luận án tiến sĩ tiêu chuẩn hóa dược liệu cao alkaloid và cao flavonoid từ khổ sâm bắc sophora flavescens ait trồng tại đắk nông

Xây dựng quy trình chiÁt xuÁt, phân lập và tinh chÁ các alkaloid, flavonoid từ rễ Khổ sâm bắc .... Ngoài các alkaloid đưÿc phân lập từ rễ că, nhóm hÿp chÁt này cũng đưÿc báo cáo trong cá

PHAN NGUYÄN TR¯äNG THÌNG

LUÊN ÁN TI¾N S) D¯ĀC HâC

Bà Y TÀ

MÃ Sà: 62.72.04.10

LUÊN ÁN TI¾N S) D¯ĀC HâC

NG¯äI H¯âNG DÈN KHOA HâC: 1 PGS.TS NGUYÄN NGâC VINH 2 PGS.TS TRÄN ANH Vi

LäI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu căa riêng tôi, các kÁt qu¿ nghiên cứu đưÿc trình bày trong luận án là trung thực, khách quan và chưa từng đưÿc công bố á bÁt kỳ nơi nào

Tác gi¿ luận án

MĂC LĂC

Trang

Tổng quan về thực vật học căa Khổ sâm bắc 3

Tổng quan về thành phần hóa học căa Khổ sâm bắc 6

ChiÁt xuÁt và phân lập các thành phần flavonoid và alkaloid từ Khổ sâm bắc 13 Các phương pháp phân tích flavonoid và alkaloid Khổ sâm bắc 27

Tác dāng dưÿc lý và công dāng căa Khổ sâm bắc 33

Chuẩn hóa dưÿc liệu và yêu cầu chÁt lưÿng Khổ sâm bắc theo các Dưÿc điển hiện hành 39

Giới thiệu về cao dưÿc liệu 43

ThiÁt kÁ nghiên cứu 48

Đối tưÿng nghiên cứu 49

Thßi gian và địa điểm nghiên cứu 49

Cỡ mẫu căa nghiên cứu 49

Xác định các biÁn số đác lập và phā thuác 50

Phương pháp và công cā đo lưßng, thu thập số liệu 50

Quy trình nghiên cứu 53

Phương pháp phân tích dữ liệu 75

Xây dựng quy trình chiÁt xuÁt, phân lập và tinh chÁ các alkaloid, flavonoid từ rễ

Khổ sâm bắc 76

ThiÁt lập chÁt đối chiÁu 104

Xây dựng quy trình định tính, định lưÿng alkaloid, flavonoid trong rễ Khổ sâm bắc, các cao chiÁt từ rễ Khổ sâm bắc 114

Đánh giá tác dāng sinh học căa cao toàn phần, cao alkaloid, cao flavonoid và các chÁt phân lập 133

Tiêu chuẩn hóa cao chiÁt và dưÿc liệu Khổ sâm bắc 138

Xây dựng quy trình chiÁt xuÁt, phân lập và tinh chÁ từ Khổ sâm bắc 142

Đánh giá chÁt đối chiÁu 149

Xây dựng quy trình định tính, định lưÿng alkaloid, flavonoid trong rễ Khổ sâm bắc, các cao chiÁt từ rễ Khổ sâm bắc 150

Đánh giá tác dāng sinh các cao chiÁt và ho¿t chÁt từ Khổ sâm bắc 157

Tiêu chuẩn hóa cao chiÁt và dưÿc liệu Khổ sâm bắc 161

DANH MĂC CÁC KÝ HIÆU, CÁC CHĀ VI¾T TÌT VÀ THUÊT NGĀ ANH – VIÆT

Ký hiÇu, chā vi¿t tÍt

AChE Acetylcholinesterase Acetylcholinesterase

13C-NMR Carbon nuclear magnetic resonance Phổ carbon DEPT Distortionless Enhancement by

Polarization Transfer

DMEM Dulbecco's modified Eagle's DMEM

DPPH 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl

EC50 Half maximal effective concentration Nồng đá hiệu qu¿ tối đa mát nửa EMA European Medicines Agency Cơ quan Qu¿n lý thuốc Châu Âu ESI Electrospray Ionization Ion hóa phun điện

FeCl3 Ferric Chloride Sắt (III) clorid

HKCMMS The Hong Kong Chinese Materia Medica Standards

Tiêu chuẩn dưÿc liệu Hồng Kông Trung Quốc

1H-NMR Proton nuclear magnetic resonance Phổ proton HPLC High Performance Liquid

Chromatography

Sắc ký lỏng hiệu năng cao

HSQC Hetetonuclear Single Quantum Coherence

HTCO Ho¿t tính chống oxi hóa Ho¿t tính chống oxi hóa

Ký hiÇu, chā vi¿t tÍt

Nồng đá tối đa ức chÁ mát nửa

IUPAC International Union of Pure and Applied Chemistry

Hiệp hái Quốc tÁ về Hóa học thuần túy và ứng dāng

LC Liquid Chromatography Sắc ký lỏng

MTT 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromid)

3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromid) N Number of therical plates Số đĩa lý thuyÁt

RSD Relative Standard Deviation Đá lệch chuẩn tương đối

SDH Succinat dehydrogenase succinat dehydrogenase

SPE Solid Phase Extraction ChiÁt pha rắn

Tf, As Tailing factor, Asymmetry Hệ số kéo đuôi, hệ số bÁt đối xứng UV Ultraviolet Ánh sáng tử ngo¿i

DANH MĂC CÁC BÀNG

Trang

DANH MĂC CÁC HÌNH

Trang

Đ¾T VÂN ĐÀ

Việt Nam là đÁt nước với nguồn tài nguyên phong phú và đa d¿ng sinh học, nhiều loài thực vật đưÿc phát hiện có tác dāng hß trÿ và điều trị bệnh, là điều kiện rÁt thuận lÿi trong việc nghiên cứu và phát triển các thuốc có nguồn gốc th¿o dưÿc, phù hÿp với định hướng phát triển ngành dưÿc Việt Nam Trong kho tàng cây thuốc Việt Nam, ngoài những cây có nguồn gốc b¿n địa thì nhiều cây thuốc di thực như Đương Quy, Đan Sâm, & thực sự là những nguồn cung cÁp quan trọng, h¿n chÁ nhập khẩu và gi¿m bớt sự phā thuác căa ngành dưÿc liệu Việt Nam vào nguồn cung bên ngoài Mát trong những dưÿc liệu quý đưÿc di thực đó là Khổ sâm bắc hay còn gọi là Khổ sâm cho rễ (Sophora flavescens Ait.) và thưßng hay có sự nhầm lẫn với Khổ sâm cho lá (Croton tonkinensis Gagnep.) vì hay gọi chung là Khổ sâm.

Khổ sâm bắc (Sophora flavescens Ait.) đưÿc sử dāng nhiều á Trung Quốc, Nhật B¿n và đã đưÿc di thực từ những năm 90 căa thÁ kỷ XX, chúng thích nghi với khí hậu và phát triển tốt, đặc biệt á các vùng núi như Đắk Nông, Sapa Mát số chÁ phẩm chứa dưÿc liệu này đưÿc s¿n xuÁt t¿i Việt Nam như Ninh tâm vương đưÿc dùng hß trÿ trong bệnh lý nhịp tim nhanh, Nữ vương hß trÿ trong điều trị viêm nhiễm phā khoa á nữ giới Khổ sâm bắc là dưÿc liệu đưÿc sử dāng từ lâu trong y học cổ truyền phương đông, để chữa nhiều bệnh như chống lo¿n nhịp, các chứng viêm, xuÁt huyÁt tiêu hoá, lỵ và ký sinh trùng1-4 Hiện nay, trên thị trưßng thuốc trên thÁ giới có nhiều s¿n phẩm thuốc và thực phẩm chức năng từ Sophora flavescens như <dung dịch tiêm Yanshu, Fufang kushen= căa công ty Dưÿc phẩm Zhendong (Trung Quốc), <thực phẩm bổ sung Kushen và Kushen hawaii pharm= căa công ty Nature’s Health (Mỹ)

Chuyên luận về Sophora flavescens đã đưÿc đề cập trong các Án b¿n căa dưÿc điển Trung Quốc (2020), dưÿc điển Nhật B¿n (JP17) và dưÿc điển Hồng Kông 2017 với chỉ tiêu định tính và định lưÿng dưÿc liệu dựa vào 3 alkaloid chính là matrin, oxymantrin và sophoridin5, 6 Bên c¿nh thành phần alkaloid, flavonoid cũng là mát trong những nhóm hÿp chÁt chính trong Khổ sâm bắc4, 7, 8 Trong hơn năm thập kỷ qua, hàng trăm hÿp chÁt flavonoid đã đưÿc phân lập với nhiều tác dāng dưÿc lý đã

đưÿc chứng minh in vitro và in vivo như diệt khối u, kháng khuẩn 9 kháng viêm 10 và kháng virus11 Tuy nhiên, flavonoid vẫn chưa có trong chỉ tiêu đánh giá chÁt lưÿng căa dưÿc liệu Khổ sâm bắc, với hàm lưÿng cao và tính chÁt dưÿc lý căa flavonoid, các nhà khoa học đề nghị đưa nhóm ho¿t chÁt flavonoid trá thành mát trong những chỉ tiêu đánh giá chÁt lưÿng căa dưÿc liệu này2 Tuy nhiên, mát số hÿp chÁt như kurarinon và sophoraflavanon G nằm trong nhóm hÿp chÁt này có đác tính khi dùng liều cao Vì vậy, việc tiêu chuẩn hóa các cao chiÁt alkaloid, cao chiÁt flavonoid s¿ giúp chuyên biệt hóa tác dāng, gi¿m nguy cơ gây đác cho ngưßi dùng

Tuy vậy, Dưÿc điển Việt Nam V hiện nay vẫn chưa có chuyên luận riêng về dưÿc liệu Khổ sâm bắc, đồng thßi hiện nay chỉ có mát số công trình nghiên cứu về dưÿc liệu Khổ sâm bắc t¿i Việt Nam12 gây khó khăn trong việc đánh giá chÁt lưÿng dưÿc liệu thô và chÁ phẩm chứa dưÿc liệu này trong nước và ngo¿i nhập Nhằm đáp ứng nhu cầu kiểm soát chÁt lưÿng và phāc vā công tác kiểm nghiệm thuốc và dưÿc liệu trong nước, luận án <Tiêu chuÇn hóa d°āc liÇu, cao alkaloid và cao flavonoid

tă Khå sâm bÍc (Sophora flavescens Ait.) trãng t¿i ĐÍk Nông” đưÿc thực hiện

với các māc tiêu nghiên cứu sau:

- Xây dựng quy trình chiÁt xuÁt, phân lập và tinh chÁ các alkaloid, flavonoid từ Khổ sâm bắc

- ThiÁt lập chÁt đối chiÁu các chÁt phân lập từ Khổ sâm bắc

- Xây dựng quy trình định tính, định lưÿng alkaloid, flavonoid trong Khổ sâm bắc, các cao chiÁt từ Khổ sâm bắc

- Nghiên cứu thử tác dāng sinh học căa các cao chiÁt và các chÁt phân lập đưÿc từ Khổ sâm bắc

- Tiêu chuẩn hóa cao chiÁt và dưÿc liệu Khổ sâm bắc

TäNG QUAN TÀI LIÆU Tång quan vÁ thực vËt hãc cÿa Khå sâm bÍc

Đặc điểm thực vật học cÿa loài Khổ sâm bắc

Vị trí phân lo¿i

- Tên khoa học: Sophora flavescens Aiton - Tên thông thưßng: Khổ sâm bắc

- Tên gọi khác: Dã hòe, Khổ cốt, Khổ sâm cho rễ, Sơn đậu căn, Ðịa sâm&

- Theo hệ thống phân lo¿i căa Takhtajan A.L công bố năm 1987 và sửa đổi năm 200913, cây Khổ sâm bắc có vị trí phân lo¿i thực vật như sau:

Ngành Ngọc lan (Magnoliophyta) Lớp Ngọc lan (Magnoliopsida)

Phân lớp Hoa hồng (Rosidae) Liên bá Đậu (Fabaceae)

Khổ sâm bắc là cây bāi nhỏ, cao kho¿ng 0,5 - 1,2 m hoặc hơn Rễ hình trā dài, vỏ ngoài màu vàng trắng Thân thưßng phân nhiều cành, cành non có lông tơ r¿i rác Lá kép lông chim lẻ mọc so le, gồm 5 - 10 đôi lá chét hình mác dài kho¿ng 3 - 4 cm, ráng 1 - 2 cm, dốc thuôn, đầu nhọn hoặc hơi tù, mặt trên nhẵn, mặt dưới phă lông mịn màu xám Cām hoa mọc á k¿ lá hoặc đầu cành thành chùm dài 10 - 20 cm Hoa màu vàng nh¿t, đài 5 răng hình chuông, tràng 5 cánh không đều, nhị 10, rßi nhau, bầu có lông mịn Qu¿ đậu, thắt l¿i giữa các h¿t, thuôn dài 5 - 12 cm, đưßng kính 5 - 8 mm, đầu có mỏ thuôn dài; h¿t 3 - 7, hình cầu, màu đen 1, 14

(A) Các phần trên mặt đÁt (B) Rễ cây (C) Dưÿc liệu đưÿc cắt lát Cây Khổ sâm bắc Sophora flavescens Ait

Nguồn Xirui He, 20152.

Đặc điểm vi học

Tzu Che Lin đã mô t¿ mát số đặc điểm vi học rễ, thân, lá căa S flavescens 15

Vi phẫu rễ: Rễ cắt ngang có tiÁt diện gần tròn Bần gồm 9 3 12 lớp tÁ bào hình chữ nhật dẹp, xÁp xuyên tâm, thưßng bị bong tróc Vùng vỏ gồm 22 3 28 lớp tÁ bào mô mềm Thưÿng tầng gồm 2 3 6 lớp tÁ bào mô phân sinh kích thước nhỏ Vùng trung trā có 12 3 17 tia tăy

Vi phẫu thân: Thân cắt ngang có tiÁt diện gần tròn Biểu bì gồm 1 lớp tÁ bào hình chữ nhật Vùng vỏ gồm 6 3 11 lớp tÁ bào mô mềm hình đa giác góc tròn, chiÁm kho¿ng ¼ tiÁt diện Vùng trung trā có các tÁ bào mô mềm có kích thước lớn hơn

Vi phẫu lá: PhiÁn lá gồm biểu bì 1 lớp tÁ bào á c¿ mặt trên và mặt dưới Mô giậu gồm 1 3 2 lớp tÁ bào hình chữ nhật dài, mô mềm khuyÁt gồm 2 3 3 lớp tÁ bào mô mềm hình đa giác góc tròn, chừa các khuyÁt lớn Gân giữa có 1 bó m¿ch xÁp hình vòng cung, kích thước lớn

Hình ¿nh vi học căa S flavescens (A - rễ, B - thân, C - lá, D – thân

phóng to)

Nguồn Zelin, 201115 Phân bố - sinh thái

Khổ sâm bắc có nguồn gốc từ Trung quốc, đưÿc nhập vào Việt Nam vào kho¿ng đầu những năm 1970 Đây là cây sống nhiều năm Về mùa đông, toàn bá phần trên tàn lāi, từ phần gốc còn l¿i s¿ n¿y mầm vào kho¿ng giữa mùa xuân năm sau Cây ưa sáng và ưa ẩm, thích nghi với điều kiện căa nước ôn đới ẩm và vùng nhiệt đới núi cao (cao 1500 m), nhiệt đá trung bình năm kho¿ng 15 oC Cây trồng á Sa Pa (Lào Cai) sinh trưáng tốt, ra hoa nhiều nhưng hầu như không có qu¿ Số cây trồng hiện có là do nhân giống bằng các nhánh con tách từ gốc1

Cây ra hoa tháng 6 3 8, có qu¿ tháng 8 3 1014 Bá phận dùng 3 thu hái và chÁ biÁn

Rễ că - Radix Sophorae flavescentis, thưßng gọi là Khổ sâm - 苦参 14

Thu hái că, rửa s¿ch đÁt cát, thái phiÁn, phơi khô hoặc đem că tươi ngâm nước vo g¿o nÁp mát đêm, rửa s¿ch, để trong 3 giß rồi mới thái phiÁn, phơi khô B¿o qu¿n nơi khô ráo14

Tång quan vÁ thành phÅn hóa hãc cÿa Khå sâm bÍc

Thành phần hóa học cÿa loài S flavescens

Khổ sâm bắc đã đưÿc nghiên cứu về thành phần hóa học từ lâu với rÁt nhiều báo cáo đã đưÿc công bố Tính đÁn năm 2015, hơn 200 hÿp chÁt đã đưÿc phân lập

và xác định cÁu trúc từ loài S flavescens Trong đó, chă yÁu các nghiên cứu đưÿc

thực hiện trên bá phận rễ că, ngoài ra phần khí sinh, hoa, h¿t cũng đưÿc quan tâm Alkaloid và flavonoid đưÿc coi là các thành phần hÿp chÁt chính, bên c¿nh các nhóm hÿp chÁt khác như: triterpenoid, lignan, phenyl propanoid, coumarin, acid phenolic &2

Thành phần flavonoid

Flavonoid là thành phần hóa học đưÿc tìm thÁy với số lưÿng nhiều nhÁt căa

loài S flavescens (&) với sự hiện diện căa đa d¿ng các phân nhóm: flavanon, flavanonol, flavonol, chalcon, isoflavonoid, biflavonoid

Các dẫn chÁt flavonoid căa S flavescens đưÿc bắt đầu nghiên cứu từ năm 1985 Theo thống kê căa Xirui He2, tính đÁn năm 2015 đã có 124 cÁu trúc flavonoid đưÿc công bố, trong đó nhiều hÿp chÁt thể hiện các tác dāng dưÿc lý in vitro và in vivo

như: Kushenol A - C, E, F, H, K - X, kurarinon, isokurarinon, norkurarinon,

(2S)-2’-methoxykurarinon, kurarinol, neokurarinol, norkurarinol, kosamol A, leachianon A, leachianon G, sophoraflavanon G, 8 lavandulylkaempferol, formononetin, và isoxanthohumol2 Các flavonoid phân lập từ S flavescens đáng chú ý với mát số dẫn chÁt mang nhóm thÁ isoprenyl và lavandulyl trong cÁu trúc Các nhóm thể này chă yÁu gắn t¿i vị trí C-8, mát số ít á vị trí C-6 trong khung flavonoid

Cho đÁn những năm gần đây các báo cáo về các flavonoid có cÁu trúc mới phân lập từ S flavescens vẫn còn đưÿc công bố, cā thể:

8-(3-hydroxymethyl-2-butenyl)-5,7,2′,4′-tetrahydroxyflavanon (2017); sophoflavanon A và sophoflavanon B (2018);

kushenol Z (2019); sophoraflavanon M và sophoraflavanon N (2019); sophobiflavonoid A 3 H (2019); 4H-1-benzopyran-4-on,2-(4-hydroxyphenyl)-3,7-dihydroxy-5-methoxy-8-[5-methyl-2-(1-methylethenyl)-4-hex-enyl] (2021);

sophoflavonoid A và sophoflavonoid B (2021) [H.7]; kurarinol A và kurariol B (2021); (2R)-kurarinol, sophoraflavenochroman G, 2′ -methoxy kushenol I, sophoraflavanonol A, 7,4′ -dihydroxy-8-lavandulylflavonol, 5-methoxy-7-hydroxy-8-lavandulylbenzochromon, 2-methoxy-2′ ,4′

Nguồn Xirui He, 20152.

Hơn 20 hÿp chÁt isoflavon đưÿc phân lập từ dưÿc liệu này như daidzein, formononetin, calycosin, ononin,& Trong đó, có formononetin có tác dāng ức chÁ

enzyme monoamin oxidase, mát số isoflavon có tác dāng b¿o vệ tÁ bào gan như

Ngoài ra còn có các pterocarpan đưÿc phân lập cũng có ho¿t tính sinh học đáng quan tâm, điển hình là kushecarpin D, maackiain, pterocarpin, trifolirhizin2, sophorapterocarsid A 3 E

Cấu trúc một số pterocarpan từ rễ Khổ sâm bắc

Nguồn Xirui He, 2015 2 Thành phần alkaloid

Alkaloid là thành phần ho¿t chÁt phổ biÁn nhÁt trong Khổ sâm bắc, và đã có nhiều nghiên cứu về thành phần này trong vài thập kỷ qua đặc biệt là á Trung Quốc Ngoài các alkaloid đưÿc phân lập từ rễ că, nhóm hÿp chÁt này cũng đưÿc báo cáo trong các bá phận khác căa Khổ sâm bắc như phần trên mặt đÁt, hoa và h¿t Các alkaloid đưÿc phân lo¿i dựa vào cÁu trúc chă yÁu bao gồm 4 phân nhóm: kiểu matrin, kiểu cytisin, kiểu anagyrin và kiểu sophocarpin

Các alkaloid có kiểu khung matrin: matrin, isomatrin, allomatrin,

cis-neomatrin, trans-cis-neomatrin, hydroxy-7, 11-dehydromatrin, oxymatrin, 9³-hydroxymatrin, 14β-9³-hydroxymatrin, sophoranol, sophoranol N-oxid, oxysophoranol

N-oxid, 13, 14-dehydroxysophoridin, 7, 11-dehydromatrin, 5³,9 ³-hydroxymatrin2, flavesines G−J, alopecurine B, 7,11-dehydro-oxymatrin, 10-oxy-5,6-dehydromatrin, 10-oxysophoridinsophcence A

Các alkaloid có kiểu khung sophocarpin: sophocarpin, oxysophocarpin, sophocarpin N-oxid, 9³-hydroxysophocarpin, 9³-hydroxysophocarpin N-oxid,

hydroxysophocarpin, sophoramin, 13-ethylsophoramin, tetrahydroneosophoramin, isosophocarpin, 5epi-sophocarpin, 5³-hydroxysophocarpin2,

Các alkaloid có kiểu khung cytisin: cytisin, methylcytisin, baptifolin, rhombifolin4, N-butylcytisin, kushenin

Các alkaloid có kiểu khung anagyrin: anagyrin, flavascensin, lupinin, 5, 6-dehydrolupanin, lehmannin 2

Sophocarpin Isosophocarpin 7,11-Dehydromatrin Matrin

Sophoridin 9a-Hydroxysophocarpin Lupanin

9a-hydroxysophoramin

Isomatrin Oxysophocarpin 7a-hydroxysophoramin

Leontalbinin N-oxid Sophoranol Oxymatrin 9a-hydroxymatrin

Một số thành phần alkaloid của Khổ sâm bắc

Nguồn Xirui He, 2015 2 Các nhóm hÿp chÁt khác

Hiện nay, chỉ có 9 hÿp chÁt triterpenoid đặc trưng đã đưÿc phân lập từ rễ căa Khổ sâm bắc, gồm: lupeol, lupenon, monogynol B, β-amyrenol, soyasaponin І, và sophoraflavosid І - IV2

Mát lo¿t các hÿp chÁt khác, bao gồm mát số lignan, phenylpropanoid, coumarin và phenolic acid, cũng đã đưÿc phân lập từ rễ Khổ sâm bắc Ba lignan đã đưÿc xác định bao gồm: citrusin A, citrusin B và alaschanioside A Trong mát nghiên cứu,

mưßi hai dẫn xuÁt dibenzoyl mới (sophodibenzosid A-L) đã đưÿc tinh chÁ từ phân đo¿n n-butanol căa Khổ sâm bắc Mát số hÿp chÁt khác bao gồm: syringin,

corchionosid C, coniferin, acid piscidic và benzyl O-β-D-glucopyranosid cũng đã

đưÿc phân lập từ thân và lá căa cây này2

Gần đây cũng có mát số công bố mới về mát số nhóm hÿp chÁt khác phân lập từ S flavescens như: Jian-Shuang Jiang (2020) phân lập đưÿc 2 dẫn chÁt benzoic acid là sophophenosid A và B, Guo-Xian Li (2021) đã xác định đưÿc 2 dẫn chÁt lavandulylated acylphloroglucinol là flavescenol A và B

Chi¿t xuÃt và phân lËp các thành phÅn flavonoid và alkaloid tă Khå sâm bÍc

Chiết xuất và phân lập flavonoid

Các phương pháp chiÁt xuÁt

Các phương pháp chiÁt xuÁt dưÿc liệu thông dāng như ngâm l¿nh, ngâm nóng, chiÁt bằng Soxlet, ngÁm kiệt,&với dung môi như ethanol, methanol, nước,&có hoặc không có yÁu tố phā trÿ như khuÁy trán, nhiệt đá, siêu âm, vi sóng&16 Đối với dưÿc liệu Khổ sâm bắc, Komatsu và cáng sự (1970) đã chiÁt xuÁt dưÿc liệu này với phương pháp ngâm l¿nh bằng methanol á nhiệt đá phòng17 Những công trình gần đây, S

flavescens đưÿc chiÁt xuÁt với quy mô lớn bằng ethanol có nồng đá cao, có hoặc không có sử dāng nhiệt đá Nhìn chung, rễ Khổ sâm bắc thưßng đưÿc chiÁt xuÁt bằng những dung môi thông dāng, đa năng, dễ bay hơi như methanol, ethanol có đá cồn khác nhau bằng phương pháp chiÁt xuÁt đơn gi¿n như ngâm l¿nh, ngÁm kiệt hay đun hồi lưu

Các phương pháp phân lập, tinh chÁ

Sau khi chiÁt xuÁt dưÿc liệu, dịch chiÁt đưÿc cô đặc thành cao toàn phần, tiÁp theo tiÁn hành chiÁt lỏng 3 lỏng với các dung môi có đá phân cực tăng dần, đây là xu hướng thực hiện phân lập các hÿp chÁt flavonoid trên dưÿc liệu Khổ sâm mà đưÿc nhiều tác gi¿ thực hiện trong nghiên cứu căa mình Các dung môi có đá phân cực tăng dần như diethyl ether, dicloromethan, ethyl acetat, n-butanol và nước đưÿc sử

dāng trong phương pháp chiÁt lỏng 3 lỏng Sau đó các dịch chiÁt này đưÿc cô đặc thành cao, báo cáo khối lưÿng và đưÿc lựa chọn để thực hiện các phương pháp tinh chÁ khác dựa trên đá phân cực căa phân đo¿n

Các cao phân đo¿n này đưÿc tinh chÁ qua sắc ký cát silica gel pha thuận với mát số hệ dung môi như n-hexan 3 aceton, dicloromethan 3 methanol, dicloromethan 3 ethyl acetat, benzen - ethyl acetat có đá phân cực phù hÿp Đặc biệt Ryu Shi Yong và cáng sự (1997) đã tiÁn hành chọn lọc các phân đo¿n sau sắc ký cát silica gel pha thuận dựa trên tác dāng kháng tÁ bào ung thư căa cao để tiÁp tāc tinh chÁ trên sắc ký cát và thu đưÿc 15 hÿp chÁt tinh khiÁt18 Trong các nghiên cứu gần đây hơn căa Sook Kyung Hyun và cáng sự (2008); Hyung-Jun Won và cáng sự (2015); Chang-Won Kang và cáng sự (2016) đã tinh chÁ các phân đo¿n từ sắc ký cát pha thuận như đã đề cập á trên bằng sắc ký cát pha đ¿o với hệ dung môi methanol 3 nước và thu đưÿc các hÿp chÁt tinh khiÁt 19-21

D¿ng pha tĩnh khác cũng đưÿc sử dāng trong sắc ký các cao phân đo¿n để cô lập hÿp chÁt từ Khổ sâm bắc Yi Shen và cáng sự (2013); Chang-Won Kang và cáng sự (2016) và Rong Huang cùng cáng sự (2017) sử dāng pha tĩnh là sephadex LH-20 để tinh chÁ các cao phân đo¿n từ sắc ký cát silica gel pha thuận 7, 19, 21.

Xu hướng gần đây đã ghi nhận việc ứng dāng các phương pháp phân lập, tinh chÁ mới trong nghiên cứu thành phần hóa học cây Khổ sâm bắc nói riêng và dưÿc liệu học nói chung đặc biệt là sự hß trÿ căa phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao điều chÁ (HPLC điều chÁ) Năm 2013, Yi Shen và cáng sự với phương pháp HPLC điều chÁ đã thu đưÿc 24 hÿp chÁt tinh khiÁt đa phần là các isoflavonoid glycosid22 Gần đây nhÁt, năm 2017, Rong Huang cùng cáng sự đã cô lập đưÿc 5 flavonoid trong đó có mát chÁt mới chưa từng đưÿc công bố trước đây là 8-(3-hydroxymethyl-2-butenyl)-5,7,2′,4′-tetrahydroxyflavanon bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao điều chÁ7

Mát số công trình nghiên cứu phân lập flavonoid từ Khổ sâm bắc

Một số công trình nghiên cứu phân lập flavonoid từ rễ Khổ sâm bắc Sophora flavescens Ait

Sau đó chiÁt phân bố cao MeOH với ether 3 nước Lắc lớp ether với dung dịch KOH 5%, lÁy lớp nước acid hóa và lắc l¿i với ether

Lớp ether đưÿc tinh chÁ bằng sắc ký

ChiÁt phân bố với ether TiÁn hành sắc kí cát lớp ether với hexan 3 aceton (2:1 3 1:2) thu đưÿc các

Sắc ký cát cao EA bằng các dung môi đá phân cực tăng dần (hexan, benzen, cloroform, ete, ethyl acetat) Phân đo¿n

ChiÁt phân bố cao methanol thu đưÿc 35 g cao DCM, 50 g cao EA

Sắc ký cát pha thuận phân đo¿n DCM với dung môi DCM-MeOH (gradient) thu 6 phân đo¿n TiÁn hành tương tự với cao EA Chọn các phân đo¿n có ho¿t tính đác tÁ bào cao để tinh chÁ

ChiÁt cao ethanol thu đưÿc với DCM, EA và n-butanol thu đưÿc 128,4 g, 25,5 g và 280,3 g cao tương ứng

Từ cao DCM, tiÁn hành sắc ký silica gel rửa bằng DCM - EA (gradient) cho 43 phân đo¿n

Phân đo¿n 2 đưÿc tinh chÁ trên silica gel bằng benzen - ethyl acetat (10:1) Phân đo¿n 33 đưÿc tinh chÁ trên silica gel sử dāng benzen-ethyl acetat (3: 2) Phân đo¿n cao EA (23 g) đưÿc sắc ký rửa gi¿i trên cát silica gel bằng

Phân đo¿n 15 (1,5 g) tinh chÁ trên cát silica gel (DCM-MeOH, gradient)

150 mg kurarinol và 50 mg kuraridinol

Hàn quốc

TT Nm [ ] Khái l°āng, bá phËn dùng, dung môi

chi¿t

Chi¿t phân bá lßng – lßng Xÿ lý qua cát Thu đ°āc sÁn phÇm Quác gia

DCM-MeOH (gradient) thu đưÿc 17 phân đo¿n

Phân đo¿n 16 (15,4 g) đưÿc tinh chÁ trên cát silica gel (hexan-EA,

Cao MeOH chiÁt phân bố lần lưÿt với n-hexan, cloroform, EtOAc và n-butanol đưÿc 3,9 g; 22 g; 33,5 g và 38,9 g cao tương ứng

TiÁn hành sắc kí cát cao EA với hệ dung môi cloroform-ethyl acetat (gradient) đưÿc 21 phân đo¿n Sắc ký cát pha đ¿o phân đo¿n 15 (2 g) với hệ dung môi MeOH-H2O (gradient) đưÿc 12 phân đo¿n TiÁn hành sắc ký cát pha đ¿o phân đo¿n 9-15 (120 mg) với dung môi MeOH-H2O (70:30)

53 mg kuraridin Hàn quốc

ChiÁt phân bố cao ethanol thu đưÿc cao PE, EA, n-BuOH

Cao n-BuOH đưÿc qua cát Diaion HP-20 với hệ EtOH-H2O (gradient) thu đưÿc 6 phân đo¿n A-F Phân đo¿n B và C đầu tiên đưÿc tinh chÁ qua cát sephadex LH-20, rồi sử dāng HPLC điều chÁ; phân đo¿n D đưÿc tinh chÁ qua cát pha thuận (hệ CHCl3 3 MeOH, gradient) trước khi đưÿc xử lý trên cát sephadex LH-20 và HPLC điều chÁ

12 dẫn chÁt căa dibenzoyl, 5

isoflavone glycoside mới cùng 8 hÿp chÁt đã biÁt trong rễ cây S flavescens

Cao này qua cát pha thuận hệ DCM-MeOH (gradient) thu 10 phân đo¿n

Phân đo¿n B, C, D, E qua cát sephadex LH-20, cát pha đ¿o

Cao cồn đưÿc chiÁt phân bố thu đưÿc 1,5 kg cao EA

Sắc ký cao này qua cát sắc ký với dung môi PE 3 EA (gradient), EA 3 aceton (gradient), aceton 3 methanol (gradient) thu đưÿc 7 phân đo¿n Phân đo¿n C đưÿc tinh chÁ bằng cát sắc ký pha thuận MeOH 3 nước (gradient) cho 16 phân đo¿n Các phân đo¿n này sử dāng phương pháp HPLC điều chÁ

8 hÿp chÁt biflavonoids lần đầu đưÿc công bố là Sophobiflavonoid A-H

Trung quốc

Chiết xuất và phân lập alkaloid

Các phương pháp chiÁt xuÁt

Mát trong những nghiên cứu đầu tiên trên thành phần hóa học căa dưÿc liệu Khổ sâm bắc đưÿc thực hiện bái Komatsu và cáng sự (1970) đã chiÁt xuÁt dưÿc liệu này bằng methanol với phương pháp ngâm l¿nh á nhiệt đá phòng 17 Các nghiên cứu khác căa thÁ kỷ trước cũng sử dāng dung môi chiÁt xuÁt tương tự là methanol nhưng với các phương pháp chiÁt xuÁt khác như đun hồi lưu và trích nóng Những công trình gần đây đưÿc các tác gi¿ thực hiện chiÁt xuÁt bằng ethanol có nồng đá cao, có hoặc không có sử dāng nhiệt đá Nhìn chung các nghiên cứu trước đây chiÁt xuÁt

Sophora flavescens bằng những dung môi thông dāng, đa năng, dễ bay hơi như methanol, ethanol đá cồn khác nhau với phương pháp chiÁt xuÁt đơn gi¿n như ngâm l¿nh, ngÁm kiệt hay đun hồi lưu

Phương pháp chiÁt xuÁt đối với dưÿc liệu khô đưÿc sử dāng là phương pháp ngâm hoặc phương pháp ngÁm kiệt Đối với phương pháp ngâm, quá trình ngâm có thể đưÿc lặp l¿i thêm 1 hay vài lần để chiÁt kiệt ho¿t chÁt trong dưÿc liệu Sự khuÁy trán, các yÁu tố phā trÿ như nhiệt đá, siêu âm, vi sóng, chÁt diện ho¿t& có thể đưÿc sử dāng để gia tăng quá trình chiÁt Các phương pháp ngâm thưßng đưÿc sử dāng:

phương pháp ngâm lạnh, phương pháp ngâm nóng, chiết bằng Soxhlet, chiết bằng dung môi ở nhiệt độ sôi

Phương pháp ngÁm kiệt có thể sử dāng các yÁu tố phā trÿ như nhiệt đá, chÁt diện ho¿t& để gia tăng quá trình chiÁt26

Các phương pháp phân lập, tinh chÁ

Các alkaloid đưÿc tiÁn hành phân lập, tinh chÁ bằng các phương pháp hóa học và phương pháp sắc ký

Các phương pháp hóa học đưÿc áp dāng cho các alkaloid gồm26:

- Tách riêng các alkaloid bằng cách tăa với các thuốc thử chung căa alkaloid - Tách riêng các alkaloid ra khỏi các chÁt tan trong dung môi hữu cơ bằng nước

acid

- Tách riêng các alkaloid ra khỏi các chÁt tan trong nước bằng dung môi hữu cơ trong môi trưßng kiềm

Các phương pháp sắc ký thưßng đưÿc sử dāng để phân lập, tinh chÁ các alkaloid như sắc ký cát cổ điển, sắc ký rây phân tử và sắc ký lỏng điều chÁ Tuy nhiên, vì các alkaloid trong cây thưßng có cÁu trúc khá giống nhau nên khó phân tách bằng các phương pháp sắc ký thông thưßng Hiện nay, các phương pháp sắc ký đưÿc ưu chuáng hơn gồm sắc ký trao đổi ion, sắc ký phân bố ngưÿc dòng có thay đổi pH

Mát số công trình nghiên cứu phân lập alkaloid từ Khổ sâm bắc

Một số công trình nghiên cứu phân lập alkaloid từ Khổ sâm bắc Sophora flavescens Ait

Cao alcaloid tổng + ether Oxymatrin 2 g Nhật Dịch còn l¿i qua sắc ký cát pha

Cao chiÁt đưÿc phân tán trong dung dịch HCl và chiÁt phân bố với CHCl3

Dịch nước thêm NaOH đÁn pH 9,6 và tiÁp tāc chiÁt với CHCl3 Dịch CHCl3 này đưÿc cô quay đÁn cắn khô

Alkaloid đưÿc phân lập và tinh 4 giß Sau đó, rễ ướt bị nghiền nát, tiÁp tāc chiÁt bằng hßn hÿp CHCl3 - MeOH (5: 5)

Dịch chiÁt đưÿc tiÁn hành sắc ký pha rắn đánh dÁu phân tử hệ dung môi MeOH 3 H2O (3:7) để rửa t¿p, hệ dung môi acid acetic băng - MeOH (9:1) rửa gi¿i matrin

38.7 µg/g-1 matrin (tinh khiÁt 71.4%) Trung quốc

TT Nm [ ]

Khái l°āng, bá phËn

dùng, dung môi chi¿t Chi¿t phân bá lßng lßng Xÿ lý qua cát Thu đ°āc sÁn phÇm Quác gia

4 2007305,5 g bát khô đưÿc ngâm l¿nh hßn hÿp dung môi EtOH 3NH4OH 25% (4:1)

Dịch chiÁt đưÿc tách ra bằng hệ thống SFE điều chÁ ra từng phân đo¿n Mßi phân đo¿n tiÁn hành sắc ký phân bố ngưÿc dòng tốc đá cao (HSCCC) với hệ dung môi CHCl3

Đưÿc chiÁt với nước á nhiệt đá 80 oC trong thßi gian 4 giß

Dịch chiÁt - sắc ký điều chÁ pha đ¿o - dung môi MeOH 3 H2O - acid trifluoroacetic (16:84:0.002)

Matrin 0,0091 mg/g (90,8%) và oxymatrin 0,15 mg/g (88,1%)

Trung quốc

6 200832 1 kg dưÿc liệu đưÿc chiÁt với 3 lần mßi lần 10 lít nước trong 10 giß Cô dịch chiÁt l¿i còn 1 lít

Dịch chiÁt này đưÿc đưa qua các lo¿i cát resin khác nhau để thu

TT Nm [ ]

Khái l°āng, bá phËn

dùng, dung môi chi¿t Chi¿t phân bá lßng lßng Xÿ lý qua cát Thu đ°āc sÁn phÇm Quác gia

7 201033 10,0 kg rễ chiÁt với hệ dung môi aceton - H2O (7:3) á nhiệt đá phòng

Sau đó là đưÿc hòa tan trong nước Ám đã đưÿc acid hóa bằng HCl đÁn pH 4 3 5, chiÁt phân bố với CHCl3 Lớp nước đưÿc trung hòa với NaOH đÁn pH 9 - 10 và chiÁt xuÁt với CHCl3 mát lần nữa Cô chân không dịch CHCl3 này thu đưÿc 55,0 g cao đặc

Cao alkaloid đưÿc tiÁn hành sắc ký cát silica-gel với hệ dung môi rửa gi¿i hÁt t¿p Oxymatrin s¿ bị rửa gi¿i cuối cùng

oxymatrin với đá tinh s¿ch 93,4% Trung quốc

TT Nm [ ]

Khái l°āng, bá phËn

dùng, dung môi chi¿t Chi¿t phân bá lßng lßng Xÿ lý qua cát Thu đ°āc sÁn phÇm Quác gia

9 201435 3 kg Khổ sâm bắc chiÁt xuÁt ba lần với ethanol 95% trong 1,5 h

Các dịch chiÁt đưÿc cô quay thu hồi dưới áp suÁt gi¿m thu đưÿc cao toàn phần Phân tán cao trong nước và kiềm hóa với amoniac đÁn pH 10 ChiÁt phân bố năm lần với cloroform Sau đó, các dịch chiÁt đưÿc kÁt hÿp và cô quay thu đưÿc cao alkaloid

Cao alkaloid - sắc ký cát silica gel và hệ dung môi CHCl3-MeOH-H2O

3 alkaloid gồm:

oxymatrin, matrin, lupeol

Trung quốc

10 2015350,5 g dưÿc liệu khô phân tán trong hệ thống 2 dung môi Dịch chiÁt đưÿc lọc và ly tâm Dịch nổi phía trên đưÿc cô đặc và sÁy khô trong lò chân không á 50 oC Hòa tan dịch chiÁt trong nước

Cát resin đưÿc kiềm hóa đÁn pH 10 bằng NaOH, sau đó n¿p dịch alkaloid TiÁn hành rửa gi¿i bằng diethyl ete và EtOH 50%

Để thu đưÿc tương ứng là matrin và oxymatrin

Trung quốc

tán trong nước và chiÁt phân bố với ether dầu và ethyl acetat

Sắc ký cát silica-gel với cao 360 g cao etyl acetat với hệ dung môi CHCl3 - MeOH) (100: 0 → 50: 50) thu đưÿc 13 phân đo¿n (1313) Sau đó, phân đo¿n 2 đưÿc phân tách thêm bằng cát silica