng kỹ thuật kênh vi lỏng, nhiều loại protein khác nhau cũng có thể được tập trung cùng một lúc dựa trên các trúc đa kênh [39] Các chip vi lỏng có thể dễ dàng được chế tạo với cấu trúc đa kênh trên một chip, từ đó một nhóm protein có thể được tập trung nhờ cấu trúc chip vi đa kênh Điều này đáp ứng được yêu cầu bài toán cần xác định và phát hiện một nhóm protein tăng đột biến hoặc xuất hiện trong mẫu giúp cho chẩn đoán và xét nghiệm bệnh

Kênh vi lỏng với nhiều ưu điểm đã được sử dụng trong những thiết kế có các chức năng như phân tách, tập trung các hạt sinh học lại vào một vùng diện tích nhỏ nơi các phương pháp xét nghiệm miễn dịch được áp dụng để bắt cặp đặc hiệu các hạt sinh học bằng cách dùng các kháng thể sinh học Bằng cách tập trung các hạt sinh học vào một vùng nhỏ, một số lượng nhỏ hay nồng độ thấp của protein hoặc tế bào ung thư có thể được phát hiện nhờ sử dụng cấu trúc vi kênh Có nhiều phương pháp được sử dụng để tập trung và phân tách các hạt sinh học trong kênh vi lỏng như phương pháp dòng chảy vi lưu, phương pháp sử dụng hạt từ hay phương pháp sử dụng điện trường Trong tập trung protein, các nghiên cứu trên thế giới đã phát triển các phương pháp điện để tập trung protein lại trong kênh vi lỏng [44] Các protein mang điện tích âm phụ thuộc vào độ PH của dung dịch đệm Khi độ pH của dung dịch đệm lớn hơn 7 thì protein mang điện âm, nhờ vậy việc tập trung có thể tiến hành bằng cách sử dụng các dòng chảy điện di và điện thẩm Các thiết kế dựa trên cấu trúc kênh lỏng sử dụng vật liệu PDMS trong chế tạo vi kênh Trong kênh vi lỏng các hiệu ứng vật lý đã được sử dụng một cách hiệu quả để tập trung protein Có thể liệt kê ra

Trang 33

một số nguyên lý như dòng chạy diện di (electrophoresis), dòng chảy điện thẩm (electro-osmotic flow), phương pháp làm giàu, làm nghèo ion trong kênh vi lỏng bằng các kênh nano, màng lọc ion, các cấu trúc đứt gãy nano hình thành ở giữa hai lớp vật liệu tạo bởi sự phóng điện đánh thủng giữa hai lớp

Dòng chảy điện di và dòng chảy điện thẩm

Phương pháp sử dụng điện di là phương pháp sử dụng dòng điện DC ở trong kênh lỏng hoặc vi lỏng để tạo ra dòng chảy các loại ion theo các hướng mong muốn Dòng chảy ion kéo các loại ion với vận tốc khác nhau tùy thuộc vào khối lượng và kích thước hạt Bằng cách điều khiển dòng chảy trong kênh có độ dài đủ lớn và có những vật liệu cản trở kích thước hạt, các hạt với kích thước hoặc khối lượng khác nhau theo thời gian bị phân tách thành các ngăn khác nhau Phương pháp này được áp dụng để phát triển các cấu trúc kênh có kích thước cỡ cm hoặc µm dùng trong phân tách protein [7, 13, 42, 52] Các thiết bị có cấu trúc trên có hiệu suất tập trung đạt từ 20 đến 50 lần Lượng lấy mẫu tùy thuộc vào kích thước của thiết bị

Dòng chảy điện thẩm (EOF) được gây ra bởi bề mặt của kênh dựa trên các hiệu ứng tạo ra bởi sự phân bố điện tích giữa thành kênh và dung dịch Ở gần thành kênh các lớp ion tự do với mật độ lớn hơn khi dòng chảy điện di xảy ra nó kéo theo các ion trái dấu Dòng chảy điện thẩm đạt được hiệu suất cao khi kích thước của vi kênh giảm xuống dẫn đến vùng ảnh hưởng của phân bố điện tích giữa hai lớp tăng lên đáng kể trong kênh Hiệu ứng trên đã được sử dụng trong xét nghiệm sắc ký khi mà dòng chảy điện thẩm trong ống mao dẫn kéo các ion khác nhau với tốc độ khác nhau dẫn đến hệ quả là khi độ dài của ống đủ lớn thì các loại ion khác nhau bị phân tách [42],[7]

Làm giàu, làm nghèo ion

Hiệu ứng bề mặt lớp tiếp xúc giữa thành kênh và dung dịch còn được khai thác ở các vi kênh siêu nhỏ cỡ nano mét Ở kênh cấu trúc nano, hiệu ứng bề mặt giữa hai lớp thành kênh và dung dịch tạo ra một lớp phân bố điện tích Lớp điện tích này có thể là điện tích âm hoặc điện tích dương tạo ra mật độ điện tích âm và dương khác nhau trong kênh Hệ quả của nó là khi được cấp điện dương và âm ở hai đầu kênh tạo

Trang 34

ra hiệu ứng một bên thì một loại điện tích dương hoặc âm bị giữ lại, một bên thì điện tích được làm giàu lên khi có dòng chảy [39]

Hiệu ứng điện trên bề mặt ở chỗ hai lớp vật liệu khác nhau tiếp xúc nhau (tiếp xúc giữa dung dịch và chất rắn) được biểu hiện rõ nét ở kênh có kích thước siêu nhỏ như vi kênh cỡ nano-mét Lớp tiếp xúc bề mặt giữa hai loại vật liệu khác nhau có sự chênh lệch và khuếch tán ion của hai loại vật liệu khác nhau sang nhau, điều này tạo ra một lớp ion âm và ion dương phân bố trên hai mặt (double layers) Sự phân bố ion này ảnh hưởng đến dòng chảy trong các kênh đặc biệt là kênh nano mét Sự có mặt của các ion tạo ra hiệu ứng chọn lọc ion cho qua vi kênh khi mật độ ion trong kênh có sự khác nhau giữa loại ion dương và ion âm bởi lực điện trường do phân bố điện tích gần bề mặt [59] Hệ quả là một bên thì thừa ion do bị chặn lại một bên thì thiếu

ion do ion không qua được Hình 1.6 giải thích hiện tượng làm giàu và làm nghèo

ion trong kênh lỏng sử dụng kênh cấu trúc nano Dung dịch điện phân chứa cặp ion (A+B-) trong kênh vi lỏng dưới sự tác dụng của điện trường khi được cấp vào kênh di chuyển về hai phía kênh Trong kênh kích thước nano, mật độ điện tích ở bề mặt tạo ra sự chênh lệch nồng độ điện tích trong kênh

Hình 1.6 Nguyên lý làm giàu, làm nghèo ion dựa trên cấu trúc kênh nano [59]

Trang 35

Cụ thể, trong trường hợp thành kênh tích điện âm, thì xung quanh thành kênh và trong kênh nano chứa nhiều điện tích dương nghĩa là [A+]> [B-] ở trong kênh nano Qiaosheng Pu và các đồng nghiệp đã đưa ra mô hình và tính toán chứng minh rằng điện tích âm và dương được làm giàu ở một bên và một bên bị mất dần điện tích gọi là làm nghèo ion [59] Trong mô hình đó tỉ lệ điện tích dương và âm được giả thuyết là [A+ ]= α.[B-] với α>1 trong kênh nano nghĩa là trong kênh nano, nồng độ hạt điện tích dương nhiều hơn mật độ điện tích âm α lần Gọi mật độ dòng đi qua kênh micro của hai loại ion dương và âm lần lượt là: 𝐽1𝐴, 𝐽1𝐵 Dòng đi qua kênh nano của hai loại ion dương và âm là: 𝐽𝑛𝐴, 𝐽𝑛𝐵 Từ đó ta có phương trình liên hệ:

Trong đó 𝐸 là điện trường trong kênh, S là diện tích mặt cắt của kênh, µ là hệ

số điện dịch thể hiện độ linh động điện của ion Áp dụng định luật Kirchoff cho mô hình dòng liên tục ta có:

𝐽1𝐴 − 𝐽1𝐵= 𝐽𝑛𝐴− 𝐽𝑛𝐵 (1.3) Trong kênh micro, nồng độ các hạt điện tích âm và dương được coi là như nhau ([𝐴]1 = [𝐵]1) nên kết hợp các phương trình ở trên ta có mối liên hệ:

𝐽1𝐴 = (µ𝐴+ µ𝐵/αµ𝐴+µ𝐵 ) 𝐽𝑛𝐴

𝐽1𝐵 = (µ𝐴+ α µ𝐵µ𝐴+µ𝐵 ) 𝐽𝑛𝐵

(1.4)

Trang 36

Phương trình 1.4 mô tả thông lượng dòng của ion dương và ion âm di chuyển tới một đầu kênh micro (𝐽1𝐴, 𝐽1𝐵) và thông lượng dòng di chuyển trong kênh nano (𝐽𝑛𝐴, 𝐽𝑛𝐵) Có thể thấy 𝐽1𝐴<𝐽𝑛𝐴 do α > 1 Dòng điện tích dương 𝐽1𝐴cung cấp ion dương đi đến đầu cuối trong khi dòng 𝐽𝑛𝐴 mang ion dương tới đầu cuối của kênh nano dẫn tới sự mất cân bằng tạo ra thiếu ion dương ở nơi cấp điện dương Ở đầu cấp điện tích âm thì lượng ion dương bị lấy đi không bằng lượng điện tích dương cấp từ kênh nano vào nên điện tích dương được làm giàu ở đầu cấp điện âm Tương tự với điện tích âm do α > 1 nên 𝐽1𝐵>𝐽𝑛𝐵 Điều này dẫn tới ở đầu cấp điện âm, lượng ion âm được cấp vào lớn hơn lượng điện tích âm vào kênh nano nên ion âm ở đầu điện cấp điện tích âm ion âm cũng được làm giàu, ở phía bên kia, kênh nano cung cấp lượng điện tích âm không nhiều bằng lượng mất đi do cấp điện dương nên dẫn đến thiếu hụt ion âm Như vậy cả hai điện tích âm và điện tích dương đều được làm giàu và làm nghèo ở hai phía của kênh

Chip vi kênh tập trung protein dựa trên nguyên lý dòng chảy EOF và làm nghèo ion

Các hiệu ứng nêu trên đã được áp dụng vào thiết kế các chip vi lỏng dùng để tập trung protein trong một diện tích nhỏ Phương pháp làm nghèo ion đã được phát triển để tạo ra các bẫy protein khi các protein mang điện di chuyển đến gần vùng nghèo ion bị giữ lại và tích lũy theo thời gian Một trong những phương pháp là sử dụng màng lọc ion để tạo ra vùng làm nghèo ion đã được nghiên cứu và thực hiện [39] Trong nghiên cứu này, Lee và các cộng sự đã phát triển một chip vi kênh sử

dụng màng lọc nano (Nafion) để tạo ra một vùng nghèo ion trong kênh vi lỏng Hình 1.7(a) mô tả thiết kế của chip vi kênh tập trung protein sử dụng màng lọc ion Hình 1.7(b) mô tả nguyên lý hoạt động của chip vi kênh Sau khi chip được chế tạo với

màng

lọc nối hai kênh Vùng nghèo ion được tạo ra bằng cách cấp điện áp một chiều 50 V vào hai đầu kênh giữa và 0V vào kênh còn lại Lúc này vùng dọc màng lọc bị thiếu hụt ion do in bị hút về phía kênh có cấp điện áp 0V Sau đó protein trong kênh

Trang 37

được tập trung lại bằng cách tạo ra điện áp chênh lệch giữa hai đầu kênh ở giữa Việc tạo điện áp chênh lệch 50V-25V ở hai đầu kênh tạo ra dòng chảy EOF dẫn các ion chạy về phía đầu kênh 25 V Protein mang điện di chuyển về phía đầu kênh có cấp điện 25 V tuy nhiên đến gần vùng nghèo ion thì bị tích lũy lại và tập trung theo thời gian Với thiết kế này protein đã được tập trung lại với nồng độ sau khi tập trung tăng gấp 104 so với nồng độ ban đầu trước khi tập trung

Hình 1.7 Thiết kế của chip tập trung protein dùng màng lọc ion: (a) mô hình thiết kế của chip vi kênh bao gồm hai kênh micro được liên kết với nhau bằng một màng lọc ion; (b) sơ đồ nguyên lý chứng minh hoạt động của chip vi kênh khi vùng nghèo ion sau đó dòng chảy protein được lái đến và bị tích lũy gần vùng nghèo ion [39]

Một phương pháp khác để tạo ra vùng nghèo ion là chế tạo kênh nano tích hợp trong chip vi kênh Tập trung protein thực hiện trong kênh vi lỏng sử dụng kênh nano

tạo ra vùng nghèo ion đã được thực hiển bởi Wang và các cộng sự [77] Trong thiết

kế này, bẫy protein đã được tạo ra bằng cách sử dụng dòng chảy điện thẩm lái protein

vào một vùng bẫy là vùng nghèo ion Hình 1.8 mô tả thiết kế và nguyên lý hoạt động

của chip vi lỏng tập trung protein sử dụng bộ lọc ion để tạo ra vùng nghèo ion Hai kênh vi lỏng được thiết kế cách nhau bởi một kênh nano với độ cao 40 nm tạo ra một biên giới nơi mà một bên ion được làm giàu lên và một bên nghèo ion Kênh nano được tạo ra bằng cách ăn mòn một vùng giữa hai kênh vi lỏng Dòng chảy EOF lái

Trang 38

protein đến vùng biên giới thì bị giữ ở vùng nghèo ion và tập trung dần số lượng theo thời gian Ban đầu, điện áp DC được cấp vào đầu các kênh tạo ra vùng nghèo ion nằm

gần kênh nano Tiếp theo đó, điện áp DC ở hai đầu kênh là Vs và Vd được thay đổi tạo ra chênh lệch điện thế Lúc này dòng EOF được tạo ra trong vi kênh có độ cao 1,5 µm di chuyển protein mang điện âm về phía vùng nghèo và bị dừng lại ở đó Protein dần được tập trung và đo nồng độ tích lũy theo thời gian bằng phương pháp nhuộm màu huỳnh quang Thí nghiệm đã tiến hành với các nồng độ protein khác nhau đặc biệt là với nồng độ protein 33 pM Nồng độ trước và sau khi tập trung protein lại đã đo cường độ chỉ ra hiệu suất tập trung cỡ 106 đến 108 chỉ với lượng lấy mẫu 1µl

Hình 1.8 Thiết kế chip trung protein dựa trên cấu trúc kênh vi lỏng sử dụng bộ lọc nano tạo ra vùng nghèo ion dùng để bẫy protein [77]

Trang 39

Ngoài chế tạo kênh nano bằng cách ăn mòn lớp vật liệu đế, các cấu trúc đứt gãy nano còn có thể được tạo ra bằng cách tạo ra điện áp đánh thủng ở lớp tiếp xúc của hai loại vật liệu Bằng cách sử dụng điện áp DC cao áp, các cấu trúc đứt gãy nano giữa lớp tiếp xúc giữa hai loại vật liệu được hình thành và có thể được sử dụng để tạo ra vùng nghèo ion Phương pháp dùng các cấu trúc đứt gãy nano tạo ra từ thế phóng điện cũng được các nghiên cứu khai thác để thực hiện trên cấu trúc chíp vi kênh [36] Ở thiết kế này, chip được cấu tạo bằng hai vi kênh (PDMS) có dạng gấp khúc Vị trí

gấp khúc của hai kênh cách nhau bởi một khe khoảng cách 20 µm (Hình 1.9) [36]

Hình 1.9 Cấu tạo của một chip vi kênh chế tạo bằng PDMS để tập trung protein [36]

Để tạo được cấu trúc đứt gãy nano có chức năng như kênh nano nối thông hai kênh micro, một điện áp chênh lệch giữa hai vi kênh khoảng vài trăm vôn được sử

Trang 40

dụng để tạo ra dòng rò Các cấu trúc đứt gãy nano được hình thành ở lớp tiếp giáp giữa PDMS và tấm kính nền khi có dòng điện một chiều chạy dọc lớp tiếp xúc Trường hợp điện áp một chiều đặt vào kênh quá cao có thể dẫn đến tạo bọt khí và sôi kênh Sau khi tạo ra các đứt gãy nano, việc làm giàu và làm nghèo ở hai bên đầu kênh có thể đạt được để tạo ra một bẫy protein khi kết hợp với các dòng chảy điện di và điện thẩm Hiệu suất tập trung protein có thể đạt được trong khoảng 103 đến 106 trong

dải điện áp từ 200 V đến 300 V dùng tạo kênh nano Hình 1.10 mô tả kết quả tập

trung của protein nồng độ 10 nM theo thời gian khi điện áp giữa các kênh được khảo sát ở 100 V và 200 V Có thể thấy điện áp càng cao thì hiệu suất đạt được càng lớn Tuy nhiên với điện áp lớn thì dễ gây ra bọt khí sôi bên trong kênh

Hình 1.10 Protein nồng độ 10 nM được tập trung lại theo thời gian được theo dõi bằng phương pháp đo cường độ huỳnh quang với hai điện áp đặt vào hai kênh lần lượt là 100 V và 200 V [36]

Các khảo sát tập trung nồng độ thấp protein đã được tiến hành Hình 1.11 mô

tả kết quả tập trung được theo dõi trong 30 phút bởi phương pháp đo huỳnh quang Ba nồng độ 1 pM, 100 pM và 10 nM protein BSA đã được tiến hành tập trung với điện áp hai kênh chênh lệch 200 V Hệ số tập trung đạt được từ 103-106 với nồng độ