HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ --- BÙI VĂN NGUYÊN NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM CẤU TRÚC VÀ HOẠT TÍNH SINH HỌC CỦA FUCOIDAN TỪ MỘT SỐ LOÀI RONG NÂU... HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ --- BÙI VĂN N
Trang 1HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ
-
BÙI VĂN NGUYÊN
NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM CẤU TRÚC VÀ HOẠT TÍNH SINH HỌC CỦA FUCOIDAN TỪ MỘT SỐ LOÀI RONG NÂU
VIỆT NAM
LUẬN ÁN TIẾN SỸ HÓA HỌC
HÀ NỘI – 2018
Trang 2HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ
-
BÙI VĂN NGUYÊN
NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM CẤU TRÚC VÀ HOẠT TÍNH SINH HỌC CỦA FUCOIDAN TỪ MỘT SỐ LOÀI RONG NÂU
VIỆT NAM
LUẬN ÁN TIẾN SỸ HÓA HỌC Chuyên ngành: Hóa học các hợp chất thiên nhiên
Mã số: 9440117
Người hướng dẫn khoa học:
1 PGS.TS Bùi Minh Lý
2 PGS.TS Nguyễn Quyết Chiến
Hà Nội – 2018
Trang 3LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của bản thân dưới sự hướng
dẫn của PGS.TS Bùi Minh Lý và PGS.TS Nguyễn Quyết Chiến, có tham khảo
thêm các tài liệu đáng tin cậy, có nguồn gốc rõ ràng Các số liệu, kết quả trong luận
án là hoàn toàn trung thực và chưa được công bố trong bất kỳ công trình nào khác Tôi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm về nội dung luận án này
Tác giả luận án
Bùi Văn Nguyên
Trang 4
LỜI CẢM ƠN
Đầu tiên, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành và sâu sắc nhất tới PGS TS
Bùi Minh Lý và PGS.TS Nguyễn Quyết Chiến, những người thầy bằng cả tâm
huyết của mình đã hướng dẫn tôi về khoa học, gợi mở cho tôi các ý tưởng nghiên cứu và chia sẻ nhiều vấn đề của cuộc sống trong suốt thời gian tôi làm luận án
Tôi xin gửi lời cảm ơn tới GS TS Phạm Quốc Long - Viện trưởng Viện Hóa
học các Hợp chất thiên nhiên, cùng ban lãnh đạo Viện, bộ phận đào tạo của Viện đã tạo điều kiện rất nhiều cho tôi hoàn thành luận án của mình
Tôi xin gửi lời cảm ơn tới các thầy cô, các anh chị phụ trách của Học Viện
Khoa học Công nghệ, đã tạo mọi điều kiện cho tôi hoàn thành luận án của mình
Tôi xin gửi lời cảm ơn tới UBND tỉnh Khánh Hòa, ban giám hiệu trường
Đại học Khánh Hòa, Khoa KHTN và Công nghệ, đã tạo mọi điều kiện tốt nhất để
tôi hoàn thành luận án
Tôi xin gửi lời cảm ơn tới lãnh đạo viện, các nhà khoa học, anh chị em và bạn
bè đang công tác tại Viện Nghiên cứu Ứng dụng và Công nghệ Nha Trang, Viện
Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam đã tạo mọi điều kiện tốt nhất để tôi
làm thực nghiệm và luôn động viên giúp đỡ để tôi hoàn thành đề tài luận án
Tôi xin chân thành cảm ơn tới các nhà khoa học trong nhóm nghiên cứu
PGS.TS Trần Thị Thanh Vân, PGS.TS Thành Thị Thu Thủy, GS.TSKH
Anatolii I Usov và PGS.TS Yoshiaki Yuguchi đã tạo điều kiện giúp đỡ và hướng dẫn tôi trong quá trình hoàn thành công trình nghiên cứu này
Tôi xin chân thành cảm ơn các đề tài hợp tác quốc tế với Liên Bang Nga mã
số VAST.HTQT.Nga.02.15-16 và VAST.HTQT.Nga.06.13-14, với Nhật Bản mã
số VAST.HTQT.NHATBAN.02.13-15 đã tài trợ kinh phí giúp hoàn thành luận án Tôi xin gửi lời cảm ơn tới TS Lê Như Hậu, Viện Nghiên cứu Ứng dụng và
giám định tên khoa học
Tôi xin gửi lời tri ân của mình tới gia đình, bạn bè, những người thân luôn động viên tôi hoàn thành công trình nghiên cứu khoa học này
Xin chân thành cảm ơn!
Tác giả
Bùi Văn Nguyên
Trang 5MỤC LỤC
LỜI CAM ĐOAN i
LỜI CẢM ƠN ii
MỤC LỤC iii
DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT vii
DANH MỤC CÁC BẢNG ix
DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ xi
MỞ ĐẦU 1
Chương 1 TỔNG QUAN 4
1.1 Tổng quan về rong nâu 4
1.1.1 Giới thiệu về rong biển 4
1.1.2 Giới thiệu về Rong Nâu 7
1.1.2.1 Phân loại và phân bố rong nâu trên thế giới 7
1.1.2.2 Phân loại và phân bố rong nâu ở Việt Nam 9
1.1.3 Thành phần hóa học của rong Nâu 14
1.1.3.1 Polysaccharide 14
1.1.3.2 Hợp chất phenolic 19
1.1.3.3 Hợp chất carotenoid 21
1.1.3.4 Hợp chất Terpenoid 22
1.1.3.5 Các hợp chát khác 25
1.2 Tổng quan về Sulfated polysaccharide (Fucoidan) 26
1.2.1 Giới thiệu chung về Fucoidan 26
1.2.2 Thành phần hóa học của fucoidan trong một số loài rong nâu 26
1.2.3 Cấu trúc hóa học của fucoidan 28
1.2.4 Tính chất hóa lý của fucoidan 29
1.2.5 Hoạt tính sinh học và ứng dụng của fucoidan 30
1.2.5.1 Hoạt tính chống đông tụ máu và chống huyết khối 30
1.2.5.2 Hoạt tính chống virus 32
1.2.5.3 Hoạt tính kháng u và điều hòa miễn dịch 33
1.2.5.4 Hoạt tính chống oxy hóa 35
1.2.5.5 Giảm lipid máu 36
Trang 61.2.5.6 Kháng viêm 36
1.2.5.7 Chống lại các bệnh về gan 37
1.2.5.8 Hoạt tính kháng khuẩn 37
1.2.5.9 Tác dụng giảm lượng đường huyết trong máu 37
1.2.5.10 Các ứng dụng của fucoidan 38
1.3 Tình hình nghiên cứu trên thế giới và ở Việt Nam liên quan đến nội dung nghiên cứu của luận án 39
1.3.1 Tình hình nghiên cứu trên thế giới 39
1.3.2 Tình hình nghiên cứu ở Việt Nam 44
Chương 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 49
2.1 Đối tượng nghiên cứu 49
2.2 Phương pháp nghiên cứu 50
2.2.1 Phương pháp chiết tách và phân đoạn fucoidan 51
2.2.1.1 Phương pháp tách chiết fucoidan 51
2.2.1.2 Phương pháp phân đoạn fucoidan 51
2.2.2 Phương pháp nghiên cứu cấu trúc của fucoidan 51
2.2.2.1 Phương pháp phân tích liên kết bằng methyl hóa 51
2.2.2.2 Phương pháp sắc ký thẩm thấu gel (GPC) 53
2.2.2.3 Phương pháp phổ IR 53
2.2.2.4 Phương pháp phổ NMR 54
2.2.2.5 Phương pháp phổ MS 59
2.2.2.6 Phương pháp tán xạ tia X góc nhỏ (SAXS) 64
2.2.3 Phương pháp thử hoạt tính sinh học 66
2.2.3.1 Phương pháp thử nghiệm hoạt tính gây độc tế bào in vitro 66
2.2.3.2 Phương pháp đánh giá khả năng ức chế sự phát triển của khối tế bào ung thư trên thạch mềm 68
2.2.3.3 Phương pháp thử nghiệm hoạt tính chống đông tụ máu 68
Chương 3 THỰC NGHIỆM 70
3.1 Thu thập và xử lý rong 70
3.2 Chiết tách và phân lập fucoidan từ rong nâu 71
3.3 Xác định thành phần và cấu trúc của fucoidan 77
Trang 73.3.1 Xác định hàm lượng tổng carbohydrate 77
3.3.2 Xác định thành phần monosaccharide 77
3.3.3 Xác định hàm lượng sulfate 78
3.3.4 Phương pháp khử sulfate 78
3.3.5 Xác định hàm lượng axít uronic 78
3.3.6 Phân tích liên kết bằng methyl hóa 79
3.3.7 Thủy phân tạo oligosaccharide 79
3.3.8 Sắc ký thẩm thấu gel (GPC) 79
3.3.9 Phổ IR 80
3.3.10 Phổ NMR 80
3.3.11 Phổ ESI-MS/MS 80
3.3.12 Phương pháp tán xạ tia X góc nhỏ (SAXS) 80
3.4 Đánh giá hoạt tính sinh học 81
3.4.1 Hoạt tính gây độc tế bào 81
3.4.2 Thử nghiệm hoạt tính ức chế hình thành khối u ba chiều trên thạch mềm 82
3.4.3 Thử nghiệm hoạt tính chống đông tụ máu 83
Chương 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 85
4.1 Nghiên cứu lựa chọn phương pháp chiết tách fucoidan 85
4.2 Hàm lượng fucoidan và một số polysaccharide tan trong nước của 06 loài rong nâu sinh trưởng ở biển Nha Trang, thành phần hóa học của các fucoidan thu được 86
4.3 Nghiên cứu đặc điểm cấu trúc của các fucoidan từ hai loài rong nâu S binderi và S duplicatum 90
4.3.1 Nội dung và kết quả nghiên cứu loài Sargassum binderi 90
4.3.2 Nội dung và kết quả nghiên cứu loài Sargassum duplicatum 92
4.4 Nghiên cứu cấu trúc và hoạt tính sinh học của fucoidan phân lập từ rong nâu Sargassum aquifolium 96
4.4.1 Chiết xuất và làm sạch fucoidan 96
4.4.2 Xác định cấu trúc của fucoidan 100
4.4.2.1 Tách loại các nhóm sulfat (Desulfation) 100
Trang 84.4.2.2 Phổ NMR của FSA và các phân đoạn sắc ký anion của FSA 101
4.4.2.3 Phân tích liên kết bằng methyl hóa (Methylation analysis) 104
4.4.2.4 Tách 1,0M-deS trên cột sắc ký trao đổi anion 106
4.4.2.5 Các đặc điểm cấu trúc của deS-2 và deS-3 107
4.4.2.6 Các đặc điểm cấu trúc của deS-4 111
4.4.2.7 Các đặc điểm cấu trúc của deS-6 115
4.4.2.8 Các đặc điểm cấu trúc của deS-5 117
4.4.2.9 Nghiên cứu một số đặc điểm cấu trúc của phân đoạn FSA-1,5M bằng phương pháp phân tích methyl hóa kết hợp với phổ ESI-MS/MS 117
4.4.3 Đánh giá hoạt tính sinh học 124
4.4.3.1 Hoạt tính gây độc tế bào 124
4.4.3.2 Hoạt tính chống khối u in vitro 124
4.4.3.3 Hoạt tính chống đông tụ máu 126
4.5 Nghiên cứu cấu trúc và hoạt tính gây độc tế bào của các fucoidan phân lập từ rong nâu Turbinaria decurrens 131
4.5.1 Chiết xuất, phân đoạn và xác định thành phần của các fucoidan từ rong nâu Turbinaria decurrens 131
4.5.2 Xác định cấu trúc của FTD-2,0N phân lập từ rong nâu Turbinaria decurrens 135
4.5.3 Đánh giá hoạt tính gây độc tế bào của FTD-2,0M 142
4.6 Nghiên cứu kích thước và hình dáng của 6 fucoidan phân lập từ rong nâu Việt Nam, phân tích liên hệ của chúng với hoạt tính gây độc tế bào 144
4.6.1 Nghiên cứu kích thước và hình dáng của các fucoidan bằng phương pháp tán xạ tia X góc nhỏ 144
4.6.2 Liên hệ giữa các đặc điểm cấu trúc của các mẫu fucoidan với hoạt tính gây đốc tế bào 151
KẾT LUẬN 156
KIẾN NGHỊ 159
CÁC CÔNG TRÌNH CÔNG BỐ CÓ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN 160
TÀI LIỆU THAM KHẢO 162
Trang 9DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT
Các phương pháp sắc ký
Các phương pháp phổ
Spectrometry
Sắc ký khí - Phổ khối
Chromatography
Sắc ký lỏng cao áp
Spectrometry
Sắc ký lỏng cao áp - Phổ khối
Ionization Detector
Sắc ký khí – Đầu dò ion hóa ngọn lửa
H-1H
Spectrometry
Phổ khối ion hóa phun mù điện tử
Correlation
Phổ tương tác dị hạt nhân qua nhiều liên kết
Spectrometry
Phổ khối ion hóa phun mù điện tử
Coherence
Phổ tương tác dị hạt nhân qua một liên kết
MALDI-TOF/MS
Time-of-flight mass spectrometry with matrix-assisted laser
desorption/ionization
Phổ khối MALDI-TOF/MS
(CHTHN)
Spectroscopy
Phổ NOESY
kính quay
Trang 10Hoạt tính sinh học
Monosaccharide
Hóa chất
giá chức năng đông máu
dịch ở người
trưởng của đối tượng thử
bromide, Cetrimonium bromide
Hexadecyl trimethyl ammonium bromid
Trang 11DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 1.1 Thành phần loài và phân bố rong nâu Khánh Hòa 12
Bảng 1.2 Thành phần hóa học của một số fucoidan 27
Bảng 1.3 Sự phân bố trọng lượng phân tử của fucoidan 30
Bảng 1.4 Cấu trúc hóa học của các fucoidan từ một số loài rong nâu 39
Bảng 2.1 Các đỉnh phổ đặc trưng của fucoidan trên phổ hồng ngoại 54
Bảng 2.2 Độ dịch chuyển hóa học của C và H trong một số gốc đường 56
Bảng 2.3: Các mảnh đặc trưng cho các sulfate fucose có nhóm sulfate 61
ở các vị trí khác nhau trong phổ khối dạng ion âm 61
Bảng 2.4 Fucoidan phân đoạn SmF3 của rong S mcclurei 62
Bảng 2.5 Thông số đối với một số dạng cấu trúc polymer 65
Bảng 4.1 Thành phần polysaccharid tan trong nước từ một số loài rong nâu (% trên trọng lượng rong khô) 87
Bảng 4.2 Thành phần hóa học của các fucoidan phân lập được từ 06 loài rong nâu thu ở Nha Trang 88
Bảng 4.3 Thành phần hóa học của các phân đoạn fucoidan từ Sargassum binderi 91 Bảng 4.4 Thành phần hóa học của các phân đoạn fucoidan từ S duplicatum 93
Bảng 4.5 Hiệu suất và thành phần (%) của FSA và các phân đoạn fucoidan thu được sau sắc ký trao đổi anion 98
Bảng 4.6 Thành phần (%) của các fucoidan tách loại sulfat 1,0M-deS và 1,5M-deS so sánh với fucoidan mẹ của chúng (FSA-1,0M và FSA-1,5M) 101
Bảng 4.7 Kết quả phân tích liên kết bằng methyl hóa 104
Bảng 4.8 Hiệu suất và thành phần (%) của các phân đoạn tách 1,0M-deS trên cột sắc ký trao đổi anion so sánh với fucoidan mẹ của chúng 107
Bảng 4.9 Kết quả gán phổ 1H- và 13C-NMR của deS-2 ( = ppm, ký hiệu của các gốc đường xem Hình 4.16) 109
Bảng 4.10 Kết quả gán phổ 1H- và 13C-NMR của deS-4 114
Bảng 4.11 Kết quả gán phổ 1H- và 13C-NMR của deS-6 116
Bảng 4.12 Kết quả phân tích methyl hóa FSA-1,5M và 1,5M-deS 118
Trang 12Bảng 4.13 Tỉ lệ sống sót của các tế bào ung thư khi có mặt các phân đoạn fucoidan
từ FSA 124 Bảng 4.14 Tác dụng của chất thử tới kích thước trung bình và mật độ của các quần thể tế bào 125 Bảng 4.15: Thành phần hóa học của các phân đoạn Fucoidan chiết từ rong
Turbinaria decurrens 135
Bảng 4.16 Kết quả thử nghiệm tác dụng chống khối u của FTD-2,0N trên tế bào ung thư gan Hep-G2 142 Bảng 4.17 Hiệu suất, thành phần hóa học và KLPT trung bình của các mẫu
fucoidan phân lập từ 6 loài rong nâu Việt Nam 146 Bảng 4.18 Bán kính hồi chuyển của mặt cắt ngang Rgc ước lượng từ đồ thị Guinier của các mẫu fucoidan đo trong NaCl 0,5M 149 Bảng 4.19 Hoạt tính độc tế bào của các mẫu fucoidan trên các dòng tế bào ung thư gan Hep-G2 và ung thư mô liên kết RD 152 Bảng 4.20 Liên hệ giữa hoạt tính với KLPT trung bình của các mẫu fucoidan 153 Bảng 4.21 Liên hệ giữa hoạt tính với hàm lượng sulfat và tỉ lệ sulfat/đường của các mẫu fucoidan 153 Bảng 4.22 Liên hệ giữa hoạt tính với bán kính hồi chuyển Rgc của các mẫu
fucoidan 154
Trang 13DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ
Hình 1.1 Bản đồ vị trí khu vực điều tra phân bố một số chi rong nâu tỉnh Khánh
Hòa 11
Hình.1.2 Cấu trúc của một phân đoạn fucoidan đặc trưng tách và phân lập từ rong nâu 46
Hình 2.1 Hình dạng rong Sargassum aquifolium và Turbinaria decurrens 50
Hình 2.2 Quy trình methyl hóa phân tích liên kết glycoside trong polysaccharide 52 Hình 2.3 Nguyên lý hoạt động của kỹ thuật ion hóa ESI-MS 59
Hình 2.4 Cơ chế phân mảnh của carbohydrate 60
Hình 2.5 Cơ chế phân mảnh của carbohydrate 61
Hình 2.6 Cơ chế phân mảnh oligosacaride với sự có mặt của ion kim loại 62
Hình 2.7 Phổ MS và cơ chế phân mảnh của fucoidan 62
Hình 3.1 Vị trí địa lý nơi thu thập mẫu rong nâu và ảnh rong Sargassum aquifolium 70
Hình 3.2 Rong nâu Sargassum aquifolium và Turbinaria decurrens 71
Hình 3.3 Sơ đồ chiết tách và phân đoạn fucoidan rừ rong nâu Sargassum aquifolium 73
Hình 3.4 Sơ đồ chiết tách và phân đoạn fucoidan rừ rong nâu Turbinaria decurrens 74
Hình 3.5 Sơ đồ chiết tách và phân đoạn fucoidan rừ các loài rong nâu Sargassum polycystum (Fsp), Sargassum mcclurei (Fsm), Sargassum oligocystum (Fso), Sargassum denticarpum (Fsd), Sargassum swatzii (Fsw) và Tubinaria ornata (Fto) 75
Hình 3.6 Qui trình chiết theo Bản quyền của Nga (Patent WO 2005/014657) 76
Hình 4.1 Sắc ký đồ GPC của fucoidan từ rong nâu Sargassum aquifolium 86
Hình 4.2 Sắc ký đồ GPC của fucoidan từ rong nâu Turbinaria decurrens 86
Hình 4.3 Tách các phân đoạn của fucoidan từ S.binderi trên cột DEAE-Cellulose 90 Hình 4.4 Phổ 13C-NMR của fucoidan phân đoạn F2 từ rong Sargassum binderi 92
Hình 4.5 Phân đoạn của fucoidan chiết từ rong Sargassum duplicatum 93 Hình 4.6 Phổ IR của phân đoạn fucoidan chiết từ rong nâu Sargassum duplicatum
Trang 14Hình 4.7 Phổ 1H-NMR của fucoidan FSDu chiết từ rong nâu S duplicatum 94
Hình 4.8 Sơ đồ chiết xuất, phân lập và chuyển hóa các fucoidan của S aquifolium 97
Hình 4.9 Sắc ký đồ GPC của fucoidan FSA từ rong nâu Sargassum aquifolium 99
Hình 4.10 Các phân đoạn của fucoidan từ rong nâu Sargassum aquifolium 99
Hình 4.11 Trích đoạn phổ 13C-NMR của FSA-2,0M 102
Hình 4.12 Trích đoạn phổ 13C-NMR của FSA-1,5M 103
Hình 4.13 Trích đoạn phổ 13C-NMR của FSA-1,0M 103
Hình 4.14 Sắc ký đồ của 1.0M-deS trên cột trao đổi anion DEAE-Sephacel 106
Hình 4.15 Một phần của phổ HSQC của deS-2 108
Hình 4.16 Các mảnh cấu trúc của fucoidan desulfat hóa deS-2 (các gốc đường đều ở dạng pyranose) 108
Hình 4.17 Một phần của phổ HMBC của deS-2 110
Hình 4.18 Phổ HSQC của deS-4 112
Hình 4.19 Một phần của phổ HMBC của deS-4 112
Hình 4.20 Mảnh cấu trúc của deS-4 114
Hình 4.21 Phổ HSQC của deS-6 115
Hình 4.22 Một phần của phổ HMBC của deS-6 115
Hình 4.23 Mảnh cấu trúc của deS-6 116
Hình 4.24 Phổ ESI-MS của FSA-1,5M trong vùng m/z 320 đến m/z 610 120
Hình 4.25 Phổ ESIMS/MS của ion [FucSO3]- với m/z 243 121
Hình 4.26 Phổ ESIMS/MS của ion [Fuc2SO3]- với m/z 389 122
Hình 4.27 Phổ ESIMS/MS thức âm của ion [FucGalSO3]- (m/z 405) 123
Hình 4.28 Hình ảnh dưới kính hiển vi ngược của các quần thể tế bào Hep-G2 nuôi cấy trên thạch mềm dưới tác dụng của cácchất thử 126
Hình 4.29 Hoạt tính chống đông máu của các fucoidan từ S aliqualium đo được bằng phương pháp APTT 127
Hình 4.30 Sơ đồ chiết tách và phân đoạn các fucoidan từ rong nâu Turbinaria decurrens 132
Hình 4.31 Sắc ký đồ của GPC của fucoidan FTD từ rong nâu Turbinaria decurrens 133