(Luận án tiến sĩ) Nghiên Cứu Một Số Đa Hình Đơn Gen Pdcd1 Và Cd274 Ở Bệnh Nhân Nhiễm Virus Viêm Gan B Mạn Tính

Þ GIÁO DĂC VÀ ĐÀO T¾O BÞ Y TÀ TR¯âNG Đ¾I HâC Y HÀ NÞI

Þ GIÁO DĂC VÀ ĐÀO T¾O BÞ Y TÀ TR¯âNG Đ¾I HâC Y HÀ NÞI

========

PH¾M THà MINH HUYÂN

Chuyên ngành : Hóa sinh y hãc Mã sç : 9720101

LUÀN ÁN TIÀN SĨ Y HâC

NG¯äI H¯âNG DÀN KHOA HâC:

1 PGS.TS Đ¿ng Thá Ngãc Dung 2.TS Nghiêm Xuân Hoàn

HÀ NÞI - 2022

Trong suçt quá trình thực hiÉn đà tài này tôi đã nhận đ°āc rất nhiÃu sự giúp đÿ cąa lãnh đ¿o các c¢ quan, thầy cô, đéng nghiÉp, các bÉnh nhân và gia đình thân yêu cąa mình

Tr°ãc hÁt tôi xin bày tå lòng biÁt ¢n sâu sắc tãi PGS.TS Đ¿ng Thá Ngãc Dung- Bá môn Hóa sinh tr°ång Đ¿i hãc Y Hà Nái và TS Nghiêm Xuân Hoàn- Phó chą nhiÉm khoa Sinh hãc phân tā, BÉnh viÉn TWQĐ 108, là nhăng ng°åi thầy đã trực tiÁp h°ãng dÁn tôi thực hiÉn nghiên cću, đã tận tình giúp đÿ, đáng viên tôi trong suçt quá trình thực hiÉn đà tài, góp ý và sāa chăa luận án

Tôi xin bày tå lòng biÁt ¢n chân thành đÁn quý thầy cô, đéng nghiÉp, nhăng ng°åi đã t¿o mãi điÃu kiÉn, giúp đÿ tôi trong quá trình thực hiÉn luận án này:

Ban giám hiÉu, Phòng Đào t¿o Sau Đ¿i Hãc- tr°ång Đ¿i hãc Y Hà Nái Toàn thÅ quý thầy cô, cán bá trong Bá môn Hóa Sinh- tr°ång Đ¿i hãc Y Hà Nái

Ban giám đçc bÉnh viÉn TWQĐ 108

Toàn thÅ quý thầy cô, cán bá, sinh viên cąa Trung tâm nghiên cću y hãc ViÉt Đćc- BÉnh viÉn TWQĐ 108

Toàn thÅ các bác sỹ, d°āc sỹ, kỹ s°, kỹ thuật viên cąa Trung tâm xét nghiÉm- BÉnh viÉn TWQĐ 108

Tôi xin đ°āc gāi låi cảm ¢n tãi các bÉnh nhân và gia đình cąa hã đã giúp tôi có đ°āc sç liÉu trong luận án này

Tôi xin gāi låi cảm ¢n chân thành tãi quỹ Phát triÅn khoa hãc và công nghÉ quçc gia (Nafosted) đã hß trā kinh phí cho nghiên cću này KÁt quả nghiên cću là mát phần kÁt quả trong đà tài: <Nghiên cću vai trò các phân tā ćc chÁ điÅm kiÅm soát tín hiÉu miÇn dách cąa con đ°ång PD-1/PD-L1 và IDO/TDO-Kyn-AhR đçi vãi hậu quả lâm sàng ç bÉnh nhân nhiÇm vi rút viêm gan B m¿n tính=

cću Tôi xin gāi låi cảm ¢n chân thành tãi ThS Đào Ph°¢ng Giang- Trung tâm t° vấn di truyÃn và sàng lãc ung th°- BÉnh viÉn TWQĐ 108, BSNT Bùi Đình Tùng, BSNT Ngã Thá Uyên- Bá môn Hóa Sinh tr°ång Đ¿i hãc Y Hà Nái, CN Bùi Thùy Linh đã nhiÉt tình giúp đÿ tôi trong quá trình thực hiÉn đà tài

Cuçi cùng tôi xin ghi nhã công ¢n sinh thành, nuôi d°ÿng, d¿y dß, tình yêu th°¢ng cąa bç mẹ hai bên cùng sự ąng há, đáng viên cąa chéng tôi và cąa hai con và các anh chá em trong gia đình, nhăng ng°åi đã luôn ç bên, là chß dựa văng chắc đÅ tôi yên tâm hãc tập và hoàn thành luận án

Ph¿m Thá Minh HuyÃn

Tôi là Ph¿m Thá Minh HuyÃn, nghiên cću sinh khóa 38 Tr°ång Đ¿i hãc Y Hà Nái, chuyên ngành Hóa sinh Y hãc, xin cam đoan:

1 Đây là luận án do bản thân tôi trực tiÁp thực hiÉn d°ãi sự h°ãng dÁn cąa cô PGS.TS Đ¿ng Thá Ngãc Dung và thầy TS Nghiêm Xuân Hoàn

2 Công trình này không trùng l¿p vãi bất kỳ nghiên cću nào khác đã đ°āc công bç t¿i ViÉt Nam

3 Các sç liÉu và thông tin trong nghiên cću là hoàn toàn chính xác, trung thực và khách quan, đã đ°āc xác nhận và chấp thuận cąa c¢ sç n¢i nghiên cću

Tôi xin hoàn toàn cháu trách nhiÉm tr°ãc pháp luật và nhăng cam kÁt này

Hà Nội, ngày tháng năm 2022

Ng°åi viÁt cam đoan

Ph¿m Thá Minh HuyÃn

ĂC LĂC

Đ¾T VÂN Đ 1

CH¯¡NG 1: TäNG QUAN TÀI LIÈU 3

1.1 Đ¾I C¯¡NG V NHIÆM VIRUS VIÊM GAN B 3

1.1.1 Virus viêm gan B 4

1.1.2 Sinh lý bÉnh trong nhiÇm virus viêm gan B 5

1.1.3 Đáp ćng miÇn dách trong nhiÇm virus viêm gan B 7

1.1.4 Ch¿n đoán và điÃu trá nhiÇm virus viêm gan B 14

1.2 CON Đ¯äNG TÍN HIÈU PD-1/PD-L1 17

1.2.1 Tín hiÉu thông qua con đ°ång PD-1/ PD-L1 18

1.2.2 Vai trò cąa con đ°ång PD-1/PD-L1 trong nhiÇm virus viêm gan B m¿n tính 19

1.2.3 Vai trò cąa con đ°ång PD-1/PD-L1 trong ung th° gan 22

1.2.4 Ćng dăng con đ°ång PD-1/ PD-L1 trong điÃu trá hiÉn nay 23

1.3 ĐA HÌNH Đ¡N NUCLEOTID CĄA GEN PDCD1, CD274 VÀ BIÄU HIÈN PROTEIN HUYÀT T¯¡NG CĄA GEN PD-1, PD-L1 25

1.3.1 Khái niÉm và đa hình đ¢n nucleotid 25

1.3.2 Đa hình đ¢n nucleotid cąa gen PDCD1 28

1.3.3 Đa hình đ¢n nucleotid cąa gen CD274 31

1.3.4 Protein sPD-1, sPD-L1 33

CH¯¡NG 2: ĐàI T¯ĀNG VÀ PH¯¡NG PHÁP NGHIÊN CĆU 36

2.1 ĐæI T¯ĀNG NGHIÊN CĆU 36

2.1.1 Nhóm ng°åi khåe m¿nh 36

2.1.2 BÉnh nhân nhiÇm virus viêm gan B m¿n tính 36

2.1.3 Cÿ mÁu nghiên cću 40

2.2 PH¯¡NG PHÁP NGHIÊN CĆU 42

2.2.1 ThiÁt kÁ nghiên cću và s¢ đé nghiên cću 42

2.2.3 Trang thiÁt bá, dăng că, hóa chất nghiên cću 46

2.2.4 Kỹ thuật phân tích đa hình đ¢n nucleotid gen PDCD1 và CD274 48

2.2.5 Kỹ thuật đánh l°āng protein sPD-1 và sPD-L1 52

2.3 XĀ LÝ VÀ PHÂN TÍCH Sæ LIÈU 52

2.4 Đ¾O ĐĆC NGHIÊN CĆU 53

2.5 THäI GIAN VÀ ĐàA ĐIÄM NGHIÊN CĆU 53

2.6 CÁC BIÈN PHÁP KHæNG CHÀ SAI Sæ TRONG NGHIÊN CĆU 54

CH¯¡NG 3: KÀT QUÀ NGHIÊN CĆU 55

3.1 Đ¾C ĐIÄM CHUNG CĄA ĐæI T¯ĀNG NGHIÊN CĆU 55

3.1.1 Đ¿c điÅm phân bç và tuổi cąa đçi t°āng nghiên cću 55

3.1.2 Đ¿c điÅm và giãi cąa đçi t°āng nghiên cću 56

3.1.3 Đ¿c điÅm cận lâm sàng ç nhóm bÉnh nhân nhiÇm HBV m¿n 56

3.2 PHÂN Bæ KIÄU GEN VÀ ALEN CĄA CÁC BIÀN THÄ PD-1.1, PD-1.5, PD-1.9 VÀ rs2297136, rs4143815 æ CÁC NHÓM NGHIÊN CĆU 57

3.3 PHÂN Bæ HAPLOTYPE æ CÁC NHÓM NGHIÊN CĆU 73

3.3.1 Phân bç haplotype cąa 2 SNP trên exon 5 cąa gen PD-1 ç các nhóm nghiên cću 73

3.3.2 Phân bç haplotype cąa gen PD-1 ç các nhóm nghiên cću 75

3.3.3 Phân bç haplotype cąa gen PD-L1 ç các nhóm nghiên cću 78

3.4 NèNG Đà PROTEIN sPD-1 và sPD-L1 79

3.4.1 Néng đá protein sPD-1 79

3.4.2 Néng đá protein sPD-L1 81

3.5 MæI LIÊN QUAN GIĂA KIÄU GEN VÀ NèNG Đà sPD-1, sPD-L1 85

3.5.1 Mçi liên quan giăa kiÅu gen PD-1 và néng đá protein sPD-1 85

3.5.2 Mçi liên quan giăa kiÅu gen PD-L1 vãi néng đá protein sPD-L1 86

CH¯¡NG 4: BÀN LUÀN 87

4.1 PHÂN Bæ KIÄU GEN VÀ ALEN CĄA MàT Sæ ĐA HÌNH Đ¡N

GEN PDCD1 VÀ CD274 æ BÈNH NHÂN NHIÆM VIRUS VIÊM GAN B M¾N TÍNH VÀ NG¯äI KHäE M¾NH 92 4.2 MæI LIÊN QUAN GIĂA MàT Sæ ĐA HÌNH Đ¡N GEN PDCD1,

VâI MàT Sæ THÄ BÈNH LÂM SÀNG æ BÈNH NHÂN NHIÆM VIRUS VIÊM GAN B M¾N TÍNH 96

KÀT LUÀN 118 H¯àNG NGHIÊN CĆU TIÀP THEO 120 DANH MĂC CÁC CÔNG TRÌNH NGHIÊN CĆU

ĐÃ CÔNG Bà LIÊN QUAN ĐÀN LUÀN ÁN TÀI LIÈU THAM KHÀO

PHĂ LĂC

Tĉ viÁt tÃt TiÁng Anh TiÁng ViÉt

a.a Amino acid Acid amin

AHB Acute hepatitis B virus Viêm gan virus B cấp ALT Alanine transaminase

APC Antigen presenting cell TÁ bào trình diÉn kháng nguyên AST Aspartate transaminase

cccDNA Covalently closed circular

DNA

DNA d¿ng vòng DC Dendritic cell TÁ bào gai

HBV Hepatitis B virus Virus viêm gan B

HCC Hepatocellular cancer Ung th° biÅu mô tÁ bào gan HCV Hepatitis C virus Virus viêm gan C

INR International normalized ratio

ITIM Immunoreceptor

tyrosine-based inhibitory motif

Motif ćc chÁ phă thuác thă thÅ tyrosine

ITSM Immunoreceptor

tyrosine-based switch motif

Motif chuyÅn phă thuác thă thÅ tyrosine

LC Liver cirrhosis X¢ gan LCMV Lymphocytic chriomeningitis

virus

Virus gây viêm màng não lympho

MHC Major Histocompatibility Complex

Phćc hāp hòa hāp mô chą yÁu mPD-1 membrane PD-1 Protein PD-1 d¿ng gắn màng mPD-L1 membrane PD-L1 Protein PD-L1 d¿ng gắn màng NA Nucleos(t)ide analogue Ho¿t chất t°¢ng tự Nuclos(t)ide

NK Natural killer cell TÁ bào giÁt tự nhiên NKT Natural killer T cell TÁ bào T giÁt tự nhiên SNP Single nucleotide

polymorphism

Đa hình đ¢n nucleotid sPD-1 Soluble PD-1 Protein PD-1 d¿ng hòa tan sPD-L1 Soluble PD-L1 Protein PD-L1 d¿ng hòa tan

Bảng 2.1 Đánh giá chćc năng gan theo Child - Pugh 44

Bảng 2.2 Phân chia giai đo¿n HCC theo BCLC 44

Bảng 2.3 Trình tự méi cąa phản ćng PCR 47

Bảng 3.1 Phân bç và tuổi ç các nhóm nghiên cću 55

Bảng 3.2 Phân bç giãi tính cąa các nhóm nghiên cću 56

Bảng 3.3 Đ¿c điÅm cận lâm sàng ç nhóm bÉnh nhân nhiÇm HBV m¿n 56

Bảng 3.4 Đa hình PD-1.1 ç nhóm bÉnh nhân nhiÇm virus viêm gan B m¿n tính và ng°åi khåe m¿nh 59

Bảng 3.5 Đa hình PD-1.1 ç các nhóm bÉnh nhân nhiÇm virus viêm gan B m¿n 60

Bảng 3.6 Đa hình PD-1.5 ç nhóm bÉnh nhân nhiÇm HBV m¿n và ng°åi khåe m¿nh 62

Bảng 3.7 Đa hình PD-1.5 ç các nhóm bÉnh nhân nhiÇm virus viêm gan B m¿n 63

Bảng 3.8 Đa hình PD-1.9 ç nhóm bÉnh nhân nhiÇm virus viêm gan B m¿n tính và ng°åi khåe m¿n 65

Bảng 3.9 Đa hình PD-1.9 ç các nhóm bÉnh nhân nhiÇm virus viêm gan B m¿n tính 66

Bảng 3.10 Đa hình rs2297136 ç nhóm bÉnh nhân và ng°åi khåe m¿nh 68

Bảng 3.11 Đa hình rs2297136 ç các nhóm bÉnh nhân nhiÇm virus viêm gan B m¿n 69

Bảng 3.12 Đa hình rs4143815 ç nhóm bÉnh nhân và ng°åi khåe m¿nh 71

Bảng 3.13 Đa hình rs4143815 ç các nhóm bÉnh nhân nhiÇm virus viêm gan B m¿n 72

Bảng 3.14 Phân bç haplotype ç nhóm bÉnh nhân nhiÇm HBV m¿n và nhóm ng°åi khåe m¿nh 73

Bảng 3.15 Mçi liên quan giăa các haplotype PD-1.5/1.9 vãi các thÅ bÉnh cąa bÉnh nhân nhiÇm HBV m¿n tính 74

HBV m¿n 75Bảng 3.17 Phân bç các haplotype điÅn hình ç các nhóm bÉnh nhân nhiÇm

virus viêm gan B m¿n tính 76Bảng 3.18 Mçi liên quan haplotype PD-1.1, PD1.5 và PD-1.9 vãi các thÅ

bÉnh ç bÉnh nhân nhiÇm HBV m¿n 77Bảng 3.19 Phân bç haplotype gen PD-L1 ç nhóm ng°åi khåe m¿nh và nhóm

bÉnh nhân nhiÇm virus viêm gan B m¿n 78

Hình 1.1 Cấu trúc phân tā cąa virus viêm gan B 5

Hình 1.2 Các pha cąa nhiÇm virus viêm gan B m¿n tính 6

Hình 1.3 TiÁn triÅn lâm sàng ç bÉnh nhân nhiÇm virus viêm gan B 7

Hình 1.4 Đáp ćng miÇn dách trong nhiÇm virus viêm gan B 11

Hình 1.5 Thuçc điÃu trá nhiÇm HBV m¿n tính đã đ°āc chấp nhận 16

Hình 1.6 Tín hiÉu PD-1 ćc chÁ sự ho¿t hóa cąa tÁ bào lympho T 19

Hình 3.4 Hình ảnh đ¿i diÉn giải trình tự gen xác đánh tính đa hình PD-1.5 61

Hình 3.5 Hình ảnh đ¿i diÉn giải trình tự gen xác đánh tính đa hình PD-1.9 64

Hình 3.6 Hình ảnh điÉn di sản ph¿m PCR đ¿i diÉn xác đánh kiÅu gen rs2297136 67

Hình 3.7 Hình ảnh đ¿i diÉn giải trình gen xác đánh tính đa hình rs2297136 67

Hình 3.8 Hình ảnh điÉn di sản ph¿m PCR đ¿i diÉn xác đánh kiÅu gen rs4143815 70

Hình 3.9 Hình ảnh đ¿i diÉn giải trình tự gen xác đánh tính đa hình rs4143815 70

Hình 3.10 Néng đá sPD-1 ç nhóm bÉnh nhân và nhóm ng°åi khåe m¿nh, trong nhóm nhiÇm HBV m¿n tính 79

nhân nhiÇm HBV m¿n tính 80 Hình 3.12 Néng đá protein sPD-1 ç các nhóm APRI và Fib-4 81

Hình 3.13 Néng đá protein sPD-L1 giăa các nhóm nghiên cću 81

Hình 3.14 Néng đá protein sPD-L1 ç các nhóm AST, ALT, Bilirubin toàn

phần, Bilirubin trực tiÁp, tiÅu cầu, prothrombin 82 Hình 3.15 Néng đá sPD-L1 ç các nhóm theo phân lo¿i Child-Pugh và 83

Hình 3.16 Mçi t°¢ng quan giăa néng đá sPD-1 và sPD-L1 84 Hình 3.17 Mçi liên quan giăa đa hình PD-1.1, PD-1.5, PD-1.9 vãi néng đá

protein sPD-1 85

Hình 3.18 Mçi liên quan giăa đa hình gen rs2297136 và rs4143815 vãi néng

đá protein sPD-L1 86

Đ¾T VÂN ĐÂ

Virus viêm gan B (HBV) là mát trong nhăng tác nhân gây bÉnh phổ biÁn nhất trên toàn cầu Theo °ãc tính cąa tổ chćc y tÁ thÁ giãi có khoảng 3,5% dân sç toàn cầu nhiÇm virus viêm gan B.1 ViÉt Nam là mát trong nhăng n°ãc có tỷ lÉ nhiÇm virus viêm gan B cao nhất thÁ giãi vãi khoảng 10% dân sç bá nhiÇm HBV dÁn đÁn tỷ lÉ tā vong cao do các biÁn chćng cąa bÉnh nh° suy gan cấp trên nÃn viêm gan m¿n tính, x¢ gan (XG) và ung th° biÅu mô tÁ bào gan (HCC).2, 3

Trong c¢ chÁ bÉnh sinh cąa nhiÇm HBV, đáp ćng miÇn dách tÁ bào đóng vai trò quan trãng nhất thông qua ho¿t đáng cąa tÁ bào lympho T TÁ bào lympho T đóng vai trò nÃn tảng trong viÉc lo¿i bå virus.4-8 Sự suy giảm chćc năng miÇn dách cąa tÁ bào lympho T là c¢ chÁ chính dÁn đÁn sự tén t¿i dai dẳng cąa HBV trong c¢ thÅ và sự phát triÅn x¢ gan, ung th° gan sau thåi gian dài nhiÇm HBV Sự suy giảm chćc năng miÇn dách tÁ bào lympho T gây ra bçi sự biÅu hiÉn quá mćc cąa các phân tā ćc chÁ điÅm kiÅm soát tín hiÉu miÇn dách nh°: PD-1/PD-L1, 2B4, TIM-3, CTLA-4&9-11 Trong đó, con đ°ång tín hiÉu PD-1/PD-L1 (programmed cell death-1/ programmed cell death ligand-1) đ°āc cho là có vai trò quan trãng trong c¢ chÁ dÁn đÁn sự suy giảm chćc năng tÁ bào T trong nhiÇm HBV m¿n tính.12, 13

PD-1 là mát receptor ćc chÁ miÇn dách đ°āc biÅu hiÉn trên bà m¿t nhiÃu lo¿i tÁ bào miÇn dách và mát sç tÁ bào ung th°.14 Phçi tā PD-L1 cąa nó là các protein xuyên màng Khi PD-1 gắn vãi PD-L1 s¿ t¿o ra tín hiÉu ćc chÁ sự ho¿t hóa tÁ bào lympho T bằng nhiÃu quá trình và tín hiÉu sinh hãc nái bào khác nhau.14 Gần đây, mát sç nghiên cću đã chćng minh rằng ngoài d¿ng gắn màng, protein PD-1 và PD-L1 còn có d¿ng hòa tan (sPD-1, sPD-L1) cũng có ho¿t tính sinh hãc.15, 16 Néng đá sPD-1, sPD-L1 có liên quan vãi mćc đá n¿ng và tiên l°āng trong nhiÃu lo¿i ung th° 16,17

Sự ho¿t hóa ćc chÁ miÇn dách cąa con đ°ång tín hiÉu PD-1/PD-L1 dÁn tãi sự suy giảm chćc năng miÇn dách tÁ bào lympho T là c¢ chÁ chính quyÁt đánh sự tiÁn triÅn thành m¿n tính và các biÁn chćng cąa nhiÇm HBV Các biÁn thÅ di truyÃn có thÅ làm thay đổi cấu trúc cąa gen ho¿c ảnh h°çng tãi viÉc t°¢ng tác vãi các yÁu tç phiên mã do đó làm ảnh h°çng tãi sç l°āng, chćc năng cąa protein do gen mã hóa Vì vậy, các biÁn thÅ di truyÃn cąa gen

có liên quan vãi tính nh¿y cảm và tiÁn triÅn cąa bÉnh gan trong nhiÇm HBV.18, 19 Trong khi đó trên thÁ giãi có mát vài nghiên cću đánh giá mçi liên quan giăa biÁn thÅ di truyÃn gen PDCD1 vãi tiÁn triÅn cąa bÉnh lý gan trong

nhiÇm virus viêm gan B m¿n tính,20, 21 ch°a có nghiên cću nào và vai trò cąa biÁn thÅ gen CD274 æ ViÉt Nam, ch°a có nghiên cću nào và vai trò cąa biÁn

thÅ di truyÃn gen PDCD1, CD274 cũng nh° néng đá protein sPD-1, sPD-L1

Do đó, chúng tôi thực hiÉn đà tài <Nghiên cứu một số đa hình đơn gen

măc tiêu:

người khỏe mạnh

ở bệnh nhân nhiễm virus viêm gan B mạn tính

M¿t khác, XG và HCC là nguyên nhân ngày càng gia tăng gánh n¿ng bÉnh tật và tā vong trên toàn thÁ giãi.25 XG và HCC do nhiÇm HBV m¿n tính đã và đang là mát vấn đà y tÁ rất nghiêm trãng ç các n°ãc châu Á vì tỷ lÉ nhiÇm HBV rất cao Khoảng 80% các tr°ång hāp HCC ç nhăng khu vực này là do nhiÇm HBV.26 Đáng chú ý là phần lãn tr°ång hāp nhiÇm virus tÿ khi mang thai ho¿c giai đo¿n sãm cąa thåi th¢ ấu, mát sç bÉnh nhân có thÅ nhiÇm tiÁp virus khác ç giai đo¿n sau cąa cuác đåi Các đ¿c điÅm này đÃu là yÁu tç nguy c¢ cao dÁn tãi hậu quả lâm sàng xấu H¢n năa, nhăng n°ãc ç khu vực này hầu hÁt có thu nhập quçc gia tính trên đầu ng°åi ç mćc thấp tãi trung bình.27

Do đó, chi phí cho viÉc điÃu trá nhiÇm virus viêm gan B lâu dài thực sự là mát gánh n¿ng đçi vãi nÃn y tÁ cũng nh° vãi xã hái

1.1.1 Virus viêm gan B (Hepatitis B virus, HBV)

HBV thuác hã Hepadnaviridae, gém các virus chća chußi DNA nhå, có vå, có ái tính vãi gan, có dải vật chą hẹp Hã Hepanaviridae gém 2 nhánh khác nhau và kiÅu gen: avihepadnaviridae và orthohepadnaviridae Avihepadnavirus lây nhiÇm cho vát (duck HBV hay DHBV), diÉc (heron HBV) và chim Orthohepadviridae nhiÇm cho đáng vật có vú, gém HBV gây bÉnh cho ng°åi và WHV (Woodchuck hepatitis virus) gây bÉnh cho chuát chũi.22 Do thiÁu ho¿t tính đãc và sāa bản nháp có thÅ phiên mã ng°āc dÁn tãi sự đát biÁn th°ång xuyên cąa các kiÅu gen cąa virus, vì vậy tén t¿i đéng thåi các virus khác biÉt và kiÅu gen trong các cá thÅ bá nhiÇm, đ°āc gãi là

ćng miÇn dách ho¿c thuçc kháng virus t¿o ra các đát biÁn HBV có khả năng l¿n trçn đáp ćng miÇn dách HBV có ít nhất 8 kiÅu gen, đ°āc ký hiÉu tÿ A đÁn H vãi sự khác biÉt và gen trên 8% nh°ng d°ãi 17% giăa mßi tuyp.28,29 Typ thć 9 (typ I) có sự khác và kiÅu gen khoảng 8% vãi typ C làm cho viÉc phân lo¿i nó thành mát typ riêng vÁn còn gây tranh cãi Typ 10 là J đ°āc mô tả gần đây và d°ång nh° là kÁt quả tÿ sự kÁt hāp giăa kiÅu gen C và HBV Gibbon.30

Các typ HBV phân bç khác nhau giăa các quần thÅ khác nhau, các vùng đáa lý khác nhau, có mçi liên quan giăa kiÅu gen vãi mćc đá n¿ng cąa bÉnh và đáp ćng điÃu trá Ví dă kiÅu gen C phổ biÁn ç ng°åi châu Á, liên quan vãi bÉnh n¿ng h¢n và đáp ćng vãi điÃu trá bằng interferon kém h¢n.31,32

DNA cąa HBV có d¿ng vòng không ch¿t (relaxed-circular DNA genome), chußi đôi mát phần, mã hóa cho 4 khung đãc mç chéng lấn Khung đãc mç lãn nhất mã hóa polymerase cąa virus, có ho¿t tính phiên mã ng°āc Khung lãn thć hai mã hóa 3 protein vå cąa virus: S, M và L là các kháng nguyên bà m¿t HBsAg Mát khung đãc mç khác mã hóa cho precore, liên quan vãi kháng nguyên E cąa virus (HBeAg) và protein lõi t¿o thành vå capsid cąa virus Cuçi cùng, khung nhå nhất mã hóa protein X (HBx), mát

protein điÃu chßnh nhå cần cho sự nhân lên cąa virus in vitro và in vivo.33

Hình 1.1 CÃu trúc phân tċ cąa virus viêm gan B 22

(A) HÉ gen cąa HBV Chußi đôi mát phần gắn vào protein polymerase rcDNA (relaxed circular DNA)

(B) S¢ đé thÅ hiÉn bản chất chéng lấn cąa khung đãc mç cąa HBV (C) Virion cąa virus HBV tr°çng thành (mảnh Dane)

1.1.2 Sinh lý bÉnh trong nhiÇm virus viêm gan B

Khi nhiÇm HBV, c¢ thÅ có thÅ có viêm gan ho¿c có thÅ không có triÉu chćng NhiÇm virus viêm gan B ç ng°åi tr°çng thành 95% có khả năng tự lo¿i bå virus trong vòng 6 tháng Ng°āc l¿i, trẻ nhiÇm virus trong giai đo¿n 1 đÁn 5 tuổi thì 30 đÁn 90% chuyÅn thành nhiÇm m¿n tính.34 Trong nhiÇm virus cấp, đáp ćng cąa hÉ miÇn dách vãi HBV là hiÉu quả và đúng thåi điÅm ViÉc lo¿i bå virus liên quan vãi sự đáp ćng cąa tÁ bào T m¿nh m¿ t¿o ra tác đáng kháng virus theo cả c¢ chÁ phă thuác và không phă thuác hąy tÁ bào Khi nhiÇm cấp tính chuyÅn thành m¿n tính, có sự suy yÁu tiÁn triÅn và chćc năng tÁ bào T đ¿c hiÉu HBV.35

NhiÇm HBV m¿n là mát quá trình đáng hãc phản ánh sự t°¢ng tác giăa sự nhân lên cąa HBV và đáp ćng miÇn dách cąa vật chą DiÇn biÁn cąa nhiÇm HBV m¿n đ°āc chia ra d°ãi d¿ng biÅu đé thành 5 pha

Hình 1.2 Các pha cąa nhiÇm virus viêm gan B m¿n tính.36

DiÇn biÁn cąa bÉnh nhân nhiÇm HBV m¿n không nhất thiÁt theo thć tự tÿ pha 1 đÁn pha 5 Sự ho¿t hóa các c¢ chÁ miÇn dách đÅ lo¿i bå virus đéng thåi gây viêm và ho¿i tā mô gan Quá trình này diÇn ra không liên tăc Mát bÉnh nhân nhiÇm HBV m¿n tính có thÅ chuyÅn đổi giăa các pha có ho¿t tính miÇn dách và bất ho¿t vài lần trong suçt cuác đåi Sự l¿p l¿i các giai đo¿n ho¿t đáng miÇn dách dÁn tãi tổn th°¢ng x¢ hóa và ung th° biÅu mô tÁ bào gan.37

Nguy c¢ tiÁn triÅn thành x¢ gan và ung th° gan thì rất khác nhau giăa các cá thÅ và cháu ảnh h°çng phần lãn bçi đáp ćng miÇn dách cąa vật chą Khoảng 30% bÉnh nhân viêm gan B m¿n tính s¿ phát triÅn thành x¢ gan Nguy c¢ HCC cąa bÉnh nhân x¢ gan là 2-5% mßi năm, là mçi lo ng¿i chính hiÉn nay đçi vãi bÉnh nhân viêm gan B m¿n.38

HuyÁt t°¢ng

Hình 1.3 TiÁn triÅn lâm sàng å bÉnh nhân nhiÇm virus viêm gan B.38

Nguy c¢ phát triÅn HCC cao h¢n ç các bÉnh nhân vãi mát ho¿c nhiÃu yÁu tç liên quan tãi vật chą (x¢ gan, viêm ho¿i tā gan m¿n, tuổi già h¢n, giãi nam, chąng tác châu Phi, nghiÉn r°āu, đéng nhiÇm m¿n tính virus viêm gan khác ho¿c HIV, tiÅu đ°ång ho¿c hái chćng chuyÅn hóa, hút thuçc, tiÃn sā gia đình d°¢ng tính) và/ho¿c vãi HBV (HBV DNA cao và/ ho¿c HBsAg cao, kiÅu gen HBV chuyÅn tÿ C>B, đát biÁn đ¿c hiÉu).35 NhiÃu nghiên cću và yÁu tç gen cąa vật chą đã cho thấy đa hình gen cąa vật chą có thÅ ảnh h°çng tãi viÉc nhiÇm HBV, tiÁn triÅn bÉnh, đáp ćng vãi vaccine và đáp ćng vãi thuçc kháng virus nh° đa hình ç các gen mã hóa HLA (human leukocyte antigens)39, cytokine, chemokine, toll like receptor, microRNAs, gen liên quan vãi vitamin D, NTCP (Natri taurocholate cotransporting polypeptide).40

1.1.3 Đáp ćng miÇn dách trong nhiÇm virus viêm gan B

Gan là c¢ quan duy nhất đ°āc cung cấp bçi cả máu tĩnh m¿ch và đáng m¿ch Dòng máu đáng m¿ch giàu oxy vào gan qua đáng m¿ch gan, tuy nhiên đây là nguén máu nhå cung cấp cho gan Phần lãn máu vào gan đ°āc cung cấp bçi tĩnh m¿ch cāa Dòng máu tÿ tĩnh m¿ch cāa vÿa giàu dinh d°ÿng vÿa chća mầm bÉnh Ngoài chćc năng sản xuất protein, chuyÅn hóa các chất dinh

d°ÿng, lo¿i bå đác tç, gan còn đ°āc thiÁt kÁ đÅ t°¢ng tác tçi đa vãi mầm bÉnh trong máu Vá trí quan trãng cąa gan nằm phía d°ãi đ°ång đi cąa hÉ tiêu hóa, vì vậy đáp ćng miÇn dách trong gan t¿o ra mát cân bằng phćc t¿p giăa dung n¿p đçi vãi nhăng cái không gây h¿i và miÇn dách vãi mầm bÉnh Mát đ¿c điÅm quan trãng là ç gan tÁ bào lympho T, tÁ bào trình diÉn kháng nguyên m¿c dù có thÅ ho¿t hóa, nhân dòng nh°ng l¿i không đ°āc khuyÁn khích chćc năng đáp ćng, nhằm tránh gây tổn th°¢ng c¢ quan nÁu đáp ćng miÇn dách m¿nh m¿ chçng l¿i các kháng nguyên thông th°ång tÿ thćc ăn và các vi sinh vật bình th°ång cąa đ°ång tiêu hóa Hay nói cách khác gan thiên và dung n¿p miÇn dách Môi tr°ång thiÁu miÇn dách này đ°āc thÅ hiÉn rõ nhất vãi thành công cąa ghép gan và sự khai thác môi tr°ång này bçi mát sç virus nh°: HBV, HCV dÁn tãi viêm gan m¿n tính.41

Khi virus viêm gan B xâm nhập vào c¢ thÅ, c¢ thÅ vật chą phản ćng l¿i bằng cả đáp ćng miÇn dách tự nhiên (đáp ćng miÇn dách không đ¿c hiÉu) và đáp ćng miÇn dách thu đ°āc (đáp ćng miÇn dách đ¿c hiÉu)

1.1.3.1 Đáp ứng miễn dịch tự nhiên

Đáp ćng miÇn dách tự nhiên th°ång đóng vai trò trung gian sau nhiÇm đÅ h¿n chÁ sự lan ráng cąa mầm bÉnh và kích ho¿t đáp ćng miÇn dách thu đ°āc Các tÁ bào NK, đ¿i thực bào, tÁ bào gai& nhå các receptor khuôn mÁu nh°: Toll-like receptor, RNA helicase, receptor protein kinase&nhận ra các yÁu tç đ¿c hiÉu cąa mầm bÉnh nh° chußi RNA, lipopolysaccharide ç vå, peptidoglycan& cảm ćng sản xuất interferon typ I (IFNs) và sản xuất các cytokine khác ho¿t hóa đáp ćng miÇn dách và thúc đ¿y viÉc lo¿i bå virus.34

Đáp ćng miÇn dách tự nhiên cąa vật chą trong pha sãm cąa nhiÇm virus đ°āc đ¿c tr°ng bçi viÉc sản xuất interferon typ I (IFN α/³) và ho¿t hóa cąa tÁ bào diÉt tự nhiên (NK).42 Sự ho¿t hóa tÁ bào NK, NKT sản xuất IFN ´ ćc chÁ quá trình tái sinh cąa virus ngay t¿i chß và tránh lan ra các tÁ bào xung quanh, do đó h¿n chÁ sự lan tràn cąa virus TÁ bào gan, tÁ bào Kupffer sau khi ho¿t hóa

s¿ sản xuất các chemokine khác nhau Chúng thu hút các tÁ bào đ¢n nhân, đ¿i thực bào, NK, NKT và tÁ bào T vào gan dÁn tãi sản xuất mát l°āng lãn TNF-α, ngoài ra còn IFN-´, TNF-³, IL-10 (các cytokine đác tÁ bào) Đây cũng là nguyên nhân chính dÁn tãi tổn th°¢ng gan.34

1.1.3.2 Đáp ứng miễn dịch thu được

Đáp ćng miÇn dách dách thÅ đóng vai trò chą yÁu khi virus còn ç ngoài tÁ bào Vì vậy nó quan trãng trong giai đo¿n sãm vãi vai trò ngăn sự kÁt hāp cąa virus vãi receptor t°¢ng ćng, ngăn hòa màng giăa vå virus và màng tÁ bào Đôi khi chúng không có tác dăng tiêu diÉt vì chúng chß chçng l¿i các epitope không quan trãng cąa virus Đáp ćng miÇn dách tÁ bào là ph°¢ng thćc bảo vÉ chính cąa c¢ thÅ chçng l¿i virus Khi virus vào c¢ thÅ nó bá các tÁ bào trình diÉn kháng nguyên (đ¿i thực bào, tÁ bào gai, lympho B) bắt, chÁ biÁn t¿o nên các đo¿n peptide kháng nguyên đ¿c tr°ng cho virus Các kháng nguyên này đ°āc gắn vãi phân tā MHC-I trong bào t°¢ng cąa tÁ bào trình diÉn kháng nguyên Sau đó phćc hāp MHC-kháng nguyên đ°āc đ°a ra bà m¿t tÁ bào, trình kháng nguyên cho tÁ bào lympho T TÁ bào lympho T sau khi gắn vãi kháng nguyên s¿ đ°āc ho¿t hóa, phân chia, biÉt hóa t¿o thành dòng tÁ bào lympho T phù hāp đÅ lo¿i bå kháng nguyên (pha méi) Sau khi đ°āc ho¿t hóa, tÁ bào T ho¿t hóa s¿ tãi tÁ bào đích (tÁ bào mang virus) và tấn công tÁ bào đích bằng các c¢ chÁ đ¿c hiÉu (pha ho¿t đáng)

NhiÇm HBV ho¿t hóa cả lympho TCD4+ và TCD8+ TCD4+ nhận ra epitope kháng nguyên lõi cąa HBV, ho¿t hóa phân chia, biÉt hóa thành Th17 sản xuất IL-17 cảm ćng tÁ bào biÅu mô sản xuất chemokine thu hút b¿ch cầu đa nhân tãi vá trí nhiÇm Đéng thåi TCD4+ còn tiÁt IL-2 giúp TCD8+ đ°āc ho¿t hóa dÇ dàng h¢n æ các bÉnh nhân HBV, sç l°āng tÁ bào Th17 tăng đáng kÅ trong máu và gan, đ°āc đéng hành bçi tăng mćc IL-17 và IL-22 trong máu.12 Đéng thåi Th1 sản xuất cytokine IFN-´ và TNF-α.43

TÁ bào TCD8+ khi đ°āc ho¿t hĩa s¿ phân chia và biÉt hĩa thành tÁ bào T gây đác (cytotoxic T cell hay Tc) Nĩ tiêu diÉt tÁ bào mang virus bằng cách giải phĩng perforin (giúp granzyme vào tÁ bào đích), granzyme (các pro-protease đ°āc ho¿t hĩa bên trong tÁ bào đÅ kích ho¿t apoptosis cąa tÁ bào đích), IFN-gamma (ngăn ch¿n sự nhân lên/giÁt virus) Chúng cũng mang phân tā tác đáng gắn màng Fas ligand (CD178), gắn vãi Fas (CD95) trên tÁ bào đích làm ho¿t hĩa apoptosis ç tÁ bào mang Fas

TÁ bào TCD8+ đ¿c hiÉu HBV cĩ vai trị nÃn tảng trong viÉc lo¿i bå virus và trong tiÁn triÅn cąa nhiÇm HBV Nghiên cću trên tÁ bào ng°åi cho thấy tÁ bào TCD8+ ćc chÁ sự nhân lên cąa HBV bằng cả c¢ chÁ phá hąy tÁ bào và c¢ chÁ khơng phá hąy tÁ bào Trong quá trình khơng phá hąy tÁ bào, TCD8 nạve, TCD8+ ho¿t hĩa di c° tãi gan Khi tãi gan, tÁ bào TCD8+ đ¿c hiÉu HBV và tÁ bào miÇn dách tự nhiên khơng đ¿c hiÉu HBV (đ¿i thực bào) trç nên ho¿t hĩa, sản xuất IFN-´ và TNF-α làm ćc sự nhân lên cąa HBV trong tÁ bào gan nhiÇm, dÁn tãi viÉc lo¿i bå virus mà khơng làm tổn th°¢ng tÁ bào.44 Chćc năng kháng HBV theo c¢ chÁ hąy tÁ bào đ°āc thực hiÉn bçi tính gây đác cąa TCD8+ Khi so sánh hiÉu quả cąa hai c¢ chÁ này, thấy rằng sự ćc chÁ nhân lên cąa HBV bằng c¢ chÁ khơng gây phá hąy tÁ bào hiÉu quả h¢n.44 M¿c dù, tÁ bào TCD8+ cĩ thÅ cảm ćng tÁ bào chÁt theo ch°¢ng trình nh°ng tổn th°¢ng gan chą yÁu gây ra bçi các tÁ bào viêm khơng đ¿c hiÉu HBV Tÿ các kÁt quả này cho rằng cĩ c¢ chÁ đÅ kiÅm sốt sự cân bằng giăa chćc năng gây đác tÁ bào và khơng gây đác tÁ bào cąa tÁ bào TCD8+ ViÉc duy trì sự cân bằng này là vai trị cąa con đ°ång PD-1 Con đ°ång này liên quan vãi tăng c°ång dung n¿p cąa tÁ bào T trong nhiÃu lo¿i nhiÇm virus m¿n tính nh°: lymphocytic choriomeningitis virus, HIV, HBV, HCV Cĩ mát sç bằng chćng cho thấy ch¿n con đ°ång PD-1/PD-L1 cĩ thÅ thay đổi sự cân bằng giăa chćc năng gây đác tÁ bào và chćc năng khơng gây đác tÁ bào cąa tÁ bào TCD8+ đáp ćng, dÁn tãi làm giảm tổn th°¢ng mơ do miÇn dách.44

Sau pha cấp, mát sç tÁ bào TCD8+ đ¿c hiÉu HBV biÉt hĩa thành tÁ bào TCD8+ nhã, đÅ ngăn viÉc tái nhiÇm HBV trong t°¢ng lai Tuy nhiên, trong nhiÇm HBV m¿n- là tình tr¿ng phổ biÁn nhất cąa virus này, tÁ bào TCD8+ đ¿c hiÉu HBV bá suy giảm chćc năng miÇn dách, biÅu hiÉn sự ćc chÁ và chćc năng, thậm chí chÁt theo ch°¢ng trình.12

Hình 1.4 Đáp ćng miÇn dách trong nhiÇm virus viêm gan B 45

Vậy tình tr¿ng suy kiÉt cąa tÁ bào lympho T là gì? Bình th°ång sau pha nhiÇm cấp tính, các tÁ bào lympho T s¿ trç thành tÁ bào T nhã mang mát sç đ¿c điÅm giúp phân biÉt chúng vãi tÁ bào T nạve gém: chćc năng đáp ćng phản ćng nhanh sau khi đçi m¿t l¿i vãi kháng nguyên, cĩ l¿i khả năng trç và mơ lympho thć hai, tiÃm năng sinh sơi lãn và cĩ khả năng tén t¿i lâu mà khơng cĩ kháng nguyên thơng qua sự phân chia ổn đánh nái mơi nhå IL-17, IL-15 Các đ¿c tính này đ¿t đ°āc dần dần theo thåi gian giúp tÁ bào T nhã thực hiÉn miÇn dách bảo vÉ.46 Tuy nhiên, trong nhiÃu lo¿i nhiÇm m¿n tính và

ung th° thấy có sự suy kiÉt chćc năng cąa tÁ bào lympho T Đây là tình tr¿ng đ¿c tr°ng bçi ho¿t tính gây đác cąa tÁ bào lympho T kém, xóa tÁ bào TCD4+ và TCD8+ đ¿c hiÉu virus, thay đổi tỷ lÉ giăa cytokine duy trì tÁ bào T (IL-2) và cytokine ćc chÁ (IL-10, TGF-³) KÁt quả làm nhấn chìm đáp ćng cąa tÁ bào T đ¿c hiÉu virus.13 Sự suy kiÉt chćc năng cąa tÁ bào lympho T tiÁn triÅn dần dần: đầu tiên là mất khả năng sản xuất IL-2 (mát cytokine giúp sinh sôi tÁ bào T), tiÁp theo tÁ bào T mất ho¿t tính gây đác, giảm sản xuất TNF-α và IFN-´.13 Nh° vậy trong nhiÇm m¿n tính, tÁ bào T không chß thay đổi và kiÅu hình mà còn thay đổi và chćc năng Cuçi cùng, các tÁ bào T suy kiÉt này chÁt theo ch°¢ng trình do không biÉt hóa thành tÁ bào T nhã đ°āc.43

Nguyên nhân suy kiÉt tÁ bào lympho T trong viêm gan B m¿n tính gém: Ph¢i nhiÇm kéo dài vãi kháng nguyên virus làm giảm sç l°āng, chćc năng cąa tÁ bào TCD8+ đ¿c hiÉu virus

Sự biÅu hiÉn cąa các lo¿i receptor ćc chÁ trên bà m¿t tÁ bào lympho T nh°: PD-1, lymphocyte activation gene-3 (LAG-3),43 cytotoxic T lymphocyte-associated antigen-4 (CTLA-4), CD244& Ng°åi ta cho rằng mßi receptor ćc chÁ điÃu khiÅn các chćc năng tÁ bào khác nhau Nh° con đ°ång PD-1 có tác đáng m¿nh lên sự tén t¿i và /ho¿c sinh sôi cąa tÁ bào TCD8+ suy kiÉt LAG-3 ảnh h°çng tãi tiÁn triÅn cąa chu kỳ tÁ bào nh°ng ít ảnh h°çng tãi sự tén t¿i cąa tÁ bào và apoptosis&

Mát c¢ chÁ khác liên quan vãi kích thích các tÁ bào điÃu hòa miÇn dách: tÁ bào CD4+ CD25+ Foxp3+ Treg (tÁ bào Treg) ćc chÁ tÁ bào T trā giúp đ¿c hiÉu HBV (HBV-specific T helper cells) æ nhăng bÉnh nhân nhiÇm HBV m¿n tính, các tÁ bào Tregs ho¿t đáng m¿nh và tăng sç l°āng trong máu ngo¿i vi so vãi nhóm chćng Sự hiÉn diÉn cąa các tÁ bào Tregs đ¿c hiÉu HBV đóng vai trò quan trãng vào đáp ćng miÇn dách không đầy đą, không hiÉu quả đÅ tiêu diÉt virus và dÁn đÁn tình tr¿ng nhiÇm m¿n tính.47-49 Sự suy kiÉt cąa tÁ bào lympho T làm cản trç sự lo¿i bå virus và sự héi phăc sau viêm gan

Đáp ćng miÇn dách không đầy đą trong nhiÇm virus viêm gan B m¿n tính dÁn tãi sự tén t¿i lâu dài cąa virus trong c¢ thÅ sinh ra x¢ gan và ung th° biÅu mô tÁ bào gan Nh° ç trên đã trình bày tÁ bào TCD8 đ¿c hiÉu HBV đóng vai trò quan trãng nhất trong viÉc tiêu diÉt virus Ban đầu tÁ bào TCD8 diÉt tÁ bào gan nhiÇm HBV bằng cách cảm ćng tÁ bào gan chÁt theo ch°¢ng trình thông qua c¢ chÁ phă thuác perforin và Fas Nhăng tÁ bào gan bá chÁt theo ch°¢ng trình s¿ nhanh chóng đ°āc lo¿i bå bçi tÁ bào Kuffer Tuy nhiên, khi virus vÁn tăng lên, ç giai đo¿n tiÁn triÅn tÁ bào Kupffer bá ho¿i tā thć phát giải phóng các kháng nguyên liên quan vãi tổn th°¢ng thu hút b¿ch cầu đa nhân trung tính vãi ổ viêm ho¿i tā B¿ch cầu đa nhân trung tính ho¿t hóa giải phóng các chất trung gian viêm thu hút mát sç l°āng lãn tÁ bào đ¢n nhân (bao gém tÁ bào lympho T, B, NK, NKT, tÁ bào gai&) tãi ổ viêm Sự thâm nhiÇm sç l°āng lãn các tÁ bào đ¢n nhân là nguyên nhân chính dÁn tãi các tổn th°¢ng gan.44 Sự ho¿i tā tÁ bào gan dÁn tãi tăng sinh tÁ bào thay thÁ cho tÁ bào chÁt Trong quá trình này sự tích tă chất nÃn ngo¿i bào trong môi tr°ång viêm làm giảm sç l°āng và kích th°ãc các cāa sổ cąa tÁ bào nái mô hình sin, dÁn tãi giảm tính đàn héi cąa gan TÁ bào hình sao ho¿t hóa các con đ°ång tăng sinh m¿ch tr°ãc tình tr¿ng thiÁu oxy t¿i ổ viêm, tăng giải phóng chemokine và các chất hóa ćng đáng b¿ch cầu KÁt quả hình thành sẹo x¢ thay thÁ cho mô bá tổn th°¢ng và quá trình x¢ hóa gan tiÁp tăc tiÁn triÅn X¢ gan là giai đo¿n cuçi cąa quá trình x¢ hóa đ°āc đ¿c tr°ng bçi sự hình thành tÿng b°ãc các vòng x¢ xung quanh các khçi tÁ bào gan X¢ gan điÅn hình th°ång tiÁn triÅn hàng năm tãi hàng chăc năm mãi có biÅu hiÉn rõ ràng và lâm sàng.50

Viêm gan m¿n dÁn tãi tăng xâm lấn cąa các tÁ bào miÇn dách, ho¿t hóa tÁ bào sao, t¿o ra vi môi tr°ång bÉnh lý, tăng các thành phần collagen bÉnh lý, các protein chất nÃn ngo¿i bào, yÁu tç phát triÅn và cytokine dÁn tãi x¢ gan và có thÅ hình thành chất nÃn tiÃn ung th°.51 Ho¿i tā tÁ bào gan hậu quả là tái t¿o

dÁn tãi x¢ gan, ung th° gan Sự nhân lên liên tăc cąa tÁ bào gan có thÅ làm lan ráng cąa các tổn th°¢ng sinh ung th°.52 Tuy nhiên, ç bÉnh nhân nhiÇm HBV m¿n tính có thÅ tiÁn triÅn thành ung th° gan mà không qua x¢ gan Virus viêm gan B có thÅ cảm ćng sinh ung th° theo mát sç c¢ chÁ Thć nhất, sự tích hāp kiÅu gen cąa HBV vào DNA cąa vật chą có liên quan vãi viÉc xóa các đo¿n DNA nhå chća các gen liên quan đÁn ung th°: đo¿n phiên mã ng°āc ç đầu mút NST (telomerase reverse transcriptase (TERT), platelet-derived-growth-factor receptor-³ (PDGFR ³), PDGF ³ and mitogen activated protein kinase 1 (MAPK1) & Thć 2 là ho¿t tính ho¿t hóa phiên mã cąa HBx có thÅ thay đổi sự biÅu hiÉn cąa các gen kiÅm soát phát triÅn nh° SRC tyrosine kinase, Ras, Raf, MAPK, ERK, JNK & Cuçi cùng HBx có thÅ gắn và ćc chÁ p53- yÁu tç ćc chÁ mô vì vậy tăng sinh tÁ bào và thåa hiÉp các điÅm kiÅm soát tổn th°¢ng DNA TiÃm năng sinh ung th° gan cąa HBx đã đ°āc khẳng đánh trên thí nghiÉm ç chuát chuyÅn gen HBx thấy 90% phát triÅn HCC C¢ chÁ khác sinh HCC đ°āc cảm ćng bçi HBV có thÅ bắt nguén tÿ sự t°¢ng tác vật lý giăa virus và hÉ thçng çng nái bào gây ra stress cąa hÉ thçng çng nái bào và cuçi cùng cảm ćng stress oxy hóa, thúc đ¿y các con đ°ång tín hiÉu cąa sự tén t¿i và phát triÅn, gây ra các đát biÁn thông qua viÉc t¿o ra các gçc tự do và ho¿t hóa các tÁ bào sao Tóm l¿i, HBV có thÅ gây ra tr¿ng thái tiÃn ung th°, ung th° gan thông qua nhiÃu c¢ chÁ.52

1.1.4 ChÇn đoán và điÃu trá nhiÇm virus viêm gan B

Ch¿n đoán nhiÇm HBV m¿n theo <H°ãng dÁn ch¿n đoán và điÃu trá viêm gan virus B-Bá Y tÁ ViÉt Nam- 2014,53 2019=54 Ch¿n đoán các giai đo¿n bÉnh dựa trên triÉu chćng và lâm sàng, xét nghiÉm sinh hóa, xét nghiÉm huyÁt hãc, ch¿n đoán hình ảnh (siêu âm gan đ°ång băng, đo đá đàn héi gan hay Fibroscan đÅ đánh giá mćc đá x¢ gan, hình ảnh chăp cắt lãp vi tính

(CLVT/MRI) và sinh thiÁt gan Ch¿n đoán viêm gan B m¿n tính, x¢ gan, ung th° gan theo <H°ãng ch¿n đoán ch¿n đoán và điÃu trá viêm gan virus B- Bá Y tÁ ViÉt Nam-2014,53 2019=54 và <H°ãng dÁn ch¿n đoán, điÃu trá ung th° gan nguyên phát-Bá Y tÁ ViÉt Nam- 201255, 2020=.56 ViÉc đánh giá mćc đá n¿ng cąa tổn th°¢ng gan là quan trãng đÅ xác đánh các bÉnh nhân cần điÃu trá và theo dõi sự tiÁn triÅn thành x¢ gan và ung th° gan

Chß đánh điÃu trá phă thuác vào các pha khác nhau cąa nhiÇm HBV m¿n tính, đ°āc xác đánh dựa vào néng đá HBV-DNA, ALT huyÁt t°¢ng và mćc đá n¿ng cąa bÉnh gan Mát sç yÁu tç khác cũng cần xem xét gém: tuổi (tuổi già h¢n là mát yÁu tç nên xem xét điÃu trá), tiÃn sā gia đình và ung th° gan, bÉnh kÁt hāp (béo phì, bÉnh gan do r°āu), nguy c¢ truyÃn HBV và các biÅu hiÉn ngoài gan cąa viêm gan B.45, 53, 54 ĐiÃu trá bÉnh nhân nhiÇm HBV m¿n tính nhằm măc đích ćc chÁ lâu dài sự sao chép cąa virus HBV, nâng cao chất l°āng cuác sçng, kéo dài thåi gian sçng, ngăn sự tiÁn triÅn sang x¢ gan, ung th° gan, dự phòng lây truyÃn HBV cho cáng đéng bao gém ngăn truyÃn tÿ mẹ sang con, dự phòng đāt bùng phát cąa viêm gan virus B ĐiÃu trá khåi và chćc năng là HBsAg huyÁt thanh âm tính, nh°ng hiÁm khi đ¿t đ°āc vãi thuçc kháng HBV hiÉn nay Vì vậy, đích thực tÁ h¢n là ćc chÁ virus kéo dài ho¿c duy trì, đ°āc thÅ hiÉn bằng HBV DNA không phát hiÉn đ°āc và chuyÅn đảo huyÁt thanh HBeAg.45 Tÿ đó, khôi phăc chćc năng gan (giá trá ALT quay và bình th°ång), cải thiÉn và mô hãc, ngăn tiÁn triÅn tãi x¢ gan và ung th° gan Vãi măc tiêu đó hiÉn nay có hai nhóm thuçc đ°āc chấp nhận bçi FDA và c¢ quan d°āc châu Âu và nhiÃu n°ãc châu Á trong điÃu trá nhiÇm virus viêm gan B gém: thuçc kháng virus (nucleos(t)ide analogue, NA) và thuçc điÃu hòa miÇn dách

Thuác kháng virus (NA): NA đóng vai trò chą chçt trong điÃu trá

nhiÇm virus viêm gan B m¿n tính ç hầu hÁt các n°ãc ĐÁn nay 6 thuçc đ°āc FDA cấp phép

Hình 1.5 Thuác điÃu trá nhiÇm HBV m¿n tính đã đ°āc chÃp nhÁn.45

Trong đó Entecavir, TDF và TAF là thuçc hàng đầu vì khả năng và tỷ lÉ kháng thuçc thấp Entecavir có các tác dăng phă không đáng kÅ Tuy nhiên, nhăng bÉnh nhân kháng vãi Lamivudine thì TDF và TAF là lựa chãn điÃu trá tçt nhất HBsAg âm tính xuất hiÉn ç 3-11% bÉnh nhân điÃu trá bằng NA NA trực tiÁp ćc chÁ sự nhân lên cąa virus, nh°ng không có tác đáng tãi sự tén t¿i cąa cccDNA (covalently closed circular DNA), do đó khi ngÿng thuçc virus có thÅ phăc héi Vì vậy vãi phần lãn bÉnh nhân phải điÃu trá lâu dài, thậm chí suçt đåi Đéng thåi điÃu trá bằng NA không lo¿i bå hoàn toàn nguy c¢ HCC Vì vậy, khi HBsAg âm tính có thÅ dÿng NA nh°ng vÁn phải theo dõi sự phát triÅn HCC đ¿c biÉt vãi bÉnh nhân trên 50 tuổi ho¿c có x¢ gan 45

LiÉu pháp interferon: IFN-α và PEG-IFN-α

LiÉu pháp interferon vÿa có tác dăng kháng virus vÿa tăng c°ång miÇn dách Tuy nhiên HBsAg âm tính chß đ¿t ç 10% bÉnh nhân điÃu trá sau 1 năm ĐiÃu trá kéo dài h¢n có thÅ có tỷ lÉ đáp ćng cao h¢n nh°ng khó dung n¿p vãi nhiÃu bÉnh nhân BÉnh nhân điÃu trá IFN cần theo dõi ch¿t ch¿ vì thuçc có nhiÃu tác dăng phă: suy nh°āc, sçt, nhiÇm đác giáp& LiÉu pháp interferon chçng chß đánh vãi x¢ gan mất bù æ nhăng bÉnh nhân điÃu trá không liên tăc, hiÉu quả ćc chÁ virus không bằng NA Do tỷ lÉ đáp ćng khiêm tçn, tác dăng phă cần phải xem xét, liÉu pháp IFN chß nên điÃu trá cho nhóm bÉnh nhân đ°āc dự đoán là có đáp ćng tçt vãi thuçc: bÉnh nhân HBeAg d°¢ng tính, HBV typ A, B, bÉnh nhân trẻ, không bÉnh kÁt hāp và HBV DNA thấp

Mát vài nghiên cću đã tiÁn hành đánh giá hiÉu quả kÁt hāp hai lo¿i thuçc trên nh°ng kÁt quả không rõ ràng.45

Nh° vậy, vãi các thuçc điÃu trá truyÃn thçng hiÉn nay viÉc lo¿i hoàn toàn HBV khåi c¢ thÅ nghĩa là lo¿i bå cccDNA và HBV DNA tích hāp ç gan là ch°a đ¿t đ°āc Vì vậy, viÉc điÃu trá nhiÇm virus viêm gan B m¿n tính vÁn còn nhiÃu khó khăn Trong khi đó sự suy yÁu và chćc năng cąa các tÁ bào T đ¿c hiÉu kháng nguyên là mát đ¿c tr°ng đã đ°āc khẳng đánh trong nhiÇm HBV m¿n tính Mát trong các nguyên nhân dÁn tãi sự suy kiÉt cąa các tÁ bào T là sự tăng biÅu hiÉn các receptor ćc chÁ Trong đó con đ°ång PD-1/PD-L1 là con đ°ång ćc chÁ chính liên quan vãi sự suy kiÉt cąa tÁ bào T.46 Khám phá này đã mang l¿i giải th°çng Nobel trong lĩnh vực y hãc cho hai nhà khoa hãc Honjo và Allison năm 2018.57 Khám phá và con đ°ång PD-1 đã mç ra ph°¢ng pháp điÃu trá đích thu hút sự quan tâm lãn trong điÃu trá nhiÇm virus viêm gan B m¿n tính cũng nh° ung th° biÅu mô tÁ bào gan do nhiÇm virus viêm gan B m¿n tính

1.2 CON Đ¯âNG TÍN HIÈU PD-1/PD-L1

Protein PD-1 là mát protein xuyên màng typ I gém 288 a.a đ°āc biÅu hiÉn ç các tÁ bào miÇn dách nh°: tÁ bào lympho T, B, ćc bào đang tr°çng thành, tÁ bào NK, NKT, mát sç tÁ bào dòng tąy, tÁ bào trình diÉn kháng nguyên và mát sç tÁ bào ung th°.14 PD-1 có hai phçi tā là PD-L1 và PD-L2 PD-L1 cũng là mát protein xuyên màng typ I đ°āc biÅu hiÉn ráng bçi nhiÃu lo¿i tÁ bào khác nhau gém cả tÁ bào t¿o máu (tÁ bào T, B, DCs, đ¿i thực bào) và tÁ bào không phải dòng tÁ bào t¿o máu (tÁ bào nái mô m¿ch, tÁ bào nái mô chất nÃn, tÁ bào đảo tăy, tÁ bào keratin, lá nuôi hāp bào) Ng°āc l¿i sự biÅu hiÉn PD-L2 thì giãi h¿n h¢n nhiÃu, biÅu hiÉn chą yÁu ç tÁ bào gai, đ¿i thực bào, quần thÅ tÁ bào B.14 Cả PD-L1 và PD-L2 đÃu có thÅ đ°āc biÅu hiÉn bçi tÁ bào ung th°, nh°ng PD-L1 thì phổ biÁn h¢n.14 Nh° vậy trong hai phçi tā

cąa PD-1 là PD-L1 và PD-L2 thì PD-L1 đ°āc biÅu hiÉn ráng h¢n ç nhiÃu lo¿i tÁ bào ĐiÃu này gāi ý rằng PD-L1 đóng vai trò quan trãng h¢n trong ho¿t đáng cąa con đ°ång tín hiÉu PD-1 Trong các nghiên cću PD-L1 cũng nhận đ°āc nhiÃu sự quan tâm h¢n, vì vậy trong phần này chúng tôi chß đà cập tãi vai trò cąa con đ°ång PD-1/PD-L1

1.2.1 Tín hiÉu thông qua con đ°ãng PD-1/ PD-L1

PD-1 gắn vãi PD-L1 khçi phát các tín hiÉu trong tÁ bào chą yÁu dÁn tãi ćc chÁ 2 con đ°ång chính: PI3K-Atk-mTOR và RAS-MEK-ERK Sự ćc chÁ các con đ°ång này ảnh h°çng tãi sự tiÁn triÅn cąa chu kỳ tÁ bào, sự phát triÅn, biÉt hóa, sự nhân lên và tén t¿i cąa tÁ bào Că thÅ:

PD-1 khi gắn vãi phçi tā, đuôi trong bào t°¢ng cąa PD-1 chća motif ITSM thu nhận SHP-1/2 khi phosphoryl hóa dÁn tãi sự phosphoryl hóa cąa ZAP70 và LCK bá lßi, hậu quả làm ćc chÁ con đ°ång PI3K-AKT-mTOR Ngoài ra PD-1 còn ćc chÁ con đ°ång PI3K-AKT-mTOR thông qua ho¿t tính phosphoryl hóa và phosphatase cąa PTEN Sự ćc chÁ con đ°ång PI3K ćc chÁ tiêu thă oxy làm ảnh h°çng tãi con đ°ång đ°ång phân và giáng hóa glutamine, trong khi đó quá trình này đ°āc tăng lên khi ho¿t hóa tÁ bào T Nó ćc chÁ ty thÅ và chuyÅn hóa a.a trong khi tăng beta-oxy hóa acid béo ViÉc gắn PD-1 cũng liên quan vãi sự tích lũy acid béo không no tÿ đó có thÅ ćc chÁ tính miÇn dách cąa tÁ bào T.58

PD-1 ćc chÁ con đ°ång RAS-MEK-ERK thông qua sự ćc chÁ PLC-´1 KÁt quả làm giảm sự ho¿t hóa cąa các TFs (transcription factors) nh°: protein 1 ho¿t hóa (AP-1 activator protein), NFAT (nuclear factor of activated T cells) và nuclear factor κB (NF-κB) Nhăng yÁu tç này cần cho sự phiên mã và sự ổn đánh mRNA cąa IL-2 (cytokine cần cho sự ho¿t hóa cąa tÁ bào lympho T) 14

Hình 1.6 Tín hiÉu PD-1 ćc chÁ sď ho¿t hóa cąa tÁ bào lympho T.14

Con đ°ång PD-1/PD-L1 điÅn hình có tác đáng tãi sản xuất cytokine (TNF- ´, TNF- α và IL-2) h¢n là tác đáng tãi sự nhân lên cąa tÁ bào Tín hiÉu ćc chÁ qua trung gian PD-1 phă thuác vào đá m¿nh cąa tín hiÉu TCR Sự kích thích cąa TCR ç mćc thấp thì ćc chÁ m¿nh h¢n.59

Tóm l¿i con đ°ång PD-1/PD-L1 ćc chÁ sự ho¿t hóa cąa tÁ bào lympho T bằng nhiÃu cách: làm giảm tín hiÉu TCR và CD28,58 giảm sản xuất cytokine ho¿t hóa (IL-2, IFN-´), tăng cytokine ćc chÁ (IL-10) dÁn tãi giảm sinh sôi, giảm biÉt hóa tÁ bào TCD8+ và TCD4+ (thiÁu TCD4+ làm ćc chÁ thêm TCD8+), tăng chÁt theo ch°¢ng trình

1.2.2 Vai trò cąa con đ°ãng PD-1/PD-L1 trong nhiÇm virus viêm gan B m¿n tính

Con đ°ång PD-1 là mát yÁu tç điÃu khiÅn quan trãng đçi vãi chćc năng miÇn dách trong điÃu kiÉn sinh lý cąa vật chą PD-1 đ°āc biÅu hiÉn bçi các tÁ bào T trong quá trình ho¿t hóa và đóng vai trò nh° cái phanh đÅ làm dáu sự phản ćng quá mćc cąa tÁ bào T Không có PD-1, tổn th°¢ng mô do đáp ćng

miÇn dách quá mćc có thÅ dÁn tãi hậu quả phá hąy hoàn toàn đçi vãi vật chą H¢n năa, PD-1 đóng vai trò quan trãng trong dung n¿p cąa tÁ bào T ç trung °¢ng và ngo¿i vi, hß trā bảo vÉ bản thân mô khåi đáp ćng tự miÇn

æ ng°åi, PD-1 biÅu hiÉn cao h¢n trên các tÁ bào T đ¿c hiÉu HIV, HBV, HCV trong nhiÇm m¿n tính Ng°āc l¿i, các tÁ bào T đ¿c hiÉu cho các virus không tén t¿i lâu nh° virus influenza, vaccinia thì biÅu hiÉn PD-1 thấp.60

Ch¿n sự t°¢ng tác PD-1/ PD-L1 in vitro làm đảo ng°āc sự suy kiÉt cąa tÁ bào

T đ¿c hiÉu HIV, HBV, HCV vãi biÅu hiÉn tăng sản xuất cytokine59 và tăng phân chia tÁ bào.60 Tÿ các kÁt quả trên cho thấy vai trò quan trãng cąa con đ°ång PD-1/PD-L1 trong nhiÇm virus m¿n tính nói chung

Trong quá trình sinh lý bÉnh cąa nhiÇm HBV, đáp ćng miÇn dách tÁ bào đóng vai trò quan trãng nhất trong thông qua ho¿t đáng cąa tÁ bào TCD8+ và TCD4+, đ¿c biÉt là tÁ bào TCD8+ đ¿c hiÉu HBV.4-8 æ các bÉnh nhân viêm gan B m¿n tính, tÁ bào TCD8+ đ¿c hiÉu HBV trong tuần hoàn chą yÁu d°¢ng tính vãi PD-1.61 Trong sç các receptor ćc chÁ biÅu hiÉn trên tÁ bào T suy kiÉt, PD-1 đ°āc xem là receptor ćc chÁ nổi trái 43,62,63 TÁ bào TCD8+ đáp ćng có các chćc năng bao gém: tiÁt cytokine nh° IL-2, IFN-´, TNF-α và ho¿t tính gây đác tÁ bào qua trung gian perforin, granzyme B Mất chćc năng cąa tÁ bào TCD8+ suy kiÉt diÇn ra theo nhiÃu b°ãc Các kÁt quả thực nghiÉm đã cho thấy tùy thuác vào đá m¿nh cąa tín hiÉu PD-1 mà TCD8+ mất dần các chćc năng đáp ćng quan trãng: đầu tiên là mất khả năng sản xuất IL-2, tiÁp theo mất ho¿t tính gây đác, giảm sản xuất TNF-α và IFN-´,13 cuçi cùng tÁ bào T suy kiÉt trải qua chÁt theo ch°¢ng trình.64 Nh° vậy con đ°ång PD-1/PD-L1 đóng vai trò quan trãng trong viÉc suy giảm miÇn dách cąa TCD8+ đ¿c hiÉu HBV-tÁ bào có vai trò nÃn tảng tiêu diÉt virus HBV

Con đ°ång PD-1/PD-L1 không nhăng làm mất chćc năng cąa tÁ bào TCD8+ đ¿c hiÉu HBV thông qua mát sç c¢ chÁ chung nh°: làm giảm tín hiÉu TCR dÁn tãi giảm khả năng nhân lên và sản xuất cytokine, lßi trong quá trình biÉt hóa thành tÁ bào T nhã dÁn tãi chÁt tÁ bào theo ch°¢ng trình Mát sç yÁu

tç khác đóng góp vào sự mất chćc năng cąa tÁ bào TCD8+ đ¿c hiÉu HBV trong nhiÇm HBV m¿n tính: tăng ho¿t đáng cąa tÁ bào Tregs, viÉc xóa arginine trong môi tr°ång gan viêm làm giảm tín hiÉu TCR, giải phóng các cytokine điÃu chßnh miÇn dách, ph¢i nhiÇm vãi tải l°āng cao cąa kháng nguyên virus và môi tr°ång dung n¿p cąa gan.65 Ngoài ra, sự biÅu hiÉn PD-1 làm thay đổi mát sç con đ°ång chuyÅn hóa diÇn ra rất sãm trong quá trình suy kiÉt cąa tÁ bào T.64 PD-1 ćc chÁ đ°ång phân ái khí, do đó tÁ bào T lập trình l¿i con đ°ång chuyÅn hóa tÿ đ°ång phân ái khí sang tăng c°ång oxy hóa acid béo t¿o ra nhiÃu ROS Sự mất chćc năng này cąa ty thÅ này làm cho tÁ bào TCD8+ đ¿c hiÉu HBV ít khả năng sā dăng phosphoryl oxy hóa đÅ cung cấp cho nhu cầu và năng l°āng.66 Sự thiÁu dinh d°ÿng cũng là mát nguyên nhân dÁn tãi sự suy kiÉt cąa tÁ bào lympho T

TÁ bào T suy kiÉt trong nhiÇm virus viêm gan B m¿n tính có mát sç đ¿c điÅm nổi bật:

HiÉu quả cąa viÉc ch¿n PD-1/PD-L1 khác đáng kÅ giăa tÁ bào T trong gan và tÁ bào T ngo¿i vi Nghiên cću cąa Fisicaro P (2010) trên tÁ bào TCD8+ đ¿c hiÉu HBV tách tÿ máu ngo¿i vi và mô gan sinh thiÁt ç 42 bÉnh nhân nhiÇm HBV m¿n tính thấy rằng: chćc năng cąa tÁ bào TCD8+ đ¿c hiÉu HBV có thÅ đ°āc cải thiÉn bằng cách ch¿n PD-1/PD-L1 và tác đáng này trên gan lãn h¢n so vãi ç ngo¿i vi.67

Quần thÅ tÁ bào lympho TCD8+ đ¿c hiÉu HBV bá suy kiÉt không đéng nhất Nghiên cću in vitro tÿ tÁ bào b¿ch cầu đ¢n nhân đ°āc phân lập tÿ máu

bÉnh nhân viêm gan B m¿n tính thấy rằng tÁ bào TCD8+ đ¿c hiÉu HBV vå suy kiÉt n¿ng h¢n so vãi TCD8+ đ¿c hiÉu polymerase và protein lõi.61 Nghiên cću cho rằng do néng đá kháng nguyên vå có m¿t th°ång xuyên vãi néng đá cao trong nhiÇm HBV m¿n tính.61 Trong nhiÇm m¿n tính, có mát nhóm tÁ bào T 8progenitor-like9 biÅu hiÉn PD-1 mćc thấp h¢n, nh¿y cảm h¢n vãi viÉc ch¿n PD-1, khả năng nhân lên cao h¢n và khả năng sản xuất cytokine đáp ćng lãn h¢n và là d¿ng ít biÉt hóa h¢n Ng°āc l¿i nhóm tÁ bào biÉt hóa cuçi cùng cąa

tÁ bào T thì đáp ćng kém vãi viÉc ch¿n PD-1, sinh sôi ít h¢n và sản xuất các cytokine đáp ćng ít h¢n nh°ng vÁn duy trì đác tính cao h¢n.14

Bên c¿nh PD-1, sự kích thích kéo dài cąa TCR có thÅ dÁn tãi tăng biÅu hiÉn cąa các receptor ćc chÁ khác nh° 2B4, CTLA-4, Tim3, Lag3, TIGIT, BTLA, CD160 và PSGL1 Sç l°āng receptor ćc chÁ đ°āc đéng biÅu hiÉn càng nhiÃu thì mćc đá suy kiÉt cąa tÁ bào T càng n¿ng Trong nhiÇm HBV m¿n tính các phân tā đéng ćc chÁ đ°āc biÅu hiÉn phổ biÁn nhất trong gan là PD-1 và 2B4 (phát hiÉn đ°āc trên 90% tÁ bào TCD8+ đ¿c hiÉu HBV thâm nhiÇm gan), tiÁp theo là sự biÅu hiÉn cąa LAG3 và CD160.66

1.2.3 Vai trò cąa con đ°ãng PD-1/PD-L1 trong ung th° gan

Sự tăng biÅu hiÉn PD-L1 là mát trong các c¢ chÁ quan trãng giúp tÁ bào u l¿n tránh miÇn dách cąa vật chą Con đ°ång PD-1/PD-L1 vÿa ćc chÁ sự ho¿t hóa cąa tÁ bào T đ¿c hiÉu u, vÿa ćc chÁ sự di c° cąa tÁ bào T tãi u Các cytokine tiÃn viêm (IFN-´, IL-4, IL-10, VEGF) đ°āc sản xuất bçi các tÁ bào T thâm nhiÇm u có thÅ làm tăng thêm sự biÅu hiÉn cąa PD-L1 và thúc đ¿y ćc chÁ miÇn dách.14,68 æ mćc gen, các con đ°ång tín hiÉu oncogen trong tÁ bào u nh° IFN-´/ JAK2/IFN, PI3K và MEK/ERK/STAT1 có thÅ ho¿t hóa sự biÅu hiÉn cąa PD-L1.68

Sự ho¿t hóa con đ°ång PD-1/PD-L1 không chß làm giảm chćc năng cąa tÁ bào T đáp ćng mà còn làm tăng chćc năng cąa tÁ bào Treg ćc chÁ miÇn dách C¢ chÁ ćc chÁ chính cąa tÁ bào Treg là tiÁt các cytokine ćc chÁ (IL-10, TGF-³ &).12 Nghiên cću in vitro, tÁ bào TCD4 PD-1-/- có xu h°ãng giảm

đáng kÅ sự biÉt hóa thành Tregs cảm ćng ç ngo¿i vi Trong vi môi tr°ång u, PD-1 đ°āc biÅu hiÉn trên tÁ bào TCD4+ làm tăng biÉt hóa thành Tregs- Foxp3+ Tregs-Foxp3+ là mát d°ãi nhóm ćc chÁ miÇn dách cao cąa TCD4+, đóng vai trò quan trãng vãi sự ćc chÁ nhân lên và sản xuất cytokine cąa các tÁ bào T khác, ćc chÁ đáp ćng miÇn dách đ¿c hiÉu u và duy trì dung n¿p ngo¿i vi ç bÉnh nhân ung th° Khi các tÁ bào Tregs biÅu hiÉn cao PD-1 thì tăng c°ång đáp ćng và chćc năng, tăng phân chia cąa tÁ bào Treg và ćc chÁ đáp ćng cąa

tÁ bào T.68 æ bÉnh nhân HCC thấy có sự xâm nhập đáng kÅ cąa tÁ bào Treg trong gan, sç l°āng tÁ bào Treg ç u tăng so vãi vùng bên ngoài u và vùng ngo¿i vi, khi sç l°āng tÁ bào Treg xâm nhập gan tăng thì sç l°āng tÁ bào TCD8+ trong gan giảm Ghép tự thân các tÁ bào Treg đ°āc phân lập tÿ bÉnh nhân HCC thấy giảm sự sinh sôi, giảm sản xuất perforin cąa tÁ bào TCD8+ Đéng thåi các tÁ bào Treg này ćc chÁ hiÉu quả sự sinh sôi và tiÁt cytokine cąa tÁ bào T CD4CD25 H¢n năa, khi điÃu trá bÉnh nhân HCC bằng cyclophosphamide liÃu thấp làm giảm sç l°āng tÁ bào Treg thì thấy sç l°āng tÁ bào TCD4+ đ¿c hiÉu AFP tiÁt IFN-´ tăng Các nghiên cću này chß ra rằng, các tÁ bào Treg vÿa ćc chÁ trực tiÁp TCD8+ đéng thåi ćc chÁ gián tiÁp TCD8+ thông qua ćc chÁ TCD4+ Nh° vậy sự ho¿t hóa Treg t¿o ra mát vòng feedback ćc chÁ miÇn dách d°¢ng trong HCC.12

1.2.4 Ćng dăng con đ°ãng PD-1/ PD-L1 trong điÃu trá hiÉn nay

Con đ°ång PD-1/PD-L1 là mát liÉu pháp đích thu hút bçi vì PD-1 chß đ°āc biÅu hiÉn trên các tÁ bào T đáp ćng vãi kháng nguyên Do đó, viÉc điÃu chßnh con đ°ång PD-1 có thÅ tác đáng mát cách chãn lãc vãi đáp ćng miÇn dách đang tiÁn triÅn so vãi các liÉu pháp khác có tác đáng ráng trên tÁ bào miÇn dách cąa vật chą (nh° corticosterioids, cyclophosphamide) Đây cũng là liÉu pháp tiÃm năng trong điÃu trá ung th° biÅu mô tÁ bào gan (HCC) có liên quan vãi nhiÇm HBV bçi tÁ bào lympho TCD8+ đ¿c hiÉu HBV chą yÁu biÅu hiÉn PD-1.61

ViÉc sā dăng kháng thÅ kháng PD-1 ho¿c PD-L1 đã thành công đáng kÅ trong nhiÃu thā nghiÉm lâm sàng: trong ung th° hắc tç, ung th° phổi tÁ bào nhå, ung th° thận,69,70 ung th° buéng trćng, ung th° đ¿i trực tràng,71 ung th° bàng quang72 và cả HCC vãi kÁt quả làm tăng thåi gian sçng, làm chậm tiÁn triÅn cąa ung th°.14 Tuy nhiên, hiÉu quả chß xuất hiÉn ç mát sç bÉnh nhân và hầu hÁt bÉnh nhân không thuyên giảm ổn đánh sau khi sā dăng liÉu pháp Vì vậy, cần thêm các nghiên cću lâm sàng và c¢ bản đÅ xác đánh xem t¿i sao viÉc ch¿n con đ°ång PD-1/PD-L1 l¿i hiÉu quả ç mát sç bÉnh nhân nh°ng l¿i

không hiÉu quả ç sç khác.14 Sự kÁt hāp giăa viÉc sā dăng kháng thÅ ch¿n t°¢ng tác PD-1/PD-L1 vãi các liÉu pháp khác: ćc chÁ PD-1 kÁt hāp vãi ćc chÁ CTLA-4 làm tăng hiÉu quả ç bÉnh nhân ung th° hắc tç di căn,73 tăng thåi gian sçng ç bÉnh nhân ung th° hắc tç, ung th° biÅu mô thận74,75 nh°ng cũng làm tăng tác dăng phă.76 KÁt hāp x¿ trá t¿i chß vãi kháng thÅ ch¿n điÅm kiÅm soát nh° PD-1, PD-L1 cho kÁt quả khả quan trong điÃu trá ung th° đ¿i trực tràng, ung th° hầu hãng, ung th° đầu m¿t cổ.77 KÁt hāp giăa ćc chÁ PD-1/PD-L1 và hóa trá ç bÉnh nhân ung th° phổi không tÁ bào nhå tiÁn triÅn làm tăng thåi gian sçng vãi tỷ lÉ bÉnh nhân đáp ćng cao h¢n so vãi đ¢n trá liÉu bằng ćc chÁ PD-1/PD-L1 Tuy nhiên làm tăng đác tính trên thận.76

HiÉn nay vãi nhăng nß lực đÅ xác đánh các marker có thÅ tiên đoán bÉnh nhân nào s¿ đ°āc h°çng lāi tÿ viÉc ch¿n con đ°ång PD-1/PD-L1, sự biÅu hiÉn cąa PD-L1 bằng hóa mô miÇn dách (immunohistochemical, IHC) đã đ°āc xem là marker đánh h°ãng lựa chãn bÉnh nhân điÃu trá bằng kháng thÅ kháng PD-1 ho¿c PD-L1 đçi vãi nhiÃu lo¿i ung th°: ung th° phổi không tÁ bào nhå, ung th° d¿ dày, ung th° biÅu mô đ°ång tiÁt niÉu, ung th° cổ tā cung, ung th° thực quản Protein PD-L1 có thÅ đ°āc phát hiÉn bçi ph°¢ng pháp nhuám hóa mô miÇn dách MÁu đ°āc cç đánh bằng formalin, gắn parafin Sau đó, các kháng thÅ đ¢n dòng gắn trực tiÁp vãi PD-L1 ç đo¿n ngo¿i bào Nhuám tÁ bào u, tÁ bào miÇn dách bằng ph°¢ng pháp hóa mô miÇn dách vãi phćc hāp thuçc nhuám bào t°¢ng và màng tÁ bào TiÁn hành so sánh mÁu mô cąa bÉnh nhân vãi chćng âm và chćng d°¢ng Tÿ đó xác đánh chß sç CPS (combined positive score) đ°āc tính bằng tỷ sç cąa tÁ bào bắt màu PD-L1 (gém cả tÁ bào u và tÁ bào miÇn dách) trên tổng sç tÁ bào u quan sát đ°āc ho¿c chß sç TPS (tumour positive score) đ°āc tính bằng tỷ sç tÁ bào u bắt màu PD-L1 trên tổng sç tÁ bào u quan sát đ°āc Giá trá CPS ho¿c TPS lãn h¢n giá trá cut off kÁt luận là PD-L1 d°¢ng tính.78

1.3 ĐA HÌNH Đ¡N NUCLEOTID CĄA GEN PDCD1 (PD-1), CD274 (PD-L1) VÀ BIÄU HIÈN PROTEIN HUYÀT T¯¡NG CĄA GEN PD-1 (sPD-1), PD-L1 (sPD-L1)

1.3.1 Khái niÉm và đa hình đ¢n nucleotid (Single nucleotide polymorphism, SNP)

1.3.1.1 Định nghĩa đa hình đơn nucleotid

Đa hình đ¢n nucleotid (single nucleotide polymorphism hay SNP) là lo¿i biÁn thÅ di truyÃn trong bá gen, chß khác biÉt 1 nucleotid Trung bình chúng xuất hiÉn gần nh° mát lần trong mßi 1.000 nucleotid, có nghĩa là có khoảng 4 đÁn 5 triÉu SNP trong bá gen cąa mát ng°åi Nhăng biÁn thÅ này có thÅ là duy nhất ho¿c xảy ra ç nhiÃu cá nhân; các nhà khoa hãc đã tìm thấy h¢n 100 triÉu SNP trong các quần thÅ trên khắp thÁ giãi Thông th°ång, nhăng biÁn thÅ này đ°āc tìm thấy trong DNA ç vùng quanh vùng mã hóa protein cąa gen- vùng mà hiÉn nay đ°āc nhận ra là quan trãng vãi viÉc gắn miRNA và điÃu chßnh biÅu hiÉn gen ho¿c protein.79 Tuy nhiên, SNP cũng có thÅ xuất hiÉn ç trình tự mã hóa, intron ho¿c vùng giăa các gen

1.3.1.2 Ý nghĩa của các đa hình đơn nucleotid trong y học

Các SNP hầu hÁt là vô h¿i và không có bất kỳ tác đáng nào đçi vãi sćc khåe và sự phát triÅn Tuy nhiên, SNP nằm ç vùng mã hóa cąa gen ho¿c ç vùng điÃu khiÅn cąa gen có thÅ đóng vai trò trực tiÁp vãi bÉnh thông qua điÃu chßnh chćc năng gen Do chúng làm thay đổi cấu trúc cąa gen mã hóa, ho¿c ảnh h°çng tãi viÉc gắn cąa yÁu tç phiên mã ho¿c microRNA làm ảnh h°çng tãi mćc đá biÅu hiÉn cąa gen cũng nh° có thÅ gây ảnh h°çng tãi khả năng tiÁp cận vãi chromatin ho¿c các vòng DNA (DNA-looping) làm ảnh h°çng tãi hiÉu quả sao mã cąa gen.80 Mát sç SNP đ°āc cho là không trực tiÁp liên quan vãi bÉnh mà tác đáng đÁn bÉnh thông qua sự có m¿t cąa SNP làm mất cân bằng, t¿o haplotype vãi SNP có liên quan trực tiÁp vãi bÉnh.81 SNP đ°āc

sā dăng nh° là dấu hiÉu và gen trong quần thÅ đÅ nghiên cću xu h°ãng đçi vãi bÉnh Mát sç SNP cũng đ°āc xem là các marker sinh hãc, giúp các nhà khoa hãc xác đánh mçi liên quan giăa gen vãi bÉnh Sự khác biÉt cąa SNP có liên quan đÁn mát sç bÉnh: thiÁu máu héng cầu l°ÿi liÃm, ³-thalassemia, ung th° & Mát sç SNP có vai trò trong dự đoán đáp ćng cąa cá nhân vãi mát sç lo¿i thuçc, tính nh¿y cảm vãi yÁu tç môi tr°ång, tăng nguy c¢ hình thành, tiÁn triÅn ung th°.82 Các nghiên cću vÁn đang đ°āc tiÁn hành đÅ xác đánh SNP có liên quan đÁn các bÉnh phćc t¿p nh° bÉnh tim, tiÅu đ°ång, ung th°& đÅ góp thêm công că trong ch¿n đoán, theo dõi điÃu trá và tiên l°āng bÉnh nhân Vãi xu h°ãng phát triÅn cąa y hãc hiÉn đ¿i theo h°ãng cá thÅ hóa điÃu trá vãi măc tiêu nâng cao chất l°āng điÃu trá cũng nh° cải thiÉn chất l°āng sçng cąa ng°åi bÉnh thì các nghiên cću và mçi liên quan giăa bÉnh và các đ¿c điÅm di truyÃn nói chung và SNP nói riêng ngày càng quan trãng đóng góp vào cá nhân hóa điÃu trá đçi vãi lựa chãn thuçc và chÁ đá điÃu trá.83

quan đến con đường PD-1/PD-L1

Các kỹ thuật sinh hãc phân tā đÅ phát hiÉn các đa hình đ¢n nucleotid rất đa d¿ng Tuy nhiên, viÉc phát hiÉn các SNP đÅ phăc vă cho ch¿n đoán, điÃu trá bÉnh nhân thì khó h¢n so vãi viÉc phát hiÉn sự thay đổi cąa nhiÃu nucleotid Các ph°¢ng pháp phát hiÉn này vÿa phải đ¿c hiÉu cao đÅ phân biÉt sự thay thÁ chß ç mát nucleotid đéng thåi vÁn phải có đá nh¿y cao vì hai nucleotid thay thÁ th°ång đ°āc kÁt hāp trong mÁu bÉnh nhân ĐÅ giải quyÁt thách thćc này các ph°¢ng pháp phát hiÉn SNP dựa trên phản ćng PCR là phù hāp nh°: giải trình tự gen, ARMS-PCR, RFLP-PCR&

Trong nghiên cću này chúng tôi lựa chãn ph°¢ng pháp giải trình tự gen tự đáng dựa trên nguyên lý cąa Sanger và ph°¢ng pháp Tetra primer- ARMS- PCR