Xây dựng quy trình phân tích độc tố Tetrodotoxin trong ốc biển Việt Nam bằng sắc ký lỏng hiệu ứng pha ngược ghép nối với phổ kế khối lượng

Đặc tớnh, c¿u trỳc húa hòc

Năm 1909, TiÁn sĩ Yoshizumi Tahara đ°a ra xác nh¿n rằng cá nóc chāa mát lo¿i chất đác và đặt tờn là Tetrodotoxin theo tờn cÿa hò cỏ núc mà nú đ°āc phõn l¿p lần đầu tiờn- Tetraodontidae [1]. TTX là dÁn xuất aminoperhydroquinaoline, hāp chất dỏ vũng cú cụng thāc phõn tā C11H17O8N3 và cú cấu trỳc húa hòc đ°āc mô tÁ nh° hình 1.1.

Mòt só dÁn ch¿t cÿa Tetrodotoxin

Sā có mặt nhóm guanidine perhydroquinazoline (guanidin cú tớnh baz m¿nh) trong phõn tā làm cho TTX dò tan trong dung dỏch axit. Ngoài ra do TTX cấu trỳc ester nờn dò bỏ thÿy phõn trong dung dỏch cú tớnh axit m¿nh hoặc kiÃm m¿nh.

CÂ ch¿ ho¿t đòng

Cấp đá 3 làm tăng các triáu chāng thần kinh c¢ (nh° chāng khó nuãt, chāng mất ngôn ngÿ, hôn mê, mất phãi hāp, mất điÃu hòa, cÁm giác bòng bÃnh, liỏt dõy thần kinh sò, c co gi¿t) và đi kốm cỏc triỏu chāng tim m¿ch (h¿ huyÁt áp hoặc tăng huyÁt áp, rãi lo¿n nháp tim, nháp tim nhanh và bất th°òng, tớm tỏi, xanh xao, khú thỏ). Trong nhÿng tr°òng hāp nghiờm tròng dÁn đÁn cấp đỏ 4, n¿n nhõn tờ liỏt hoàn toàn, suy tim và dÁn đÁn tā vong.

Tetrodotoxins trong ãc biển

Theo khÁo sỏt, đa só cỏc loài óc này thuỏc hò Nasariidae cụ thể là óc bựn răng c°a cú tờn khoa hòc Nassarius papillosus và óc bựn búng, cú tờn khoa hòc Nassarius glans [16], [21]. Cú mát sã ph°¢ng pháp khác nhau đã đ°āc phát triển nh°ng nhìn chung t¿p trung vào 2 nhóm ph°¢ng pháp chính.

Ph°Âng phỏp thÿ nghiỏm sinh hòc 1. Phương pháp sinh hóa chuột

Để xác đánh đác tã trong đáng v¿t chân bụng biển (Nassarius glans) trong vụ ngá đác ãc biển gây tā vong trên đÁo TungSa á Đài Loan vào tháng 4 năm 2004, Hwang và cáng sā [24] đã thu th¿p 20 mÁu ãc gây ngá đác để làm mÁu phõn tớch. Ouabain hoặc veratridine đ°āc thêm vào các tÁ bào nuụi cấy, làm giÁm khÁ năng tòn t¿i cÿa chỳng bằng cỏch tăng dũng ion natri vào tÁ bào và TTX, ho¿t đáng nh° mát chất chặn kênh natri, s¿ vô hiáu hóa phÁn āng giúp tÁ bào tiÁp tục phát triển.

Ph°Âng phỏp húa hòc

Tÿ năm 1984, Noguchi và cáng sā [19] đã tách chiÁt đác tã TTX trong nhuyòn thể đỏng v¿t chõn bụng (Ách) ỏ Nh¿t BÁn bằng cỏc dung dỏch acid acetic và methanol, phân tích bằng ph°¢ng pháp GC-MS cho thấy rằng nó chāa khung quinazoline đặc tr°ng cho TTX. Mát quy trình đ°āc Margaget và cáng sā [44] đ°a ra và phát triển bằng cách sā dụng ph°¢ng pháp chiÁt pha rÁn để làm s¿ch mÁu huyÁt thanh và n°ớc tiểu cÿa bánh nhân bỏ nhiòm đỏc TTX sau đú phõn tớch cỏc mÁu bằng sÁc ký lỏng hiỏu năng cao với đầu dũ huỳnh quang. Năm 2007, nhóm nghiên cāu cÿa Jen cùng các cáng sā đã phân tích đác tã sinh v¿t biển tÿ năm loài đáng v¿t chân bụng Naitca vitellus, Natica tumidus, Oliva hirasei, Oliva lignaria và Oliva annulata đ°āc thu th¿p tÿ vùng biển Nha Trang, Khánh Hòa.

Khi so sánh với kÁt quÁ phân tích bằng HPLC cú đ°òng chu¿n tuyÁn tớnh 1-500 àg/ml và giới h¿n phỏt hiỏn 1 àg/ml khẳng đánh ph°¢ng pháp LC-MS/MS là ph°¢ng pháp đánh l°āng TTXs có giới h¿n phát hián thấp h¢n và đáng tin c¿y. Các nghiên cāu trên cho thấy ph°¢ng pháp LC- MS/MS đáng tin c¿y, LC-MS cú thể ỏp dụng để phõn tớch hàm l°āng vÁt, đỏ chòn lòc cao rất hÿu ích để xác đánh TTX và các dÁn chất cÿa TTX trong các chất nÃn phāc t¿p.

Thi¿t bò sÅc ký lỏng khói phỏ 1. Pha động

-Tr°òng hāp khụng sā dụng đ°āc cỏc detector khỏc: Khụng phỏt hiỏn đ°āc bằng detector khác hoặc trong phân tích khẳng đánh. Do v¿y th°òng dựng kỹ thu¿t này để phân tích hàm l°āng siêu vÁt trong mÁu thành phần phāc t¿p. MÁu láng hoặc dung dách đ°āc mát van tiêm tā đáng tiêm thẳng vào pha đỏng cao ỏp ngay ỏ đầu cỏt.

Ph°¢ng pháp phá khãi l°āng là mát kỹ thu¿t đo trāc tiÁp tỷ sã khãi l°āng và đián tích cÿa ion (có đ¢n vá bằng Dalton) đ°āc t¿o thành khi ion hóa phõn tā hoặc nguyờn tā cÿa mÁu. Cỏc ion đ°āc t¿o thành trong buòng ion húa, đ°āc gia tóc và tỏch riờng nhò bỏ ph¿n phõn tớch khói tr°ớc khi đÁn bỏ ph¿n phát hián (detector).

Mòt só ch¿ đò trong sÅc ký lỏng khói phỏ 1. Chế độ quét

Khãi phá s¿ cho tín hiáu t°¢ng āng với các ion đ°āc biểu thỏ bằng c°òng đỏ peak khỏc nhau. Trong các mÁnh ion sinh ra cô l¿p 1 mÁnh ion con cần quan tâm và đ°a vào đầu dò để phát hián. Tuy nhiên trong thāc tÁ phân tích vi l°āng, cỏc ion con cần khÁo sỏt th°òng tÿ 2 trỏ lờn, do v¿y kỹ thu¿t ghi phỏ MRM hiỏu dụng hÂn SRM.

Đói với kỹ thu¿t MS/MS, mỏt ion chòn lòc ỏ chÁ đỏ MS lần thā nhất và sau đó đ°āc khÁo sát tiÁp bằng cách sā dụng năng l°āng phân mÁnh t¿o ra mát hoặc vài ion con đặc tr°ng á chÁ đá MS lần thā hai. Kỹ thu¿t MS/MS đ°āc làm giÁm đỏng kể nhiòu cÿa đ°òng nÃn gúp phần để tăng đỏ chòn lòc và tăng đá nh¿y cÿa ph°¢ng pháp.

Đãi t°ÿ ng nghiên c ā u

MÁu sau khi thu đ°āc rāa s¿ch và bÁo quÁn bằng đá l¿nh, sau đó v¿n chuyển ngay và phòng thí nghiám và An toàn thāc ph¿m và mụi tr°òng (Khu vāc miÃn Trung).

Xây dăng quy trình phân tích

KhÁo sát thÁ phân mÁnh tãi °u để l°āng ion con t¿o thành nhiÃu, án đánh nhất trong điÃu kián hóa chất và trang thiÁt bá thāc tÁ t¿i phòng thí nghiám. - KhÁo sát ch°¢ng trình gradient há pha đáng: trong phân tích sÁc ký tỷ lá pha đáng Ánh h°áng rất nhiÃu đÁn khÁ năng phân tách cÿa TTXs ra khái hòn hāp và pha tĩnh. Tuy nhiờn TTXs cũng cú cấu trỳc ester nỏi phõn tā nờn dò bỏ thÿy phân bái các axit m¿nh, do đó cách duy nhất để giÿ TTXs bÃn vÿng trong dung dỏch là hũa tan trong axit hÿu c yÁu.

TTXs tan trong n°ớc và đỏ phõn cāc cao nờn dung mụi rāa giÁi th°òng đ°āc lāa chòn là methanol, acid acetic, acid formic, acetonitrile…Theo nhiÃu nghiờn cāu, dung mụi rāa giÁi cú đỏ hòi phục cao acetonitrile/n°ớc/acid acetic (20:80:1) [54]. Tÿ nhÿng kÁt quÁ khÁo sát điÃu kián sÁc ký, điÃu kián phân mÁnh khãi phá, quy trình xā lý mÁu mà cho hiáu suất cao nhất, táng hāp và xây dāng quy trình thāc nghiám đánh l°āng TTXs trong mÁu thā đ¿i dián.

2. Nòng đỏ dóy cỏc dung dỏch chu¿n

2. KÁt quÁ Ánh h°ỏng cÿa nòng đỏ acid acetic đÁn hiỏu suất thu hòi TTX

5. KÁt quÁ Ánh h°áng thể tích rāa giÁi đÁn hiỏu suất thu hòi TTX