Nghiên cứu bệnh E. coli trên vịt ở một số tỉnh Đồng bằng sông Cửu Long: Khảo sát tình hình, đặc điểm vi khuẩn gây bệnh và thử nghiệm biện pháp phòng trị

Nghiên cứu bệnh E. coli trên vịt ở một số tỉnh Đồng bằng sông Cửu Long: Khảo sát tình hình, đặc điểm vi khuẩn gây bệnh và thử nghiệm biện pháp phòng trịNghiên cứu bệnh E. coli trên vịt ở một số tỉnh Đồng bằng sông Cửu Long: Khảo sát tình hình, đặc điểm vi khuẩn gây bệnh và thử nghiệm biện pháp phòng trịNghiên cứu bệnh E. coli trên vịt ở một số tỉnh Đồng bằng sông Cửu Long: Khảo sát tình hình, đặc điểm vi khuẩn gây bệnh và thử nghiệm biện pháp phòng trịNghiên cứu bệnh E. coli trên vịt ở một số tỉnh Đồng bằng sông Cửu Long: Khảo sát tình hình, đặc điểm vi khuẩn gây bệnh và thử nghiệm biện pháp phòng trịNghiên cứu bệnh E. coli trên vịt ở một số tỉnh Đồng bằng sông Cửu Long: Khảo sát tình hình, đặc điểm vi khuẩn gây bệnh và thử nghiệm biện pháp phòng trịNghiên cứu bệnh E. coli trên vịt ở một số tỉnh Đồng bằng sông Cửu Long: Khảo sát tình hình, đặc điểm vi khuẩn gây bệnh và thử nghiệm biện pháp phòng trịNghiên cứu bệnh E. coli trên vịt ở một số tỉnh Đồng bằng sông Cửu Long: Khảo sát tình hình, đặc điểm vi khuẩn gây bệnh và thử nghiệm biện pháp phòng trịNghiên cứu bệnh E. coli trên vịt ở một số tỉnh Đồng bằng sông Cửu Long: Khảo sát tình hình, đặc điểm vi khuẩn gây bệnh và thử nghiệm biện pháp phòng trịNghiên cứu bệnh E. coli trên vịt ở một số tỉnh Đồng bằng sông Cửu Long: Khảo sát tình hình, đặc điểm vi khuẩn gây bệnh và thử nghiệm biện pháp phòng trịNghiên cứu bệnh E. coli trên vịt ở một số tỉnh Đồng bằng sông Cửu Long: Khảo sát tình hình, đặc điểm vi khuẩn gây bệnh và thử nghiệm biện pháp phòng trịNghiên cứu bệnh E. coli trên vịt ở một số tỉnh Đồng bằng sông Cửu Long: Khảo sát tình hình, đặc điểm vi khuẩn gây bệnh và thử nghiệm biện pháp phòng trịNghiên cứu bệnh E. coli trên vịt ở một số tỉnh Đồng bằng sông Cửu Long: Khảo sát tình hình, đặc điểm vi khuẩn gây bệnh và thử nghiệm biện pháp phòng trịNghiên cứu bệnh E. coli trên vịt ở một số tỉnh Đồng bằng sông Cửu Long: Khảo sát tình hình, đặc điểm vi khuẩn gây bệnh và thử nghiệm biện pháp phòng trịNghiên cứu bệnh E. coli trên vịt ở một số tỉnh Đồng bằng sông Cửu Long: Khảo sát tình hình, đặc điểm vi khuẩn gây bệnh và thử nghiệm biện pháp phòng trịNghiên cứu bệnh E. coli trên vịt ở một số tỉnh Đồng bằng sông Cửu Long: Khảo sát tình hình, đặc điểm vi khuẩn gây bệnh và thử nghiệm biện pháp phòng trịNghiên cứu bệnh E. coli trên vịt ở một số tỉnh Đồng bằng sông Cửu Long: Khảo sát tình hình, đặc điểm vi khuẩn gây bệnh và thử nghiệm biện pháp phòng trịNghiên cứu bệnh E. coli trên vịt ở một số tỉnh Đồng bằng sông Cửu Long: Khảo sát tình hình, đặc điểm vi khuẩn gây bệnh và thử nghiệm biện pháp phòng trịNghiên cứu bệnh E. coli trên vịt ở một số tỉnh Đồng bằng sông Cửu Long: Khảo sát tình hình, đặc điểm vi khuẩn gây bệnh và thử nghiệm biện pháp phòng trịNghiên cứu bệnh E. coli trên vịt ở một số tỉnh Đồng bằng sông Cửu Long: Khảo sát tình hình, đặc điểm vi khuẩn gây bệnh và thử nghiệm biện pháp phòng trịNghiên cứu bệnh E. coli trên vịt ở một số tỉnh Đồng bằng sông Cửu Long: Khảo sát tình hình, đặc điểm vi khuẩn gây bệnh và thử nghiệm biện pháp phòng trịNghiên cứu bệnh E. coli trên vịt ở một số tỉnh Đồng bằng sông Cửu Long: Khảo sát tình hình, đặc điểm vi khuẩn gây bệnh và thử nghiệm biện pháp phòng trịNghiên cứu bệnh E. coli trên vịt ở một số tỉnh Đồng bằng sông Cửu Long: Khảo sát tình hình, đặc điểm vi khuẩn gây bệnh và thử nghiệm biện pháp phòng trịNghiên cứu bệnh E. coli trên vịt ở một số tỉnh Đồng bằng sông Cửu Long: Khảo sát tình hình, đặc điểm vi khuẩn gây bệnh và thử nghiệm biện pháp phòng trịNghiên cứu bệnh E. coli trên vịt ở một số tỉnh Đồng bằng sông Cửu Long: Khảo sát tình hình, đặc điểm vi khuẩn gây bệnh và thử nghiệm biện pháp phòng trịNghiên cứu bệnh E. coli trên vịt ở một số tỉnh Đồng bằng sông Cửu Long: Khảo sát tình hình, đặc điểm vi khuẩn gây bệnh và thử nghiệm biện pháp phòng trịNghiên cứu bệnh E. coli trên vịt ở một số tỉnh Đồng bằng sông Cửu Long: Khảo sát tình hình, đặc điểm vi khuẩn gây bệnh và thử nghiệm biện pháp phòng trịNghiên cứu bệnh E. coli trên vịt ở một số tỉnh Đồng bằng sông Cửu Long: Khảo sát tình hình, đặc điểm vi khuẩn gây bệnh và thử nghiệm biện pháp phòng trịNghiên cứu bệnh E. coli trên vịt ở một số tỉnh Đồng bằng sông Cửu Long: Khảo sát tình hình, đặc điểm vi khuẩn gây bệnh và thử nghiệm biện pháp phòng trịNghiên cứu bệnh E. coli trên vịt ở một số tỉnh Đồng bằng sông Cửu Long: Khảo sát tình hình, đặc điểm vi khuẩn gây bệnh và thử nghiệm biện pháp phòng trịNghiên cứu bệnh E. coli trên vịt ở một số tỉnh Đồng bằng sông Cửu Long: Khảo sát tình hình, đặc điểm vi khuẩn gây bệnh và thử nghiệm biện pháp phòng trịNghiên cứu bệnh E. coli trên vịt ở một số tỉnh Đồng bằng sông Cửu Long: Khảo sát tình hình, đặc điểm vi khuẩn gây bệnh và thử nghiệm biện pháp phòng trịNghiên cứu bệnh E. coli trên vịt ở một số tỉnh Đồng bằng sông Cửu Long: Khảo sát tình hình, đặc điểm vi khuẩn gây bệnh và thử nghiệm biện pháp phòng trịNghiên cứu bệnh E. coli trên vịt ở một số tỉnh Đồng bằng sông Cửu Long: Khảo sát tình hình, đặc điểm vi khuẩn gây bệnh và thử nghiệm biện pháp phòng trịNghiên cứu bệnh E. coli trên vịt ở một số tỉnh Đồng bằng sông Cửu Long: Khảo sát tình hình, đặc điểm vi khuẩn gây bệnh và thử nghiệm biện pháp phòng trịNghiên cứu bệnh E. coli trên vịt ở một số tỉnh Đồng bằng sông Cửu Long: Khảo sát tình hình, đặc điểm vi khuẩn gây bệnh và thử nghiệm biện pháp phòng trịNghiên cứu bệnh E. coli trên vịt ở một số tỉnh Đồng bằng sông Cửu Long: Khảo sát tình hình, đặc điểm vi khuẩn gây bệnh và thử nghiệm biện pháp phòng trịNghiên cứu bệnh E. coli trên vịt ở một số tỉnh Đồng bằng sông Cửu Long: Khảo sát tình hình, đặc điểm vi khuẩn gây bệnh và thử nghiệm biện pháp phòng trịNghiên cứu bệnh E. coli trên vịt ở một số tỉnh Đồng bằng sông Cửu Long: Khảo sát tình hình, đặc điểm vi khuẩn gây bệnh và thử nghiệm biện pháp phòng trịNghiên cứu bệnh E. coli trên vịt ở một số tỉnh Đồng bằng sông Cửu Long: Khảo sát tình hình, đặc điểm vi khuẩn gây bệnh và thử nghiệm biện pháp phòng trịNghiên cứu bệnh E. coli trên vịt ở một số tỉnh Đồng bằng sông Cửu Long: Khảo sát tình hình, đặc điểm vi khuẩn gây bệnh và thử nghiệm biện pháp phòng trịNghiên cứu bệnh E. coli trên vịt ở một số tỉnh Đồng bằng sông Cửu Long: Khảo sát tình hình, đặc điểm vi khuẩn gây bệnh và thử nghiệm biện pháp phòng trị

GIỚI THIỆU

Ở Việt Nam, chăn nuôi vịt là nghề truyền thống đã gắn bó từ lâu đời với người dân, đặc biệt là tại vùng Đồng bằng sông Cửu Long (ĐBSCL) do đặc điểm tự nhiên với sông ngòi chằng chịt, tạo nguồn thức ăn tự nhiên cho vịt khá dồi dào Bên cạnh đó, vịt cũng là đối tượng tận dụng các phụ phế phẩm nông nghiệp có hiệu quả nhất, đặc biệt là từ ruộng lúa Nuôi vịt có vòng quay nhanh, ít tốn vốn và ít tốn chi phí thú y so với chăn nuôi gà Do đó, vịt là loài thủy cầm được người dân địa phương lựa chọn chăn nuôi Tuy nhiên, ngành chăn nuôi vịt tại Việt Nam nói chung và vùng ĐBSCL nói riêng cũng đang đối mặt với tình hình dịch bệnh phức tạp, phổ biến nhất là bệnh do vi khuẩn E coli gây ra (Nguyễn Xuân Bình và ctv., 2000; Đặng Thị Vui và Nguyễn Bá Tiếp, 2016) Bệnh gây tổn thất to lớn do đây là bệnh rất phổ biến trên vịt, mọi giống và mọi lứa tuổi của vịt đều có thể mắc bệnh, tỷ lệ bệnh và chết khá cao E coli là vi khuẩn thường trú trong đường tiêu hoá của vật nuôi, bình thường không gây bệnh nhưng khi gặp điều kiện ngoại cảnh bất lợi, sức đề kháng của vật chủ giảm, vi khuẩn

E coli bội nhiễm và trở thành nguyên nhân gây bệnh (Barnes et al., 2008) Để phòng và trị bệnh, phần lớn người chăn nuôi sử dụng nhiều loại kháng sinh trên thị trường với số lượng và liều dùng không kiểm soát Điều này làm phá vỡ cân bằng tự nhiên của hệ vi sinh vật đường ruột và tạo ra những dòng vi khuẩn kháng lại kháng sinh đặc biệt là sự đề kháng kháng sinh ở những vi khuẩn gram âm, điển hình là E coli, Klebsialla pneumoniae và một số vi khuẩn thuộc họ vi khuẩn đường ruột Enterobacteriacae.

Ngoài ra, do trên thị trường không có vaccine phòng bệnh do E coli có hiệu quả, nên việc phòng và trị bệnh do E coli trên gia cầm nói chung và trên vịt nói riêng chủ yếu dựa vào kháng sinh Điều này càng làm cho áp lực chọn lọc vi khuẩn gia tăng dẫn đến vi khuẩn đề kháng kháng sinh một cách nhanh chóng Nhiều báo cáo trên thế giới cho thấy vi khuẩn E coli đã đề kháng với nhiều loại kháng sinh và các yếu tố đề kháng kháng sinh của vi khuẩn E coli từ gia cầm đã được chứng minh có thể lan truyền sang vi khuẩn E coli trên người (Bogaard et al., 2001) Sự tăng tính đa kháng trong các dòng vi khuẩn E coli ngoài đường ruột Extraintestinal Pathogenic Escheriachia coli) (ExPEC), đặc biệt là vi khuẩn E coli gây bệnh trên gia cầm (APEC- Avian pathogenic

E coli) và việc hạn chế của kháng sinh trong tương lai sẽ gây khó khăn cho việc điều trị bệnh ở cả người và vật nuôi, vì vậy vaccine sẽ được sử dụng như một công cụ để ngăn ngừa và kiểm soát các bệnh do E coli Nhiều nghiên cứu trên thế giới cho thấy

E coli thuộc các nhóm huyết thanh O phổ biến có liên quan đến bệnh trên gia cầm là

O1, O2, O35, O36, O78 và O111, nhưng sự phân bố của những nhóm này tùy thuộc vào từng vùng địa lý khác (Sojka et al., 1965; Heller et al., 1977) Do đó việc khảo sát phân bố dịch tễ các nhóm huyết thanh E coli là công việc vô cùng quan trọng, những số liệu này sẽ là cơ sở cần thiết cho việc xây dựng chương trình giám sát và phòng chống bệnh, vì vaccine đơn giá không thể bảo vệ gia cầm chống lại E coli thuộc nhiều

2 nhóm huyết thanh khác nhau (Dziva et al.,, 2008) Ngoài ra, E coli là sinh vật sống thường trú trong đường ruột của người và động vật và khi nào các vi khuẩn này không nhận được các yếu tố di truyền mã hoá cho các yếu tố độc lực, chúng vẫn là các vi khuẩn lành tính Các yếu tố độc lực được biểu hiện bằng các protein, chúng được mã hóa bằng các gene nằm trên chromosome hoặc plasmid Có rất nhiều gene mã hóa các yếu tố độc lực của vi khuẩn E coli gây bệnh trên vịt quan trọng nhất là Fim, Col, VAT,

Hly, Iss (Wang et al., 2010; Luo et al., 2023) Nhờ những yếu tố độc lực này mà vi khuẩn mới có thể tồn tại trong cơ thể ký chủ và gây nên những biến đổi bệnh lý trên con vật. Ở nước ta, đã có một số công trình nghiên cứu về vi khuẩn E coli gây bệnh cho heo và trâu bò Tuy nhiên, các chủng E coli gây bệnh cho gia cầm có các đặc tính không hoàn toàn giống với các chủng gây bệnh cho người và động vật có vú (Delicato et al., 2003) Đặc biệt ở đồng bằng sông Cửu Long, nơi có ngành chăn nuôi vịt rất phát triển mạnh và tổng đàn vịt cao nhất nước, nhưng nghiên cứu về vi khuẩn E coli trên vịt rất hạn chế chỉ giới hạn trong việc phân lập và định danh E coli bằng xét nghiệm sinh hóa và khảo sát tính đề kháng của vi khuẩn đối với một số loại kháng sinh Do đó, cần có những nghiên cứu sâu rộng về đặc điểm dịch tễ của bệnh do E coli với sự lưu hành của các nhóm huyết thanh gây bệnh quan trọng trên vịt ở đồng bằng sông Cửu Long để làm nguồn giống và dữ liệu dùng trong sản xuất vaccine trong chiến lược phòng chống bệnh lâu dài Ngoài ra việc khảo sát những sản phẩm có hiệu quả trong phòng và trị bệnh hiện nay là những việc vô cùng cần thiết.

Từ những thực tế trên, đề tài “Nghiên cứu bệnh E coli trên vịt ở một số tỉnh Đồng bằng sông Cửu Long: Khảo sát tình hình, đặc điểm vi khuẩn gây bệnh và thử nghiệm biện pháp phòng trị” được tiến hành Các kết quả của nghiên cứu đóng góp quan trọng cho các chiến lược phòng chống bệnh lâu dài, nhằm đảm bảo sức khỏe đàn vịt, đảm bảo năng suất trong chăn nuôi vịt và đảm bảo sức khỏe của người tiêu dùng trong cộng đồng.

Xác định tình hình bệnh, một số đặc điểm bệnh lý và dịch tễ của bệnh do vi khuẩn E coli gây ra trên vịt tại 5 tỉnh vùng ĐBSCL.

Xác định các đặc điểm về kháng nguyên, tính đề kháng kháng sinh, gene mã hóa yếu tố kháng kháng sinh và gene mã hóa yếu tố độc lực của vi khuẩn E coli gây bệnh trên vịt tại 5 tỉnh vùng ĐBSCL.

Thử nghiệm lựa chọn thuốc có hiệu quả trong phòng và trị bệnh

3 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của nghiên cứu

Các kết quả của đề tài rất có ý nghĩa thực tiễn, là cơ sở khoa học cho việc chẩn đoán, phòng trị bệnh và nghiên cứu sản xuất vaccine, kháng thể phòng bệnh do E coli trên gia cầm trong tương lai.

Chủng vi khuẩn phân lập với các đặc điểm đã được xác định là nguồn giống phong phú để sản xuất vaccine và kháng thể trong chiến lược phòng chống bệnh. Điểm mới của nghiên cứu Đây là công trình nghiên cứu khá đầy đủ và có hệ thống về bệnh do E coli trên vịt những thông tin về đặc điểm dịch tễ, đặc điểm bệnh lý, đặc điểm vi khuẩn gây bệnh trên vịt.

Kết quả nghiên cứu đã xác định những nhóm huyết thanh gây bệnh quan trọng trên vịt tại vùng ĐBSCL, quan trọng nhất là O2 và O78

Nghiên cứu đầu tiên về sự hiện diện của một số gene mã hoá yếu tố đề kháng kháng sinh và một số gene mã hóa yếu tố độc lực của vi khuẩn E coli phân lập trên vịt tại vùng ĐBSCL.

Kết quả nghiên cứu cho thấy vi khuẩn E coli rất nhạy cảm với kháng sinh amikacin và có hiệu quả tốt trong phòng và trị bệnh trong điều kiện in vivo.

PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

Nội dung nghiên cứu

Nội dung 1: Khảo sát tình hình bệnh và một số đặc điểm bệnh lý và dịch tễ của bệnh do vi khuẩn E coli gây ra trên vịt tại 5 tỉnh vùng ĐBSCL.

Nội dung 2: Khảo sát một số đặc điểm sinh học của vi khuẩn E coli gây bệnh trên vịt tại 5 tỉnh vùng ĐBSCL.

Nội dung 3: Thử nghiệm thuốc phòng và trị bệnh do vi khuẩn E coli gây ra trên vịt.

Vật liệu và phương tiện nghiên cứu

3.2.1Đối tượng khảo sát Đối tượng khảo sát là những đàn vịt có các triệu chứng lâm sàng của bệnh do E. coli được nuôi theo 02 hình thức nuôi nhốt (Hình 3.1) và chạy đồng (Hình 3.2), ở các lứa tuổi từ 1–30 ngày tuổi, 31–60 ngày tuổi, 61–90 ngày tuổi và lớn hơn 90 ngày tuổi.

Hình 3.1: Vịt nuôi theo hình thức nuôi nhốt Hình 3.2: Vịt nuôi theo hình thức chạy đồng

3.2.2 Địa điểm và thời gian thực hiện Đề tài tiến hành thu thập mẫu tại 05 tỉnh/thành phố bao gồm thành phố Cần Thơ, tỉnh Hậu Giang, tỉnh Vĩnh Long, tỉnh Trà Vinh và tỉnh Đồng Tháp.

Thí nghiệm phòng và trị bệnh trên vịt được bố trí tại Trại thực nghiệm Chăn nuôi Thú Y, bộ môn Chăn Nuôi Thú Y, khoa Nông Nghiệp – Thủy Sản, trường Đại học Trà Vinh.

Thời gian thực hiện từ năm 2016 đến năm 2022.

Các phân tích trong phòng thí nghiệm được tiến hành tại phòng thí nghiệm Thú yChuyên ngành, khoa Thú y, trường Nông nghiệp, trường Đại học Cần Thơ và phòng thí nghiệm vi sinh vật học, Trung tâm phân tích kiểm nghiệm trường Đại học TràVinh.

Trình tự nucleotide của vi khuẩn E coli được giải trình tự tại công ty TNHH Sinh hoá Phù Sa Biochem, Cần Thơ.

Thiết bị: Tủ cấy vô trùng cấp 2, tủ ấm (Gemyco, Đài Loan), tủ lạnh (Toshiba, Nhật Bản), tủ sấy (Sibata, Nhật Bản), autoclave (Hirayama, Nhật Bản), máy vortex, máy ly tâm, bếp đun cách thủy, máy shock nhiệt, máy PCR (T10TM Thermal Cycler, Singapore), bể điện di.

Dụng cụ: Bộ dụng cụ mổ khám, thùng đá bảo quản mẫu, kéo, pen, kẹp, cân, đĩa petri, micropipette, ống nghiệm, ống đong, găng tay, que cấy, đèn cồn, Eppendorf, các loại đầu col, ống 0,5 McFarland chuẩn (HealthLink, Hoa Kỳ).

Hóa chất: Nutrient broth (Merck, Đức), Tryptone Bile X–glucuronide Agar (Merck, Đức), MacConkey Agar (Merck, Đức), Nutrient Agar (Merck, Đức), Tryptic Soy Agar (Merck, Đức), Kligler Iron Agar (Merck, Đức), Lysine Indole Motility (Merck, Đức), thuốc thử Kovacs (Merck, Đức), Methyl Red–Voges Proskauer (Merck, Đức), Voges Proskauer (Merck, Đức), KOH, Methyl Red (Merck, Đức), Simmon Citrate (Merck, Đức), glyceryl, cồn 70 o , cồn 90 o , dH2O, master Mix 2X, TAE (1X), Mix Dyle Đối chứng âm trong phản ứng PCR (dH2O).

Kháng huyết thanh chuẩn E coli (antiserum) gồm O1, O18, O78, O111 (Denka, Nhật Bản), O2, O35, O36, O81, O92, O93 (SSI Diagnostica, Đan Mạch).

Kháng sinh: Các đĩa tẩm kháng sinh dùng làm kháng sinh đồ của 12 loại kháng sinh tiêu chuẩn được cung cấp bởi công ty Nam Khoa, thành phố Hồ Chí Minh bao gồm ampicillin, norfloxacin, streptomycin, amikacin, fosfomycin, doxycycline, cefuroxime, gentamicin, colistin, florfenicol, ceftazidime/clavulanic acid, tetracyclin.

Kháng sinh amikacin (Pymepharco, Việt Nam), chế phẩm men tiêu hoá (chế phẩm men tiêu hóa được sản xuất tại công ty thuốc Thú Y Safa – Vedic với thành phần chính là Lactobacillus Acidophillus, nồng độ 10 8 CFU/g), than hoạt tính (Jinhuada, China) dùng trong thí nghiệm điều trị dự phòng và thí nghiệm điều trị bệnh.

Thuốc sát trùng có chứa thành phần Glutaraldehyde và Alkylbenzyldimethyl ammonium chloride (Công ty liên doanh Bio–Pharmachemie), kháng thể viêm gan vịt (công ty CP thuốc Thú y Trung Ương NAVETCO) vaccine dịch tả vịt (Phân viện Thú y Miền trung) và vaccine cúm gia cầm (công ty CP thuốc Thú y Trung Ương NAVETCO).

Thức ăn dùng trong thí nghiệm là sản phẩm của Công ty Proconco, Việt Nam với thành phần dinh dưỡng như sau: Độ ẩm (max): 13%, protein thô (min): 20%, xơ thô(max): 7%, Ca (min–max): 0,8–1,5%, P tổng số (min–max): 0,6–1,1%, lysine tổng số

(min): 0,9%, methionine + cystine tổng số (min): 0,7%, năng lượng trao đổi (min):2.800 Kcal/kg.

Phương pháp nghiên cứu

Khảo sát tình hình bệnh và một số đặc điểm bệnh lý và dịch tễ của bệnh do vi khuẩn E coli gây ra trên vịt tại 5 tỉnh vùng ĐBSCL.

3.3.1.1 Phương pháp chẩn đoán lâm sàng

Việc chẩn đoán lâm sàng chủ yếu dựa vào triệu chứng và bệnh tích của vịt mắc bệnh Những đàn vịt được chọn để mổ khám chẩn đoán bệnh do E coli trước hết phải là những đàn vịt nghi ngờ bệnh do E coli Những vịt nghi ngờ bệnh do E coli được xác định theo tiêu chuẩn của Barnes et al (2008), xuất hiện các triệu chứng đặc trưng của bệnh bao gồm tiêu chảy phân trắng xanh (hoặc hơi vàng), liệt chân hoặc sưng đầu hoặc viêm cuống rốn Các triệu chứng lâm sàng của vịt sau đó được ghi nhận vào phiếu khảo sát (Phụ lục 1).

Tiếp đến, tiến hành mổ khám vịt nghi mắc bệnh do E coli Trong mỗi đàn vịt bệnh, chọn 4–6 vịt nghi mắc bệnh và tiến hành mổ khám để kiểm tra bệnh tích Khi mổ khám, những vịt bệnh xuất hiện những bệnh tích đại thể đặc trưng của bệnh do E. coli như viêm túi lòng đỏ (trường hợp vịt con có triệu chứng viêm rốn), viêm túi khí, viêm gan (gan có màu xanh mật, gan sưng, hoại tử), viêm ruột hoại tử dạng hạt, viêm bao tim, có nhiều fibrin tích tụ ở gan, bao tim (Barnes et al., 2008) Bệnh tích đại thể của vịt được ghi nhận vào phiếu khảo sát (Phụ lục 1).

3.3.1.2 Phương pháp thu thập thông tin dịch tễ

Tất cả những đàn vịt nghi ngờ mắc bệnh do E coli tại 5 tỉnh khảo sát đều được ghi nhận đầy đủ các thông tin dịch tễ thông qua phiếu điều tra (Phục lục 1) Những thông tin như lứa tuổi, phương thức nuôi, mục đích chăn nuôi, quy mô đàn được thu thập và ghi chép cẩn thận vào phiếu điều tra Song song với những thông tin trên các triệu chứng và bệnh tích cũng được ghi nhận lại thông qua phiếu kiểm tra, mổ khám và lấy mẫu xét nghiệm.

Trong nghiên cứu này, những đàn vịt nghi ngờ bệnh do E coli được xác định theo đặc điểm bệnh lý của Barnes et al (2008) Sau khi có kết quả phân lập và nuôi cấy vi khuẩn, những đàn vịt nghi ngờ bệnh do E coli được khẳng định mắc bệnh do E. coli Tại những đàn vịt đã được khẳng định chính xác là mắc bệnh do E coli thông qua kết quả phân lập và nuôi cấy vi khuẩn, số liệu vịt biểu hiện triệu chứng lâm sàng của bệnh và số liệu vịt chết được theo dõi và ghi nhận Sau đó, các số liệu dịch tễ của đàn vịt mắc bệnh do E coli và không mắc bệnh do E coli sẽ được tổng hợp và xử lý bằng phần mềm Microsoft Excel theo phiên bản 2013 Các số liệu thống kê được xử lý bằng phần mềm Minitab phiên bản 16.0.

3.3.1.3 Phương pháp thu thập mẫu

Mẫu được thu thập tại 5 tỉnh/thành phố tại vùng ĐBSCL từ tháng 01 đến tháng

12 năm 2017 là những mẫu vịt nghi bệnh do E coli bằng phương pháp chẩn đoán lâm sàng Qua đó, nghiên cứu đã xác định tổng số đàn vịt nghi nhiễm vi khuẩn E coli thông qua chẩn đoán lâm sàng được thể hiện trong Bảng 3.1.

Bảng 3.1: Phân bố số lượng vịt khảo sát và số đàn vịt được điều tra trong nghiên cứu

Tỉnh/thành phố Số vịt khảo sát (con) Số đàn khảo sát (đàn)

3.3.1.4 Phương pháp lấy mẫu và bảo quản mẫu

Phương pháp lấy mẫu và bảo quản mẫu được thực hiện dựa vào tiêu chuẩn QCVN 01–83:2011/BNNPTNT Mẫu bệnh phẩm được chọn từ những vịt có triệu chứng tiêu chảy nặng, phân có dịch nhầy màu nâu, xanh, trắng, gầy yếu, giảm cân. Tiến hành thu thập các mẫu bệnh phẩm bao gồm gan, lách, ruột, phổi và tủy xương. Quy trình thực hiện được tóm tắt như sau: Tiến hành hủy tủy hoặc cắt lấy hết tiết, làm sạch lông vùng bụng Tiếp đến, dùng dao mổ vô trùng mổ một đường ngang khoảng 3–5 cm, cách hậu môn 3–5 cm, tùy theo vịt lớn hay nhỏ Dùng kéo đầu tù cắt hết phần bụng dưới lật lên sao cho lộ rõ các nội tạng cần lấy Dùng kéo hoặc pen đã sát trùng bằng cồn cắt mẫu cần lấy đưa vào túi nylon nhỏ hàn kín miệng Mẫu bệnh phẩm của từng con vịt được chứa riêng vào từng túi nylon nhỏ, hàn kín miệng, sau đó đưa vào một túi nylon lớn hơn, giữa 2 lớp túi nylon là tờ giấy ghi lý lịch mẫu và ký hiệu mẫu. Túi nylon đựng mẫu sẽ được chứa trong thùng chứa nước đá khô (hoặc nước đá thường giả nhỏ), vận chuyển về phòng thí nghiệm trong vòng 12 giờ sau khi mổ khám.

3.3.1.5 Phương pháp nuôi cấy và phân lập vi khuẩn E coli

Phương pháp nuôi cấy và phân lập vi khuẩn E coli từ mẫu dựa vào TCVN 5155–

1990 về thịt và sản phẩm của thịt – phương pháp phát hiện và đếm số do Uỷ ban Khoa học Nhà nước ban hành. Đối với mẫu nội tạng, sau khi loại bỏ lớp mặt ngoài, cắt lấy phần bên trong và được ria trực tiếp trên môi trường MacConkey agar (MC), sau đó đem ủ ở nhiệt độ

37 o C trong 24 giờ Nếu có khuẩn lạc màu hồng nhạt, tròn, lồi có viền, dẹt, kích thước khuẩn lạc 2–3 mm thì nghi ngờ có vi khuẩn E coli.

Tiếp tục làm thuần vi khuẩn bằng cách chọn 3–5 khuẩn lạc điển hình, dùng que cấy ria trên môi trường MC rồi đem ủ ở nhiệt độ 37 o C trong 24 giờ Sau đó, chọn tiếp những khuẩn lạc điển hình trên môi trường MC cấy tiếp trên môi trường Tryptic Soy Agar (TSA) rồi đem ủ ở nhiệt độ 37 o C trong 24 giờ Xác định hình thái, tiến hành kiểm tra sinh hóa, giữ giống và định nhóm huyết thanh vi khuẩn E coli.

3.3.1.6 Phương pháp định danh vi khuẩn E coli bằng phản ứng sinh hóa

Phương pháp định danh vi khuẩn E coli bằng phản ứng sinh hóa được trình bày trong Bảng 3.2.

Bảng 3.2: Định danh vi khuẩn E coli bằng phản ứng sinh hóa (Cowan and Steel, 1974) Đặc tính sinh hóa

Indole MR VP DĐ CT Glucose Lactose H2S Gas

MR: Methyl Red; VP: Voges Proskauer; DĐ: Di động; CT: Citrate (+): dương tính; (–): âm tính; D: Âm tính hoặc dương tính tùy loài

Môi trường Kligler Iron Agar (KIA) dùng để xác định vi khuẩn có lên men đường glucose, lactose, sinh hơi và sinh H2S hay không Dùng que cấy thẳng lấy sinh khối vi khuẩn từ đĩa thạch TSA nuôi cấy không quá 24 giờ, cấy vào phần sâu của ống thạch nghiêng nhưng tránh chạm đáy ống Sau đó, ria cấy trên bề mặt thạch nghiêng Ủ ống nghiệm vừa cấy ở 37 o C trong 24 giờ và đọc kết quả Vi khuẩn chỉ lên men glucose, không lên men lactose, sau 24 giờ nuôi cấy phần thạch nghiêng trở nên kìm có màu đỏ, còn phần thạch đứng trở nên acid có màu vàng thì kết luận Glucose (+), Lactose (– ) Vi khuẩn lên men glucose và lactose, sau 24 giờ nuôi cấy thì phần thạch nghiêng và phần thạch đứng trở nên acid có màu vàng thì kết luận Glucose (+), Lactose (+) Sự sinh hơi được ghi nhận bởi bọt khí trên môi trường thạch Vi khuẩn có sinh H2S thì xuất hiện tủa màu đen trong ống nghiệm sau 24 giờ nuôi cấy thì kết luận H2S (+) Vi khuẩn không xuất hiện tủa màu đen trong ống nghiệm thì kết luận H2S (–).

Môi trường Lysine Indole Motility (LIM) dùng để kiểm tra tính sinh indole của vi khuẩn Lấy sinh khối vi khuẩn nuôi cấy trên môi trường TSA không quá 24 giờ cấy vào ống nghiệm chứa môi trường LIM, ủ ống nghiệm vừa cấy ở 37 o C trong 24 giờ. Nhỏ 2–3 giọt thuốc thử Kovacs vào ống nghiệm có chứa vi khuẩn đã ủ ở 37 o C trong

24 giờ và quan sát kết quả Có vòng màu đỏ xuất hiện trên bề mặt môi trường thì kết luận Indole (+) Có vòng màu vàng xuất hiện trên bề mặt môi trường thì kết luận Indole (–).

Môi trường Methyl Red–Voges Proskauer (MR–VP) dùng để kiểm tra tính di động và khả năng sinh aceton của vi khuẩn Lấy sinh khối vi khuẩn nuôi cấy trên môi trường TSA không quá 24 giờ cấy vào 2 ống nghiệm chứa môi trường MR–VP, ủ ống nghiệm vừa cấy ở 37 o C trong 24 giờ Vi khuẩn có khả năng di động sẽ làm đục môi trường Vi khuẩn không có khả năng di động, chỉ thấy vi khuẩn theo đường que cấy, môi trường xung quanh que cấy vẫn trong Xác định Voges Proskauer (VP): Nhỏ 2–3 giọt dung dịch Napthol vào ống thứ 1, sau đó nhỏ tiếp 2–3 giọt KOH 40% và quan sát kết quả Có xuất hiện vòng đỏ trên bề mặt môi trường chứng tỏ vi khuẩn có khả năng sinh aceton thì kết luận VP (+) Bề mặt môi trường không đổi màu cho thấy vi khuẩn không có khả năng sinh aceton thì kết luận VP (–) Xác định Methyl Red (MR): Nhỏ 2–3 giọt thuốc thử Methyl Red và quan sát kết quả Môi trường có màu đỏ thì kết luận

MR (+), môi trường có màu vàng thì kết luận MR (–).

Môi trường Simmon Citrate dùng để kiểm khả năng sử dụng citrate thay nguồn carbon của vi khuẩn Dùng que cấy lấy sinh khối vi khuẩn từ đĩa thạch TSA nuôi cấy không quá 24 giờ ria cấy trên mặt thạch nghiêng của ống nghiệm, ủ ống nghiệm vừa cấy ở 37 o C trong 24 giờ và đọc kết quả Môi trường chuyển từ màu xanh lá cây sang màu xanh dương thì kết luận Citrate (+), môi trường vẫn giữ nguyên màu xanh lá cây ban đầu thì kết luận Citrate (–).

Tỷ lệ phát hiện vi khuẩn E coli (%) = Số mẫu dương tính /số mẫu khảo sát (con) x 100

Tỷ lệ mắc bệnh do E coli (%) = Số vịt dương tính/số vịt khảo sát (con) x 100

Tỷ lệ chết của vịt mắc bệnh do E coli (%) = Số vịt chết do mắc bệnh/số vịt khảo sát theo địa phương (con) x 100

Khảo sát một số đặc điểm sinh học của vi khuẩn E coli gây bệnh trên vịt tại 5 tỉnh vùng ĐBSCL.

3.3.2.1 Phương pháp định nhóm huyết thanh E coli

Ba trăm phân lập vi khuẩn E coli được lựa chọn để định danh nhóm huyết thanh,mỗi tỉnh chọn ngẫu nhiên 60 phân lập vi khuẩn E coli Vi khuẩn E coli sau khi phân lập tiến hành cấy chuyển trên NA, ủ ấm ở 37 o C trong 24 giờ Sau đó, lấy từ 3–5 khuẩn lạc đã mọc trên môi trường NA pha với 3 ml nước muối sinh lý đã tiệt trùng, cho vào ống nghiệm và đem đun ở 100 o C trong 1 giờ, tiếp đến ly tâm ở 2.000 vòng trong 10 phút, đổ bỏ nước trong bên trên , giữ lại phần cặn lắng dưới đáy ống nghiệm Cho 0,5 ml nước muối sinh lý đã tiệt trùng vào phần còn lại ở đáy ống nghiệm, sau đó đem vortex và tiến hành định nhóm huyết thanh bằng phương pháp ngưng kết nhanh trên phiến kính theo mô tả của Mendearis (1986).

Phương pháp được thực hiện đối với từng nhóm huyết thanh ( O1, O2, O18, O35, O36, O78, O81, O92, O93, O111) như sau : Nhỏ lên 2 đầu lam kính sạch, nhỏ 1 giọt nước muối sinh lý ở một đầu (đối chứng) và 1 giọt kháng thể chuẩn ở 1 đầu khác trên lam , dùng que cấy vòng chấm lấy một vòng kháng nguyên E coli từ huyễn dịch đã chuẩn bị vào 2 đầu lam rồi trộn đều vào từng giọt trên Lắc nhẹ nhàng và sau 5 phút có thể thấy sự ngưng kết bằng mắt thường Mẫu dương tính sẽ ngưng kết với kháng thể và mẫu âm tính khi hỗn hợp kháng nguyên và kháng thể đục đều như đối chứng

3.3.2.2 Phương pháp kiểm tra tính nhạy cảm của vi khuẩn E coli với kháng sinh

Phương pháp phân tích thống kê

Số liệu thô được xử lý bằng phần mềm Microsoft Excel theo phiên bản 2013 Các số liệu thống kê được xử lý bằng phần mềm Minitab phiên bản 16.0, sử dụng phépChi–Square Giá trị P