Nghiên cứu ứng dụng liệu pháp CAR-T trong điều trị bệnh lơ xê mi cấp dòng lympho tiền lâm sàng

Nghiên cứu ứng dụng liệu pháp CART trong điều trị bệnh lơ xê mi cấp dòng lympho tiền lâm sàngNghiên cứu ứng dụng liệu pháp CART trong điều trị bệnh lơ xê mi cấp dòng lympho tiền lâm sàngNghiên cứu ứng dụng liệu pháp CART trong điều trị bệnh lơ xê mi cấp dòng lympho tiền lâm sàngNghiên cứu ứng dụng liệu pháp CART trong điều trị bệnh lơ xê mi cấp dòng lympho tiền lâm sàngNghiên cứu ứng dụng liệu pháp CART trong điều trị bệnh lơ xê mi cấp dòng lympho tiền lâm sàngNghiên cứu ứng dụng liệu pháp CART trong điều trị bệnh lơ xê mi cấp dòng lympho tiền lâm sàngNghiên cứu ứng dụng liệu pháp CART trong điều trị bệnh lơ xê mi cấp dòng lympho tiền lâm sàngNghiên cứu ứng dụng liệu pháp CART trong điều trị bệnh lơ xê mi cấp dòng lympho tiền lâm sàngNghiên cứu ứng dụng liệu pháp CART trong điều trị bệnh lơ xê mi cấp dòng lympho tiền lâm sàngNghiên cứu ứng dụng liệu pháp CART trong điều trị bệnh lơ xê mi cấp dòng lympho tiền lâm sàngNghiên cứu ứng dụng liệu pháp CART trong điều trị bệnh lơ xê mi cấp dòng lympho tiền lâm sàngNghiên cứu ứng dụng liệu pháp CART trong điều trị bệnh lơ xê mi cấp dòng lympho tiền lâm sàngNghiên cứu ứng dụng liệu pháp CART trong điều trị bệnh lơ xê mi cấp dòng lympho tiền lâm sàngNghiên cứu ứng dụng liệu pháp CART trong điều trị bệnh lơ xê mi cấp dòng lympho tiền lâm sàngNghiên cứu ứng dụng liệu pháp CART trong điều trị bệnh lơ xê mi cấp dòng lympho tiền lâm sàngNghiên cứu ứng dụng liệu pháp CART trong điều trị bệnh lơ xê mi cấp dòng lympho tiền lâm sàngNghiên cứu ứng dụng liệu pháp CART trong điều trị bệnh lơ xê mi cấp dòng lympho tiền lâm sàngNghiên cứu ứng dụng liệu pháp CART trong điều trị bệnh lơ xê mi cấp dòng lympho tiền lâm sàngNghiên cứu ứng dụng liệu pháp CART trong điều trị bệnh lơ xê mi cấp dòng lympho tiền lâm sàngNghiên cứu ứng dụng liệu pháp CART trong điều trị bệnh lơ xê mi cấp dòng lympho tiền lâm sàngNghiên cứu ứng dụng liệu pháp CART trong điều trị bệnh lơ xê mi cấp dòng lympho tiền lâm sàngNghiên cứu ứng dụng liệu pháp CART trong điều trị bệnh lơ xê mi cấp dòng lympho tiền lâm sàngNghiên cứu ứng dụng liệu pháp CART trong điều trị bệnh lơ xê mi cấp dòng lympho tiền lâm sàngNghiên cứu ứng dụng liệu pháp CART trong điều trị bệnh lơ xê mi cấp dòng lympho tiền lâm sàngNghiên cứu ứng dụng liệu pháp CART trong điều trị bệnh lơ xê mi cấp dòng lympho tiền lâm sàngNghiên cứu ứng dụng liệu pháp CART trong điều trị bệnh lơ xê mi cấp dòng lympho tiền lâm sàngNghiên cứu ứng dụng liệu pháp CART trong điều trị bệnh lơ xê mi cấp dòng lympho tiền lâm sàngNghiên cứu ứng dụng liệu pháp CART trong điều trị bệnh lơ xê mi cấp dòng lympho tiền lâm sàngNghiên cứu ứng dụng liệu pháp CART trong điều trị bệnh lơ xê mi cấp dòng lympho tiền lâm sàngNghiên cứu ứng dụng liệu pháp CART trong điều trị bệnh lơ xê mi cấp dòng lympho tiền lâm sàngNghiên cứu ứng dụng liệu pháp CART trong điều trị bệnh lơ xê mi cấp dòng lympho tiền lâm sàng

HỌC VIỆN QUÂN Y

NCS HỒ VIẾT HOÀNH

NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG LIỆU PHÁP CAR-T TRONG ĐIỀU TRỊ BỆNH

LƠ XÊ MI CẤP DÒNG LYMPHO TIỀN LÂM SÀNG

LUẬN ÁN TIẾN SỸ Y HỌC

HÀ NỘI - 2024

HỌC VIỆN QUÂN Y

NCS HỒ VIẾT HOÀNH

NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG LIỆU PHÁP CAR-T TRONG ĐIỀU TRỊ BỆNH

LƠ XÊ MI CẤP DÒNG LYMPHO TIỀN LÂM SÀNG

Tôi xin cam đoan số liệu trong đề tài luận án là một phần số liệu trong

đề tài nghiên cứu cấp Nhà nước mã số: KC.10.39/16-20 có tên “Nghiên cứu ứng dụng liệu pháp tế bào CAR-T trong điều trị bệnh bạch cầu nguyên bào lympho cấp” Kết quả đề tài này là thành quả nghiên cứu của tập thể mà tôi là

một thành viên chính Tôi đã được chủ nhiệm đề tài và toàn bộ thành viêntrong nhóm nghiên cứu đồng ý cho phép sử dụng một phần số liệu đề tài nàyvào trong luận án để bảo vệ lấy bằng tiến sĩ Các số liệu, kết quả nêu trongluận án là trung thực và chưa từng được ai công bố trong bất kỳ công trìnhnào khác

Tác giả

Hồ Viết Hoành

Với lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc !

Tôi xin chân thành cảm ơn Đảng ủy, Ban giám đốc Học viện, Bộ mônUng bướu, Bộ môn Sinh lý bệnh, Phòng Sau đại học, Phòng khảo thí, Họcviện Quân y đã tạo điều kiện, giúp đỡ tôi trong quá trình học tập và nghiêncứu

Tôi xin chân thành cảm ơn Đảng ủy, Ban giám đốc Bệnh viện Quân y

103, Bộ môn - Trung tâm Ung bướu, Khoa Hóa trị đã tạo điều kiện thuận lợi,giúp đỡ tôi hoàn thành luận án

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn đến PGS.TS Cấn Văn Mão, PGS.TS.Nghiêm Thị Minh Châu, những người thầy đã tận tình trực tiếp dạy dỗ, dìudắt, hướng dẫn và tạo mọi điều kiện cho tôi trong suốt quá trình nghiên cứu

và hoàn thành luận án này

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn và kính trọng đến các thầy cô trong hộiđồng chấm luận án đã đóng góp nhiều ý kiến quý báu để tôi hoàn thành luận

án này Ý kiến của các thầy, cô là những bài học cho tôi trên con đường tiếptục nghiên cứu học tập

Xin chân thành cảm ơn sự động viên, giúp đỡ vô tư, tận tình của cácanh chị đi trước, đồng nghiệp, bạn bè trong quá trình học tập

Cuối cùng, tôi xin tỏ lòng biết ơn tới công ơn nuôi dạy của cha mẹ tôi,

sự quan tâm giúp đỡ, động viên của vợ, con, anh, em và bạn bè thân thiết đểtôi có được ngày hôm nay

Hà nội, ngày tháng năm 2024

Tác giả luận án

Hồ Viết Hoành

Trang Trang phụ bìa

Lời cam đoan

Mục lục

Danh mục chữ viết tắt trong luận án

Danh mục các bảng

Danh mục các biểu đồ

Danh mục các sơ đồ

Danh mục các hình

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

1.1.Lơ xê mi cấp dòng lympho 3

1.1.1 Tình hình mắc lơ xê mi cấp dòng lympho trên thế giới 3

1.1.2 Sinh lý bệnh lơ xê mi cấp dòng lympho 3

1.1.3 Chẩn đoán lơ xê mi cấp dòng lympho 4

1.1.4 Phân loại lơ xê mi cấp dòng lympho 4

1.1.5 Điều trị bệnh lơ xê mi cấp dòng lympho 6

1.2.Liệu pháp tế bào CAR-T trong điều trị lơ xê mi cấp dòng lympho 9

1.2.1 Lịch sử hình thành và phát triển của liệu pháp tế bào CAR-T 9

1.2.2 Cấu trúc thụ thể nhân tạo CAR 10

1.2.3 Các thế hệ tế bào CAR-T 12

1.3.Các kỹ thuật để tạo khối tế bào CAR-T 15

1.3.1 Sản xuất plasmid bằng E coli 15

1.3.2 Tinh sạch plasmid ADN 15

1.3.3 Tạo tế bào CAR-T sử dụng hệ thống sleeping beauty transposon 16

1.3.4 Quy trình tạo khối tế bào CAR-T 17

1.4.Độc tính của liệu pháp CAR-T với cơ thể 28

1.4.1.Hội chứng giải phóng cytokine và hội chứng nhiễm độc thần kinh 28

1.5.Tình hình nghiên cứu CAR-T 31

1.5.1.Các nghiên cứu thử nghiệm tiền lâm sàng của khối tế bào CAR-T 31

1.5.2 Các thử nghiệm lâm sàng ứng dụng khối tế bào CAR-T điều trị lơ xê mi cấp dòng lympho 33

Chương 2 ĐỐI TƯỢNG, VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 36

2.1.Đối tượng nghiên cứu 36

2.1.1 Động vật 36

2.1.2 Chất liệu nghiên cứu 36

2.1.3 Trang thiết bị sử dụng cho nghiên cứu 37

2.2.Phương pháp nghiên cứu 39

2.2.1 Phương pháp thu nhận tế bào đơn nhân từ tế bào máu ngoại vi 39

2.2.2 Đánh giá tỉ lệ tế bào chết và hoại tử bằng phương pháp phân tích tế bào dòng chảy 40

2.2.3 Phương pháp kích hoạt tế bào T bằng hạt từ phủ kháng thể kháng CD3/CD28 44

2.2.4 Phương pháp tối ưu hóa chuyển nạp véc tơ vào tế bào T bằng công nghệ nucleofector 44

2.2.5 Chuyển nạp các cấu trúc Plasmid và minicircle Sleep beauty vào tế bào T bằng công nghệ Nucleofector 46

2.2.6 Phương pháp bất hoạt tế bào trình diện kháng nguyên K562 làm môi trường nuôi cấy tế bào CAR-T 47

2.2.7 Phương pháp nuôi cấy tế bào Daudi 48

2.2.8 Phương pháp nuôi cấy, tăng sinh tế bào CAR-T 49

2.2.9 Phương pháp đánh giá khả năng tăng sinh và khả năng ly giải các dòng tế bào ung thư CD19+ của các tế bào CAR-T 49

2.2.10 Phương pháp định lượng IL-2, TNF-  và IFN-  bằng kỹ thuật ELISA 51

2.2.11 Phương pháp nuôi chuột thiếu hụt miễn dịch 53

lympho B-CD19(+) bằng khối tế bào CAR-T 53

2.2.13.Phương pháp đánh giá đáp ứng điều trị bằng khối tế bào CAR-T 54

2.3.Phân tích số liệu 59

2.4.Đạo đức trong nghiên cứu 59

Chương 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 61

3.1.Chuyển nạp véc tơ vào tế bào lympho T tạo khối tế bào CAR-T 61

3.1.1 Tối ưu hóa thu nhận tế bào đơn nhân máu ngoại vi 61

3.1.2 Tối ưu hóa chuyển nạp véc tơ vào tế bào lympho T 63

3.1.3 Kết quả chuyển nạp các cấu trúc plasmid và minicircle sleep beauty vào tế bào T 67

3.2.Đánh giá khả năng sinh khối tế bào CAR-T 69

3.2.1 Bất hoạt tế bào K562 đồng biểu hiện các thụ thể CD19, CD64, CD86 và CD137 bằng tia X làm môi trường nuôi cấy tế bào CAR-T 69

3.2.2 Tăng sinh khối tế bào CAR-T khi bổ sung IL-2 71

3.2.3 Tăng sinh khối CAR-T trong môi trường tế bào 1D2 đã bất hoạt bằng tia X 71

3.2.4 Đánh giá khả năng tăng sinh của các tế bào CAR-T khi nuôi cấy với các dòng tế bào ung thư lympho B CD19 (+) 74

3.3.Đánh giá khả năng hoạt hóa tiết IL-2, TNF-α và IFN-γ của các tế bào CAR-T 76

3.3.1 Khả năng hoạt hóa tiết IL-2 của khối tế bào CAR-T 76

3.3.2 Khả năng hoạt hóa tiết TNF-α của khối tế bào CAR-T 78

3.3.3 Khả năng hoạt hóa tiết IFN-γ của khối tế bào CAR-T 79

3.4.Đánh giá khả năng ly giải tế bào ung thư lympho B CD19(+) của tế bào CAR-T 80

3.5.Đánh giá hiệu quả điều trị của khối tế bào CAR-T trên mô hình chuột NOD/Sicd mắc bệnh lơ xê mi cấp dòng lympho B-CD19(+) 83

3.5.1 Mức độ ảnh hưởng đến toàn trạng của chuột 83

3.5.2 Hoạt độ luciferase trong máu chuột ở các nhóm 88

lách của chuột 89

Chương 4 BÀN LUẬN 91

4.1.Chuyển nạp véc tơ vào tế bào lympho T tạo khối tế bào CAR-T 91

4.1.1 Hiệu quả tối ưu hóa thu nhận tế bào đơn nhân máu ngoại vi 91

4.1.2 Hiệu quả tối ưu hóa chuyển nạp vào tế bào T bằng công nghệ nucleofector 93

4.1.3 Chuyển nạp các cấu trúc plasmid và minicircle sleep beauty vào tế bào T bằng công nghệ nucleofector 97

4.2.Khả năng sinh khối tế bào CAR-T 100

4.2.1 Bất hoạt dòng tế bào K562 nhân tạo đồng biểu hiện CD19, CD64, CD86 và CD137 bằng tia X làm môi trường nuôi cấy tế bào CAR-T 100

4.2.2 Tăng sinh khối tế bào CAR-T 102

4.3.Đánh giá khả năng hoạt hóa tiết IL-2, TNF-α và IFN-γ của khối tế bào CAR-T 103

4.4.Khả năng ly giải tế bào ung thư lympho B-CD19+ của tế bào CAR-T 105

4.5.Hiệu quả điều trị của tế bào CAR-T trên T trên mô hình chuột NOD/SCID mắc bệnh lơ xê mi cấp dòng lympho B-CD19 (+) 107

4.5.1 Tình trạng toàn thân, trọng lượng chuột trước và trong quá trình điều trị 107

4.5.2 Thời gian sống, tỉ lệ sống, tỉ lệ sống tích lũy của chuột NOD/SCID sau thời gian điều trị bằng tế bào CAR-T 108

4.5.3.Đánh giá hiệu quả điều trị qua hoạt độ luciferase trong máu chuột 108

4.5.4.Khả năng hoạt hóa tế bào miễn dịch ở máu ngoại vi và lách của chuột 109

KIẾN NGHỊ

CÁC CÔNG TRÌNH NGHIÊN CỨU ĐÃ CÔNG BỐ

116

TT Phần viết tắt Phần viết đầy đủ

1 ALL Acute Lymphocytic Leukemia (bệnh lơ xê mi cấp

dòng lympho)

2 Allo-HSCT Allogeneic Hematopoietic Stem Cell Transplantation

(ghép tế bào gốc tạo máu đồng loài)

3 ARID5B AT-Rich Interaction Domain 5B (gen mã hoá protein

chứa miền tương tác giàu AT5B)

5 APC Antigen Presenting Cell (tế bào trình diện kháng

nguyên)

6 ATMP Advanced Therapy Medicinal Products (chế phẩm

thuốc trị liệu tiên tiến)

8 CAR Chimeric Antigen Receptor (thụ cảm thể dạng khảm)

9 CAR-T Chimeric Antigen Receptor T cell (tế bào lympho T

mang thụ cảm thể nhân tạo)

10 CD Cluster of Differentiation (dấu ấn miễn dịch)

11 CDC Complement Dependent Cytotoxicity (độc tế bào phụ

14 CLL

dòng lympho)

15 CR Complete Response (đáp ứng hoàn toàn)

16 CRS Cytokine Release Syndrome (hội chứng giải phóng

cytokin)

17 CTL Cytotoxic T lymphocyte (tế bào lypmho T gây độc)

18 ADN Axit Deoxyribonucleic

19 FAB French-American-British (hệ thống phân loại của

23 HLA Human Leukocyte Antigen system (hệ thống kháng

nguyên bạch cầu ở người)

24 HSV-TK Herpes Simplex Vi rút Tyrosine Kinase (enzyme

tyrosine kinase của vi rút gây bệnh Herpes)

Immune effector Cell-Associated NeurotoxicitySyndrome (hội chứng nhiễm độc thần kinh liên quanđến tế bào miễn dịch)

26 MAB Monoclonal Antibody (kháng thể đơn dòng)

28 MHC Major Histocompatibility Complex (phức hợp tương

thích mô chính)

30 NFAT Nuclear Factor of Activated T-cells (yếu tố nhân của

tế bào T hoạt hóa)

32 NK Natural Killer (tế bào giết tự nhiên)

33 NOD Non-Obese Diabetic (tiểu đường không béo phì)

34 OE-PCR Overlap extension PCR (phản ứng khuyếch đại gen

mở rộng, chồng lấn)

35 PAS Periodic Acid Schiff (kỹ thuật nhuộm phát hiện chất

nhầy bào tương trong tế bào)

36 PBMC Peripheral Blood Mononuclear Cell (tế bào đơn nhân

máu ngoại vi)

37 PCR Polymerase Chain Reaction (phản ứng khuyếch đại

gen)

38 SB Sleeping Beauty (hệ thống chuyển vị cấu trúc di

truyền có tên là Sleeping beauty)

39 scFv Single-chain variable fragment (kháng thể đơn chuỗi)

40 SCID Severe Combined ImmunoDeficiency (suy giảm miễn

dịch kết hợp mức độ nặng)

41 SEER Surveillance, Epidemiology, and End Results (kết quả

giám sát dữ liệu dịch tễ học của Hoa Kỳ)

42 SDI Socio-Demographic Index (chỉ số nhân khẩu học)

43 TNF Tumor Necrosis Factor (yếu tố hoạt tử u)

44 WHO World Health Organization (tổ chức y tế thế giới)

Bảng Tên bảng Trang

1.1 Phân loại theo FAB 1986 5

1.2 Phân loại ALL theo WHO 2016 5

1.3 Phương pháp nuôi cấy CAR-T 26

3.1 Kết quả đếm tế bào và phân tích flow cytometry các mẫu PBMC

với tỉ lệ pha loãng máu với PBS1X khác nhau 62

3.2 Kết quả đếm tế bào sau 60h nuôi cấy 64

3.3 Nồng độ IL-2 trong dịch nuôi cấy của tế bào CAR-T và PBMC với các dòng tế bào ung thư máu 76

3.4 Nồng độ TNF-α trong dịch nuôi cấy của tế bào CAR-T và PBMC

với các dòng tế bào ung thư máu 78

3.5 Nồng độ IFN-γ trong dịch nuôi cấy của tế bào CAR-T và PBMC

với các dòng tế bào ung thư máu 79

3.6 So sánh trọng lượng trung bình chuột trước điều trị (g) 84

3.7 Thời gian sống sót của các nhóm chuột điều trị 85

3.8 Tỷ lệ sống tích lũy của chuột ở các nhóm nghiên cứu 87

3.9 Kết quả hoạt độ luciferase trong máu chuột ở các nhóm 88

Biểu đồ Tên biểu đồ Trang

3.1 Ảnh hưởng của quá trình rửa đến hiệu suất thu hồi tế bào lympho 61

3.2 Tối ưu hóa lượng PBMC cho một phản ứng chuyển nạp 64

3.3 Tối ưu hóa lượng cơ chất CD19RCD137/pSB cho một phản ứng

chuyển nạp 66

3.4 Hiệu suất chuyển nạp vào PBMC khi sử dụng các plasmid và

minicircle 67

3.5 Tỉ lệ tế bào sống sau chuyển nạp với các plasmid và minicircle tạo

tế bào CAR-T 68

3.6 Chiếu xạ bất hoạt tế bào K562 69

3.7 Số lượng tế bào sống sau tia xạ ở các liều khác nhau 70

3.8 Số tế bào sống khi tăng sinh với IL-2 71

3.9 Số tế bào CAR-T trong quá trình tăng sinh 72

3.10 Tỉ lệ tế bào biểu hiện thụ thể CAR sau 21 ngày tăng sinh 73

3.11 Kết quả đại diện phân tích biểu hiện CAR bằng flow cytometry 73

3.12 Phân tích biểu hiện CAR trên bề mặt tế bào CAR-T thu nhận được

sau 28 ngày tăng sinh 73

3.13 Khả năng tăng sinh của tế bào CAR-T khi đồng nuôi cấy với tế bào

CD19+ 75

3.14 Khả năng tăng sinh của CAR-T khi không có sự hiện diện của tế

bào CD19+ 76

3.15 Nồng độ IL-2 trong dịch nuôi cấy của tế bào CAR-T và PBMC với các dòng tế bào ung thư máu 77

3.16 Nồng độ TNF-α trong dịch nuôi cấy của tế bào CAR-T và PBMC

với các dòng tế bào ung thư máu 78

3.17 Nồng độ IFN-γ trong dịch nuôi cấy của tế bào CAR-T và PBMC

với các dòng tế bào ung thư máu 80

3.18 Tỉ lệ tế bào K562 CFSE+ bị ly giải sau 6 giờ đồng nuôi cấy với

PBMC kích hoạt hoặc CAR-T tại các tỉ lệ khác nhau 81

3.19 Tỉ lệ tế bào Daudi CFSE+ bị ly giải sau 6 giờ đồng nuôi cấy với

PBMC kích hoạt hoặc CAR-T tại các tỉ lệ khác nhau 82

3.20 Tỉ lệ tế bào 1D2 CFSE+ bị ly giải sau 6 giờ đồng nuôi cấy với

PBMC kích hoạt hoặc CAR-T tại các tỉ lệ khác nhau 82

3.21 Minh họa khả năng ly giải tế bào CD19 (Daudi)+ của CAR-T 83

3.22 Trọng lượng cơ thể chuột nghiên cứu (g) 84

3.23 Biểu đồ tích lũy sống sót theo thời gian của chuột giữa các nhóm

nghiên cứu 86

3.24 Số lượng bạch cầu và công thức bạch cầu ở máu ngoại vi của chuột

điều trị với CAR-T thế hệ 2 và nhóm chứng 89

3.25 Số lượng bạch cầu và công thức bạch cầu ở lách của chuột điều trị

với CAR-T thế hệ 2 và nhóm chứng 90

Hình Tên hình Trang

1.1 Cấu trúc chung của thụ thể khảm trên tế bào lympho T 11

1.2 Cấu trúc của bốn thế hệ tế bào CAR-T 12

1.3 Các bước sản xuất tế bào CAR-T 17

1.4 Cơ chế hoạt động của hệ thống Sleeping Beauty 24

1.5 Biểu hiện và sự tăng sinh của CAR-T 27

2.1 Kính hiển vi đảo ngược Nikon eclipse Ti2 và máy chuyển nạp

Amaxa™ 4D-Nucleofector 38

2.2 Phân tách tế bào đơn nhân từ máu ngoại vi toàn phần 39

2.3 Hình ảnh đại diện phân tích PBMC bằng flow cytometry 40

2.4 Mẫu xác định thông số chuẩn cho máy trên phần mềm BD FACSuite™ đánh giá tỉ lệ tế bào apoptosis và tế bào hoại tử 43

2.5 Bất hoạt tế bào trình diện kháng nguyên K562 đồng biểu hiện các

thụ thể CD19, CD64, CD86 và CD137 48

2.6 Buồng nuôi chuột NOD/SCID 53

2.7 Tiêm tế bào CAR-T vào phúc mạc 54

2.8 Theo dõi tình trạng sức khoẻ chuột 55

2.9 Máy đo hoạt độ luciferase TD-20/20 Luminometer hãng Turner

Designs Hoa Kỳ 55

2.10 Kỹ thuật lấy máu mắt chuột 57

3.1 Đĩa nuôi PBMC 60h sau kích hoạt 63

3.2 Hình ảnh đại diện quan sát chuột sau 7 ngày điều trị ở 3 nhóm 83

ĐẶT VẤN ĐỀ

Lơ xê mi cấp dòng lympho (Acute lymphoblastic leukemia: ALL) làbệnh lý tăng sinh ác tính các tế bào dòng lympho của cơ quan tạo máu Bệnhthường gặp ở nhóm từ 2 - 5 tuổi Hầu hết các trường hợp bệnh lơ xê mi cấpkhông có nguồn gốc từ một di truyền báo trước mà từ thay đổi đột biến ditruyền mắc phải (somatic) [1] Theo thống kê trên thế giới, tỷ lệ mắc ALLhàng năm khoảng 1 đến 4 ca/100.000 dân tùy vào vùng địa lý [2] Tại Hoa

Kỳ, ước tính trong năm 2021 có khoảng 5.690 trường hợp mới mắc và khoảng1.580 trường hợp tử vong do ALL [3]

Điều trị bệnh ALL bao gồm 3 giai đoạn chính là: cảm ứng, củng cố vàduy trì Hóa trị liệu là phương pháp điều trị kinh điển, phổ biến đối với bệnhnày Mặc dù, đã có nhiều tiến bộ đáng kể trong điều trị và tỷ lệ sống sót càngngày càng được cải thiện Tuy nhiên, có 2-3% bệnh nhân kháng với các nhómhóa chất trong giai đoạn cảm ứng và 10-15% tái phát sau điều trị ban đầuthành công và thời gian sống trung bình ở nhóm này chỉ đạt 6 tháng Cácnghiên cứu cũng chỉ ra trong số 80 - 90% bệnh nhân (BN) đáp ứng ban đầuchỉ có tỷ lệ 30-40% đáp ứng thuyên giảm lâu dài [4], [5]

Thách thức đối với các nhà khoa học là tìm ra các phương pháp điều trịmới làm tăng tỷ lệ và duy trì thời gian đáp ứng cũng như kéo dài thời giansống đối với mặt bệnh này, đặc biệt ở những BN kháng và hoặc tái phát sauđiều trị Sự ra đời liệu pháp CAR-T sử dụng tế bào T mang thụ thể nhân tạoCAR (Chimeric antigen receptors) nhắm đích trên tế bào ung thư là cuộc cáchmạng trong điều trị lơ xê mi cấp, CAR-T được xem là “thuốc sinh học” vừa

có cơ chế điều trị như liệu pháp nhắm đích, vừa diệt tế bào ung thư qua cơ chếmiễn dịch Hơn nữa, tế bào CAR-T có thể tự tăng sinh và tồn tại lâu hơn trong

cơ thể để diệt các tế bào ung thư tái phát, kháng trị Hiện nay, liệu pháp

CAR-T không những được cấp phép điều trị bệnh lơ xê mi cấp dòng lympho B mà

còn mở rộng chỉ định đối với các bệnh lý khác như bệnh đa u tủy xương, ulympho ác tính tế bào B kháng trị và hoặc tái phát Tế bào CAR-T phát triển 4thế hệ, thế hệ thứ nhất thời gian tồn tại ngắn nên ít được ứng dụng, thế hệ thứ

3 và thế hệ 4 ưu việt hơn nhưng đang trong giai đoạn thử nghiệm, các liệupháp CAR-T sử dụng trên lâm sàng hiện nay là thế hệ thứ 2 [6] Chuyển nạpgen vào tế bào lympho T là bước quan trọng để tạo tế bào CAR-T, sử dụngvéc tơ vi rút là phương pháp đạt hiệu quả chuyển gen cao, tích hợp cấu trúcgen vào tế bào ổn định, tuy nhiên kỹ thuật phức tạp, giá thành đắt đỏ nên bệnhnhân khó tiếp cận Gần đây, các nghiên cứu đã chứng minh hiệu quả củaphương pháp chuyển nạp gen không sử dụng véc tơ vi rút mà bằng hệ thống

“Sleeping Beauty” với kết quả đáp ứng lâm sàng tiềm năng, ít độc tính, chiphí thấp [7] Tại Việt Nam, chưa có công trình nào nghiên cứu tạo và ứngdụng khối tế bào CAR-T Bệnh viện đa khoa VINMEC bước đầu thử nghiệmlâm sàng pha I đối với BN lơ xê mi cấp dòng lympho B và u lympho ác tínhkhông Hodgkin tế bào B, tuy nhiên khối tế bào CAR-T được tạo ra từ hệthống chuyển gen véc tơ vi rút tự động bằng công nghệ nước ngoài [8] Vì

vậy, chúng tôi tiến hành đề tài “Nghiên cứu ứng dụng liệu pháp CAR-T

trong điều trị bệnh lơ xê mi cấp dòng lympho tiền lâm sàng” nhằm mục

tiêu:

1 Đánh giá hiệu quả chuyển nạp véc tơ vào tế bào lympho T, khả năng tăng sinh, hoạt hóa tiết cytokin (IL-2, TNF-α và IFN-γ) và ly giải tế bào ung) và ly giải tế bào ung thư lympho B-CD19 (+) của khối tế bào CAR-T.

2 Đánh giá hiệu quả điều trị của khối tế bào CAR-T trên mô hình chuột NOD/SCID mắc bệnh lơ xê mi cấp dòng lympho B-CD19 (+).

Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Lơ xê mi cấp dòng lympho

1.1.1 Tình hình mắc lơ xê mi cấp dòng lympho trên thế giới

Lơ xê mi cấp dòng lympho (ALL) là một trong những bệnh ung thưphổ biến nhất ở trẻ em trên thế giới, chiếm khoảng 75% tất cả các loại ung thưmáu; tỷ lệ mắc ALL cao gấp 5 lần so với bạch cầu cấp dòng tủy [9] Trong đó

có tới 85% ALL dòng tế bào B, 10 đến 15% dòng tế bào T và dưới 1% dòng

tế bào giết tự nhiên NK (Natural killer)

Tại Hoa Kỳ ước tính trong năm 2021 có khoảng 5.690 trường hợp mớimắc và khoảng 1.580 trường hợp tử vong do ALL, với tỷ lệ mắc bệnh khoảng3,4 ca/100.000 dân [3] Trên thế giới tỷ lệ mắc bệnh ALL khác nhau theovùng địa lý, ngoài yếu tố dịch tễ thì một phần bị ảnh hưởng bởi tiêu chuẩnchẩn đoán áp dụng là khác nhau Tại Mỹ, tỷ lệ mắc bệnh ALL cao hơn ởngười Mỹ Latin và người Mỹ gốc da trắng so với người da đen và người gốcchâu Á [10], [11] Tỷ lệ mắc mới của ALL gặp nhiều nhất ở lứa tuổi từ 2-5tuổi, thấp nhất lứa tuổi 25-45 và trẻ trai mắc nhiều hơn so với trẻ gái [12]

1.1.2 Sinh lý bệnh lơ xê mi cấp dòng lympho

Nguyên nhân bệnh lý của ALL liên quan đến sự gia tăng và biệt hóa bấtthường của một tập hợp các dòng tế bào lympho Một số nghiên cứu trên trẻ

em đã chỉ ra rằng bệnh nhân mắc các hội chứng di truyền như Down, thiếumáu Fanconi, hội chứng Bloom và hội chứng suy nhược Nijmegen có nguy

cơ cao mắc bệnh ALL [13] Một số nguyên nhân khác gây bệnh ALL baogồm tiếp xúc với bức xạ ion hóa, thuốc bảo vệ thực vật, một số dung môi hữu

cơ hoặc nhiễm vi rút như vi rút Epstein-Barr Đột biến nhiễm sắc thể (NST)liên quan đến việc chuyển đoạn hoặc sắp xếp lại NST là nguyên nhân phổbiến dẫn đến bệnh ALL Hầu hết các đột biến gen được tìm thấy ở người lớnmắc bệnh ALL cũng tương tự như ALL ở trẻ em nhưng có khác nhau đáng kể

về sự phân bố và về sinh bệnh học Ở trẻ nhỏ, 85% có đột biến tái cấu trúccủa gen MLL trong khi đột biến đa bội và chuyển đoạn NST chiếm tỷ lệ nhỏ.Ngược lại, ở trẻ vị thành niên đột biến đa bội lại chiếm tỷ lệ khoảng 25%trong khi các đột biến trên gen MLL chỉ có 5% Bên cạnh đó, có đến 25% các

ca ở trẻ vị thành niên mang đột biến trên gen TEL-AML1 [14].

Bệnh ALL có thể gây ra nhiều dấu hiệu và triệu chứng khác nhau.Song, hầu hết các biểu hiện lâm sàng của ALL là kết quả của sự thiếu hụt các

tế bào máu bình thường, phản ánh sự tích luỹ của các tế bào lympho ác tínhchưa được biệt hóa ở tủy, máu ngoại vi và các vị trí ngoài tủy, bao gồm: hộichứng thiếu máu, hội chứng nhiễm khuẩn, gan lách và hạch to Bệnh ALLcũng thường có một số triệu chứng không đặc hiệu như giảm cân, sốt, ra mồhôi trộm [15]

1.1.3 Chẩn đoán lơ xê mi cấp dòng lympho

Lơ xê mi cấp dòng lympho được chẩn đoán dựa trên kết quả xétnghiệm máu ngoại vi hoặc tủy xương Người được chẩn đoán là mắc bệnhALL nếu kết quả xét nghiệm cho thấy các tế bào bạch cầu lympho non trongtủy xương chiếm tỷ lệ hơn 20% [16] Các đánh giá dựa trên hình thái họchoặc sử dụng kỹ thuật phân tích tế bào theo dòng chảy, xét nghiệm miễn dịch

và xét nghiệm tế bào đều có giá trị trong chẩn đoán và phân tầng nguy cơ củaALL [15]

1.1.4 Phân loại lơ xê mi cấp dòng lympho

* Phân loại theo hệ thống FAB 1986 (The French-American-British).

Phân loại này dựa trên cơ sở hình thái tế bào ác tính như kích thước, đặcđiểm nhân và nguyên sinh chất, được khẳng định thêm bằng đặc trưng hoáhọc tế bào của các tế bào ác tính dòng lympho

Bảng 1.1 Phân loại theo FAB 1986

tiền lympho B

các tế bào có kích thướcnhỏ, đồng đều

PAS (-)

*Nguồn: theo Lilleyman J.S (1986) [17]

* Phân loại theo Tổ chức Y tế thế giới (WHO).

Năm 2001, Tổ chức y tế thế giới đưa ra phân loại lơ xê mi cấp dònglympho trong khuôn khổ bảng phân loại bệnh lý ác tính dòng lympho (baogồm lơ xê mi cấp dòng lympho, lơ xê mi mạn dòng lympho, u lympho áctính) Bảng phân loại này được cập nhật và sửa đổi năm 2008 và năm 2016phù hợp về lâm sàng, ứng dụng điều trị cũng như tiên lượng bệnh được tốthơn Hệ thống phân loại này đã chỉ ra sự khác biệt về mặt di truyền, kiểu hìnhmiễn dịch, đặc điểm phân tử và hình thái tế bào thông qua các xét nghiệmchẩn đoán tế bào và sinh học phân tử

Bảng 1.2 Phân loại ALL theo WHO 2016

Lơ xê mi cấp dòng lympho tế bào B

- Không phân loại khác

- Biến đổi di truyền tái diễn:

+ Với kiểu hình: t(9;22)(q34.1;q11.2); BCR::ABL1

+ Với kiểu hình: t(v;11q23.3); KMT2A tái tổ hợp

+ Với kiểu hình: t(12;21)(p13.2;q22.1); ETV6::RUNX1

+ Thể đa bội

+ Thể giảm bội

+ Với kiểu hình: t(5;14)(q31.1;q32.3) IL3::IGH

+ Với kiểu hình: t(1;19)(q23;p13.3);TCF3::PBX1

+ Thể đề xuất bổ sung biểu hiện tương tự BCR::ABL (BCR::ABL like)

+ Thể đề xuất bổ sung với iAMP21

Lơ xê mi cấp dòng lympho T

- Thể đề xuất bổ sung: dòng tế bào tiền thân T sớm (early T-cellprecursor)

- Thể đề xuất bổ sung: dòng lympho giết tự nhiên NK (Natural killer)

*Nguồn: theo Daniel A.A (2016) [18]

Năm 2023, cập nhật đồng thuận phân loại quốc tế đối với ALL đã cónhững thay đổi Các phân nhóm trong phân loại WHO 2016 đã có những sửađổi và có thêm những nhóm phân loại mới Phân loại cập nhật kết hợp giữalâm sàng, tế bào học và tiến bộ sinh học phân tử Phân loại này đã bổ sungthêm 9 nhóm phân loại mới đối với dòng lympho B, trong đó có 7 nhóm phânloại có sự sắp xếp lại các gen khác biệt và 2 loại mới đặc trưng bởi một độtbiến gen cụ thể Bốn thể đề xuất bổ sung cũng được thêm vào trong phân loạiALL dòng lympho B, mặc dù việc xác định chính xác các phân nhóm này đòihỏi phải có nghiên cứu biểu hiện gen Phân loại T-ALL cũng được cập nhật

để kết hợp các sắp xếp lại kích hoạt gen BCL11B vào phân loại dòng tế bào

tiền thân T sớm Ngoài ra, tám phân nhóm thể đề xuất bổ sung mới được thêmvào phân loại T-ALL Cập nhật phân loại mới ALL sẽ cho phép cải thiện việcphân tầng nguy cơ và lập kế hoạch điều trị tối ưu cho bệnh nhân [19]

1.1.5 Điều trị bệnh lơ xê mi cấp dòng lympho

Điều trị lơ xê mi cấp dòng lympho với mục đích tiêu diệt các tế bàobạch cầu ác tính và phục hồi tuỷ xương trở lại bình thường Liệu pháp điều trịchủ yếu hiện được sử dụng cho ALL là hóa trị liệu, thường chia thành 3 giaiđoạn: cảm ứng, củng cố và duy trì Giai đoạn điều trị cảm ứng là nhằm đạt tớitình trạng thuyên giảm bệnh Các đợt điều trị tiếp theo có mục đích củng cố

tình trạng của người bệnh hướng tới tiêu diệt hoàn toàn các tế bào ung thư.Cuối cùng là giai đoạn điều trị duy trì Trong giai đoạn này, bệnh nhân đượcđiều trị ngoại trú với liều thuốc thấp, kéo dài nhằm ngăn chặn sự tái phát củabệnh Các loại thuốc được sử dụng phổ biến bao gồm: daunorubicin, L-asparaginase,6-mercaptopurine, methotrexate, cyclophosphamide, prednisone,dexamethasone Trường hợp một số bệnh nhân mắc ALL tái phát hoặc ởdạng bệnh dai dẳng, liệu pháp điều trị sẽ thường là sử dụng các loại thuốc mớivới liều lượng cao như cytarabine, clofarabine, vincristine, và/hoặcnelarabine Hạn chế của các liệu pháp hóa trị liệu là hầu như không có khảnăng chữa khỏi bệnh triệt căn mà chỉ hướng đến lui bệnh hoàn toàn để có thểđược điều trị tiếp theo bằng liệu pháp tế bào gốc tạo máu đồng loài Tuynhiên, tỷ lệ lui bệnh hoàn toàn theo hướng điều trị này cũng không cao, chỉđạt tối đa 20% ở người trưởng thành [15].

Hiện nay, các nhà khoa học đang nghiên cứu các hướng điều trị mới,điển hình là phương pháp cấy ghép tế bào gốc tạo máu và sử dụng liệu phápmiễn dịch Cấy ghép tế bào gốc tạo máu từ tủy xương là quá trình thay thế tếbào gốc bất thường bằng những tế bào gốc khỏe mạnh của người hiến tặng.Người bệnh sau khi điều trị đáp ứng bệnh hoàn toàn có thể lựa chọn điều trịbằng phương pháp ghép tế bào gốc tạo máu đồng loài (Allo-HSCT:Allogeneic stem cell transplantation) để khôi phục tủy xương Đối với cácbệnh nhân có nguy cơ cao, các bệnh nhân bị tái phát bệnh hoặc kháng trị,Allo-HSCT từ lâu đã được coi là phương pháp điều trị tiêu chuẩn và là lựachọn tốt nhất để có đáp ứng lâu dài Điển hình là thử nghiệm LALA-94 đãcho thấy lợi ích của Allo-SCT so với phương pháp hóa trị liệu đơn thuần ởnhững bệnh nhân này [20], [21] Tuy nhiên, hạn chế chủ yếu của phươngpháp này là phải tìm được người hiến tặng có hệ miễn dịch phù hợp với cơ thểcủa người bệnh

Bên cạnh đó, việc sử dụng kháng thể đơn dòng trong điều trị ALL cũng

là một cách tiếp cận hết sức hiệu quả Kháng thể đơn dòng nhận biết các tếbào ung thư bằng cách liên kết đặc hiệu với các kháng nguyên trên bề mặt tếbào và sẽ tiêu diệt tế bào ung thư thông qua các cơ chế tác động phụ thuộcvào vùng thụ thể Fc bao gồm gây độc tế bào qua trung gian kháng thể(ADCC) và gây độc tế bào phụ thuộc bổ thể (CDC) [22] Điển hình nhưblinatumomab là một loại kháng thể đơn dòng đặc biệt bởi vì nó có thể gắnvào hai kháng nguyên khác nhau cùng một lúc Một phần của blinatumomab

sẽ gắn với CD19, được tìm thấy trên tất cả các tế bào lympho B (bao gồm cảcác tế bào ung thư bạch cầu và ung thư hạch) nhưng lại không tồn tại trong tếbào gốc tạo máu Một phần khác của blinatumomab gắn với CD3, vốn là thụthể kích thích hoạt động của tế bào T Bằng cách liên kết với cả hai loạiprotein này, blinatumomab mang các tế bào ung thư và các tế bào T lại gầnnhau, để các tế bào T tiến hành ly giải các tế bào ung thư [23]

Một hướng tiếp cận mới là liệu pháp sử dụng tế bào T mang thụ thểnhân tạo (CAR: Chimeric antigen receptors) Nguyên tắc của liệu pháp CAR-

T trong điều trị ung thư là nhằm tạo ra các tế bào T mang các thụ thể nhân tạo

có khả năng nhận biết các kháng nguyên đặc hiệu trên bề mặt tế bào ung thư

từ đó kích hoạt khả năng ly giải tế bào ung thư của tế bào T Hiện nay, liệupháp CAR-T thành công nhất là các cấu trúc CAR nhận biết thụ thể CD19.Tổng hợp các kết quả của 11 thử nghiệm lâm sàng sử dụng liệu pháp CAR-Tkháng CD19, Lorentzen và cộng sự cho thấy có 83% bệnh nhân ALL đãthuyên giảm hoàn toàn bệnh [24] So với thuốc sinh học đặc trị như kháng thểđơn dòng, liệu pháp CAR-T cũng có khả năng trị liệu trúng đích, nhưng vượttrội về tính hiệu quả Đối với ALL, liệu pháp CAR-T hiệu quả ngay cả ởnhững trường hợp đã kháng với hóa trị, xạ trị Đặc biệt, tế bào CAR-T có thể

tự tăng sinh và tồn tại lâu dài trong cơ thể để diệt các tế bào ung thư tái phát

1.2 Liệu pháp tế bào CAR-T trong điều trị lơ xê mi cấp dòng lympho

1.2.1 Lịch sử hình thành và phát triển của liệu pháp tế bào CAR-T

Năm 1989 Eshhar Z và công sự lần đầu tiên tạo ra cấu trúc mã hóa thụthể khảm của tế bào T (chimeric TCR gene) Cấu trúc di truyền này có thểđược biểu hiện ở tế bào T của người và giúp tế bào T nhận diện và phản ứngvới các kháng nguyên đích với độ đặc hiệu cao, tương tự như phản ứng khángnguyên-kháng thể Ngoài ra, sự phát hiện và phản ứng của tế bào T chuyểngen này không bị hạn chế bởi sự nhận diện phân tử MHC [25]

Năm 1993, nhằm kết hợp lợi ích từ tính đặc hiệu của kháng thể và hoạtđộng gây độc tế bào của tế bào T CD8+, nhóm nghiên cứu của Eshhar Z đãnối vùng biến thiên đơn chuỗi (single chain variable region hay scFv) của mộtphân tử kháng thể với vùng hằng định của thụ thể tế bào T (thường là chuỗizeta của phức hợp TCR/CD3) Tiếp theo các kết quả này, Eshhar Z và đồngtác giả đã tạo ra cấu trúc thụ thể dạng khảm (chimeric receptor gene) trên tếbào T và kích thích chúng biểu hiện thành “scFvRζ T cells” (tế bào CAR-Tthế hệ đầu tiên) [26] Tuy nhiên, các tế bào CAR-T thế hệ thứ nhất này chỉcho hiệu quả điều trị hạn chế trong thử nghiệm lâm sàng do không thể pháttriển lượng tế bào CAR-T trong cơ thể [27] Vì thế, tế bào CAR-T thế hệ thứhai đã được phát triển vào năm 1998, bằng cách gắn thêm một phân tử đồngkích thích (costimulatory signaling domain) của phân tử CD28 hoặc 4-1BBvào giữa vùng scFv và chuỗi CD3ζ Việc bổ sung thêm phân tử đồng kíchthích này đã giúp kích hoạt tế bào T một cách bền vững, từ đó, tăng sự tiếtcytokine và khuếch đại sự tăng sinh tế bào T khi tiếp xúc với kháng nguyên[28], [29]

Năm 2003 đánh dấu sự khởi đầu của liệu pháp CAR-T nhắm đến thụthể CD19 trên tế bào lympho B Sadelain M và đồng tác giả tại Trung tâmNghiên cứu Ung thư “Memorial Sloan-Kettering” lần đầu tiên chỉ ra rằng tếbào CAR-T nhắm đích kháng nguyên CD19 có khả năng diệt trừ tế bào B áctính trên mô hình chuột SCID/Beige Ngoài ra, việc đồng cảm ứng bằngCD80 và IL-15 cũng giúp tăng sinh tế bào CAR-T và tăng khả năng diệt tế

bào ung thư [30] Vào năm 2009, quy trình công nghệ sản xuất tế bào CAR-Tnhắm đích kháng nguyên CD19 lần đầu tiên được công bố; dựa vào đó, thửnghiệm lâm sàng Pha I đã được tiến hành trên các bệnh nhân mắc bạch cầulympho mãn tính (CLL) và bạch cầu lympho cấp tính (ALL) [31] Kết quảcủa cuộc thử nghiệm lâm sàng này lần đầu được công bố vào năm 2013, chỉ

ra sự thuyên giảm bệnh đáng kể của những bệnh nhân tham gia, đặc biệt làtrên những bệnh nhân trưởng thành mắc B-ALL Cụ thể, toàn bộ 5 bệnh nhânsau khi điều trị bằng liệu pháp CAR-T 19-28z đều đạt trạng thái tồn lưu tốithiểu âm tính (MRD: minimal residual disease negative) Ngoài ra, sau khiđược điều trị không còn phát hiện được đột biến tái tổ hợp ác tính trên genIGH của các bệnh nhân [32] Dựa vào những kết quả nghiên cứu trên, liệupháp sử dụng tế bào CAR-T nhắm đích CD19 được Cục Quản lý Dược vàThực phẩm Mỹ (FDA) công nhận là một bước đột phá, mở đường cho nhiềunghiên cứu và tiến bộ trong lĩnh vực này Đến năm 2017, FDA đã cho phépdùng liệu pháp tế bào CAR-T trong chữa trị B-ALL ở người lớn và trẻ em[33], [34] Gần đây, nhiều liệu pháp tế bào CAR-T khác đã được FDA chấpthuận để điều trị nhiều loại ung thư khác nhau, bao gồm Lisocabtagenemaraleucel (Breyanzi) điều trị u lympho không Hodgkin tế bào B lớn tái pháthoặc không đáp ứng với điều trị ban đầu, Abecma (idecabtagene vicleucel) điềutrị đa u tủy xương tái phát hoặc không đáp ứng với điều trị bước 1,Brexucabtagene autoleucel (Tecartus) để điều trị bệnh u lympho ác tính khônghodgkin thể malt tái phát hoặc không phản ứng đối với điều trị ban đầu, và Liso-cel (liso-cel) điều trị bệnh u lympho ác tính không Hodgkin tế bào B lớn tái pháthoặc không đáp ứng với điều trị ban đầu [35], [36], [37], [38]

1.2.2 Cấu trúc thụ thể nhân tạo CAR

CAR là các cấu trúc thụ thể nhân tạo, được thiết kế để có cả chức năngliên kết đặc hiệu với kháng nguyên đích và khả năng hoạt hóa tế bào T Hiệnnay, tế bào CAR-T đã phát triển đến thế hệ thứ tư, tuy nhiên, tất cả các cấutrúc CAR-T đều bao gồm 3 mô-đun: mô-đun ngoại bào (ectodomain), mô-đunxuyên màng (transmembrane) và mô-đun nội bào (endodomain) (Hình 1.1)

Hình 1.1 Cấu trúc chung của thụ thể khảm trên tế bào lympho T.

*Nguồn: theo Zhang C (2017) [39]

 Mô đun ngoại bào

Mô đun ngoại bào của tế bào CAR-T gồm có tín hiệu peptit dẫn đường(signal), vùng nhận diện kháng nguyên (scFv), và “vùng đệm” (spacer) Tínhiệu peptit dẫn đường có nhiệm vụ dẫn protein CAR đi qua mạng lưới nội chấtđến biểu hiện trên bề mặt tế bào [40] Vùng nhận diện kháng nguyên đều bắtnguồn từ vùng khả biến của kháng thể đơn dòng dạng đơn chuỗi (scFv: chuỗinặng VH liên kết với chuỗi nhẹ VL thông qua multimer của pentapeptideGGGGS) Vùng đệm “spacer” là vùng nối giữa scFv và vùng xuyên màng,thường có dạng “hinge-CH2–CH3 Fc” của kháng thể IgG1 [41]

 Mô đun xuyên màng

Mô đun xuyên màng có cấu tạo bao gồm các chuỗi xoắn alpha, có nhiệm

vụ giữ ổn định cho cấu trúc CAR Hiện nay, mô đun xuyên màng của tế bàoCAR-T thường được xây dựng dựa trên vùng xuyên màng của thụ thể CD3,CD4, CD8 và CD28 Tuy nhiên, thiết kế dựa trên CD8 và CD28 được cho là ổnđịnh và thường được sử dụng nhất trong thiết kế tế bào CAR-T [40], [42]

 Mô đun nội bào

Mô đun nội bào là nơi thực hiện chức năng hoạt hóa tế bào CAR-T.Vùng này luôn có chuỗi zeta của thụ thể tế bào T (CD247/CD3z) đi kèm vớimotif ITAM (immunoreceptor tyrosine-based activation motif) [43], [44].Motif thường có dạng: Y – XX – L/I – X(6-8) – Y – XX – L/I (Y: tyrosine, X:amino axit bất kì, L: leucine, I: isoleucine)

Sau khi mô-đun ngoại bào tương tác với kháng nguyên đích, vùng nộibào có nhiệm vụ phát tín hiệu đến nhân tế bào nhằm kích hoạt hoạt động tế bàoCAR-T Ngoài ra, tế bào CAR-T cũng cần tín hiệu từ vùng đồng kích thích(costimulatory domain) để có thể thực hiện đầy đủ các chức năng Vùng đồngkích thích thường được sử dụng là CD28, CD134 (OX-40) và CD137 (4-1BB)

1.2.3 Các thế hệ tế bào CAR-T

Như đã đề cập ở trên, đến nay, tế bào CAR-T đã phát triển đến thế hệthứ tư Sự khác biệt về mặt cấu trúc giữa các thế hệ CAR-T được trình bàytóm tắt trong Hình 1.2 dưới đây

Hình 1.2 Cấu trúc của bốn thế hệ tế bào CAR-T Sự khác biệt giữa các thế hệ

ở mô đun nội bào, phân tử OX-40 còn được gọi là CD134 và 4-1BB làCD137, NFAT kích hoạt phiên mã gen biểu hiện tổng hợp interleukin 12

* Nguồn: Journal of Cellular Immunotherapy [45]

 Tế bào CAR-T thế hệ thứ nhất

Tế bào CAR-T thế hệ thứ nhất có đặc điểm nổi bật là sử dụng chuỗiCD3 zeta hoặc FcεRIγ làm mô-đun nội bào Tuy nhiên, thiết kế này khiến tếRIγ làm mô-đun nội bào Tuy nhiên, thiết kế này khiến tếbào CAR-T không sản xuất đủ IL-2 cần thiết để duy trì hoạt động diệt tế bàoung thư Vì vậy, việc sử dụng tế bào CAR-T thế hệ thứ nhất trong điều trịthường yêu cầu bổ sung IL-2 [44] Hầu hết các nghiên cứu sử dụng CAR-Tthế hệ đầu đều không đạt được kết quả như mong đợi

 Tế bào CAR-T thế hệ thứ hai

Đặc trưng của thế hệ thứ hai là sử dụng tín hiệu kép cho việc hoạt hóa

tế bào Tín hiệu đầu tiên được phát đi khi mô-đun ngoại bào tương tác vớikháng nguyên đích Tín hiệu thứ hai được phát đi bởi một phân tử đồng kíchthích CD28/B7/4-1BB nhằm tăng tổng hợp IL-2 để kích hoạt tế bào CAR-Tmột cách hoàn toàn và tránh hiện tượng “apoptosis” (chết tế bào theo chươngtrình) Chính vì vậy, các cấu trúc CAR-T thế hệ hai đã tích hợp thêm mộtphân tử đồng kích thích như CD28, CD134(OX-40) hoặc CD137(4-1BB).Phân tử CD28 có vai trò rất quan trọng trong điều chỉnh sự tăng sinh và tồntại của tế bào lympho T, đặc biệt là trong hình thành tế bào T ghi nhớ và tếbào T hiệu ứng CD134 giúp duy trì sự tăng sinh và tăng sự tổng hợp IL-2.CD137 giúp duy trì tín hiệu đáp ứng của tế bào T, đóng vai trò quan trọngtrong khả năng tồn tại của tế bào T nói chung và hình thành bộ nhớ cho tếbào T CD8+ [46] Hiện nay, các liệu pháp CAR-T được FDA phê duyệt đều

là cấu trúc dạng này, điển hình như các cấu trúc CAR-T scFvCD19- CD3ζ hoặc scFvCD19-CD28-CD3ζ cho điều trị tế bào B ác tính [47], [48].Hơn nữa, nghiên cứu trên mô hình chuột (chuột gây mô hình bệnh lơ xê micấp dòng lympho B) chỉ ra rằng CD137 hoạt động tốt hơn so với CD28 trongcấu trúc CAR Cụ thể, tế bào CAR-T với cấu trúc scFvCD19-CD137-CD3ζtồn tại ít nhất 180 ngày so với mức 150 ngày của cấu trúc scFvCD19-CD28-CD3ζ [49]

CD137- Tế bào CAR-T thế hệ thứ ba

Tế bào CAR-T thế hệ thứ ba có đặc trưng là trong cấu trúc có sử dụngđồng thời nhiều vùng đồng kích thích Một số thiết kế điển hình như CD28-OX-40-CD3ζ hoặc CD28-CD137-CD3ζ, với mục đích tăng cường hơn nữakhả năng sinh IL-2 và khả năng diệt tế bào ung thư [50] Nhiều thử nghiệm lâmsàng sử dụng CAR-T thế hệ 3 cho điều trị ung thư bạch cầu lympho B cấptính hiện đang được tiến hành trên thế giới [51] Tuy vậy, các nghiên cứu

so sánh về hiệu quả điều trị giữa các cấu trúc CAR thế hệ thứ hai và thứ bavẫn chưa thật rõ ràng và đang trong quá trình theo dõi Do đó, chưa thể kếtluận liệu cấu trúc CAR-T thế hệ thứ ba có thực sự hiệu quả hơn so với thế

hệ thứ hai hay không [52]

 Tế bào CAR-T thế hệ thứ tư

Tế bào CAR-T thế hệ tư được tạo nên từ nền tảng thế hệ thứ 2 Về mặt

kỹ thuật, CAR-T thế hệ thứ tư được tạo ra bằng cách chuyển nạp hai cấu trúc

di truyền vào tế bào T của bệnh nhân Một cấu trúc nhằm biểu hiện thụ thểnhân tạo và cấu trúc còn lại nhằm biểu hiện các cytokine cảm ứng để hoạt hóa

tế bào CAR-T Một trong các cytokine được tạo ra là IL-12 Khi được biểu hiệncảm ứng, IL-12 sinh ra sẽ giúp tế bào tăng sinh tổng hợp IFN-γ, hoạt hóa tếbào NK (Natural Killer cells), đại thực bào (macrophage) tham gia diệt tế bàoung thư Ngoài ra, IL-12 cũng giúp cải thiện hoạt động của các tế bào lympho

T CD4+ và CD8+, hạn chế sự chết tế bào T theo chương trình [53], [54], [55]

So với các cấu trúc CAR-T thế hệ thứ hai, thế hệ thứ tư có tính phức tạp hơn

do phải chuyển đồng thời hai cấu trúc vào tế bào T của bệnh nhân Ngoài ra,việc tăng sự biểu hiện của IL-12 cũng có thể gây ra một số hiệu ứng phụ nhưhiệu ứng tấn công mục tiêu ngoài khối u “on-target, off-tumor”, gây độc cho cơthể bệnh nhân [56] Ngoài IL-12, IL-15 cũng được tạo ra trong một số cấu trúcCAR-T thế hệ thứ tư nhắm đích CD19 để điều trị lơ xê mi cấp dòng lympho B.Các kết quả nghiên cứu cho thấy cấu trúc CAR-T biểu hiện phân tử đồng kíchthích mã

hóa gen biểu hiện cytokin cảm ứng là IL-15 giúp duy trì tính bền vững cấutrúc CAR-T, tăng cường đáp ứng chống tế bào ung thư qua ức chế AICD, kéodài tuổi thọ tế bào CAR-T Các nghiên cứu cũng cho thầy cấu trúc CAR-T nàycho phép giảm thời gian tăng sinh tế bào CAR-T từ 28 ngày xuống còn 2 ngày,

mở ra cơ hội giảm chi phí sản xuất [57]

Hiện nay, để đảm bảo tính an toàn của liệu pháp CAR-T các chiến lược

sử dụng gen tự sát như HSV-TK (herpes simplex vi rút thymidine kinase)hoặc hệ thống iCasp9 (inducible caspase-9) trong cấu trúc Khi tế bào CAR-Ttăng sinh không kiểm soát trong cơ thể, sử dụng ganciclovir hoặc chất dimerhóa AP20187 để tiêu diệt tế bào CAR-T

1.3 Các kỹ thuật để tạo khối tế bào CAR-T

1.3.1 Sản xuất plasmid bằng E coli

Quá trình sản xuất plasmid bao gồm các bước như sau Đầu tiên, véc tơ

trị liệu cần được biến nạp và khuếch đại trong E.coli Bên cạnh các trình dành cho gen mục tiêu, các véc tơ này cần có gốc sao chép phù hợp cho E.coli và

gen dành cho quá trình sàng lọc dòng tế bào Sau khi đã biến nạp được

plasmid vào một chủng E.coli thích hợp, vi khuẩn được tăng sinh trong môi

trường tối ưu hóa và được thu sinh khối cho quá trình xử lý tiếp theo

Các liệu pháp gen hoặc thử nghiệm lâm sàng hiện tại yêu cầu sản xuấtplasmid với số lượng gram hoặc thậm chí kilogram Một chiến lược để tănghàm lượng plasmid tương đối được mô tả bởi Reinikainen P và cộng sự [58]

Họ đã sử dụng một plasmid có nguồn gốc pBR322 gây đột biến điểm nhạy

cảm với nhiệt độ, sự ổn định phân ly ở E coli được duy trì bằng cách bổ sung

kháng sinh thường xuyên

1.3.2 Tinh sạch plasmid ADN

Trong dịch ly giải vi khuẩn, plasmid ADN chỉ chiếm xấp xỉ 3%, vớihầu hết phần còn lại là nhiễm tạp protein và ARN Phần lớn ARN tồn tạitrong dịch ly giải có thể được loại bỏ bằng cách xử lý bằng RNase A trước khi

tinh sạch sắc ký Tuy nhiên, RNase A thường có nguồn gốc từ tuyến tụy bò,

do đó, cần được điều chỉnh nhằm loại bỏ hoàn toàn tạp chất có nguồn gốc từđộng vật này, nhằm tuân thủ các quy định quản lý [59]

Trong sắc ký phân tách, sắc ký trao đổi anion đã chiếm ưu thế tronglĩnh vực tinh chế plasmid trong những năm gần đây Ngoài ra, phương phápsiêu lọc (UF) cũng có thể được áp dụng, với khả năng phân tách các phân tửtheo kích thước Việc tách hoàn toàn ADN plasmid khỏi ARN cũng có thể đạtđược bằng bước tách nhóm với Sepharose 6 FF với sự hiện diện của đệmamoni sunfat 2M [60]

1.3.3 Tạo tế bào CAR-T sử dụng hệ thống sleeping beauty transposon

Quá trình sản xuất tế bào CART về cơ bản được thực hiện bằng cáchkích hoạt các tế bào T bằng cách sử dụng các hạt từ phủ kháng thể khángCD3/CD28, sau đó là quá trình tải nạp bằng véc tơ retrovirus hoặc lentivirus,tăng sinh trong chai hoặc túi nuôi cấy [61] Mặc dù đây là một cách tiếp cậnkhả thi, tuy nhiên để tạo ra khối tế bào CAR-T bằng cách này rất tốn kém,đòi hỏi phải sản xuất và sử dụng các véc tơ vi rút đảm bảo tiêu chuẩn GMP vàphải được kiểm soát về chất lượng

Hệ thống SB (sleeping beauty) có thể biến đổi di truyền trong tế bàođộng vật nhờ cơ chế “cắt và dán” [62] Bằng cách sử dụng các enzym SBtransposase như SB100X, cho thấy hiệu quả và sự biểu hiện tích hợp gen cóthể so sánh với các véc tơ vi rút, và việc biến đổi gen hiệu quả của tế bàolympho T cũng khả thi [63], [64] SB có cấu hình tích hợp ngẫu nhiên, thườngtích hợp gen quan tâm ở các vị trí nhiều dinucleotide TA Điều này trái ngượcvới các véc tơ retrovirusvà véc tơ lentivirus, chúng tích hợp gần các vị trí bắtđầu phiên mã hoặc vào các đơn vị phiên mã và có thể có khả năng thay đổi cơchế điều hòa phiên mã [63] Những đặc điểm này đã thúc đẩy sự phát triểncủa liệu pháp gen qua hệ thống SB và việc sử dụng nó để tạo ra các tế bàoCAR-T đã được sử dụng để điều trị bệnh nhân bị u lympho tế bào B

Kết hợp xung điện là phương pháp được lựa chọn để cung cấp haithành phần cấu thành hệ thống chuyển vị SB (véc tơ chuyển vị chứa genquan tâm và véc tơ biểu hiện enzym transposase) Việc sử dụng kết hợpxung điện để chuyển gen đã được phát triển vào đầu những năm 1980 và về

cơ bản bao gồm việc mở các lỗ trong màng tế bào thông qua việc sử dụngcác xung điện [65]

1.3.4 Quy trình tạo khối tế bào CAR-T

Quy trình chung tạo khối tế bào CART đã được chuẩn hóa tương đối, tuynhiên có sự khác nhau ở các bước Ví dụ, bước chuyển nạp cấu trúc di truyền

có thể sử dụng véc tơ vi rút hoặc véc tơ không vi rút (hình 1.3)

Hình 1.3 Các bước sản xuất tế bào CAR-T.

* Nguồn: Stock S (2019) [66]

Quá trình sản xuất tế bào CAR-T (hình 1.3) bao gồm phân lập và làmgiàu nguồn tế bào T ban đầu, kích hoạt hóa tế bào T, nuôi cấy tăng sinh tế bào

T, chuyển cấu trúc di truyền vào tế bào T bằng véc tơ vi rút hoặc hệ thống véc

tơ không vi rút, tiếp theo là nuôi cấy tăng sinh tế bào CAR-T ex vivo Khối tế

bào CAR-T thu được chính là sản phẩm cuối cùng của quy trình và sau đóđược bảo quản lạnh trước khi sử dụng Yếu tố chất lượng luôn được đảm bảo

và phải được kiểm soát trong suốt quá trình sản xuất cũng như đối với sảnphẩm tế bào CAR-T khi bảo quản lạnh Thông thường các bệnh nhân ung thưđược nhận các liệu điều trị trước khi sử dụng liệu pháp tế bào CAR-T để loại

bỏ bớt tế bào lympho và giảm sự cạnh tranh của tế bào CAR-T với tế bàolympho nội sinh

1.3.4.1 Phân lập và làm giàu tế bào T

Tế bào đơn nhân máu ngoại vi (PBMC) được sử dụng thường phân lập

từ máu ngoại vi Ly tâm phân lớp theo tỷ trọng sử dụng ficoll để loại bỏ bạchcầu hạt, hồng cầu và tiểu cầu là phương pháp thường được sử dụng [67].Ngoài ra, có thể sử dụng máy rửa tế bào tự động để phân lập tế bào T [68] Đểtối ưu hóa các bước cũng như thuận lợi tạo ra tế bào CAR-T, các hệ thống

máy ra đời và được phát triển như: hệ thống xử lý tế bào Sefia™ dùng để

phân lập, thu nhận và tạo ra sản phẩm là tế bào CAR-T hoặc hệ thống

CliniMACS Prodigy® để sản xuất tế bào CAR-T tự động tuân thủ tiêu chuẩn

chất lượng GMP [69]

Tỷ lệ thành phần tế bào sau phân lập thu được có thể ảnh hưởng đếnkiểu hình của tế bào CAR-T Bởi vì, những bệnh nhân có số lượng tế bào ungthư cao trong máu như bệnh nhân mắc bạch cầu lympho mạn tính (CLL)không được điều trị khi phân lập nhận thấy số lượng tế bào T ít biệt hóa hơntrong tế bào đơn nhân máu ngoại vi [61] Các yếu tố tế bào nội sinh có thể lànơi hấp thụ các cytokine khi được bổ sung, dẫn đến có thể làm giảm tác dụngqua trung gian cytokine đối với các tế bào CAR-T [70] Hệ thống phân lập tếbào T dựa trên hạt từ tính, chẳng hạn như hệ thống CliniMACS®, với các hạt

từ phủ kháng CD3+, kháng CD4+, hoặc kháng CD8+, cũng được lựa chọn đểloại bỏ các loại tế bào T cụ thể trong PBMC [67] Sự phát triển của quá trìnhphân lập có chọn lọc, chuyển nạp và mở rộng tế bào ở quy mô lâm sàng củanhững tế bào T ít biệt hóa để sản tạo khối tế vào CAR-T là rất có lợi [71]

1.3.4.2 Kích hoạt tế bào T

Kích hoạt tế bào lymhpho T là bước không thể thiếu của quá trình sảnxuất tế bào CAR-T Sự hoạt hóa tối ưu sẽ dẫn đến sự nuôi cấy đủ tế bào T màkhông gây ra sự biệt hóa lớn về mặt sinh lý của tế bào T hoặc sự chết tế bào

do kích hoạt (AICD) Tế bào trình diện kháng nguyên (APC), chẳng hạn như

tế bào đuôi gai (DCs), làm trung gian cho sự hoạt hóa tế bào T Tuy nhiên,khó nuôi cấy trong phòng thí nghiệm và ứng dụng vào lâm sàng nên khôngdùng để hoạt hóa tế bào CAR-T được [67]

 Sử dụng kháng thể kháng CD3/CD28

Các hạt từ gắn các kháng thể kháng CD3 hoặc kháng thể kháng CD28giúp kích thích tăng sinh các tế bào CAR-T sau đó chúng có thể được loại bỏbằng lực từ của nam châm [72] Việc sản xuất cytokine với sự hoạt hóa tế bào

T và hạt từ có kết quả cao hơn khi so sánh với sự hoạt hóa với OKT-3 vàinterleukin (IL)-2 [73] Hơn nữa, các hạt từ tính phủ kháng thể khángCD3/kháng CD28 có thể tạo ra các tế bào T ít biệt hóa hơn, có khả năng ít giàhơn cũng như các tế bào CAR-T có khả năng tăng sinh được nâng cao và phản

ứng chống khối u in vivo sớm hơn so với kích thích bằng OKT -3 và IL-2 liều

cao [74], [75] Trong các thử nghiệm lâm sàng gần đây, việc sản xuất

Kymriah® (Tisagenlecleucel; CTL019) và Lisocabtagene maraleucel (liso-cel; JCAR017) được sử dụng các hạt từ tính phủ kháng thể kháng CD3/kháng CD28, trong khi việc sản xuất Yescarta® (Axicabtagene Ciloleucel; KTE-019)

sử dụng kháng thể kháng CD3 với IL-2 [76], [77]

Một sản phẩm nanomatrix (T Cell TransAct ™) polymer hóa kết hợpvới chất chủ vận là CD3 và CD28 tái tổ hợp được nhân bản hóa cùng vớimôi trường không chứa huyết thanh (TexMACS ™) được sử dụng để kíchhoạt tế bào T trong quá trình sản xuất tế bào CAR-T Ngoài ra, chiến lượckích hoạt này làm trung gian cho sự mở rộng, hỗ trợ sự tăng sinh của các tếbào T CD4 + với tỷ lệ CD4: CD8 trung bình là 2: 1 và cũng dẫn đến hoạt

động phân giải tế bào thấp hơn khi so sánh với sự kích hoạt với chất khángCD3/khángCD28 [78].

 Sử dụng tế bào trình diện kháng nguyên nhân tạo (APC)

Trong các nghiên cứu gần đây, việc kích hoạt tế bào T để sản xuất tế bàoCAR-T đã được thực hiện với các APC nhân tạo có chứa kháng nguyên liênkết với khối u (TAA) [79] Với mục đích này, tế bào K-562 đã được biến đổigen để đồng biểu hiện các phân tử kích thích và TAA [80] Khi được chiếu xạbất hoạt, tế bào K-562 này có thể được sử dụng làm môi trường nuôi cấy tăngsinh số lượng các tế bào CAR-T Ưu điểm của phương pháp này là không có

sự biểu hiện của các kháng nguyên bạch cầu người HLA-A hoặc HLA-B vàđảm bảo các tiêu chuẩn chất lượng

1.3.4.3 Chuyển gen tạo khối tế bào CAR-T

Chuyển gen là bước rất quan trọng trong sản xuất tế bào CAR-T, quyếtđịnh hiệu quả của liệu pháp điều trị cũng như giá thành của sản phẩm Hiệnnay, có rất nhiều phương pháp chuyển gen có thể được áp dụng vào tế bào Tnhư tải nạp bằng véc tơ vi rút, transposons, mARN hoặc sử dụng hạt nano,liposome, kỹ thuật xung điện (electroporation) Tuy nhiên, có hai loại phươngpháp chính đã được thử nghiệm lâm sàng là tải nạp bằng vi rút và transposonkết hợp với kỹ thuật xung điện

 Tải nạp bằng véc tơ vi rút

Tải nạp bằng véc tơ vi rút hiện đang là phương pháp phổ biến để tạo tếbào CAR-T Các véc tơ vi rút bao gồm retrovirus(lentivirus, γ-retrovi rút) vàadenovi rút có khả năng lây nhiễm nhưng không còn khả năng nhân bản Quytrình sản xuất véc tơ vi rút đạt tiêu chuẩn GMP rất phức tạp và phải được thựchiện trong môi trường vô trùng Để sản xuất một mẻ véc tơ vi rút thường cầnhai tuần Hầu hết thời gian trên được dành cho việc tạo đủ lượng tế bào vậtchủ, có thể là HEK293T hoặc PG13 để phục vụ quá trình “đóng gói” vi rút.Đầu tiên, các tế bào vật chủ được tăng sinh trên môi trường nuôi cấy thích

hợp đến liều lượng nhất định trước khi được chuyển nạp với 4 plasmid baogồm: (i) cấu trúc Gag/Pol mã hóa protein Gag và enzyme Pol của virrus; (ii)cấu trúc mã hóa lớp vỏ glycoprotein dị nguyên đã được thiết kế nhằm loại bỏ

khả năng nhân bản; (iii) cấu trúc mã hóa gen rev trong trường hợp sử dụng

lentivirrus; (iv) cấu trúc mã hóa CAR và các trình tự khác nhằm đảm bảo hiệuquả phiên mã ngược, đóng gói và tích hợp gen chuyển vào hệ gen vật chủ.Khoảng 48 giờ sau chuyển nạp, các hạt vi rút chứa cấu trúc CAR bắt đầuđược tạo ra Trong các ngày tiếp theo, virrus có thể được thu hoạch theo mẻbằng cách thay mới môi trường nuôi cấy Sau đó, véc tơ vi rút được tinh sạch

và làm giàu bằng các bước lọc, loại bỏ cặn tế bào và các tạp chất khác, lọc vôtrùng và bảo quản ở -80oC Trước khi sử dụng, các véc tơ vi rút được kiểm trachất lượng theo quy trình của FDA [81]

Ưu điểm của phương pháp tải nạp bằng véc tơ vi rút là hiệu quả chuyểngen cao và sự tích hợp cấu trúc CAR vào hệ gen vật chủ một cách ổn định.Hai đặc trưng của retrovirus khiến chúng đặc biệt thích hợp để làm véc tơchuyển gen là: (i) phần lớn hệ gen vi rút có thể được thay bằng một hoặcnhiều gen chuyển mong muốn; (ii) khi chuyển nạp, bộ gen của vi rút đượctích hợp vĩnh viễn vào hệ gen của tế bào vật chủ Vì những lí do này, một sốγ-retrovirus đơn giản như “moloney murine leukemia vi rút” (Mo-MLV) đãứng dụng thành công để phục vụ tải nạp gen Các lentivirus cũng thường được

sử dụng, điển hình như các véc tơ thiết kế dựa trên vi rút HIV Thông thường,

tế bào T sẽ được hoạt hóa bằng hạt từ gắn kháng thể kháng OKT3, CD28(hoặc Dynabead CD3/CD28) trước khi cho ủ với véc tơ chuyển gen Sau khivéc tơ vi rút dung hợp với màng tế bào T, lõi vi rút mang cấu trúc CAR sẽđược chuyển vào tế bào chất, di chuyển dọc theo các vi ống đến nhân tế bào

để thực hiện quá trình tích hợp với hệ gen vật chủ Phương pháp này cho phéptạo tế bào CAR-T với hiệu suất lên đến 68% [82]

Tuy nhiên, để đạt được những tiêu chí an toàn cao trong nghiên cứulâm sàng, véc tơ vi rút được sử dụng phải được chứng minh không có khảnăng nhân bản, ít gây độc tế bào và ít gây phản ứng miễn dịch Vì thế, giáthành sản xuất của phương pháp này khá cao, tạo nên rào cản lớn trong việc

sử dụng rộng rãi liệu pháp CAR

 Hệ thống véc tơ Transposon-transposase

Transposon là các yếu tố di truyền kép, bao gồm một plasmid mang cấutrúc CAR và một plasmid mang gen mã hóa transposase Một số hệ thốngđiển hình có thể kể đến như “Sleeping Beauty”, “piggyBac” thường sẽ đượcchuyển trực tiếp vào tế bào chủ bằng kỹ thuật xung điện nhằm tích hợp cấutrúc di truyền vào hệ gen của tế bào vật chủ một cách ổn định Cơ chế của cácphương pháp này là enzyme transposase sẽ nhận biết và bám vào các vùngITR (inverted terminal repeats: trình tự lặp đầu cuối đảo ngược) tại hai đầucủa cấu trúc cần chuyển, sau đó cắt và dán cấu trúc di truyền vào hệ gen tếbào chủ So với các véc tơ vi rút truyền thống, transposon có ưu điểm cơ bản

là giá thành sản xuất thấp hơn nhiều lần (do bản chất của các cấu trúc là cácplasmid), an toàn hơn So với hệ thống “Piggybac”, “Sleeping Beauty” có lợithế hơn trong chỉnh sửa gen tế bào T do khả năng tích hợp ngẫu nhiên vào cácvùng trình tự TA trong hệ gen tế bào chủ; trong khi đó, công nghệ “piggyBac”thường tích hợp gen chuyển vào gần vùng điều hòa gen (regulatory region) như

“Transcriptional start site” (TSS) và các đảo CpG [83], [84]

Gần đây, nhóm nghiên cứu của Cooper J.N tại Đại học Texas, Mỹ đãcông bố kết quả thử nghiệm pha I của tế bào CAR-T được chế tạo bằng côngnghệ “Sleeping Beauty” [85] Cấu trúc CAR được sử dụng trong nghiên cứunày là CD19RCD28 được chèn vào plasmid “Sleeping Beauty” để chuyển nạpvào 2  108 tế bào PBMC bằng thiết bị Nucleofector II cùng với plasmid mãhóa cho SB transposase Các tế bào T sau chuyển nạp được nuôi cấy trongmôi trường được bổ sung IL-2, IL-21 với sự có mặt của tế bào trình diện

kháng nguyên nhân tạo (artificial antigen presenting cell hay aAPC) là tế bàoK562 biểu hiện đồng thời CD19, CD64, CD86 và CD137 Sau 28 ngày nuôicấy, lượng tế bào T được tăng sinh khoảng hơn 2000 lần, trong đó 84% cóbiểu hiện cấu trúc CAR, hoàn toàn đáp ứng yêu cầu về liều sử dụng trong điềutrị Giải trình tự bằng hệ thống Illumina (7,5 triệu trình tự thô) cho thấy 99,9%các vị trí hòa nhập của cấu trúc “Sleeping Beauty” là vào các vị trídinucleotide TA và rải đều trên toàn bộ thể gen Hầu hết các vị trí chèn vàothể gen rơi vào vùng không mã hóa, do vậy nguy cơ gây đột biến phát sinhung thư là rất thấp Khi kết hợp cùng với ghép tế bào gốc tạo máu đồng loài,sau 30 tháng theo dõi, có tới 83% các bệnh nhân đã thuyên giảm hoàn toàn.Điều đặc biệt là toàn bộ các bệnh nhân này đều còn sống, cho thấy tính antoàn của liệu pháp Tính trung bình, tế bào CAR-T tồn tại trong các bệnh nhânAllo-SCT là 201 ngày Bên cạnh đó, Cooper và cộng sự còn sử dụng côngnghệ “Sleeping Beauty” để đồng biểu hiện cytokin hoạt hóa IL-15 cùng vớicấu trúc CAR CD19RCD28 [86] Kết quả nghiên cứu cho thấy sự đồng biểuhiện IL-15 giúp tế bào CAR-T có thể tồn tại lâu hơn với kiểu hình tương tựnhư các tế bào T ghi nhớ Đặc biệt các thử nghiệm tiền lâm sàng trên chuộtcho thấy các tế bào CAR-T CD19RCD28 đồng biểu hiện IL-15 có thể được

sử dụng chỉ sau 2 ngày nuôi cấy (thay vì 28 ngày để đạt được liều lượng tếbào CAR-T thông thường) mà vẫn đạt được kết quả điều trị mong muốn Cáckết quả khích lệ này cho thấy tính hiệu quả của công nghệ chuyển gen

“Sleeping Beauty” cũng như các ưu việt của việc đồng biểu hiện IL-15 cùngvới cấu trúc CAR-T

Trong năm 2017, Monjezi R và cộng sự đã công bố kết quả nghiên cứu

sử dụng công nghệ “Sleeping Beauty” kết hợp với công nghệ minicircle nhắmđích thụ thể CD19 để thử nghiệm khả năng điều trị ALL [87] Minicircle làcác vec tơ dạng vòng, kích thước nhỏ do đã loại bỏ hoàn toàn gốc sao chép,các gen chọn lọc, và chỉ giữ lại các cấu trúc di truyền cần chuyển Cũng tương

tự như nghiên cứu đã trình bày ở trên, kết quả giải trình tự trên hệ thốngIllumina cho thấy hầu hết các vị trí hòa nhập của cấu trúc “Sleeping Beauty”đều nằm ngoài các gen liên quan đến ung thư và biểu hiện mạnh Khi thửnghiệm trên mô hình chuột, tế bào CAR-T được tạo bởi công nghệ “SleepingBeauty” dưới dạng minicircle cho phép loại bỏ hoàn toàn các tế bào ung thư.Bên cạnh đó, hiệu quả chuyển gen bằng xung điện của các cấu trúc “SleepingBeauty” dưới dạng minicircle là cao hơn nhiều lần so với khi sử dụng plasmidthông thường 49,8% tế bào T biểu hiện CAR khi sử dụng minicircle so với tỷ

lệ 12,8% của plasmid Một điểm mới của nghiên cứu này so với nghiên cứucủa Kebriaei và đồng tác giả là việc sử dụng mARN mã hóa SB transposasethay vì plasmid mang gen mã hóa Điều này sẽ giúp tránh hiện tượng gen mãhóa SB transposase hòa nhập vào thể gen của tế bào T, gây ra đột biến khôngmong muốn, do vậy giúp tăng tính an toàn của liệu pháp

Hình 1.4 Cơ chế hoạt động của hệ thống Sleeping Beauty.

* Nguồn: theo Geurts A.M (2003) [88]

 Chuyển nạp sử dụng mARN

Việc biểu hiện ARN có một số lợi thế so với cách sử dụng ADN hay virút, ví dụ như không cần phiên mã, khiến cho protein được biểu hiện nhanhchóng sau khi chuyển nạp Ngoài ra, ARN ở lại tế bào chất mà không vàonhân tế bào, khiến cho hiệu suất biểu hiện được cải thiện và biểu hiện genkhông lâu dài

Sử dụng xung điện để chuyển nạp vật liệu di truyền vào tế bào lần đầuđược mô tả vào năm 1982 Kể từ đó, tính linh hoạt của kỹ thuật này đã đượcchứng minh trong nhiều loại tế bào và các tổ chức cơ quan để chuyển nạp cáccấu trúc di truyền khác nhau tùy thuộc vào mục đích ứng dụng [89] So với kỹthuật chuyển gen bằng véc tơ vi rút, kỹ thuật này tạo ra một giải pháp thay thế

an toàn hơn cho sự biểu hiện protein mà không có nguy cơ gây đột biến chèn

và khả năng sinh miễn dịch thấp hơn

Trước khi thẩm thấu điện, màng tế bào ở trạng thái không thấm đượcđặc trưng bởi độ dẫn điện thấp, hằng số điện môi và tính phân cực Nhữngthay đổi này cho phép tạo ra các lỗ nano ưa nước mà qua đó các ion trongdung dịch nước có thể đi qua Các ion di chuyển từ điện cực dương sang điệncực âm sẽ tạo ra lực điện động cho phép ARN (một polyanion) di chuyển đếnđiện cực dương

 Sản xuất mARN cho ứng dụng chuyển nạp bằng xung điện tronglâm sàng

Trong bối cảnh sự phát triển mạnh mẽ của liệu pháp miễn dịch điều trịung thư và ứng dụng kỹ thuật chuyển nạp mARN vào tế bào miễn dịch,mARN có thể được coi là nguyên liệu ban đầu và hoạt chất để tạo ra các chếphẩm thuốc trị liệu tiên tiến (ATMP: Advanced Therapy Medicinal Products)dựa trên tế bào Vì lý do này, các sản phẩm mARN không hoàn toàn tuân thủcác yêu cầu tiêu chuẩn GMP, nhưng chất lượng được kiểm soát chặt chẽ,được coi là nguyên liệu ban đầu hợp lệ cho sản xuất các sản phẩm thuốc thử