(Luận Văn Thạc Sĩ Vật Lí) Xây Dựng Quy Trình Phân Tích Độc Tố Tetrodotoxins Trong Ốc Biển Ở Việt Nam Bằng Lc- Ms Ms

à Viát Nam, tÿ 2007 đÁn nay, mßi năm đÃu ghi nh¿n các vụ ngá đác TTXs trong ãc biển xÁy ra chÿ yÁu á các cùng ven biển Thanh Hóa, Ninh Thu¿n, Khánh Hòa...Mặc dù đ°āc rất nhiÃu sā quan tâ

trình nghiên cứu của tôi dựa trên những tài liệu, số liệu do chính tôi tự tìm hiểu và nghiên cứu Chính vì vậy, các kết quả nghiên cứu đảm bảo trung thực

và khách quan nhất Đồng thời, kết quả này chưa từng xuất hiện trong bất cứ một nghiên cứu nào Các số liệu, kết quả nêu trong luận văn là trung thực nếu sai tôi hoàn chịu trách nhiệm trước pháp luật

Tác giÁ

Võ Thß Đoan Trang

đ°āc sā quan tâm và giúp đÿ quý báu cÿa các thầy cô, b¿n bè và đßng nghiáp

Đầu tiên, tôi xin bày tá lòng biÁt ¢n chân thành và sâu sÁc đÁn PGS.TS Đào Viát Hà đã t¿n tình h°ớng dÁn và t¿o mßi điÃu kián tãt nhất giúp tôi hoàn thành lu¿n văn

Tôi xin trân trßng cÁm ¢n Ban lãnh đ¿o Hßc vián Khoa hßc và Công nghá - Vián Hàn lâm Khoa hßc và Công nghá Viát Nam, Ban lãnh đ¿o Vián Nghiên cāu và Āng dụng công nghá Nha Trang, Ban lãnh đ¿o Vián HÁi d°¢ng hßc Nha Trang đã t¿o mßi điÃu kián thu¿n lāi giúp tôi hoàn thành các hßc phần cÿa lu¿n văn và các thÿ tục cần thiÁt

Tôi xin chân thành cÁm ¢n sā giúp đÿ và t¿o điÃu kián và mßi mặt cÿa quý anh chá Phòng thí nghiám và An toàn thāc ph¿m và môi tr°ßng (Khu vāc miÃn Trung)- Vián HÁi d°¢ng hßc Nha Trang; cÿa quý thầy cô, anh chá hßc viên cao hßc các lớp CHE21A đang công tác và hßc t¿p t¿i Vián Nghiên cāu

và Āng dụng công nghá Nha Trang

Tôi cũng xin cÁm ¢n Sá Giáo dục và Đào t¿o Khánh Hòa, Ban lãnh đ¿o tr°ßng THPT Lý Tā Trßng, các anh chá em đßng nghiáp đã luôn t¿o điÃu kián trong công viác, đáng viên và trā giúp tôi để tôi dành thßi gian chuyên tâm hßc t¿p và hoàn thành lu¿n văn

Cuãi cùng, tôi xin bày tá lòng biÁt ¢n sâu sÁc đÁn gia đình, ng°ßi thân

và b¿n bè đã quan tâm, đáng viên và giúp đÿ tôi trong suãt quá trình hßc t¿p

và hoàn thành lu¿n văn

Tác giÁ luÃn văn

Võ Thß Đoan Trang

MĀC LĀC

MĀC LĀC 1

DANH MĀC CÁC KÍ HIàU VÀ CHĀ VI¾T TÄT 4

DANH MĀC CÁC HÌNH VẼ 6

DANH MĀC CÁC BÀNG 8

DANH MĀC CÁC PHĀ LĀC 9

Mâ ĐÀU 10

Ch°¢ng 1 TàNG QUAN NGHIÊN CĀU 12

1.1.ĐàC Tâ TETRODOTOXIN 12

1.1.1.Đặc tính, cấu trúc hóa hßc 12

1.1.2.Mát sã dÁn chất cÿa Tetrodotoxin 13

1.1.3.Đác tính Tetrodotoxin 14

1.1.4.C¢ chÁ ho¿t đáng 14

1.1.5.Tetrodotoxins trong ãc biển 15

1.2.MàT Sâ PH¯¡NG PHÁP PHÂN TÍCH TETRODOTOXINS 16

1.2.1.Ph°¢ng pháp thā nghiám sinh hßc 16

1.2.1.1.Ph°¢ng pháp sinh hóa chuát 16

1.2.1.2.Ph°¢ng pháp thā nghiám cÁm āng sinh hßc 18

1.2.1.3.Thā nghiám trên mô tÁ bào 18

1.2.1.4.Ph°¢ng pháp thā nghiám hấp thụ mißn dách liên kÁt với enzyme 19

1.2.2.Ph°¢ng pháp hóa hßc 20

1.2.2.1.Ph°¢ng pháp sÁc ký lớp máng 20

1.2.2.2.Ph°¢ng pháp quang phá hßng ngo¿i 20

1.2.2.3.Ph°¢ng pháp sÁc ký khí khãi phá 21

1.2.2.4.Ph°¢ng pháp sÁc ký láng hiáu năng cao 22

1.3.PH¯¡NG PHÁP SÀC KÝ LàNG KHâI PHà 26

1.3.1.S¢ l°āc và sÁc ký láng khãi phá 26

1.3.2.ThiÁt bá sÁc ký láng khãi phá 27

1.3.2.1.Pha đáng 27

1.3.2.2.Há thãng b¢m 27

1.3.2.3.Cát tách và pha tĩnh 27

1.3.2.4.Há tiêm mÁu 28

1.3.2.5.Detector khãi phá 28

1.3.3.Mát sã chÁ đá trong sÁc ký láng khãi phá 28

1.3.3.1.ChÁ đá quét 28

1.3.3.2.ChÁ đá khÁo sát ion chßn lßc 28

1.3.3.3.ChÁ đá khÁo sát ion cô l¿p và khÁo sát đa ion cô l¿p 29

Ch°¢ng 2 ĐâI T¯þNG VÀ PH¯¡NG PHÁP NGHIÊN CĀU 30

2.1 ĐâI T¯ĀNG NGHIÊN CĀU 30

2.1.1 Đãi t°āng nghiên cāu 30

2.1.2 Nguyên liáu, thiÁt bá 30

2.1.2.1 Dung môi, hóa chất 30

2.1.2.2 ThiÁt bá, dụng cụ phân tích 30

2.2 PH¯¡NG PHÁP NGHIÊN CĀU 31

2.2.1 Thu mÁu và bÁo quÁn mÁu 31

2.2.2.Xây dāng quy trình phân tích 31

2.2.2.1 KhÁo sát điÃu kián khãi phá xác đánh TTX 31

2.2.2.2 KhÁo sát điÃu kián sÁc ký láng hiáu năng cao 32

2.2.2.3 KhÁo sát quy trình xā lý mÁu 32

2.2.3 Đánh giá quy trình phân tích TTXs 33

2.2.3.1 KhÁo sát khoÁng tuyÁn tính và xây dāng đ°ßng chu¿n 33

2.2.3.2 Xác đánh giới h¿n phát hián và giới h¿n đánh l°āng 34

2.2.3.3 Đá chụm và đá đúng cÿa ph°¢ng pháp 34

Ch°¢ng 3 K¾T QUÀ VÀ THÀO LUÂN 36

3.1 KHÀO SÁT ĐIÂU KIàN PHÂN TÍCH TTXs TRÊN THIÀT Bà LC-MS/MS 36

3.1.1 KhÁo sát các điÃu kián cÿa detector khãi phá 36

3.1.2 KhÁo sát các điÃu kián cÿa há pha đáng 37

3.1.2.1 KhÁo sát ch°¢ng trình gradient pha đáng 38

3.1.2.2 KhÁo sát tãc đá dòng 40

3.2 KHÀO SÁT QUY TRÌNH XĀ LÝ MÀU 43

3.2.1 KhÁo sát nßng đá dung môi tách chiÁt 45

3.2.2 KhÁo sát thể tích dung môi rāa giÁi 47

3.3 ĐÁNH GIÁ PH¯¡NG PHÁP PHÂN TÍCH 53

3.3.1.KhÁo sát khoÁng tuyÁn tính và l¿p đ°ßng chu¿n 53

3.3.2 Giới gi¿n phát hián và giới h¿n đánh l°āng 55

3.3.3 Đánh giá đá chụm và đá đúng cÿa ph°¢ng pháp 56

3.4 PHÂN TÍCH MàT Sâ MÀU âC THĀC TÀ 58

K¾T LUÂN VÀ KI¾N NGHÞ 62

T ÀI LIàU THAM KHÀO 63

PHĀ LĀC 69

DANH MĀC CÁC KÍ HIàU VÀ CHĀ VI¾T TÄT

AOAC Association of official analytical chemists Hiáp hái các nhà hóa

phân tích chính thāc

EDTA Ethylene diamine tetraacetic acid Axit ethylene diamine

tetraacetic

ELISA Enzyme linked immunosorbent assay Xét nghiám hấp thụ mißn

dách liên kÁt với enzyme

ESI Electro spray ionization Kỹ thu¿t ion hóa bằng

phun đián tā

GC-MS Gas chromatography-Mass spectrometry SÁc ký khí ghép khãi phá

HPLC High performance liquid chromatography SÁc ký láng hiáu năng cao

LC-MS Liquid chromatography- Mass

spectrometry SÁc ký láng ghép khãi phá LC-

MS/MS

Liquid chromatography tandem mass

spectrometry SÁc ký láng khãi phá kép

chuát MRM Multiple reaction monitoring Kỹ thu¿t khÁo sát

đa ion cô l¿p

PSP Paralytic shellfish poisons Đác tã gây tê liát á

đáng v¿t có vá

SPR Surface plasmon resonance CÁm biÁn cáng h°áng

TCBA Tissue culture bioassay Ph°¢ng pháp thā nghiám

trên mô tÁ bào RSD Relative standard deviation Đá lách chu¿n t°¢ng đãi

DANH MĀC CÁC HÌNH VẼ

Hình 1 1 Cấu trúc hóa hßc TTX 12Hình 1 2 Mát sã dÁn xuất cÿa TTX 14Hình 1 3 Tetrodotoxin ngăn kênh v¿n chuyển natri 15Hình 1 4 MÁu ãc Nassarius papillosus và Nassarius glans gây ngá đác t¿i

V¿n Ninh, Khánh Hòa ngày 11/9/2020 16Hình 1 5 Phá hßng ngo¿i cÿa TTX 21Hình 1 6 SÁc ký đß HPLC-FLD cÿa TTXs chu¿n và 23Hình 1 7 Phá khãi phân giÁi LC-MS/MS cÿa 3 loài (A) Oliva annulata, (B) Oliva lignaria, (C) Oliva hirasei và (D) TTX 24

Hình 1.8 SÁc ký đß LC-MS, mÁu chu¿n TTXs (A) và các mÁu thā

F.niphobles (B), T.nigrovirids (C), T.biocellatus (D) 25

Hình 2 1 ThiÁt bá LC-MS/MS t¿i phòng thí nghiám và An toàn thāc ph¿m và môi tr°ßng (Khu vāc miÃn Trung) 30Hình 2 2 MÁu ãc (a) Nassarius glans, (b) Nassarius papillosus 31

Hình 3 1 SÁc ký đß LCMS/MS cÿa TTXs chu¿n với các thÁ phân mÁnh 25V, -27V, -29V 36 Hình 3 2 SÁc ký đß LC-MS/MS cÿa TTXs chu¿n với các thÁ phân mÁnh -38V, - 40V, -42V 37Hình 3 3 Đß thá ch°¢ng trình gradient 1 39Hình 3 4.SÁc ký đß LC-MS/MS cÿa TTXs chu¿n theo ch°¢ng trình gradient

-1 39Hình 3 5 Đß thá ch°¢ng trình gradient 2 40Hình 3 6 SÁc ký đß LC-MS/MS cÿa TTXs chu¿n theo ch°¢ng trình gradient

2 40Hình 3 7 SÁc ký đß LC-MS/MS cÿa TTXs chu¿n với tãc đá dòng 0,4 ml/phút 41

Hình 3 8 SÁc ký đß LC-MS/MS cÿa TTXs chu¿n với tãc đá dòng 0,6

ml/phút 42

Hình 3 9 S¢ đß xā lý mÁu dā kiÁn 44

Hình 3 10 Đß thá Ánh h°áng cÿa nßng đá acid acetic đÁn hiáu suất thu hßi TTXs 47

Hình 3 11 Đß thá Ánh h°áng cÿa thể tích rāa giÁi đÁn hiáu suất thu hßi TTXs 50

Hình 3 12 S¢ đß quy trình xā lý mÁu 51

Hình 3 13 Đß thá sā phụ thuác dián tích peak vào nßng đá TTX 54

Hình 3 14 Đß thá sā phụ thuác dián tích peak vào nßng đá 4-epiTTX 54

Hình 3 15 Đß thá sā phụ thuác dián tích peak vào nßng đá 4,9-anhydroTTX 55

DANH MĀC CÁC BÀNG

BÁng 2 1 Sã l°āng và khãi l°āng trung bình cÿa 2 loài ãc bùn thu á vùng

biển Khánh Hòa 31

BÁng 2 2 Nßng đá dãy các dung dách chu¿n 34

BÁng 3 1 Thông sã điÃu kián tãi °u phân tích TTXs bằng LC-MS/MS 43

BÁng 3 2 KÁt quÁ Ánh h°áng cÿa nßng đá acid acetic đÁn hiáu suất thu hßi TTX 45

BÁng 3 3 KÁt quÁ Ánh h°áng cÿa nßng đá acid acetic đÁn hiáu suất thu hßi 4-epiTTX 46

BÁng 3 4 KÁt quÁ Ánh h°áng cÿa nßng đá acid acetic đÁn hiáu suất thu hßi 4,9-anhydroTTX 46

BÁng 3 5 KÁt quÁ Ánh h°áng thể tích rāa giÁi đÁn hiáu suất thu hßi TTX 48

BÁng 3 6 KÁt quÁ Ánh h°áng thể tích rāa giÁi đÁn hiáu suất thu hßi 4-epiTTX 49

BÁng 3 7 KÁt quÁ Ánh h°áng thể tích rāa giÁi đÁn hiáu suất thu hßi 4,9-anhydroTTX 49

BÁng 3 8 Sā phụ thuác dián tích peak vào nßng đá TTXs 53

BÁng 3 9 KÁt quÁ khÁo sát khoÁng tuyÁn tính và đ°ßng chu¿n cÿa TTXs 55

BÁng 3 10 Đá lặp l¿i cÿa ph°¢ng pháp 57

BÁng 3 11 Hiáu suất thu hßi cÿa ph°¢ng pháp 57

BÁng 3 12 KÁt quÁ phân tích 15 mÁu ãc loài N glans 59

BÁng 3 13 KÁt quÁ phân tích 20 mÁu ãc loài N papillosus 60

DANH MĀC CÁC PHĀ LĀC

Phụ lục 1 SÁc ký đß LC-MS/MS phân tích các mÁu ãc N glans 69 Phụ lục 2 SÁc ký đß LC-MS/MS phân tích các mÁu ãc N papillosus 70

à Viát Nam, tÿ 2007 đÁn nay, mßi năm đÃu ghi nh¿n các vụ ngá đác TTXs trong ãc biển xÁy ra chÿ yÁu á các cùng ven biển Thanh Hóa, Ninh Thu¿n, Khánh Hòa Mặc dù đ°āc rất nhiÃu sā quan tâm nghiên cāu và đác tã TTXs với các ph°¢ng pháp, kỹ thu¿t phân tích khác nhau, nh°ng đÁn nay á Viát Nam ch°a có nhiÃu công bã và và phân tích đác tã này á ãc biển bằng kỹ thu¿t sÁc ký láng khãi phá kép LC-MS/MS Đây là kỹ thu¿t hián đ¿i với đá nh¿y, đá đặc hiáu và đá chính xác rất cao giúp phát hián chính xác đác tã TTX và các đßng phân cÿa nó, đáp āng đ°āc tiêu chu¿n và sã liáu đác tã TTXs trong sinh v¿t biển so với thÁ giới Vì v¿y, viác thāc hián đà tài <Xây

dăng quy trình phân tích đßc tã tetrodotoxins trong ãc biển ã Viát Nam bằng LC-MS/MS= là cần thiÁt, có ý nghĩa khoa hßc và thāc tißn

Māc đích nghiên cāu

Đ°a ra đ°āc quy trình xác đánh đác tã tetrodotoxins á ãc biển có đá tin c¿y và chính xác cao, phù hāp với điÃu kián trang thiÁt bá t¿i Viát Nam

Nßi dung nghiên cāu

- KhÁo sát nßng đá acid acetic dùng tách chiÁt đác tã TTXs tÿ 1-2 loài

ãc biển tā nhiên;

- KhÁo sát mát sã điÃu kián tách chiÁt và tinh s¿ch đác tã TTXs tÿ ãc biển;

- KhÁo sát mát sã điÃu kián phân tích đác tã TTXs tÿ mÁu chiÁt bằng ph°¢ng pháp sÁc ký láng khãi phá kép (LC-MS/MS)

- Xây dāng quy trình thāc nghiám phân tích đác tã trong ãc biển TTXs

bằng ph°¢ng pháp LC-MS/MS

- Đánh giá kÁt quÁ cÿa quy trình thāc nghiám trên c¢ sá so sánh, đãi chiÁu với sã liáu kiểm chāng

C¢ sã khoa hßc và tính thăc tißn cÿa đÁ tài

Dāa trên nhÿng tiÁn bá khoa hßc- kỹ thu¿t và công nghá, trong lu¿n án này tôi đà xuất nghiên cāu xây dāng quy trình thāc nghiám phân tích TTXs

bằng LC-MS/MS, phù hāp với điÃu kián trang thiÁt bá t¿i phòng thí nghiám

An toàn thāc ph¿m và môi tr°ßng (Khu vāc miÃn Trung), Vián HÁi d°¢ng hßc đÁm bÁo đá chính xác và tin c¿y ph°¢ng pháp phân tích Đãi t°āng nghiên cāu là mát sã loài ãc biển th°ßng gây ngá đác t¿i vùng biển Nha Trang, Khánh Hòa KÁt quÁ cÿa đà tài là dÁn liáu khoa hßc tin c¿y phục vụ công tác quÁn lý an toàn thāc ph¿m biển và là tiÃn đà cần thiÁt để có sã liáu phân tích chính xác phục vụ cho nhÿng công trình công bã quãc tÁ và đác tã TTXs trong sinh v¿t biển t¿i Viát Nam

Nhāng đóng góp cÿa luÃn văn

- ĐÃ xuất đ°āc ph°¢ng pháp tách chiÁt, tinh s¿ch đác tã TTXs trong

mÁu ãc để phân tích bằng LC-MS/MS

- Xây dāng đ°āc quy trình phân tích đác tã TTXs trong mÁu ãc biển

bằng (LC-MS/MS) có đá chính xác cao

Ch°¢ng 1 TàNG QUAN NGHIÊN CĀU

1.1 ĐÞC Tâ TETRODOTOXIN

1.1.1 Đặc tính, c¿u trúc hóa hßc

Tetrodotoxin là mát trong nhÿng chất đác phi protein m¿nh nhất cũng nh° chất đác tā nhiên biển đ°āc biÁt đÁn nhiÃu nhất Năm 1909, TiÁn sĩ Yoshizumi Tahara đ°a ra xác nh¿n rằng cá nóc chāa mát lo¿i chất đác và đặt tên là Tetrodotoxin theo tên cÿa hß cá nóc mà nó đ°āc phân l¿p lần đầu tiên- Tetraodontidae [1] Cấu trúc cÿa chất đác này đã đ°āc xác đánh bái Tsuda và cáng sā [2], Goto và cáng sā [3] TTX là dÁn xuất aminoperhydroquinaoline, hāp chất dá vòng có công thāc phân tā C11H17O8N3 và có cấu trúc hóa hßc đ°āc mô tÁ nh° hình 1.1

Hình 1 1 Cấu trúc hóa hßc TTX[3]

TTX là tetrahydroxy-6-(hydroxymethyl)-2,3,4,41,5,6,7,8-octahydro-1H-8a,10-

VÃ đặc tính, TTX là mát lo¿i bát không màu TTX trá nên sÁm màu

á khoÁng 220oC nh°ng không nóng chÁy [4], có cấu trúc l°ÿng cāc [5] tan trong n°ớc, bÃn nhiát Sā có mặt nhóm guanidine perhydroquinazoline (guanidin có tính baz¢ m¿nh) trong phân tā làm cho TTX dß tan trong dung dách axit Ngoài ra do TTX cấu trúc ester nên dß bá thÿy phân trong dung dách có tính axit m¿nh hoặc kiÃm m¿nh Môi tr°ßng để đÁm bÁo cấu trúc TTX án đánh trong dung dách là trong axit hÿu c¢ yÁu [6]

Phân tā TTX có 6 nhóm OH á vá trí C4, C6, C8, C9, C10, C11 á mßi vá trí gÁn thêm nhóm guaidin có tính kiÃm m¿nh Cấu trúc TTX thay đái liên quan đÁn mát hay nhiÃu nhóm OH, chúng có ái lāc với màng tÁ bào não, á

đó có chāa nhiÃu kênh v¿n chuyển ion Na+ Nghiên cāu cho thấy kênh v¿n chuyển ion Na+ bá đóng khi dùng TTX với nßng đá 1,8 nM [7]

1.1.2 Mßt sã dÁn ch¿t cÿa Tetrodotoxin

Trong tā nhiên, TTX cùng tßn t¿i với các dÁn xuất cÿa nó Cho đÁn nay

đã có 30 cấu trúc cÿa TTX đã đ°āc báo cáo và đác tính thay đái tùy theo cấu trúc [8] Các dÁn xuất deoxy cÿa TTX thì ít đác h¢n TTX nh°ng các dÁn xuất hydroxyl đác h¢n TTX NhiÃu nghiên cāu đã phát hián các dÁn chất cÿa TTX nh° 4-epiTTX; 4,9-anhydroTTX; 5,6,11-trideoxyTTX [8] trong trāng loài cá

nócFugu poecilonotus và Fugu pardalis [9]; 6-epiTTX trong cá nóc Spheroids Spengler [10] và các loài khác nh° loài sa giông Cynops ensicauda

[11], ãc Nassarius glans, b¿ch tuác đãm xanh Hapalochlaena [12]…Mát sã

cấu trúc cÿa các dÁn xuất TTXs đ°āc mô tÁ trong hình 1.2

Hình 1 2 Mát sã dÁn xuất cÿa TTX [8]

1.1.3 Đßc tính Tetrodotoxin

Đác tính cÿa TTX th°ßng đ°āc biÁt đÁn đác h¢n mát nghìn lần so (1200 lần) với Cyanua và hián ch°a có thuãc giÁi đác đặc hiáu [9] Trong các thā nghiám sinh hßc trên chuát, liÃu gây chÁt trung bình LD50đ°āc phát hián

là 10 µg/kg khi ăn phÁi chất đác và tÿ 1 đÁn 2 mg TTX là đÿ để gây chÁt cho mát ng°ßi tr°áng thành [13], [14]

Theo nghiên cāu cÿa Kao [15], liÃu gây chÁt tãi thiểu cÿa TTX trên mát

sã loài đáng v¿t qua đ°ßng tiêm d°ới da nh° [10]: Ách: 5 µg/kg; gà mái: 6

µg/kg; chuát nhÁt: 8 µg/kg; bß câu 2,7 µg/kg; thá: 8 µg/kg; mèo: 10 µg/kg

1.1.4 C¢ ch¿ ho¿t đßng

C¢ chÁ gây đác cÿa TTX trong c¢ thể là āc chÁ kênh trao đái ion natri v¿n đáng qua màng tÁ bào thần kinh với LD50 9µg/kg (tiêm phúc m¿c) TTX ho¿t đáng bằng cách chặn các kênh natri, làm mất sā lan truyÃn tín hiáu thần kinh đÁn màng tÁ bào quan trßng cÿa tÁ bào c¢ tim, c¢ x°¢ng, há thần kinh trung °¢ng và ngo¿i biên [16]dÁn đÁn các triáu chāng điển hình và th¿m chí nặng nhất là tā vong [17], [13]

Hình 1 3 Tetrodotoxin ngăn kênh v¿n chuyển natri [13]

Cấp đá cÿa triáu chāng ngá đác TTXs đ°āc Tani và cáng sā đ°a ra năm 2009 [18] Cấp đá 1 bao gßm các dấu hiáu tê liát bao gßm tê môi và đầu l°ÿi và các vấn đà tiêu hóa nh° nôn māa Cấp đá 2 là tê liát lan đÁn tā chi, đau đầu Cấp đá 3 làm tăng các triáu chāng thần kinh c¢ (nh° chāng khó nuãt, chāng mất ngôn ngÿ, hôn mê, mất phãi hāp, mất điÃu hòa, cÁm giác bßng bÃnh, liát dây thần kinh sß, c¢ co gi¿t) và đi kèm các triáu chāng tim m¿ch (h¿ huyÁt áp hoặc tăng huyÁt áp, rãi lo¿n nháp tim, nháp tim nhanh và bất th°ßng, tím tái, xanh xao, khó thá) Trong nhÿng tr°ßng hāp nghiêm trßng dÁn đÁn cấp đá 4, n¿n nhân tê liát hoàn toàn, suy tim và dÁn đÁn tā vong

1.1.5 Tetrodotoxins trong ãc biển

Các vùng biển trên thÁ giới có rất nhiÃu thÿy sÁn chāa đác tã TTXs sinh sãng, đặc biát á các vùng biển nhiát đới Trong đó, đác tã TTXs trong mát sã loài ãc biển đã đ°āc ghi nh¿n bái nhiÃu nhóm nghiên cāu nh° Noguchi và cáng sā [19], Hwang và cáng sā [20], Taniyama và cáng sā [18], Đặng Quãc Minh và cáng sā [21] Đác tã TTX đ°āc tìm thấy trong

nhiÃu loài ãc nh° ãc mặt trăng (Turban), ãc đụn (The top of shells), ãc h°¢ng Nh¿t BÁn (Babylonia japonica), ãc bùn (Niotha, Zeuxis) Tÿ năm 1985 đÁn

2004, t¿i Trung Quãc đã có ít nhất 28 vụ ngá đác Ngoài ra, mát sã tr°ßng hāp đ°āc ghi nh¿n do ngá đác TTXs khi ăn ãc biển t¿i Đài Loan, Nh¿t BÁn, Brunei [22], [23], [19], [20] Đác tính TTXs tính theo đ¢n vá chuát (MU)

trong loài Nassarius glans theo ghi nh¿n cÿa Tani tÿ 725 đÁn 9860 MU/cá thể [15] T¿i Viát Nam, tÿ năm 2006 đÁn 2020, tình hình ngá đác ãc biển do TTXs xÁy ra rÁi rác á các đáa ph°¢ng ven biển nh° QuÁng Ngãi, Bình Thu¿n,

Khánh Hòa gây ra mát sã tr°ßng hāp tā vong Theo khÁo sát, đa sã các loài

ãc này thuác hß Nasariidae cụ thể là ãc bùn răng c°a có tên khoa hßc Nassarius papillosus và ãc bùn bóng, có tên khoa hßc Nassarius glans [16],

[21] Theo nghiên cāu Đặng Quãc Minh và cáng sā, các loài N Pullus, N conoidalis conoidalis và N glans đ°āc xác đánh chāa hàm l°āng cao đác tã TTXs, trung bình tÿ 368-2625 MU/cá thể, đác tính v°āt ng°ÿng cho phép [16]

Hình 1 4 MÁu ãc Nassarius papillosus và Nassarius glans

gây ngá đác t¿i V¿n Ninh, Khánh Hòa ngày 11/9/2020

1.2 MÞT Sâ PH¯¡NG PHÁP PHÂN TÍCH TETRODOTOXINS

Quy trình xác đánh đác tã TTXs trong sinh v¿t biển nói chung cũng nh° trong ãc biển nói riêng đã đ°āc nghiên cāu ráng rãi bái các nhà khoa hßc Có

mát sã ph°¢ng pháp khác nhau đã đ°āc phát triển nh°ng nhìn chung t¿p trung vào 2 nhóm ph°¢ng pháp chính

1.2.1 Ph°¢ng pháp thÿ nghiám sinh hßc

Xét nghiám sinh hóa chuát MBA (Mouse bioassay) là ph°¢ng pháp chính để phát hián đác tã trong đáng v¿t có vá đ°āc áp dụng nhiÃu n°ớc trên

thÁ giới Trong các xét nghiám sinh hßc trên chuát, chất chiÁt tÿ mÁu đ°āc đ°a vào c¢ thể đáng v¿t thí nghiám và sau đó thßi gian chÁt đ°āc theo dõi

Để biÁt nßng đá TTX trong mÁu nghiên cāu, thā nghiám sinh hßc trên chuát đ°āc thāc hián bằng cách tiêm phúc m¿c Sau khi tiêm chất chiÁt TTX, chuát thā nghiám bÁt đầu xuất hián các dấu hiáu và triáu chāng đặc tr°ng nh° cào x°ớc vai, miáng bằng chân sau, yÁu dần đÁn liát á chân sau, cā đáng không phãi hāp, thá nông, co gi¿t, nhÁy, tiÁp theo là suy hô hấp và cuãi cùng

bi chÁt Đác tính cÿa chất chiÁt chāa TTX đ°āc biểu thá bằng đ¢n vá chuát

MU Quy đánh đ¢n vá chuát (MU) là l°āng đác tã TTX tãi thiểu gây chÁt chuát có trßng l°āng 18 - 20 g trong vòng 30 phút

Hashimoto và Noguchi [9] đã xác đánh chính xác hàm l°āng đác tã TTX á cÿa cá bãng t°āng sā dụng đ°ßng cong này quan há giÿa liÃu l°āng

và thßi gian chÁt cÿa chuát Mát lo¿t các dung dách thā nghiám đ°āc chu¿n bá bằng cách pha loãng dách chiÁt đác tã ch°a biÁt với acid acetic 0,1% Mát l°āng nhá các dung dách này đ°āc tiêm vào màng bụng mát nhóm chuát Đ°ßng cong thßi gian chÁt đ°āc v¿ dāa vào giá trá trung bình cÿa thßi gian chuát chÁt á mßi nßng đá pha loãng

Để xác đánh đác tã trong đáng v¿t chân bụng biển (Nassarius glans)

trong vụ ngá đác ãc biển gây tā vong trên đÁo TungSa á Đài Loan vào tháng

4 năm 2004, Hwang và cáng sā [24] đã thu th¿p 20 mÁu ãc gây ngá đác để làm mÁu phân tích Các mô mÃm tách ra đ°āc làm nhuyßn với acid axetic 1% trong methanol trong vòng 5 phút và ly tâm Dách chiÁt đ°āc làm khô á 45oC

sā dụng há thãng cô quay chân không và đ°āc kiểm tra đác tính TTX trên dòng chuát nhÁt trÁng ICR kháe m¿nh, khãi l°āng tÿ 18-20 gam KÁt quÁ xác

đánh đ°āc đác tính trung bình cÿa tÿng mÁu ãc N glans khác nhau trong

nghiên cāu này là 5.1886 ±1.959 MU

MBA cho đÁn nay vÁn đ°āc sā dụng trong mát sã tr°ßng hāp Tuy nhiên, do có mát sã h¿n chÁ nh° lý do đ¿o đāc, viác sā dụng MBA đãi với mát sã nhóm đác tã biển chß là ph°¢ng pháp tham khÁo Ngoài ra, MBA không thể cung cấp thông tin và thành phần đác tã cũng nh° phân biát đ°āc TTXs với các chất đác thần kinh khác nh° chất đác gây tê liát á đáng v¿t có

vá (PSP) á mát sã loài đáng v¿t biển chāa đßng thßi cÁ 2 lo¿i này Thêm vào

đó, các nh°āc điểm khác cÿa kỹ thu¿t này còn tßn t¿i, nh° thßi gian thā nghiám kéo dài, thiÁu tính đặc hiáu và dÁn đÁn các kÁt quÁ d°¢ng tính giÁ

cao Vì nhÿng lý do này, nhu cầu phát triển các ph°¢ng pháp thay thÁ MBA

đã đ°āc nghiên cāu ráng rãi

Mát trong nhÿng ph°¢ng pháp giúp phát hián đác tã nhanh chóng là

cÁm biÁn cáng h°áng plasmon bà mặt SPR (Surface Plasmon Resonance) SPR cho phép xác đánh các thông sã đáng hßc cÿa t°¢ng tác phân tā, nh°ng

nó cũng đ°āc sā dụng để đánh l°āng chất phân tích trong các nÃn mÁu phāc

t¿p

Năm 2013, Campbell và cáng sā [27] đã phát triển ph°¢ng pháp xét nghiám SPR phát hián TTX đ¢n giÁn và nhanh chóng á đáng v¿t chân bụng á Châu Âu Mô mÃm đáng v¿t chân bụng hoặc cá nóc đ°āc chiÁt bằng dung

dách đám natri axetat, pH =5,0 Dách chiÁt đ°āc pha loãng 1:20 trong dung

dách đám pH =7,4 Dung dách kháng thể đ°āc trán với l°āng bằng nhau cÿa dung dách hiáu chu¿n hoặc mÁu và đ°āc tiêm trên bà mặt chip với tãc đá dòng 12 µl/phút trong 2 phút Viác đßc các đ¢n vá đáp āng cÿa thiÁt bá đ°āc

thāc hián 10 giây tr°ớc và 30 giây sau mßi lần b¢m để xác đánh sā khác biát

và đ¢n vá cÿa đáp āng thiÁt bá t°¢ng đãi với tÿng chất hiáu chu¿n hoặc mÁu

BÃ mặt chip đ°āc tái sinh bằng hßn hāp với tß lá 1:1 acid clohydric (10 nM)

và dung dách natri dodecyl sulfate 1% có pH 1,75 Mát chu kỳ phân tích điển hình đ°āc hoàn thành trong khoÁng 6 phút và mßi chất chu¿n đ°āc phân tích

lặp l¿i [9] Quy trình chiÁt xuất đ¢n đã đ°āc áp dụng để thúc đ¿y tính nhanh chóng cÿa thā nghiám Viác chu¿n bá mÁu đ¢n giÁn này cho phép chiÁt xuất

40 mÁu mßi giß với tãc đá phát hián nhanh 6 phút mßi lần phân tích Tuy nhiên SPR có đá nh¿y kém h¢n thā nghiám sinh hßc truyÃn thãng vì ph°¢ng pháp này cháu Ánh h°áng lớn bái các điÃu kián bên ngoài Tất cÁ các yÁu tã làm thay đái chß sã khúc x¿ trên bà mặt cÁm biÁn làm cÁn trá quá trình phân tích nh° nÃn mÁu không đßng nhất, phāc t¿p và các liên kÁt không đặc hiáu [28]

Ph°¢ng pháp thā nghiám trên mô tÁ bào TCBA (Tissue Culture Bioassay) này có thể thay thÁ cho MBA TCBA phát hián cÁ TTX và STX do

các đác tã này có c¢ chÁ ho¿t đáng t°¢ng tā Kogure và cáng sā [29] nh¿n thấy rằng tÁ bào u nguyên bào thần kinh cÿa chuát Neuro-2a có thể đ°āc āng dụng trong viác xác đánh TTX Ouabain hoặc veratridine đ°āc thêm vào các

tÁ bào nuôi cấy, làm giÁm khÁ năng tßn t¿i cÿa chúng bằng cách tăng dòng ion natri vào tÁ bào và TTX, ho¿t đáng nh° mát chất chặn kênh natri, s¿ vô hiáu hóa phÁn āng giúp tÁ bào tiÁp tục phát triển TÁ bào đ°āc nuôi bá sung 13,3

% huyÁt thanh bò trong môi tr°ßng ¿m có chāa 5% CO2- 95% không khí á

37oC TÁ bào đ°āc nuôi cấy bằng dung dách 0,5% tryspin – 0,2% EDTA Ít nhất 200 tÁ bào trong mßi giÁng đ°āc chßn ngÁu nhiên và theo dõi Hàm l°āng TTX đ°āc °ớc tính tÿ mãi quan há giÿa nßng đá TTX và tỷ lá phần trăm tÁ bào sãng

Trên c¢ sá cÿa ph°¢ng pháp, Hamasaki và cáng sā [30] đã cÁi tiÁn bằng cách sā dụng muãi tetrazolium, 3-(4,5-dimetyl-2-thiazolyl) -2,5 diphenyl-2H tetrazolium bromide và đo tā đáng đĩa microplate để giÁm thßi gian Các muãi tetrazolium bá phân cÁt bái enzym dehydrogenase trong ti thể, t¿o ra tinh thể formazan màu xanh lam đ¿m Do đó, xét nghiám dß thāc hián h¢n và kÁt quÁ có thể lặp l¿i, đ¢n giÁn, rẻ tiÃn và có thể thay thÁ cho ph°¢ng pháp thā nghiám sinh hóa chuát Tuy nhiên, ph°¢ng pháp này vÁn có khÁ năng bá Ánh h°áng bái tay nghà cÿa kỹ thu¿t viên vì cần phÁi có các b°ớc rāa

để lo¿i bá thuãc nhuám hoặc tÁ bào chÁt tā do Ngoài ra, nó cũng ch°a phân biát các chất đác và các hóa chất khác có khÁ năng āc chÁ dòng natri

Ph°¢ng pháp xét nghiám hấp thụ mißn dách liên kÁt với enzyme (ELISA) sā dụng hiáu quÁ trong viác phát hián và đánh l°āng peptides, protein, antibodies, hormone, trong các mÁu sinh hßc

Trong nghiên cāu ngá đác TTX khi ăn cá nóc á Bangladesh, Islam và

cáng sā [31] sā dụng mát kháng thể kháng nguyên l¿i TTX để xác đánh nßng

đá TTX trong n°ớc tiểu và máu tÿ 38 bánh nhân [32] KÁt quÁ TTX á d°ới māc phát hián (< 1,6 ng/ml) trong 11 mÁu máu nh°ng phát hián đác tã trong n°ớc tiểu Ngy và cáng sā [33], Reverté và cáng sā [34] cũng đã phát triển ph°¢ng pháp này để phát hián đác tã tetrodotoxin trong hàu và trai Ph°¢ng pháp này có lāi thÁ sàng lßc TTX trong các mÁu đáng v¿t hai mÁnh vá có thể

đ¢n giÁn hóa, thßi gian phân tích nhanh nh°ng ELISA tãn nhiÃu công sāc và tãn kém để chu¿n bá kháng thể, ph°¢ng pháp thiÁu tính án đánh, sā āc chÁ không đÿ kháng nguyên mißn dách có thể dÁn đÁn kÁt quÁ sai, mát sã tr°ßng hāp cho kÁt quÁ d°¢ng tính giÁ hoặc âm tính giÁ và đặc biát là chi phí phân tích rất cao nên āng dụng ch°a đ°āc phá biÁn

1.2.2 Ph°¢ng pháp hóa hßc

Bên c¿nh các ph°¢ng pháp sinh hßc cùng với sā phát triển cÿa hóa

phân tích hián đ¿i nhằm phát hián l°āng vÁt đác tã và các dÁn xuất cÿa nó chính xác h¢n, các nhà khoa hßc nghiên cāu phân tích đác tã TTXs bằng các ph°¢ng pháp hóa hßc nh° sÁc ký bÁn máng, quang phá, sÁc ký khí kÁt hāp với khãi phá GC-MS, kỹ thu¿t sÁc ký láng hiáu năng cao HPLC, kỹ thu¿t sÁc

ký láng khãi phá LC-MS hoặc LC-MS/MS đã đ°āc phát triển Quy trình này th°ßng gßm các b°ớc c¢ bÁn nh° chiÁt tách, tinh s¿ch, phân tích và xā lý sã liáu

Theo mát sã nhóm nghiên cāu [35] [36], ph°¢ng pháp sÁc ký lớp máng TLC (Thin layer chromatography) đ°āc sā dụng để xác đánh hāp chất TTX bằng cách sā dụng bÁn máng silica gel Tấm này đ°āc theo dõi với 2 lo¿i dung môi: dung môi 1 (pyridin – ethyl acetat – acid acetic – n°ớc) với tỷ lá 15:5:3:4 và dung môi 2 (butanol – acid acetic – n°ớc) với tỷ lá 2:1:1 L°āng dung môi tăng lên nhß tác đáng cÿa mao dÁn và thu đ°āc sā phân tách sÁc ký Đác tã s¿ hiển thá huỳnh quang t¿i b°ớc sóng 365 nm Thuãc thā màu đ°āc

sā dụng là dung dách KOH 10% hoặc thuãc thā Weber

Mát ph°¢ng pháp hiáu quÁ để xác đánh các nhóm chāc các chất là sā dụng quang phá hßng ngo¿i IR (Infrared Spectroscopy) Mặc dù phá IR đ°āc cho là phāc t¿p nh°ng nó vÁn góp phần đánh danh TTX Năm 1984, Onoue đã

sā dụng phá IR sā dụng để đánh tính đác tã TTX trong cá nóc [37] Manabu Asakawa và cáng sā [37] cũng đã đ°a ra nghiên cāu phá muãi TTX-HCl

đ°āc phân l¿p tÿ loài Caphalothrix sp á vánh Hiroshima Các dÁi hấp thụ á

3353, 3235, 1666, 1612 và 1076 cm-1 đ°āc quan sát thấy trong quang phá cÿa

tinh thể này cho thấy sā hấp thụ đặc tr°ng các nhóm chāc OH, guanidin và COO- cÿa TTX (Xem hình 1.6)

Hình 1 5 Phá hßng ngo¿i cÿa TTX [37]

SÁc ký khí GC (Gas chromatography) và khãi phá MS (Mass spectrum)

t¿o thành mát sā kÁt hāp hiáu quÁ để phân tích hóa hßc Ph°¢ng pháp GC-MS

là ph°¢ng pháp gián tiÁp để phát hián TTX và các dÁn chất cÿa nó [38], [39]

Tÿ năm 1984, Noguchi và cáng sā [19] đã tách chiÁt đác tã TTX trong nhuyßn thể đáng v¿t chân bụng (Ách) á Nh¿t BÁn bằng các dung dách acid

acetic và methanol, phân tích bằng ph°¢ng pháp GC-MS cho thấy rằng nó chāa khung quinazoline đặc tr°ng cho TTX Viác sàng lßc đác tã tetrodotoxin

á cá nóc, phân tích đá nh¿y cÿa TTX trong huyÁt t°¢ng ng°ßi sā dụng ph°¢ng pháp GC-MS đã đ°āc báo cáo [40], [41] Trong các báo cáo sā dụng

mô cá nóc nặng 0,5 g đ°āc xā lý bằng 5 ml acid acetic 0,1%, sau đó thÿy phân bằng kiÃm KÁt hāp kỹ thu¿t chiÁt chất láng-láng và t¿o dÁn xuất N-methyl -N-TMS-trifluoroacetamide Ph°¢ng pháp đã chß sā dụng mát l°āng mÁu nhá và dung môi, quy trình chiÁt láng láng đ°āc đ¢n giÁn hóa cũng nh° phân tích sÁc ký ngÁn (8,2 phút)

1.2.2.4 Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao

Ph°¢ng pháp sÁc ký láng hiáu năng cao HPLC (High performance liquid chromatography) dāa trên sā phân tách giÿa pha đáng và pha tĩnh nên

có thể āng dụng để phân tích TTXs NhiÃu nghiên cāu đã sā dụng ph°¢ng pháp thay đái các detector cho thấy kÁt quÁ đá nh¿y, giới h¿n phát hián và giới h¿n đánh l°āng khác nhau

Năm 1998, Chen và cáng sā sā dụng HPLC với đầu dò huỳnh quang để

đánh l°āng TTX trong cá nóc N Lineatai cho kÁt quÁ khoÁng tuyÁn tính rất

tãt tÿ 10-2000 ng và giới h¿n phát hián là 10 ng Mát quy trình đ°āc Margaget và cáng sā [44] đ°a ra và phát triển bằng cách sā dụng ph°¢ng pháp chiÁt pha rÁn để làm s¿ch mÁu huyÁt thanh và n°ớc tiểu cÿa bánh nhân

bá nhißm đác TTX sau đó phân tích các mÁu bằng sÁc ký láng hiáu năng cao với đầu dò huỳnh quang Nßng đá TTX tãi thiểu có thể đánh l°āng đ°āc lần l°āt là 5 và 20 ng/ml đãi với huyÁt thanh và n°ớc tiểu Đ°ßng chu¿n là tuyÁn tính trong khoÁng 20–300 ng/ml đãi với n°ớc tiểu và 5–20 ng/ml đãi với huyÁt thanh Nhằm mục đích đánh l°āng TTX trong mÁu huyÁt t°¢ng và n°ớc tiểu ng°ßi, Yu và cáng sā [43] cũng thu đ°āc giới h¿n phát hián là 10 ng/ml khi sā dụng sÁc ký láng hiáu năng cao gép đầu dò diode

à Viát Nam, ph°¢ng pháp sÁc kỷ láng hiáu năng cao đ°āc nhóm các nhà khoa hßc āng dụng ph°¢ng pháp phân tích đác tã TTX trong ãc h°¢ng đ°āc nuôi bằng thāc ăn chÁ biÁn tÿ cá nóc trong sÁn ph¿m n°ớc mÁm chÁ

biÁn tÿ các nóc đác chấm cam [47] hoặc trong mát sã loài ãc bùn tā nhiên gây

ngá đác [21] ( Xem hình 1.7)

Hình 1 6 SÁc ký đß HPLC-FLD cÿa TTXs chu¿n và

mát sã mÁu ãc thu á vùng biển Khánh Hòa, tháng 6/2015 [21]

Khi nghiên cāu các ph°¢ng pháp phân tích hóa hßc hián đ¿i đãi với TTXs, các nhà nghiên cāu nh¿n thấy c°ßng đá huỳnh quang cÿa 6-epiTTX và 11-norTTX-6(R)-ol cao gấp 20 lần và 10 lần so với TTX, trong khi 5-deoxyTTX và 11-deoxyTTX có c°ßng đá huỳnh quang chß bằng 1/20 và 1/100 cÿa TTX [47] Nh° v¿y, khi sā dụng há thãng thiÁt bá HLPC-FLD có thể làm Ánh h°áng đáng kể đÁn giới h¿n phát hián TTXs và đá nh¿y cÿa ph°¢ng pháp Ph°¢ng pháp sÁc ký láng ghép đầu dò khãi phá có thể khÁc phục h¿n chÁ này bái nó làm tăng khÁ năng phát hián TTXs mát cách chính xác và hiáu quÁ h¢n Ph°¢ng pháp sÁc ký láng khãi phá LC-MS (Liquid chromatography Mass spectrum) là ph°¢ng pháp có tính āng dụng cao và đang dần trá nên trong phân tích các đác tã trên nÃn mÁu sinh hßc

Nhóm nghiên cāu Tsai và cáng sā [48] sā dụng ph°¢ng pháp LC-MS

để đánh l°āng TTXs trong máu và n°ớc tiểu cÿa các n¿n nhân bá ngá đác khi

sā dụng cá nóc Thành phần pha đáng đ°āc sā dụng là hßn hāp 1% acetonitril, 10 mM trimethylamin, 10 mM amoniformat, tãc đá dòng tãi °u

đ°āc khÁo sát là 0,4 ml/phút và cát Zorax 300SB-C3 Ph°¢ng pháp LC-MS đ°āc xác nh¿n có hiáu quÁ h¢n ph°¢ng pháp GC-MS hay HPLC Đá phục hßi đác tã trong nÃn mÁu 88,6% và giới h¿n phát hián là 15,6 nM

Năm 2007, nhóm nghiên cāu cÿa Jen cùng các cáng sā đã phân tích

đác tã sinh v¿t biển tÿ năm loài đáng v¿t chân bụng Naitca vitellus, Natica tumidus, Oliva hirasei, Oliva lignaria và Oliva annulata đ°āc thu th¿p tÿ vùng biển Nha Trang, Khánh Hòa KÁt quÁ đã đ°a ra quy trình phân tích đác

tã STX và TTX bằng ph°¢ng pháp phân tích HPLC, kÁt hāp với ph°¢ng pháp LC-MS/MS [49] KÁt quÁ phân tích bằng LC-MS/MS các nhà nghiên cāu đã tìm thấy mÁnh phá m/z = 320 có thể gán cho [TTX + H]+và các mÁnh ion thā cấp t°¢ng āng m/z = 302 và 162 đặc tr°ng cho TTX

Hình 1 7 Phá khãi phân giÁi LC-MS/MS cÿa 3 loài

(A) Oliva annulata, (B) Oliva lignaria, (C) Oliva hirasei và (D) TTX [49]

Năm 2008, Jen và cáng sā [50] sā dụng kÁt hāp hai ph°¢ng pháp phân tích HPLC và LC-MS/MS với cát Cosmosil HILIC 150 x 4,6 mm Đác tã TTX hàm l°āng lớn đ°āc xác đánh bằng ph°¢ng pháp truyÃn thãng HPLC-

FLD Tuy nhiên, chất đác trong mÁu máu chß á d¿ng vÁt và ph°¢ng pháp LC–MS/MS mới xác nh¿n sā hián dián cÿa TTX Nghiên cāu này cho thấy rằng

LC–MS/MS kÁt hāp với chiÁt pha rÁn có khÁ năng phát hián thấp h¢n và đáng tin c¿y h¢n khi xác đánh TTX trong các mÁu máu so với LC–MS đã báo cáo tr°ớc KÁt quÁ cho thấy đá tuyÁn tính trong huyÁt thanh đ°āc quan sát thấy trong khoÁng nßng đá tÿ 1-100 ng/ml, đá phục hßi TTXs trong mÁu đÁn 90%

và giới h¿n phát hián là 0,1 ng/ml Khi so sánh với kÁt quÁ phân tích bằng HPLC có đ°ßng chu¿n tuyÁn tính 1-500 µg/ml và giới h¿n phát hián 1 µg/ml khẳng đánh ph°¢ng pháp LC-MS/MS là ph°¢ng pháp đánh l°āng TTXs có giới h¿n phát hián thấp h¢n và đáng tin c¿y

Jang và cáng sā [51] sā dụng há thãng LC-MS để phân tích đánh tính

và đánh l°āng TTXs tÿ loài cá nóc F Niphobles, T nigroviridis và T Biocellatus (Xem hình1.9)

Hình 1 8 SÁc ký đß LC-MS, mÁu chu¿n TTXs (A) và các mÁu thā

F.niphobles (B), T.nigrovirids (C), T.biocellatus (D) [51]

KÁt hāp với phân tích LC-MS/MS thu đ°āc các mÁnh ion m/z 320–162 āng với TTX và 4-epiTTX, m/z 302–162 āng với 4,9-anhydroTTX, m/z 304–

162 āng với 5-deoxyTTX và 11-deoxyTTX, m/z 288–224 āng với

6,11-dideoxyTTX, và m/z 272–162 āng với 5,6,11-trideoxyTTX Ph°¢ng pháp đ¿t giới h¿n phát hián TTXs là 0,5 nmol/g

Trong nghiên cāu cÿa Kudo và cáng sā [12] mát chất mới t°¢ng tā TTX là 6-deoxyTTX đ°āc phân l¿p tÿ bußng trāng cÿa cá nóc bằng há thãng LC-MS với với cát TSK gel Amide-80 (2,0 x 150 mm; 5 μm ) Thành phần pha đáng đ°āc tãi °u là acetonitrile - đám ammoni format 16mM (tỷ lá 7:3), tãc đá dòng 0,2 ml/phút Nghiên cāu thāc hián khÁo sát l°āng TTXs trong cá

nóc T pardalis và ãc N glans, b¿ch tuác đãm xanh Hapalochlaena sp và b¿ch tuác H maculosa Hāp chất 6-deoxyTTX cũng đ°āc xác đánh á các đáng v¿t biển khác, ãc N glans và b¿ch tuác đãm xanh bằng cách sā dụng

LC-MS

NhiÃu nghiên cāu đã chāng minh LC-MS và LC/MS-MS đã nâng cao

đá chßn lßc và đá nh¿y khi phân tích đác tã TTXs trên toàn thÁ giới Sā cÁi tiÁn thiÁt bá phân tích làm tăng hiáu quÁ trong đánh danh và xác đánh đặc tính các đßng phân đác tã TTXs Tuy nhiên, sÁc ký láng ghép đầu dò khãi phá đ¢n vÁn bá h¿n chÁ khi cần kÁt quÁ đánh l°āng hàm l°āng vÁt mát sã dÁn xuất cÿa TTX Các nghiên cāu trên cho thấy ph°¢ng pháp LC- MS/MS đáng tin c¿y, LC- MS có thể áp dụng để phân tích hàm l°āng vÁt, đá chßn lßc cao rất hÿu ích để xác đánh TTX và các dÁn chất cÿa TTX trong các chất nÃn phāc t¿p

1.3 PH¯¡NG PHÁP SÄC KÝ LàNG KHâI PHà

1.3.1 S¢ l°ÿc vÁ sÅc ký láng khãi phá

SÁc ký láng khãi phá (LC-MS) là ph°¢ng pháp phân tích hóa hßc hián đ¿i với sā kÁt hāp giÿa thiÁt bá sÁc ký láng hiáu năng cao (HPLC) và detector khãi phá (MS) Hßn hāp các chất cần phân tích trong pha đáng sau khi đ°āc tách qua cát sÁc ký s¿ đ°āc phát hián và đánh l°āng bằng detector khãi phá

Trong phân tích , ng°ßi ta th°ßng sā dụng ph°¢ng pháp LC-MS cho:

- Các hāp chất có đá phân cāc trung bình và cao, khó bay h¢i

- Phân tích thuãc trong dách sinh hßc

- Phân tích các hāp chất tā nhiên

-Tr°ßng hāp không sā dụng đ°āc các detector khác: Không phát hián đ°āc bằng detector khác hoặc trong phân tích khẳng đánh

- Nét nái b¿t cÿa phân tích khãi phá là tính chßn lßc và đá nh¿y, đá đặc hiáu cao Giới h¿n phát hián có thể đÁn 10-14 gam Do v¿y th°ßng dùng kỹ thu¿t này để phân tích hàm l°āng siêu vÁt trong mÁu thành phần phāc t¿p

1.3.2 Thi¿t bß sÅc ký láng khãi phá

Mát trong các yÁu tã Ánh h°áng đáng kể đÁn sā phân tách cÿa quá trình sÁc ký là thành phần pha đáng Thông th°ßng, pha đáng là hai dung môi (hÿu c¢ hoặc dung dách n°ớc) hoà tan vào nhau với tỷ lá thích hāp để có khÁ năng phân tách với đá phân giÁi cao

1.3.3 Mßt sã ch¿ đß trong sÅc ký láng khãi phá

Với mát hßn hāp nhiÃu chất, sau khi đ°āc tách ra qua cát sÁc ký láng

và đ°a vào detector khãi phá, khãi phá kÁ ghi nh¿n táng c°ßng đá các ion sinh ra tÿ mßi chất Ta có mát sÁc đß toàn ion và phá khãi đ°āc lấy toàn bá các ion (Full scan) Full scan cho đầy đÿ thông tin và chất phân tích h¢n, tuy nhiên ph°¢ng pháp này có đá nh¿y không cao, nhißu đ°ßng nÃn có thể lớn

Do đó chÁ đá quét này có hiáu quÁ đãi với các phân tích khi chất phân tích có nßng đá đÿ lớn và th°ßng đ°āc lāa chßn để khÁo sát ion mẹ

Trong kỹ thu¿t phân tích chßn lßc ion (SIM), đầu dò MS chß ghi nh¿n tín hiáu mát sã mÁnh ion đặc tr°ng cho chất cần xác đánh ChÁ đá SIM có thể đ°āc dùng để đánh l°āng chất phân tích Để đ¿t đá nh¿y và đá chính xác cao

có thể chßn đ°āc nhiÃu ion mát lần Do đó, khi đã biÁt ion mẹ chÁ đá SIM th°ßng đ°āc sā dụng để khÁo sát năng l°āng phân mÁnh tãi °u cho quá trình phân tích

1.3.3.3 Chế độ khảo sát ion cô lập và khảo sát đa ion cô lập

Kỹ thu¿t ghi phá có đá nh¿y cao th°ßng đ°āc sā dụng là khÁo sát ion

cô l¿p (SRM) và khÁo sát đa ion cô l¿p (MRM) SRM là cô l¿p ion cần chßn

để phân mÁnh Trong các mÁnh ion sinh ra cô l¿p 1 mÁnh ion con cần quan tâm và đ°a vào đầu dò để phát hián Tuy nhiên trong thāc tÁ phân tích vi l°āng, các ion con cần khÁo sát th°ßng tÿ 2 trá lên, do v¿y kỹ thu¿t ghi phá MRM hiáu dụng h¢n SRM Đầu tiên, cô l¿p ion cần chßn (ion mẹ á tā cāc thā nhất, phân mÁnh ion cô l¿p đó t¿i tā cāc thā 2 thu đ°āc các ion con, cô l¿p 2 hoặc nhiÃu ion con cần quan tâm á tā cāc thā 3 và đ°a vào đầu dò để phát hián

Đãi với kỹ thu¿t MS/MS, mát ion chßn lßc á chÁ đá MS lần thā nhất và sau đó đ°āc khÁo sát tiÁp bằng cách sā dụng năng l°āng phân mÁnh t¿o ra mát hoặc vài ion con đặc tr°ng á chÁ đá MS lần thā hai Kỹ thu¿t MS/MS đ°āc làm giÁm đáng kể nhißu cÿa đ°ßng nÃn góp phần để tăng đá chßn lßc và tăng đá nh¿y cÿa ph°¢ng pháp

Ch°¢ng 2 ĐâI T¯þNG VÀ PH¯¡NG PHÁP NGHIÊN CĀU 2.1 ĐâI T¯þNG NGHIÊN CĀU

2.1.1 Đãi t°ÿng nghiên cāu

TTXs trong 2 loài ãc biển có tiÃn sā gây ngá đác thāc ph¿m t¿i Viát Nam đ°āc thu á vùng biển ven bß Khánh Hòa và lân c¿n, Viát Nam, đ°āc đánh danh làm tiêu bÁn và lấy phần mô mÃm làm mÁu nghiên cāu MÁu đ°āc

bÁo quÁn d°ới -10oC, t¿i phòng thí nghiám An toàn thāc ph¿m và môi tr°ßng (Khu vāc miÃn Trung), Vián HÁi d°¢ng hßc Nha Trang, Khánh Hòa

2.1.2 Nguyên liáu, thi¿t bß

2.1.2.1 Dung môi, hóa chất

- Chu¿n TTX (Wako, Nh¿t BÁn), chu¿n 4-epiTTX (Nh¿t BÁn), chu¿n 4,9-anhydroTTX (Nh¿t BÁn)

- Acetonitrile (Merck, Đāc), Methanol (Wako, Nh¿t BÁn), Acid formic (Wako, Nh¿t BÁn), Ammonium hydroxide (Wako, Nh¿t BÁn), n°ớc

cất siêu s¿ch Mili-Q Water (Merck, Đāc) dùng cho LC-MS/MS

- Acid acetic (Wako, Nh¿t BÁn)

2.1.2.2 Thiết bị, dụng cụ phân tích

- Cân phân tích, máy ly tâm, buret, pipet thÿy tinh

- Cát chiÁt pha rÁn SPE (Envi-carb 250 mg/3ml)

- Cát Waters Xbrige (HILIC column) Amide 4.6 mm I.D.×150mm

- Nghiên cāu này sā dụng thiÁt bá LC-MS/MS 8040 Shimadu, Nh¿t BÁn

Hình 2 1 ThiÁt bá LC-MS/MS t¿i phòng thí nghiám vÃ

An toàn thāc ph¿m và môi tr°ßng (Khu vāc miÃn Trung)

2.2 PH¯¡NG PHÁP NGHIÊN CĀU

2.2.1 T hu mÁu và bÁo quÁn mÁu

2 loài ãc bùn, bao gßm: Nassarius glans (Hình 2.2a), Nassarius papillosus (Hình 2.2b) đ°āc thu ngoài tā nhiên t¿i vùng biển Khánh Hòa vào tháng 6/2023 (BÁng 2.1) MÁu sau khi thu đ°āc rāa s¿ch và bÁo quÁn bằng đá

l¿nh, sau đó v¿n chuyển ngay và phòng thí nghiám và An toàn thāc ph¿m và

môi tr°ßng (Khu vāc miÃn Trung) MÁu đ°āc bÁo quÁn d°ới -10oC đÁn khi thāc hián phân tích đác tã

Hình 2 2 MÁu ãc (a) Nassarius glans, (b) Nassarius papillosus

BÁng 2 1 Sã l°āng và khãi l°āng trung bình cÿa

2 loài ãc bùn thu á vùng biển Khánh Hòa

2.2.2 Xây dăng quy trình phân tích

2.2.2.1 Khảo sát điều kiện khối phổ xác định TTX

Do TTXs có đá phân cāc và qua tham khÁo mát sã tài liáu [51], [53], [54] chúng tôi tiÁn hành xác đánh TTXs bằng kĩ thu¿t ion hóa phun đián tā

ESI với chÁ đá bÁn phá ion d°¢ng và chÁ đá ghi phá MRM KhÁo sát thÁ phân mÁnh tãi °u để l°āng ion con t¿o thành nhiÃu, án đánh nhất trong điÃu kián hóa chất và trang thiÁt bá thāc tÁ t¿i phòng thí nghiám

2.2.2.2 Khảo sát điều kiện sắc ký lỏng hiệu năng cao

TiÁn hành trên mÁu chu¿n TTXs (gßm TTX: 2,551 µg/ml; 4-epiTTX: 2,148 µg/ml; 4,9-anhydroTTX: 1,755 µg/ml)

Chúng tôi tiÁn hành khÁo sát điÃu kián sÁc ký láng hiáu năng cao với các nái dung:

- KhÁo sát ch°¢ng trình gradient há pha đáng: trong phân tích sÁc ký tỷ

lá pha đáng Ánh h°áng rất nhiÃu đÁn khÁ năng phân tách cÿa TTXs ra khái hßn hāp và pha tĩnh Ch°¢ng trình đ°āc chßn phÁi đÁm bÁo peak cần phân tích trong sÁc ký đß phân tách rõ ràng, không bá ch¿p và thßi gian l°u hāp lý

- KhÁo sát tãc đá dòng: điÃu chßnh tãc đá dòng để thßi gian l°u phù hāp, đÁm bÁo áp suất cát

Tÿ kÁt quÁ khÁo sát lāa chßn điÃu kián sÁc ký thích hāp để có thể tiÁn hành đánh l°āng TTXs trong mÁu ãc trên há thãng LC-MS/MS

2.2.2.3 Khảo sát quy trình xử lý mẫu

Viác xây dāng quy trình tách chiÁt đác tã TTXs tÿ mÁu ãc là cần thiÁt

để đÁm bÁo đá chính xác cÿa kÁt quÁ phân tích LC/MS-MS

KhÁo sát nßng đá dung môi tách chiÁt: Do trong phân tā TTXs có nhóm guanindin perhydroquinaolin có tính kiÃm m¿nh nên TTXs tan trong dung dách axit Tuy nhiên TTXs cũng có cấu trúc ester nái phân tā nên dß bá thÿy phân bái các axit m¿nh, do đó cách duy nhất để giÿ TTXs bÃn vÿng trong dung dách là hòa tan trong axit hÿu c¢ yÁu Acid acetic đ°āc lāa chßn

sā dụng trong nhiÃu nghiên cāu [6], [44], [53], [54] [53] để chiÁt đác tã TTXs

tÿ sinh v¿t biển khi phân tích bằng kỹ thu¿t sÁc ký láng với đầu dò MS/MS Trong nghiên cāu này, chúng tôi tiÁn hành khÁo sát nßng đá acid acetic phù hāp Đánh giá qua hiáu suất thu hßi sau tách chiÁt bằng ph°¢ng pháp thêm chu¿n vào mÁu trÁng và tính hiáu suất thu hßi theo công thāc sau:

tt lt

C R C

pháp sắc ký lỏng khối phổ song song

Tÿ nhÿng kÁt quÁ khÁo sát điÃu kián sÁc ký, điÃu kián phân mÁnh khãi phá, quy trình xā lý mÁu mà cho hiáu suất cao nhất, táng hāp và xây dāng quy trình thāc nghiám đánh l°āng TTXs trong mÁu thā đ¿i dián

2.2.3 Đánh giá quy trình phân tích TTXs

Theo h°ớng dÁn th¿m đánh ph°¢ng pháp phân tích AOAC, th¿m đánh l¿i quy trình phân tích đã xây dāng, đÁm bÁo ph°¢ng pháp nghiên cāu là phù hāp với các nái dung c¢ bÁn nh° sau:

TiÁn hành pha dãy các dung dách chu¿n TTXs với dung môi là acid acetic 0,03M Các dung dách chu¿n đ°āc bÁo quÁn trong tÿ l¿nh nhiát đá f

4oC Nßng đá dãy dung dách chu¿n đ°āc ghi trong bÁng 2.2

BÁng 2 2 Nßng đá dãy các dung dách chu¿n

Nßng đá TTX (µg/ml) 2,500 1,250 0,500 0,250 0,125 Nßng đá 4-epiTTX

2.2.3.2 Xác định giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng

Giới h¿n phát hián LOD (Limit of detection) đ°āc đánh nghĩa là nßng

đá nhá nhất cÿa chất phân tích mà có tín hiáu sÁc ký lớn gấp 3 lần tín hiáu đ°ßng nÃn (S/N=3) Đây là mát thông sã đặc tr°ng cho đá nh¿y cÿa ph°¢ng pháp Chất nào nh¿y h¢n s¿ có giới h¿n phát hián nhá h¢n

Giới h¿n đánh l°āng LOQ (Limit of quantification) là nßng đá nhá nhất

đo đ°āc cÿa ph°¢ng pháp với đá đúng và đá chính xác thích hāp Theo lý thuyÁt thãng kê trong hóa phân tích thì LOQ là nßng đá chất phân tích mà cho tín hiáu gấp 10 lần tín hiáu đ°ßng nà (S/N=10) tāc là:

103

- Đá lặp l¿i: là māc đá gần nhau cÿa các giá trá riêng lẻ cÿa các phép đo lặp l¿i và đ°āc biểu dißn bằng đá lách chu¿n (SD) hay đá lách chu¿n t°¢ng đãi RSD (%) Chúng tôi tiÁn hành khÁo sát trên nÃn mÁu thāc, phân tích lặp l¿i 6 lần Tính giá trá trung bình, đá lách chu¿n, đá lách chu¿n t°¢ng đãi cÿa các lần thā nghiám

Giá trá trung bình: 1

n

i i tb